TECHNOZYM ADAMTS

TECHNOZYM ADAMTS
3050138-003
04/2005
TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH
For research use only
GB
REF
5450401
IT
DE
TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH
Symbols key / Symbolschlüssel
(if applicable / wenn anwendbar)
manufactured by / Hergestellt von / prodotto da
DIL
dilute or dissolve in / verdünnen oder lösen in / a diluire o a sciogliere in
expiry date / Verfallsdatum / data di scadenza
IVD
in vitro diagnostic use / in vitro Diagnostikum / diagnostico in vitro
storage temperature / Lagertemperatur / temperatura di conservazione
LOT
lot / Charge / lotto
consult instructions for use / Gebrauchsanweisung beachten / consultare le
istruzioni per l'uso
MTP
microtiter plate / Mikrotiterplatte / placa microtiter
CE-mark / CE-Zeichen / marchio di CE
REF
catalogue number / Katalognummer / numero di catalogo
determinations / Bestimmungen / determinazioni
RTU
SUB
ready to use / gebrauchsfertig / pronto all’uso
AQUA
distilled Water / destilliertes Wasser / acqua distillata
CONJ
conjugate / Konjugat / Coniugato
STOP
stop solution / Stopplösung / Soluzione di arresto
CONT
control / Kontrolle
WASH
washing solution concentrate / Waschlösungskonzentrat / concentrado de
solución de lavado
substrate / Substrat / substrato
Technoclone GmbH
Brunner Str. 59/5
1230 Vienna, Austria
www.technoclone.com
GB
TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH
PRODUCT DESCRIPTION
WASHING
(reference 1,3,4)
INTENDED USE
CONJUGATE
REACTION
(reference 1,2)
The TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH ELISA is a test for detection of human autoantibodies
(IgG) in serum or plasma against ADAMTS13, the protease which is responsible for cleaving
unusually large vWF (ULvWF). Most of these autoantibodies inhibit ADAMTS13 activity and
thus non-cleaved ULvWF accumulates in plasma. This is believed to be the major cause for
thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH test makes it
possible to differentiate between congenital (gene polymorphisms) and acquired
(autoantibodies) TTP and to control efficacy of plasma exchange therapy.
SUBSTRATE
REACTION
(reference 1,2)
MATERIAL REQUIRED (not supplied with the kit)
Distilled water
Test tubes for diluting samples
Measuring cylinder (1000 mL)
Precision pipettes (10, 100 and 1000 µL)
Variable pipette (1000 µL)
Multichannel and/or dispensing pipettes (100 and 200 µL)
ELISA washer or multichannel pipette
ELISA reader with 450 nm filter, with a 620 nm reference filter if available.
WARNING AND PRECAUTIONS
-
-
-
All human blood or plasma products as well as samples must be considered as potentially
infectious. They have to be handled with appropriate care and in strict observance of safety
regulations. The rules pertaining to disposal are the same as applied to disposing hospital
waste.
Calibrators and control plasmas are made from human blood and any individual plasma
involved in the procedure is HBsAg, HIV 1/2 Ab and HCV-Ab-negative (see labels on the
vials). However, all human blood products should be handled as potentially infectious
material.
Stopping solution (sulphuric acid) may irritate the skin. Should acid get into your eyes,
wash out immediately with water and consult a doctor.
The reagents sometimes contain preserving agents (merthiolate). Beware of swallowing!
Avoid contact with skin or mucous membranes
STABILITY AND STORAGE
The expiry date printed on the labels applies to storage of the unopened vial at + 2…8 °C.
Stability after reconstitution/opening:
Material/Reagent
Calibrators,
control plasmas
State
Storage
Stability
after reconstitution
-20 °C
6 months
ELISA test strip
after opening
Washing buffer conc.
after opening
1+9 dilution of
concentrate
Washing buffer
Incubation buffer
(= sample dilution
buffer)
Conjugate
Chromogen TMB
2 ... 8 °C with adhesive film in
plastic bag with drying agent
2 ... 8°C
after opening
2 ... 8 °C
2 months
after opening
working solution
after opening
2 ... 8 °C
room temperature
2 ... 8 °C
6 months
60 minutes
expiry date
3 x 200 µL
100 µL
Incubate at room temperature
10 minutes
ELISA-Reader, 450 nm
Reagents of different lots must not be combined
Precision and performance, among others, essentially depend on the following factors:
- Thorough mixing of all substances used for dilution, 10 sec. with Vortex Mixer
- Test calibrators, controls and samples in duplicates
- Incubate at indicated temperature (RT: room temperature, 20...25°C)
- Strict observance of the order of pipetting and of the time element as indicated
- The time for sample incubation, conjugate and substrate reaction as indicated starts
after pipetting the last sample. Incubation times should not vary by more than ± 5%.
- During sample incubation and conjugate reaction, the time for pipetting
calibrators/control plasmas/samples and/or conjugate solutions must not exceed 60
seconds per ELISA test strip (8 wells).
- During substrate reaction and at stopping, the time needed for pipetting the substrate
and/or the stopping solution must not exceed 10 seconds per ELISA test strip. Short
pipetting times may be secured b using multichannel- and dispensing pipettes.
3. Label/number strips with a water resistant pen in case the strips accidentally fall out of the
frame during testing.
4. After the last washing, wells must be aspirated thoroughly, turned upside down and
positioned on a blotting paper; by gentle tapping, the last remnants must be removed.
5. Measuring the difference in wave lengths at 450 and 620 nm the precision of the test is
increased.
LIMITATION OF THE TEST
Samples with high concentrations of other than anti ADAMTS-13 autoantibodies may result in
weak positive or borderline results.
ANALYSES RESULTS
CALCULATION OF THE RESULTS
Setting up a reference curve:
X axis: concentration ADAMTS-13 IgG (U/mL)
Y axis: Extinction at 450nm
Graph plot is linear-linear with a linear or point to point fit.
Assessment of reference curve
ƒ The extinction coefficient of the highest calibrator should be between 1.0 and 2.5.
ƒ The extinction coefficient of the lowest Calibrator should be <0.1.
ƒ The extinction difference between these two values should be at least 1.0.
ƒ The validity of the test may be checked on the basis of the calculated control values.
Example of standard curve
ADAMTS-13 INH - standard curve
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
PREPARATION OF THE SAMPLES
20
Sample material: Human serum or citrated plasma. Samples can be stored up to six weeks in
the refrigerator. At -20°C they can be stored for several months. Samples may not be frozen
and thawed several times.
40
60
80
100
120
anti ADAMTS-13 (Units/mL)
Measuring concentration of samples
PREPARATION OF REAGENT
1. Before starting the test, all the required components are to be brought to room
temperature.
2. Preparing the washing buffer: Dilute 1 part by volume washing buffer concentrate with 9
parts by volume distilled water (1+9). Mix well! (Diluted washing buffer concentrate =
washing buffer). There may be crystalline precipitations which will dissolve at 37°C within
10 minutes.
3. Reconstituting calibrators and control plasmas: Calibrators and control plasmas are
reconstituted with 500 µL distilled water and mixed for 10 seconds after a reconstitution
time of 15 minutes (vortex mixer).
Calibrators and Controls are ready to use, no dilution is necessary.
Reconstituted components are clear to slightly turbid.
4. Sample Dilution: Samples are diluted with incubation buffer (1+100) : Dilute 1 part by
volume sample with 100 parts by volume incubation buffer
10 µL sample + 1000 µL incubation (= sample dilution) buffer
5. Preparing the conjugate working solution (1+50): Dilute 1 part by volume conjugate with 50
parts by volume incubation buffer.
For 8 test wells : Mix 20 µL conjugate with 1000 µL incubation (= sample dilution)
buffer
PERFORMANCE OF THE TEST
Pipette calibrators, control plasmas, diluted
samples into test wells; cover test strips with
film
Incubate at room temperature
100 µL
shake 10 sec.,
measure within
10 min.
1.
2.
TEST PROCEDURE
SAMPLE
INCUBATION
(reference 1,2)
Pipette stopping solution into wells
References
6 months
3 weeks
Washing buffer
Pipette Substrate solution into test wells, cover
test strip with film
MEASURING
(reference 5)
expiry date
2 ... 8 °C
100 µL
60 minutes
STOPPING
(reference 1,2)
OD 450nm
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
3 x 200 µL
Incubate at room temperature
WASHING
(reference 1,3,4)
COMPOSITION
1. ELISA test strips (12), with 8 wells each, coated with a recombinant form of ADAMTS-13
protease; the drying agent is supplied in an aluminium bag.
2. Washing buffer concentrate (PBS; pH 7.3); containing detergent; 0.01% merthiolate; 1 vial,
100 mL.
3. Incubation buffer (= sample dilution buffer) (PBS; pH 7.3); contains stabiliser protein;
0.01% merthiolate; and green dye, 1 vial, 100 mL, ready for use.
4. Calibrators (Standards) numbered from 1 to 5; lyophilised; 1 vial each; 0.5 mL.
Concentrations are lot-specific; consult the label on the vial.
5. Positive and negative control plasma; lyophilised; 1 vial each; 0.5mL. Concentrations are
lot-specific; consult the label on the vial.
6. Conjugate: anti-human IgG POX; dyed blue; 1 vial, 0.3 mL.
7. Chromogen substrate TMB (tetramethylbenzidine); 1 vial; 12 mL; ready to use.
8. Stopping solution sulphuric acid 1.9 mol/L; 1 vial; 12 mL; ready to use.
9. Adhesive film: for ELISA test strips; 2 pieces.
Washing buffer
Pipette conjugate working solution into wells,
cover test strip with film
100 µL
60 minutes
ƒ
ƒ
Read off the concentration from the reference curve.
If there are samples with extinction coefficients higher than that of the highest point on the
curve, they have to be prediluted with incubation buffer (1+1, or 1+3). The measured
concentration then has to be multiplied with the dilution factor 2 or 4, respectively.
INTERPRETATION OF RESULTS / REFERENCE RANGE
negative samples. < 12 units/mL
borderline: 12 – 15 units/mL
positve samples: > 15 units/mL
It is recommended that individual laboratories establish their own normal range. When
interpreting the serological results the history of the patient has to be taken into account.
STANDARDISATION
Standards are calibrated against a plasma with a very high titre of anti ADAMTS-13 IgG. A
1:200 dilution of this reference plasma is defined to contain an antibody concentration of 100
Units/mL. (arbitrary units).
LITERATURE
Sadler JE. A new name in thrombosis, ADAMTS13. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:
11552-11554.
Tsai HM, Li A, Rock G. Inhibitors of von Willebrand factor-cleaving protease in thrombotic
thrombocytopenic purpura. Clin Lab. 2001;47:387-392.
Fontana S, Hovinga JA, Studt JD et al. Plasma therapy in thrombotic thrombocytopenic
purpura: review of the literature and the Bern experience in a subgroup of patients with
severe acquired ADAMTS-13 deficiency. Semin Hematol. 2004;41:48-59.
Klaus C, Plaimauer B, Studt JD et al. Epitope mapping of ADAMTS13 autoantibodies in
acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2004;103:4514-4519.
DE
TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH
PRODUKTBESCHREIBUNG
KONJUGATREAKTION
(Hinweise 1,2)
ANWENDUNG
Der TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH ELISA ist ein Test für den Nachweis humaner AutoAntikörper (IgG) in Serum oder Plasma. Diese Antikörper sind gegen die vWF spaltende
Protease ADAMTS-13 gerichtet und hemmen deren Aktivität. Die Hauptfunktion von ADAMTS13 ist die Spaltung von ungewöhnlich großen vWF Molekülen. Das Fehlen der ADAMTS-13
Funktion wird als Hauptursache für die thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP)
angesehen. Der TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH Test dient zur Unterscheidung der
erworbenen TTP (Autoantikörper) von der vererbten TTP (Polymorphismen im ADAMTS-13
Gen) und zur Überprüfung der Wirksamkeit einer Plasmaersatztherapie.
BENÖTIGTES MATERIAL (nicht im Kit enthalten)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Aqua dest.
Röhrchen zur Verdünnung der Proben
Messzylinder (1000 mL)
Präzisionspipetten (10, 100 und 1000 µL)
Variable Pipette (1000 µL)
Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten (100 und 200 µL)
ELISA-Waschgerät oder Mehrkanalpipette
ELISA-Reader mit 450 nm Filter und 620 nm Referenzfilter falls verfügbar.
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
-
-
-
Alle humanen Blut- bzw. Plasmaprodukte und Proben müssen als potentiell infektiös
angesehen werden. Sie sind mit der notwendigen Sorgfalt und entsprechend den
Sicherheitsvorschriften zu behandeln und wie Krankenhausmüll zu entsorgen.
Obwohl alle Kalibratoren und Kontrollen, hergestellt aus humanem Blut, und alle hierzu
verwendete Einzelplasmen HbsAg, HIV 1/2 Ak und HCV-Ak negativ (siehe Flaschenetikett)
sind, müssen sie als potentiell infektiös betrachtet werden.
Stopplösung (Schwefelsäure) kann zu Reizungen der Haut führen. Sollte Säure in die
Augen gelangen, sofort mit viel Wasser auswaschen und einen Arzt aufsuchen!
Die Reagenzien enthalten teilweise Konservierungsmittel (Merthiolat). Nicht schlucken!
Haut- oder Schleimhautkontakt vermeiden!
LAGERUNG UND STABILITÄT
Die Reagenzien sind ungeöffnet bei +2...8°C zu lagern und bis zu dem auf den Etiketten
angegebenem Datum verwendbar.
100 µL
Bei Raumtemperatur inkubieren
60 Minuten
Waschpuffer
3 x 200 µL
WASCHEN
(Hinweise 1,3,4)
SUBSTRATREAKTION
(Hinweis 1,2)
Substratlösung in Testvertiefungen pipettieren;
STOPPEN
(Hinweis 1,2)
Stopplösung in Testvertiefungen pipettieren
100 µL
ELISA-Reader, 450nm
10 Sek. schütteln,
Messung innerhalb
von 10 Min.
ZUSAMMENSETZUNG
1. ELISA-Teststreifen (12): mit jeweils 8 Testvertiefungen; beschichtet mit rekombinantem
ADAMTS-13 Protein; mit Trocknungsmittel im Aluminiumbeutel verpackt.
2. Waschpufferkonzentrat: (PBS; pH 7,3); detergenshaltig; 0,01% Merthiolat; 1 Fl.; 100 mL.
3. Inkubationspuffer (=Probenverdünnungspuffer): (PBS; pH 7,3); grüngefärbt enthält
Stabilisatorprotein; 0,01% Merthiolat; 1 Fl.; 100 mL; gebrauchsfertig
4. Kalibratoren (Standards): nummeriert von 1-5; lyophilisiert; je eine Fl.; 0,5 mL. Die
chargenabhängigen Konzentrationen entnehmen Sie bitte den Flaschenetiketten!
5. Positive und negative Kontrollplasmen, lyophilisiert; je eine Fl.; 0,5mL. Die
chargenabhängigen Konzentrationen entnehmen Sie bitte den Flaschenetiketten!
6. Konjugat: anti-human-IgG POX; blaugefärbt; 1 Fl.; 0,3 mL
7. Chromogenes Substrat: TMB (Tetramethylbenzidin) 1 Fl., 12 mL, gebrauchsfertig
8. Stopplösung: Schwefelsäure 1,9 mol/L; 1 Fl.; 12 mL, gebrauchsfertig
9. Abklebefolien: für ELISA-Teststreifen; 2 Stk.
Konjugatgebrauchslösung in Testvertiefung
pipettieren. Teststreifen mit Folie abdecken
Teststreifen mit frischer Folie abdecken
Bei Raumtemperatur inkubieren
MESSEN
(Hinweis 5)
HINWEISE
1. Reagenzien verschiedener Chargen dürfen nicht kombiniert werden.
2. Präzision und Wiederfindung hängen u.a. von folgenden Faktoren entscheidend ab:
- Gute Durchmischung aller Verdünnungsansätze, 10 Sek. auf Probenmischer
- Durchführung von Doppelbestimmungen
- Inkubation bei der korrekten Temperatur (RT: Raumtemperatur; 20 - 25°C)
- Genaue Einhaltung von Pipettierreihenfolge und Zeittakt.
- Die angegebene Zeit für die Probeninkubation, Konjugat- und Substratreaktion wird
nach der Pipettierung der letzten Probe genommen. Inkubationszeiten sollten um nicht
mehr als ±5% variiert werden.
- Bei der Probeninkubation und Konjugatreaktion darf die Zeit für die Pipettierung der
verdünnten Kalibratoren/Kontrollplasmen/Proben bzw. Konjugatlösung 60 Sek. pro
ELISA-Teststreifen (8 Vertiefungen) nicht überschreiten.
- Bei der Substratreaktion und beim Stoppen darf die Pippettierzeit der Substrat- bzw.
Stopplösung 10 Sek. pro ELISA-Teststreifen nicht überschreiten. Kurze Pipettierzeiten
werden durch Verwendung von Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten erreicht.
3. Teststreifen mit wasserfestem Stift markieren, falls sie während des Testes versehentlich
aus der Halterung fallen sollten.
4. Nach dem letzten Waschvorgang müssen die Testvertiefungen leer gesaugt und auf
saugfähigem Papier ausgeklopft werden.
5. Durch Differenzwellenlängenmessung bei 450 nm und 620 nm wird die Präzision des Tests
erhöht.
TESTEINSCHRÄNKUNGEN
Proben mit hohen Konzentrationen anderer Autoantikörper als anti-ADAMTS-13 Antikörper
können schwach positive oder grenzwertige Ergebnisse liefern.
ANALYSENERGEBNISSE
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
Erstellung der Bezugskurve:
x-Achse: anti ADAMTS-13 IgG Konzentration (U/mL)
y-Achse: Extinktion
Bezugskurve ist linear-linear. Werte mittels linearer Regression miteinander verbinden.
Beurteilung der Bezugskurve:
Material/Reagenz
Zustand
Lagerung
Stabilität
•
•
•
•
Kalibratoren,
Kontrollplasmen
nach
Rekonstitution
-20 °C
6 Monate
Beispiel einer Standardkurve:
Stabilität nach Rekonstitution/nach Öffnen:
ELISA-Teststreifen
nach Öffnen
Waschpufferkonzentrat
nach Öffnen
1+9 Verdünnung
des Konzentrats
Waschpuffer
Inkubationspuffer
(=Probenverdünnungspuff nach Öffnen
er)
Konjugat
Chromogenes Substrat
nach Öffnen
Gebrauchslösung
nach Öffnen
2 ... 8 °C mit Abklebefolie in
Alubeutel mit Trockenmittel
2 ...8°C
Die Extinktion des höchsten Kalibrators sollte zwischen 1,0 und 2,5 liegen
Die Extinktion des niedrigsten Kalibrators sollte <0,1 sein.
Die Extinktionsdifferenz dieser Kalibratoren sollte mindestens 1,0 sein.
Die Auswertbarkeit des Tests kann anhand der ermittelten Kontrollwerte überprüft werden
Verfallsdatum
ADAM T S - 13 INH - stan d ard cu rve
6 Monate
2 ... 8 °C
3 Wochen
2 ... 8 °C
2 Monate
2 ... 8 °C
Raumtemperatur
2 ... 8 °C
6 Monate
60 Minuten
Verfallsdatum
100 µL
10 Minuten
2,5
2
1,5
1
0,5
TESTDURCHFÜHRUNG
0
VORBEREITUNG DER PROBEN
0
Probenmaterial: Humanserum oder Citratplasma. Proben können bis zu 6 Wochen im
Kühlschrank aufbewahrt werden. Bei -20°C können sie mehrere Monate aufbewahrt werden.
Proben dürfen nicht mehrfach eingefroren und wieder aufgetaut werden.
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
1. Vor Testbeginn alle benötigten Testkomponenten auf Raumtemperatur bringen.
2. Herstellen des Waschpuffers: 1 Volumenteil Waschpufferkonzentrat mit 9 Volumenteilen
Aqua dest. Verdünnen (1+9). Gut mischen! (Verdünntes Waschpufferkonzentrat =
Waschpuffer). Eventuelle kristalline Niederschläge gehen bei 37°C innerhalb von 10 min in
Lösung.
3. Rekonstituieren der Kalibratoren und Kontrollplasmen: Die Kalibratoren und
Kontrollplasmen werden mit 500 µL Aqua dest. Rekonstituiert und nach einer
Rekonstitutionszeit von 15 min, 10 Sekunden gemischt (Probenmischer). Rekonstituierte
Komponenten sind klar bis leicht trüb.
Kalibratoren und Kontrollen sind gebrauchsfertig und müssen nicht verdünnt werden!
4. Probenverdünnung: Proben werden mit Inkubationspuffer verdünnt (1+100): 1 Volumenteil
Probe wird mit 100 Volumenteilen Inkubationspuffer verdünnt.
10 µL Probe + 1000 µL Inkubationspuffer (=Probenverdünnungspuffer)
5. Herstellen der Konjugatgebrauchslösung (1+50): 1 Volumenteil Konjugat mit 50
Volumenteilen Inkubationspuffer verdünnen.
Für 8 Testvertiefungen : 20 µL Konjugat mit 1000 µL Inkubationspuffer
(=Probenverdünnungspuffer) mischen.
TESTVERFAHREN
PROBENINKUBATION
(Hinweise 1,2)
Kalibratoren, Kontrollplasmen, verdünnte
Proben in Testvertiefung pipettieren.
Teststreifen mit Folie abdecken
Bei Raumtemperatur inkubieren
60 Minuten
WASCHEN
(Hinweise 1,3,4)
Waschpuffer
3 x 200 µL
100 µL
20
40
60
80
100
120
anti ADAMT S-13 (Units/mL)
Konzentrationsbestimmung der Proben:
ƒ
ƒ
Konzentrationen der Proben an der Bezugskurve ablesen
Sollte der Extinktionswert einer Probe höher als der des höchsten Standards liegen, so
muss die Probe mit Inkubationspuffer vorverdünnt werden (1+1 oder 1+3). Die ermittelte
Konzentration wird in diesem Fall mit dem Verdünnungsfaktor 2 bzw. 4 multipliziert.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE/REFERENZBEREICH
Negativ: < 12 units/mL
Graubereich: 12 – 15 units/mL
Positiv: > 15 units/mL
Es wird empfohlen, dass jedes Labor seinen eigenen Normalbereich bestimmt. Die Beurteilung
und Interpretation der serologischen Ergebnisse darf nur durch entsprechendes Fachpersonal
erfolgen. Dabei muß die Patientenanamnese berücksichtigt werden.
STANDARDISIERUNG
Die Standards werden gegen ein Plasma mit einem sehr hohen Titer an anti ADAMTS-13 IgG
kalibriert. Die Antikörperkonzentration wird als willkürliche Einheit definiert: 100 U/mL
entsprechen einer 1:200 Verdünnung dieses Referenzplasmas.
LITERATUR
Sadler JE. A new name in thrombosis, ADAMTS13. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:
11552-11554.
Tsai HM, Li A, Rock G. Inhibitors of von Willebrand factor-cleaving protease in thrombotic
thrombocytopenic purpura. Clin Lab. 2001;47:387-392.
Fontana S, Hovinga JA, Studt JD et al. Plasma therapy in thrombotic thrombocytopenic
purpura: review of the literature and the Bern experience in a subgroup of patients with
severe acquired ADAMTS-13 deficiency. Semin Hematol. 2004;41:48-59.
Klaus C, Plaimauer B, Studt JD et al. Epitope mapping of ADAMTS13 autoantibodies in
acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2004;103:4514-4519.
IT
TECHNOZYM® ADAMTS-13 INH
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
INDICAZIONI D’USO
L’ELISA TECHNOZYM ADAMTS-13 INH è un test per valutare la presenza di autoanticorpi
umani nel siero o nel plasma per ADAMTS 13, la proteasi responsabile della lisi del Fattore di
von Willebrand insolitamente piccola (ULvWF). Molti di questi autoanticorpi inibiscono l’attività
di ADAMTS 13, causando un accumulo di ULvWF non degradato nel plasma. Si pensa che
questo possa essere la causa principale della trombocitopenia trombotica purpurea (TTP). Il
saggio TECHNOZYM ADAMTS-13 INH è in grado di distinguere tra la TTP congenita
(polimorfismo genetico) e acquisita (autoanticorpi) e di valutare l’efficacia della terapia di
cambio del plasma.
COMPOSIZIONE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Le strisce (12) del kit ELISA, ciascuna costituita da 8 pozzetti, sono piastrate con una
forma ricombinante della proteasi ADAMT-13; l’agente essiccato è fornito in una busta
di alluminio.
Washing Buffer Concentrate (PBS; pH 7,3); contiene detergente; 0,01% di mertiolato; 1
vial di 100 ml.
Incubation Buffer (PBS; pH 7,3); contiene proteina stabilizzante; 0,01% di mertiolato;
colorante verde; 1 vial di 100 ml; pronto per l’uso.
Calibratori (Standards) numerati da 1 a 5; liofilizzati; 1 vial ciascuno da 0,5 ml. Le
concentrazioni sono lotto-specifiche; consultare l’etichetta sulla vial.
Controllo positivo e negativo del plasma; liofilizzato; 1 vial ciascuno di 0,5 ml. Le
concentrazioni sono lotto-specifiche; consultare l’etichetta sulla vial.
IgG POX anti-human coniugato; colorato di blue; 1 vial di 0,3 ml.
Substrato cromogeno TMB (tetrametilbenzidina); 1 vial di 12 ml, pronta per l’uso.
Stopping Solution di acido solfidrico 1,9 mol/l; 1 vial di 12 ml, pronta per l’uso.
Film adesivo: per le linee del saggio ELISA; 2 pezzi.
REAZIONE DI
CONIUGAZION
E (reference
1,2)
LAVAGGI
(reference
1,3,4)
REAZIONE
CON IL
SUBSTRATO
(reference 1,2)
STOPPING
(reference 1,2)
100 µL
Incubare a temperatura ambiente
60 minuti
Washing Buffer
3 x 200 µL
Aggiungere la Substrate solution nei
pozzetti, coprendo le strisce del test con un
film
Incubare a temperatura ambiente
Reference
1.
2.
Acqua bidistillata.
Provette per diluire gli standard e i campioni.
Cilindro graduato da 1000 ml.
Pipette di precisione da 10, 100 e 1000 µl.
Pipetta ripetitiva da 1000 µl.
Pipette multicanale e/o dispensanti da 100 e 200 µl.
Buretta per ELISA o pipetta multicanale.
Lettore di piastra per ELISA con filtro a 420 nm e con filtro di riferimento a 620 nm se
disponibile.
ATTENZIONI E PRECAUZIONI
100 µL
Lettore di piastre ELISA, 450 nm
Agitare 10 secondi;
misurare entro 10
minuti
4.
Tutti i prodotti del sangue o del plasma così come tutti i campioni devono essere
considerati come potenzialmente infettivi. Devono essere maneggiati con particolare
attenzione e in stretta osservanza delle regole di sicurezza. Le regole riguardanti
l’eliminazione sono le stesse applicate allo smaltimento riguardante gli ospedali.
- I calibratori e i plasmi controllo sono prodotti a partire da sangue umano e ogni plasma è
stato testato e trovato negativo per gli anticorpi per l’HIV 1/2, HBs Ag e HVC (guardare
l’etichetta sulle vials). Comunque tutti i prodotti derivati da sangue umano dovrebbero essere
maneggiati con cura come se fossero materiale potenzialmente infetto.
- La Stopping Solution (acido solforico) potrebbe essere irritante per la pelle. Se l’acido viene
a contatto con gli occhi, risciacquare immediatamente e consultare un dottore.
- Qualche volta i reagenti contengono composti conservanti (mertiolato). Stare attenti a non
ingerire! Evitare il contatto con la pelle o le membrane mucose.
LIMITAZIONI DEL SAGGIO
STABILITA’ E CONSERVAZIONE
Costruzione di una curva standard:
asse delle X: concentrazione di ADAMTS-13 IgG (U/ml).
asse delle Y: densità ottica a 450 nm.
Materiale/Reagente
Stato
Conservazione
Stabilità
Calibratori, plasmi
controllo
Dopo
ricostituzione
-20 °C
6 mesi
Strisce del kit ELISA
Dopo apertura
2-8°C con il film adesivo nel
Data di
sacchetto di plastica con un
scadenza
essiccante
Washing Buffer
Concentrate
Dopo apertura
2 ...8°C
6 mesi
Washing Buffer
Incubation Buffer
IgG coniugato
Cromogeno TMB
1+9 diluizioni del
concentrato
Dopo apertura
Dopo apertura
Soluzione di lavoro
2 ... 8 °C
3 settimane
2 ... 8 °C
2 ... 8 °C
Temperatura ambiente
2 mesi
6 mesi
60 minuti
Dopo apertura
2 ... 8 °C
Data di
scadenza
TESTDURCHFÜHRUNG PROCEDURE DEL TEST
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
I campioni da utilizzare per il test sono siero umano o plasma trattato con citrato. I campioni
possono essere conservati fino a sei settimane in un frigo, per alcuni mesi se conservati
invece a –20°C. I campioni non devono essere scongelati e ricongelati più volte.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
5.
I campioni che hanno alte concentrazioni di altri autoanticorpi oltre a anti ADAMTS-13
potrebbero risultare debolmente positivi o avere valori borderline.
ANALISI DEI RISULTATI
CALCOLO DEI RISULTATI
Il grafico è lineare se calcolato con una regressione lineare o punto per punto.
Calcolo della curva standard:
•
Il coefficiente di estinzione del calibratore più alto dovrebbe essere compreso tra 1,0 e
2,5.
•
Il coefficiente di estinzione del calibratore più basso dovrebbe essere < 0,1.
•
La differenza tra questi due valori dovrebbe essere almeno 1,0.
•
La validità del saggio dovrebbe essere controllata sulla base dei valori ottenuti con i
controlli.
Esempio di curva standard
ADAMTS-13 INH - standard curve
2,5
2
OD 450nm
La data di scadenza riportata sull’etichetta è relativa alla conservazione della vial non aperta a
2-8°C. La stabilità dopo ricostituzione/apertura:
1,5
1
0,5
0
0
Prima di iniziare il saggio, tutti i componenti necessari devono essere portati a
temperatura ambiente.
2.
Preparazione del Washing Buffer: diluire 1 parte in volume del Washing Buffer
Concentrate con 9 parti in volume di acqua bidistillata (1+9). Miscelare bene! (Il Washig
Buffer diluito è il tampone utilizzato nei lavaggi). Si potrebbero formare dei precipitati
cristallini che si scioglieranno a 37°C in 10 minuti.
3.
Ricostituzione dei calibratori e dei plasmi controllo: i calibratori e i plasmi controllo sono
ricostituiti con 500 µl di acqua bidistillata e miscelati per 10 secondi dopo un tempo di
ricostituzione di 15 minuti (usare un Vortex Mixer). I reagenti ricostituiti vanno da un
aspetto limpido a leggermente torbido.
4.
Diluizione dei campioni: i campioni sono diluiti con il Buffer di incubazione (1+100);
diluire 1 parte in volume di campione con 100 parti in volume di Buffer di incubazione
20
1.
10 µL di campione + 1000 µL Idi buffer di incubazione
5.
Preparazione della soluzione di lavoro del coniugato (1+50): diluire 1 parte in volume del
coniugato con 50 parti in volume del Buffer di incubazione.
Per 8 pozzetti del test : mischiare 20 µL di coniugato con1000 µL di buffer di
incubazione.
40
60
80
100
120
anti ADAMTS-13 (Units/mL)
Misurazione delle concentrazioni dei campioni
•
Calcolare le concentrazioni dalla curva standard.
•
Se ci sono campioni con coefficiente d’estinzione più alto di quello del punto più
alto della curva, questi devono essere prediluiti con il Buffer di incubazione (1+1
o 1+3). La misura delle concentrazioni poi deve essere moltiplicata per il fattore
di diluizione 2 o 4 rispettivamente.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI/INTERVALLO DI REFERENZA
Campioni negativi: < 12 unità/ml
Valore soglia: 12-15 unità/ml
Campioni positivi: > 15 unità/ml
STANDARDIZZAZIONE
Gli standards sono calibrati con un plasma che ha livelli estremamente alti di IgG anti
ADAMTS-13. Una diluizione 1:200 di questo plasma di riferimento per definizione contiene una
concentrazione di anticorpi di 100 unità/ml. (Unità arbitrarie).
LETTERATURA
PERFORMANCE DEL SAGGIO
INCUBAZIONE
DEL
CAMPIONE
(reference 1,2)
LAVAGGI
(reference
1,3,4)
10 minuti
I reagenti di differenti lotti non devono essere mischiati.
La precisione e la performance, dipendono, tra le altre cose, dai seguenti fattori:
- miscelare tutte le componenti usate per la diluizione 10 secondi con il Vortex
Mixer.
- utilizzare i calibratori, i controlli e i campioni in duplicato.
- incubare alla temperatura indicata (RT: temperatura ambiente, 20…25°C).
- stretto rispetto dell’ordine di aggiunta dei composti nei pozzetti e dei tempi come
indicato.
- il tempo di incubazione del campione, di reazione del coniugato e del substrato
come indicato inizia dopo aver aggiunto l’ultimo campione. Il tempo di
incubazione non dovrebbe variare di più o meno un 5%.
- durante il tempo di incubazione e di reazione del coniugato, il tempo impiegato
per aggiungere i calibratori/controlli plasma/campioni e/o soluzioni dei coniugati
non deve superare i 60 secondi per ogni striscia del kit dell’ELISA (8 pozzetti).
- durante la reazione con il substrato e allo stopping, il tempo necessario per
l’aggiunta del substrato e/o della Stopping Solution non deve superare i 10
secondi per ogni striscia del kit dell’ELISA. Un ridotto tempo di pipettamento
potrebbe essere ottenuto utilizzando pipette ripetitive o pipette multicanale.
Ogni striscia del kit ELISA deve essere numerata con pennarello indelebile per
evitare ogni errore in caso di errato posizionamento nel telaio durante le varie
operazioni
Dopo l’ultimo lavaggio i pozzetti devono essere completamente aspirati, capovolti
e posti su carta da blotting, rimuovendo le gocce rimanenti colpendo
delicatamente gli stessi
La precisione del test è aumentata se si calcola la differenza tra la lettura a
lunghezza d’onda 450 nm e quella a 620 nm.
3.
-
100 µL
Inserire la Stopping solution nei pozzetti
MISURAZIONE
(reference 5)
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI CON IL KIT
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Aggiungere la Conjugate working solution
nei pozzetti, coprendo le strisce del test con
un film
Calibratori delle pipette, plasmi controllo,
campioni diluiti nei pozzetti del saggio;
coprire le linee del test con un film
Incubare a temperatura ambiente
60 minuti
Washing Buffer
3 x 200 µL
100 µL
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Fontana S, Hovinga JA, Studt JD et al. Plasma therapy in thrombotic thrombocytopenic purpura: review of the
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