FAMÍLIA DE KITS LABSCREEN
FAMÍLIA DE KITS LABSCREEN
Para detecção de anticorpos HLA usando a
tecnologia de Citometria de Fluxo
Instruções de Uso
APRESENTAÇÃO E COMPOSIÇÃO DA FAMÍLIA
Código
Descrição
LS1PRA
Kit Detec. Ac. Classe I Especificidades
LS2PRA
Kit Detec. Ac. Classe II Especificidades
LSM12
LS1A04
LS2A01
Kit Detec. Simultânea Ac. Classe I e II - Mistura de Pérolas
Classe I e Classe II
Kit Detec. Ac. Classe I Especificidades - Antígenos Únicos HLA
Classe I Combi - Grupo 4
Teste LabScreen de Detecção de Anticorpos de Antígenos
Únicos HLA de Classe II – Grupo 1
LS-AB2
LS-NC
LSMICA001
LSMUTR
Conjugado PE de cabra, anti-humano IgG para uso em
conjunto com kit LabScreen - LS-AB2
Soro controle Negativo para uso em conjunto com kit
LabScreen
Teste LabScreen de Detecção de Anticorpos de MICA
Antígenos Únicos e Especificidades
LABScreen Multi HLA Classe I e II e HNA - LSMUTR
USO PRETENDIDO
1
Os produtos LabScreen são fabricados para serem utilizados na detecção de
anticorpo HLA através da tecnologia de citometria de fluxo.
PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO
Os produtos LabScreen utilizam micropérolas revestidas com antígenos HLA
de classe I e de classe II e reagentes pré-otimizados para a detecção de anticorpos
HLA de classe I e de classe II em soro humano. Os produtos LabScreen utilizam o
Sistema de Ensaio Lambda Multi-Analítico de Pérolas (LABMAS – Lambda Array
Beads Multi-Analyte System), o qual caracteriza o analisador de fluxo LABScan 100,
para aquisição de dados e análise.
O teste Mixed (misturado) detecta a presença de anticorpo para antígenos
HLA de classe I e/ou de classe II.
O teste PRA pode detectar anticorpos e suas especificidades contra
antígenos HLA em cada painel LABScreen.
O ensaio de Antígenos Únicos (Single Antigen) permite a confirmação da
especificidade específica sugerida por um teste de PRA anteriormente realizado.
O soro de controle negativo é usado para estabelecer o valor de fundo
para cada pérola (bead) em uma bateria de testes.
Princípio
Os produtos LabScreen são utilizados em testes de detecção de anticorpo
que utiliza um painel de pérolas codificadas por cor, as quais são revestidas com
antígenos HLA purificados. Até 100 diferentes pérolas podem ser combinadas em
uma suspensão para um único teste.
O soro teste é primeiramente incubado com pérolas LabScreen. Qualquer
anticorpo HLA presente no soro teste ligasse aos antígenos e então são marcados
com R-Ficoeritrina (PE)-conjugado de cabra anti-humano IgG. O Analisador de
Fluxo LabScan 100 detecta a emissão fluorescente de PE de cada pérola, permitindo
quase uma aquisição de dados em tempo real. O padrão de reação do soro teste é
2
comparado à planilha de leitura lote-específico definindo a série de antígenos para
determinar o PRA e a especificidade HLA.
COMPONENTES FORNECIDOS
Código
Descrição
Componentes do produto
Mistura de Pérolas classe I LabScreen: 1 X
Kit Detec. Ac. Classe I
LS1PRA
Especificidades
125 µL / Tampão de lavagem LabScreen:
1 X 13 mL
3
Mistura de Pérolas classe I LabScreen: 1 X
Kit Detec. Ac. Classe II
LS2PRA
LSM12
Especificidades
1 X 13 mL
Kit Detec. Simultânea Ac.
Mistura de pérolas de classe I e de classe
Classe I e II - Mistura de
II LabScreen: 1 X 500 µL / Tampão de
Pérolas Classe I e Classe II
Lavagem LabScreen: 2 X 26 mL
Kit Detec. Ac. Classe I
LS1A04
125 µL / Tampão de lavagem LabScreen:
Especificidades - Antígenos
Pérolas antígenos únicos de classe I
LabScreen – Grupo 4: 1 X 125µL / Tampão
Únicos HLA Classe I Combi Grupo 4
de lavagem LabScreen: 1 X 13 mL
Teste LabScreen de Detecção
Pérolas antígenos únicos de classe II
LS2A01
de Anticorpos de Antígenos
Únicos HLA de Classe II –
LabScreen - Grupo 1: 1 X 125 µL /
Tampão de lavagem LabScreen: 1 X 13 mL
Grupo 1
Conjugado PE de cabra, antihumano IgG para uso em
LS-AB2
conjunto com kit LabScreen -
1 X 1 mL (liof.)
LS-AB2
Soro controle Negativo para
uso em conjunto com kit
Soro controle Negativo – 1 x 400µL
LS-NC
LabScreen
Teste LabScreen de Detecção
Pérolas antígenos únicos de MICA - Grupo
de Anticorpos de MICA
LSMICA001
1: 1 X 125 µL / Tampão de lavagem
Antígenos Únicos e
Especificidades
LabScreen: 1 X 13 mL
Mistura de pérolas de classe I e II e HNA
LSMUTR
LABScreen Multi HLA Classe I
e II e HNA - LSMUTR
LabScreen: 1 X 500 µL / Tampão de
Lavagem LabScreen: 1 x 52 mL
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
Instrumentos não fornecidos

Analisador Luminex (sua calibração deverá seguir as instruções do fabricante
Luminex)
4

Plataforma Luminex XY (acessório opcional para leitura automatizada de 96
amostras no analisador de fluxo LabScan 200).

Centrífuga (para placa PCR de 96 poços – 200µL cada poço)

Minicentrífuga para tubo de 1,5 mL

Agitador tipo Vortex

Agitador de placa ou plataforma de rotação

Para opção de trabalho com placa-filtro:
o
Manifold para vácuo
o
Placa com filtro
o
Bomba a vácuo com pressão inferior a 100mmHg
o
Agitador de placa ou plataforma de rotação
Materiais não fornecidos

Conjugado-PE de cabra anti-humano IgG (cat # LS-AB2 – da One Lambda)

PBS (filtrado)

Tubo de 1,5mL

Ponteira para micropipetas

Se o teste é realizado em placa de 96 poços:

o
Microplaca de 96 poços – 250µL
o
Selo para vedar a placa acima
Soro de controle negativo (cat # LS-NC da One Lambda – ou outro
equivalente – não contendo anticorpo HLA quando testado pelo método
LabScreen)

Placa filtro
CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, TRANSPORTE, LIMITES DE TEMPERATURA,
UMIDADE OU PROTEÇÃO À LUZ
Código
Informações sobre transporte
Temperatura de
5
armazenamento
Os produtos devem ser transportados
Toda a família
acondicionados com gelo seco.
Abaixo de -65°C
a. Uma vez descongeladas, as esferas não podem mais ser recongeladas,
devendo ser conservadas entre 2-8°C por até 3 meses.
b. Após a primeira utilização, conservar o Tampão de Lavagem entre 2- 8°C
por até 3 meses.
PRECAUÇÕES
a. Para uso em diagnóstico in vitro.
b. Referir-se à folha de dados de segurança para informação detalhada.
CUIDADO: Os reagentes de teste do LabScreen PRA contêm
Azida
sódica a 0,1% (NaN3), como preservativo. Em condições ácidas, Azida
sódica libera Ácido hidrazóico, um componente extremamente tóxico
Reagentes contendo Azida sódica devem ser diluídos em água corrente
antes de serem descartados. Essas condições são recomendadas para
evitar depósitos em encanamentos onde condições explosivas podem ser
desenvolvidas.
CUIDADO: todos os produtos de sangue devem ser tratados como
potencialmente infecciosos. A fonte do material do qual se originou este
produto foi dado como negativo quando testado de acordo com os
atuais requerimentos de testes do FDA. Nenhum método de teste
conhecido pode oferecer segurança que produtos derivados de sangue
humano não transmitirão agente infeccioso.
CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA
6
Quando trabalhar com soro humano, é recomendado o uso de EPIs
adequados para um laboratório clínico, bem como tomar todos os cuidados para
trabalho com sangue humano.
PROCESSO DE MEDIÇÃO
Coleta e Preparo da Amostra
a) O soro para teste pode ser fresco (de sangue mantido à temperatura
ambiente por menos de 24 horas). O soro separado deverá estar
congelado a -20°C ou abaixo dessa temperatura, e descongelado
imediatamente antes do ensaio. Entretanto, os grumos deverão ser
separados do soro de teste através de centrifugação (8000 – 10000 g por
10
min)
ou
por
filtração
(0,2
um)
antes
do
teste.
Qualquer
grumo/precipitado ou contaminação no soro poderá gerar resultados
inválidos.
b) O soro do teste não poderá ser aquecido inativado, pois pode dar um
fundo alto no teste.
c) O soro não diluído é, geralmente, usado para o teste. Entretanto, se uma
amostra de fundo alto é diluída para este ensaio, o soro de controle
negativo deverá ser testado na mesma diluição.
Procedimento do Teste
Para Efetuar o Teste em Tubo de Microcentrifugação de 1,5mL:
1. As pérolas LabScreen devem ser bem misturadas através de Vortex leve
ou por pipetagem repetitiva antes de ser usado.
2. Incubar 5 µL das pérolas LabScreen com 20 µL do soro teste em tubos
separados de 1,5 mL no escuro por 30 min a 20-25°C com suave
agitação.
3. Para cada bateria de teste, um soro de controle negativo deve ser
testado (código da One Lambda LS-NC) para estabelecer valores de
fundo.
7
4. Diluir tampão de lavagem 10X em água destilada para fazer uma solução
1X.
5. Adicione 1 mL de tampão de lavagem 1X a cada tubo com solução
pérola/soro e agite em Vortex. Centrifugue a 9300 g por 2 minutos.
Aspire e descarte o sobrenadante.
6. Repetir a etapa 5 duas vezes.
7. Diluir 1 µL do conjugado PE anti-humano IgG 100X (código da One
Lambda LS-AB2) com 99 µL de tampão de lavagem 1X para fazer uma
solução 1X.
8. Adicione 100 µL de conjugado PE anti-humano IgG a cada tubo. Agite
em Vortex e incube no escuro por 30 minutos a 20-25°C com agitação
suave.
9. Repetir a etapa 5 duas vezes
10. Adicionar 80 µL de PBS a cada tubo. A amostra está pronta para a
aquisição de dados e análises, ou pode ser armazenada a 2-5°C no
escuro por até 24 horas antes da análise.
Para Efetuar o Teste em Placa de 96 Poços:
Cuidado: o fechamento da placa de 96 poços deve ser feito com todo
cuidado e completamente para prevenir a contaminação da amostra poço-apoço. Feche a placa com selo adesivo pressionando-o contra cada anel dos
96 poços. Não reutilize os selos das placas. Utilize um selo fresco para cada
etapa que requeira a aplicação do selo adesivo na placa.
1. As pérolas LabScreen devem ser bem misturadas por suave agitação em
Vortex ou pipetagem repetitiva por diversas vezes antes do uso.
2. Incubar 5 µL das pérolas LabScreen com 20 µL do soro teste em cada
poço da placa de 96 poços no escuro por 30 minutos a 20 – 25°C com
agitação suave.
3. Para cada bateria de teste, um controle um soro controle negativo deve
ser testado (código da One Lambda LS-NC) para estabelecer valores de
background
8
4. Diluir tampão de lavagem 10X em água destilada para fazer uma solução
1X.
5. Depois da incubação, adicione 150 µL de tampão de lavagem 1X a cada
poço da placa. Cobrir com o selo da placa (código da One Lambda #
SSPSEA300) e agite em Vortex. Centrifugue a 1300 g por 5 minutos.
Aspire e descarte o sobrenadante.
6. Remover o tampão de lavagem dos poços da placa por aspiração a
vácuo ou por agitação (to flick).
7. Adicionar 200 µL de tampão de lavagem 1X a cada poço da placa. Cobrila com um novo selo e agitar em Vortex. Centrifugar a 1300g por 5
minutos.
8. Remover o tampão de lavagem dos poços da placa por aspiração a
vácuo ou agitação (to flick).
9. Repetir as etapas 7 e 8.
10. Diluir 1µL do conjugado PE anti-humano IgG 100X por teste (código da
One Lambda LS-AB2) com 99µL de tampão de lavagem 1X para fazer
uma solução 1X.
11. Adicione 100µL de conjugado PE anti-humano IgG a cada poço. Cobrir a
placa com o selo. Agite em Vortex e incube no escuro por 30 minutos a
20-25°C com agitação suave.
12. Centrifugar a 1300g por 5 minutos.
13. Remover o conjugado PE anti-humano IgG 1X de cada poço da placa
através de aspiração a vácuo ou agitação (to flick).
14. Repetir as etapas 7 e 8 duas vezes
15. Adicionar 80µL de PBS a cada poço. Cobrir com um novo selo e agitar
em vortex. A amostra está pronta para a aquisição de dados e análises,
ou pode ser armazenada a 2-5°C no escuro por até 24 horas antes da
análise.
Para Efetuar o Teste em uma Placa Filtro de 96 Poços:
9
1. Diluir tampão de lavagem 10X (código da One Lambda LSPWABUF) em
água destilada para fazer uma solução 1X (aproximadamente 3,2
mL/placa/lavagem).
2. Tampar qualquer poço da placa que não vá ser utilizado, o qual
permanecerá não utilizado durante o teste, com o selo de placa para
assegurar que os poços não utilizados permanecem secos. Pré-umedeça
os filtros na placa filtro dispensando 300µL de tampão de lavagem
dentro de somente aqueles poços que serão utilizados para o ensaio.
3. Incubar a placa por 10 minutos em agitador de placa a baixa
temperatura.
4. Adicione 5µL de pérolas LabScreen com 20 µL de soro teste por poço
teste da placa.
a. Agite em Vortex ou gentilmente agite com pipetagem para
misturar bem as pérolas LabScreen antes de usar.
b. Para cada bateria de teste, um soro controle negativo (código da
One Lambda LS-NC) deverá ser testado para estabelecer valores
de background
c. Durante as etapas de dispensação de pérolas e amostra, pressione
gentilmente as ponteiras contra a placa filtro para evitar ruptura
dos filtros.
5. Incubar no escuro por 30 minutos a 20-25°C com agitação suave.
6. Adicione 275 µL de tampão de lavagem por poço (menos pode ser
requerido baseado no volume da amostra e pérola já presentes no
poço.)
7. Ligue a bomba de vácuo. Não exceda a pressão de vácuo em
100mmHg! Pressione a placa firmemente no manifold a vácuo.
Certifique-se de que o líquido drena vagarosamente. Um rápido vácuo
causará perda das pérolas devido à aderência nos poros do papel de
filtro. Certifique-se que todos líquido foi drenado dos poços antes de
proceder à próxima etapa de lavagem.
8. Repetir etapas 6-7 acima por mais 4 vezes.
9. Adicione 100 µL de 1 do PE conjugado anti-humano IgG 1X a cada poço.
10
10. Incubar no escuro por 30 minutos a 20-25°C com agitação suave.
11. Repetir etapas 6-7 cinco vezes.
12. Adicione 80 µL de PBS 1X em cada poço.
13. Leia a amostra na máquina LabScan 100, ajustando a altura da sonda
caso seja necessário.
OBS.: qualquer um dos protocolos acima pode ser usado para um teste
combinado:
1. Para o teste Combinado de classe I e de classe II (OLI cat. # LS12PRA)
use 5 µL de cada suspensão de pérolas com 40µL do soro teste.
2. Os produtos cat.# LS1A03 e LS2A01 não podem ser combinados com
outros produtos.
3. Volumes iguais de pérolas de classe I e de classe II ou pérolas de
antígenos únicos grupo 1 e 2 podem ser misturadas primeiro. Então
use 10 µL da mistura de pérolas por teste.
Resultados
Aquisição de Dados:
1. Prepare a máquina LabScan 100 para aquisição de amostra e
calibração de acordo com o Manual do Usuário da Luminex.
2. Escolha um Template (gabarito) de acordo com a identificação de
catálogo do kit e número de lote.
I.
Os templates de aquisição estão disponíveis através do Cd da One
Lambda ou poderão ser baixados da internet através do web site
de download da One Lambda (http://download.onelambda.com)
II.
Para criar seu próprio template de aquisição, seguintes instruções
que se encontram no capítulo de Aquisição do Manual do Usuário
da Luminex.
3. Crie um nome de arquivo para as amostras que serão adquiridas.
4. Certifique-se de que todos os ajustes do template estão corretos. As
especificações do template são:
I.
Volume da amostra: 50 mL.
11
II.
Time-out da amostra: 80 segundos
III.
Doublet Discriminator Gate: 8000 (low limit) e 16000 (high limit)
IV.
Número e ID das da beads (pérolas) selecionadas de acordo com a
worksheet fornecida com o produto.
V.
Número de eventos mínimo: 100 por bead
VI.
Flow nate: Fast.
5. Entre com o nome das amostras (Cuidado: se a mesma amostra é
testada mais de uma vez, um nome diferente deverá ser aplicado).
6. Agora, a placa está pronta para ser lida
7. Coloque a placa dentro da plataforma xy e inclua o reservatório com
sheat fluid (líquido circulante).
8. Clique no botão START para iniciar a aquisição desta seção. Depois
que as amostras terminaram de correr, os dados deverão ser salvos
(clique na tecla SAVE) como arquivo do tipo CSV.
9. Lave a máquina 2 vezes com sheat fluid (fluido de análise) ao final de
cada seção.
Análise de Dados:
1. Cada reatividade de soro pode ser calculada pelo sinal mediano
fluorescente de cada perda revestida HLA depois correção para
ligação não específica à pérola controle negativo (NC#001). Todos os
dados são normalizados aos resultados obtidos usando um soro de
controle negativo (catálogo da OL1#LS-NC)
2. A reatividade da amostra testes é calculada baseada nos valores
medianos fluorescentes, os quais podem ser obtidos do arquivo –
CSV.
3. Para o LabScreen PRA ou LabScreen Single Antigen, a medicina
normalizada para cada pérola revestida HLA equivale os valores
medianos de cada pérola dividida pelo valor mediano de cada pérola
do controle negativo (NC).
12
a) Para o LabScreen Mixed, a mediana normalizada equivale ao
valor mediano das pérolas revestidas de Classe I ou Classe II
menos o valor mediano da pérola do controle negativo.
4. Os valores medianos background para cada pérola HLA e a pérola
NC são obtidos usando um soro controle negativo.
5. A força da reatividade anti-HLA é calculada pela razão de
background normalizado (NBG ratio).
CALIBRAÇÃO DO PROCESSO
Logo
após
a
instalação
ou
revisão/manutenção
técnica
e
durante
procedimentos de rotina, a calibração do Analisador Luminex deverá ser efetuada. A
calibração deverá ser feita diariamente, como parte da rotina de inicialização da
máquina e sempre que a temperatura d Cal Temp mostrada no monitor do sistema
indicar uma mudança de mais de 3 graus Celsius (°C). Os calibradores são
microesferas com propriedades de dispersão de luz conhecida e também com
intensidades conhecidas de fluorescência nas faixas dos comprimentos de onda de
Reporter (relator RP1), Classification 1 (classificação CL1), e Classification 2
(classificação CL2). O processo de calibração utiliza essas microesferas para ajustar
classe de voltagem para ótima e classificação consistente de microesfera e leituras
de relator (reporter). Os ajustes da última calibração realizada aplicam-se
automaticamente a qualquer nova sessão.
Esta é a aparência da Tela principal no Computador após ter sido ligado:
13
Para Calibrar o Instrumento:
1. Ligue o Analisador Luminex. Clique em Warmup na tela principal e, então,
clique em OK na caixa de diálogo que aparecerá. Depois de 30 minutos de
aquecimento (warmup), vá para a próxima etapa.
2. Clique em Prime na tela principal. Clique OK quando você quiser começar o
ciclo de prime (onde é deixado entrar o fluído de análise - sheath fluid) na
máquina, para a retirada de bolhas maiores.
3. Remova as microesferas calibradoras (Classification CAL1 e Reporter CAL2) de
seu local de estoque, ou seja, das temperaturas de 2-8°C. Agite os frascos
com as microesferas em Vortex na posição horizontal.
4. Dispense 5 gotas (aprox. 200 µL) da microesfera de calibração Classification
(CAL1) em um tubo identificado de 1,5 ml, e dispense 5 gotas (aprox. 200 µL)
da microesfera de calibração Reporter (CAL2) em outro tubo identificado de
1,5 ml.
5. Envolva os tubos contendo as microesferas com papel alumínio para protegêlas da luz. Permita às microesferas que sua temperatura chegue à
temperatura ambiente.
6. Clique em Alcohol Flush na tela principal. Utilize 1,2 mL de isopropanol a
70% ou etanol a 70% para o fluxo com álcool. Este fluxo remove qualquer
14
pequena bolha de ar que esteja presente no interior do sistema. Clique OK
quando estiver pronto para iniciar com o fluxo de álcool.
7. Clique em Calibrate na tela principal. A seguinte caixa de diálogo aparecerá:
8. Coloque o nome da pessoa que estiver efetuando a calibração no campo
solicitado.
9. Selecione
Product/Lot
Number
para
as
microesferas
de
calibração
Classification e na sequência para Reporter.
10. Clique OK. A caixa de diálogo abaixo aparecerá:
15
11. Coloque o tubo contendo a microesfera de calibração Classification no
suporte para amostra localizado na frente do aparelho.
12. Certifique-se
de
que
Classification
está
selecionado e, então, clique Start.
A barra de progresso mostrará o progresso
da calibração. A calibração deverá levar
menos que dois minutos. Se a posição no
monitor do sistema mudar para “Sample
Empty” antes da calibração se completar, a
mensagem
“Calibration
Failed”
aparecerá.
Click OK e comece o processo novamente.
Quando
a
calibração
acabar
para
as
microesferas de classificação, a mensagem
“Calibration Succeeded” aparecerá. Os ajustes e qualquer comentário que for
inserido serão incluídos no relatório de calibração.
16
13. Clique OK.
14. Coloque o tubo com as microesferas de calibração reporter (CAL2) no
suporte de amostras.
15. Selecione Reporter e clique em Start.
A barra de progresso lhe mostrará o progresso da calibração. A calibração
deverá levar menos que dois minutos. Se a posição no monitor do sistema
mudar para “Sample Empty” antes da calibração se completar, a mensagem
“Calibration Failed” aparecerá. Click OK e comece o processo novamente.
Quando a calibração acabar para as microesferas de classificação, a
mensagem “Calibration Succeeded” aparecerá. Os ajustes e qualquer
comentário que for inserido será incluído no relatório de calibração.
16. Clique OK.
Obs.: as microesferas de calibração são muito concentradas. Cada vez que o
instrumento for calibrado, ele deverá ser lavado com 4 ciclos de WASH utilizando o
fluído de circulação (Sheath Fluid). Notar que entre as microesferas de calibração,
deverá ser feita a lavagem por 3 vezes com o fluído de circulação.
CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS
Cálculos
As abreviações utilizadas nesta seção estão definidas abaixo:

NBG ratio  Razão do fundo normalizado, usado para determinar a força
de cada reação anti-HLA.

S#N  Valor fluorescente mediano amostra-específico para pérola #N.

SNC Bead  Valor fluorescente mediano amostra-específico para pérola
controle negativo.

BG#N  Valor fluorescente mediano do fundo do soro NC para pérola #N.

BGNC Bead  Valor fluorescente mediano do fundo do soro NC para
pérola do controle negativo.
17

NC Serum  Soro controle negativo (catálogo da One Lambda # LS-NC)
validade para um dado lote de pérola LabScreen.
1. Para LabScreen PRA ou LabScreen Single Antigen.
NBG Ratio =
S#N / SNC Bead
BG#N / BGNC Bead
2. Para LabSreen Mixed:
NBG Ratio
=
S#N / SNC Bead
BG#N / BGNC Bead
Determinação do Valor de Corte Positivo/Negativo
1. Para LabSreen PRA e LabSreen Mixed:
a) Selecione a razão NBG que dá um significante “Shith Over” valor de fundo
fluorescente quando o valor de fundo é obtido usando um soro controle
negativo em 3.5 testes duplicados. Se preferir, teste 5-10 amostras de
doadores do sexo masculino, não transplantados e que não tenham passado
por transfusão para obter um valor médio de fundo.
b) Valide o valor de corte usando de 5-10 amostras de alossoro referência com
especificidade de anticorpo HLA definidos. Os valores da razão NGB para as
reações de antígenos positivos esperados deverão estar acima do valor de
corte.
c) Reações positivo-negativas adicionais podem ser observadas. Se necessário,
ajuste o corte do ensaio LabScreen para combinar com a sensibilidade de
ensaio de detecção de anticorpo aceita anteriormente.
2. Para LabScreen Single Antigen:
18
a) Teste o soro controle negativo ou diversas amostras de soro negativo
usando o (1.a) acima.
b) Defina a faixa de trabalho:
- Working Range = NBG Ratio Maximum – NBG Ratio Minimum.
c) Defina os pontos de corte dentro de faixa de trabalho:
- Relative NBG Ratio cut-off = X% (Working Range) + NBG Ratio Minimum
onde X% = porcentagem definida pelo usuário do ponto de corte dentro da
faixa de trabalho positivo / negativo (1), área cinza (2), positivo fraco (4) e
positivo forte (8).
d) Ajuste o critério para definir reações positiva X negativa, por exemplo:
(1) Se [ NBG Ratio max/ NBG Ratio min ] > 8, então aplique o cálculo em 2C.
(2) Se [ NBG Ratio max/ NBG Ratio min ] < 8, e:
i – NBG Ratio max > 5, então razão NBG min deverá ser ajustada para a metade
do NBG Ratio max e o corte relativo da razão NBG deverá ser recomputada
(com em 2C) baseado no NBG Ratio min ajustado. As reações são então
classificados conforme o escore acima.
ii – NGB Ratio max < 5 então a reação do soro teste com aquela bead (pérola)
é negativa. Determina o escore de “1”.
e) Teste diferentes alossoros referência como no (1b) acima, usando a razão
NBG relativa para validar o corte.
(1) Estabeleça um corte de reatividade forte e fraca baseado na performance do
alossoro referência, relativo a um ensaio estabelecido.
19
(2) Pode ser útil colocar os valores da razão no histograma para a visualização
do padrão de reatividade HLA de cada soro.
(3) Sensitividades maiores ou menores podem ser obtidos pelo ajuste do corte.
Valores Esperados
A. LabScreen PRA Classe I ou Classe II
1. A força de reatividade do soro teste de cada pérola pode ser comparada
para distinguir reações forte positivas, fracas positivas e negativas. Reações
de
reatividade podem ser classificada dentro de diferentes faixas, se um
sistema de escova é desejado.
2. Nossos dados mostram que razões de NBG > 1.5 no teste LabScreen PRA
correlaciona bem com reações positivas pelo número de reações válidas
para aquele soro teste.
3. Para determinar a especificidade do anticorpo HLA entre com o escove de
reação dentro da planilha de leitura lote-específica para analisar o padrão de
reação.
B. LabSreen Mixed:
1. Faça a contagem das reações HLA de Classe I e Classe II separadamente, de
acordo com a força de reatividade do soro para cada conjunto de pérolas.
2. Se qualquer uma das pérolas no ensaio das misturas é positiva, então o
resultado deverá ser determinado como positivo.
3. Nossos dados mostram que razões de NBG > 2.2 no teste LabScreen mixed
correlaciona bem com reações positivas no LAT mixed.
C. LabSreen Single Antigen
1. O alossoro pode produzir razões de Sinal / Fundo que são maiores que
aquelas abtidas no ensaio PRA estabelecendo o corte do ensaio usando uma
razão realtiva do NBG (conforme em resultados, seção D-2C) é uma maneira
de normalizar dos dados.
20
2. Nossos dados mostram que um corte positivo / negativo ou razão NBG
calculada para cada soro teste dará resultados comparáveis ao ensaio
LabScreen PRA.
D. Orientações Gerais:
1. Cada contagem de beads deverá estar acima de 50. Uma contagem menor
de pérolas pode ser devido à pérola de amostra durante as etapas de
lavagens. Também pode ser devido à imprópria calibração ou entupimento
no LabScan 100. Baixa contagem de beads pode também ser causada por
pérolas fotobranqueadas que pulam para fora da região mapeada.
2. Valores do sinal são as médias de cada conjunto de pérolas vs. o soro teste.
Um soro controle negativo deveria ser testado com a mesma bateria de
amostras para estabelecer o valor (ou valores) do background para aquela
corrida de teste.
3. Soro controle negativa (Lat # LS-NC da One Lambda ou outro equivalente) é
recomendado. Usando qualquer outro soro controle negativo pode requerer
ajuste nos valores de corte.
4. Pérolas de controle negativo (Ag ID = NC) não são revestidos com
antígenos HLA. O valor médio pode variar junto com diferentes amostras de
soros com alto fundo. Isso deve ser sempre menor que 1500 e menor ou
igual que a metade do valor do PC (controle positivo).
5. Pérolas de controle positivo (Ag ID = PC) são beads (pérolas) revestidas com
IgG humano purificado. Ela deve se ligar ao anticorpo secundário para
produzir um sinal positivo. O valor do PC deverá estar acima de 500 e pelo
menos duas vezes o valor do NC.
E. Validação do Ensaio:
21
1. O valor de corte do sinal para fundo deve ser validado se um novo soro
controle negativo for usado.
2. Para um dado soro, o valor do PC/NC deve ser maior que 2. Um valor de
fundo da pérola NC para o soro teste, um sinal alto para a pérola HLA para
o controle NS, ou um sinal baixo do anticorpo secundário ou o Sistema
LabScan 100. Neste caso, os dados devem ser confirmados.
3. Cada usuário deve avaliar o desempenho do ensaio no seu laboratório para
validar os valores selecionados de corte.
LIMITAÇÕES DO PROCESSO
A. O soro que contém contaminantes ou agregados pode entupir o LabScan
100 e gerar dados incorretos. Agregados no soro teste devem ser removidos
por centrifugação ou por filtragem antes da realização do teste.
B. Temperatura ambiente onde o LabScan 100 está localizado pode afetar a
calibração da máquina. Se a temperatura ambiente muda, pode ser que a
máquina precise ser recalibrada. Consulte o manual do fabricante para
maiores informações.
C. A aquisição precisa de dados depende do desempenho apropriado do
LabScan 100. A máquina deve ser calibrada e mantida de modo apropriado.
No caso de lavagem insuficiência do sistema, agregado da amostra podem
causar entupimento na máquina e gerar dados inválidos.
D. Determinação da especificidade do anticorpo até limitada aos antígenos HLA
presentes em cada painel de pérolas. (Veja a planilha de leitura loteespecífica).
CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE
Recomenda-se que, a cada novo lote, sejam realizados testes com o uso
de soros com anticorpos cuja reatividade seja previamente conhecida, a fim de
22
avaliar a correta caracterização dos anticorpos, bem como a porcentagem do
painel reativo de anticorpo (PRA).
VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES
DEMOGRÁFICOS,
EPIDEMIOLÓGICOS,
ESTATÍSTICOS,
DESEJÁVEIS,
TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS
Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Usando os valores de referencia de corte em “Expected Values”, os ensaios
LabScreen têm fornecido resultados comparáveis aos resultados do FlowPRA da
One Lambda e aos ensaios da Lambda Antigen Tray.
Entretanto, os padrões de anticorpo HLA podem ser um pouco complexos.
Uma dada amostra teste pode conter diversas especificidades de anticorpos HLA de
Classe I e de Classe II, cada uma com diferente avidez; entretanto, nem todas as
especificidades serão reconhecidas em ensaios com menor sensitividade.
Portanto, cada laboratório deverá estabelecer e validar os cortes do ensaio
para seu próprio uso. Baseando-se em suas perícias em reconhecer os padrões
CREG HLA e um avaliação do desempenho do ensaio usando alossoro HLA com
especificidades definidas.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
The Luminex 200 User’s Manual, Luminex Corporation, PN 89-00002-00-005
R Pei, J-H Lee, T Chen S Rojo, and PI Terasaki. Flow Cytometric Detection of HLA Antibodies
Using a Spectrum of Microbeads. Human Immunology 60, 1293-1302 (1999)
23
R PEI, G WANG, C TARSITANI, S ROJO, T CHEN, S TAKEMURA, A LIU, J-H LEE. Simultaneous
HLA class I and Class II antibodies secrrening with Flow cytometry. Human Immunology 59,
313-322 (1998)
RA BRAY, DA SINCLAIR, L WIMOTH-HOSEY, C LYONS, P CHAPMAN, J HOLCOMB.
Significance of the flow cytometric PRA in the evaluation of patients awaiting renal
transplantation. Department of Pathology, Emory University, Atlanta, GA. ASHI Abstract,
1998.
IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
Website: www.biometrix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
One Lambda, Inc.
21001 Kittridge Street
Canoga Park – CA - EUA
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REGISTRO ANVISA
80298490004
RESPONSÁVEL TÉCNICA
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira
CRQ/PR: 09302336
REVISÕES
Revisão
Descrição da Alteração
Data
00
Elaboração
11/2006
Formatação, layout, produtos
descontinuados, alteração nas condições de
01
armazenagem e transporte, inclusão das
denominações comerciais de cada item da família,
02/2011
inclusão de número de registro e alteração de
Responsável Técnica
02
Alteração na apresentação comercial da família
02/2011
03
Alteração do DDG
09/2012
04
Revisão gramatical e ortográfica, formatação,
alteração de Responsável Técnica
12/2012
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