0208 B 57 plus Box

0208 B 57 plus Box
Código do Produto: 0208
HLA-B 57 plus
1.0
Typing Kit
0197
Dispositivo para utilização in vitro
Manual de Instruções
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
3060-197 cantanhede
portugal
tel + 351 231 410 946
fax + 351 231 410 947
e-mail [email protected]
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Versão1.4, Maio 2010.
0197
0197
biocant – centro de inovação em biotecnologia
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13. Hughes DA, Vilar FJ, Ward CC, Alfirevic A, Park BK, Pirmohamed M. Costeffectiveness analysis of HLA B*5701 genotyping in preventing abacavir
hypersensitivity. Pharmacogenetics. 2004;14:335-42.
14. Hughes AR, Mosteller M, Bansal AT, Davies K, Haneline SA, Lai EH, Nangle K, Scott
T, Spreen WR, Warren LL, Roses AD; CNA30027 Study Team; CNA30032 Study
Team. Association of genetic variations in HLA-B region with hypersensitivity to
abacavir in some, but not all, populations. Pharmacogenomics. 2004;5:203-11.
15. Gillespie GM, Stewart-Jones G, Rengasamy J, Beattie T, Bwayo JJ, Plummer FA, Kaul
R, McMichael AJ, Easterbrook P, Dong T, Jones EY, Rowland-Jones SL. Strong TCR
Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted
Immune Response in HIV-1 Infection. J Immunol. 2006 Sep 15;177(6):3893-902.
Índice
Apresentação…………………………………………………………………
4
Alterações e Melhoramento do produto……………………………
4
Controlo da Qualidade …………………………………………………… 5
Validação – Linhas Celulares……………………………………………
5
Componentes do HLA-B 57 plus 1.0 Typing Kit…………………
6
Protocolo de amplificação por PCR…………………………………… 7
Reagentes………………………………………………………… 7
Extracção de DNA……………………………………………… 7
Amplificação por PCR ………………………………………… 7
Parâmetros do programa de PCR………………………… 8
Protocolo de electroforese em gel de agarose…………………… 9
Preparação do gel a 2%……………………………………… 9
Electroforese……………………………………………………… 9
Esquema da placa HLA-B 57 plus 1.0 …………………………………10
Identificação da placa HLA-B 57 plus 1.0 ……………………………10
Folha de interpretação dos Resultados ……………………………… 11
Tabela de interpretação dos Resultados …………………………… 11
Guia de resolução de problemas ……………………………………… 12
Avisos e precauções ………………………………………………………… 13
Guia técnico …………………………………………………………………… 14
Garantia ………………………………………………………………………… 15
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Aviso de Garantia …………………………………………………………… 16
Declaração de Conformidade …………………………………………… 17
Folha de dados de segurança…………………………………………… 18
Referências……………………………………………………………………… 21
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Referências
Apresentação
Alguns subtipos do gene HLA-B*57 estão associados a uma
1.
Bunce M, O’Neill CM, Barnardo MCNM, Krausa P, Browning MJ, Morris PJ, Welsh KI.
Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5
& DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence-specific primers (PCR-SSP).
Tissue Antigens 1995; 46: 355-367.
2.
Bodmer JG, Marsh SG, Albert ED, Bodmer WF, Bontrop RE, Charron, Dupont B, Erlich
HA, Fauchet R, Bach B, Mayr WR, Parham P, Sasazuki T, Schreuder GM, Strominger
JL, Svejgaard A, Terasaki PI. Nomenclature for factors of the HLA System, 1996.
Hum Immunol 1997, 53: 98-128.
3.
Nomenclature for factors of the HLA System. Compiled by Steven G. E. Marsh for the
WHO
Nomenclature
Committee
for
Factors
of
the
HLA
System.
http://www.anthonynolan.com/HIG/nomenc.html
4.
Schaffer M, Olerup O. HLA-AB typing by polymerase-chain reaction with sequencespecific primers: more accurate, less errors, and increased resolution compared to
serological typing. Tissue Antigens. 2001; 58: 299-307.
5.
Phillips E, Mallal S. Drug hypersensitivity in HIV. Curr Opin Allergy Clin Immunol.
2007;7:324-30.
6.
Waters LJ, Mandalia S, Gazzard B, Nelson M. Prospective HLA-B*5701 screening and
abacavir hypersensitivity: a single centre experience. AIDS. 2007;21:2533-4.
7.
Mallal S, Nolan D, Witt C, Masel G, Martin AM, Moore C, Sayer D, Castley A, Mamotte
C, Maxwell D, James I, Christiansen FT. Association between presence of HLAB*5701, HLA-DR7, and HLA-DQ3 and hypersensitivity to HIV-1 reverse-transcriptase
inhibitor abacavir. Lancet. 2002;359:727-32.
8.
Vilar FJ, Naisbitt DJ, Park BK, Pirmohamed M. Mechanisms of drug hypersensitivity in
HIV-infected patients: the role of the immune system. J HIV Ther. 2003;8:42-7.
9.
Lucas A, Nolan D, Mallal S. HLA-B*5701 screening for susceptibility to abacavir
hypersensitivity.J Antimicrob Chemother. 2007;59:591-3.
progressão lenta da doença em doentes infectados pelo HIV-1,
particularmente o alelo B*5701 em caucasianos e B*5703 em
africanos. A presença deste alelo (B*5701) tem sido também
fortemente associado com a hipersensibilidade relacionada com
ABACAVIR.
O HLA-B*57 tem vindo também a ser associado a infecção pelo HCV
e Psoríase.
Este kit contém tiras com misturas de primers desidratadas e PCR
Master Mix para efectuar a identificação do alelo HLA-B5701.
Alterações e melhoramento do Produto
O kit HLA-B*57 Single está constantemente a ser actualizado, ao nível
da sua especificidade e interpretação, de modo a incluir novas
associações a doença que venham a ser descritas. Este produto pode
também ser melhorado de modo a aumentar o seu rendimento.
As alterações, adições ou modificações de primers, em relação ao lote
anterior estão detalhadas na tabela abaixo:
Tubo
N/A
Primers
motivo
10. Chui CK, Brumme ZL, Brumme CJ, Yip B, Phillips EJ, Montaner JS, Harrigan PR.A
simple screening approach to reduce B*5701-associated abacavir hypersensitivity on
the basis of sequence variation in HIV reverse transcriptase. Clin Infect Dis.
2007;44:1503-8.
11. Mallal S, Phillips E, Carosi G, Molina JM, Workman C, Tomazic J, Jägel-Guedes E,
Rugina S, Kozyrev O, Cid JF, Hay P, Nolan D, Hughes S, Hughes A, Ryan S, Fitch N,
Thorborn D, Benbow A; PREDICT-1 Study Team. HLA-B*5701 screening for
hypersensitivity to abacavir. N Engl J Med. 2008;358:568-79.
12. Sun HY, Hung CC, Lin PH, Chang SF, Yang CY, Chang SY, Chang SC. Incidence of
abacavir hypersensitivity and its relationship with HLA-B*5701 in HIV-infected
patients in Taiwan. J Antimicrob Chemother. 2007;60:599-604.
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21/24
Folha de Dados de Segurança (3/3)
Material Safety Data Sheet (MSDS)
Controlo de Qualidade
Foram usadas amostras de DNA de 3 linhas celulares constantes do
12. Informação ecológica
Não existem dados disponíveis.
SSOP Panel do 13th International Histocompatibility Workshop para
verificar a especificidade das misturas de primers deste kit.
13. Informação sobre a eliminação de resíduos
Elimine o material de acordo com toda a regulamentação aplicável (os
resíduos devem ser devidamente tratados e/ou incinerados).
Nome do Workshop
IHW 09273
IHW 09052
IHW 09398
14. Informação sobre o transporte
No transporte dos Kits devem estar a seguradas as temperaturas, não
devendo ultrapassar os 25ºC. A duração do transporte não deve ser superior a
3 dias, de modo a garantir que todos os componentes do Kit cheguem em
perfeitas condições aos seus destinatários.
Designação
LADA
DBB
FH18
15. Contactos Úteis
Não foram registados Falsos positivos ou falsos negativos.
Número Nacional de Emergência: 112
Centro de Informação Anti-Venenos: 808 250 143
O controlo negativo pode detectar contaminação cruzada com
16. Outras informações
produtos de PCR.
As informações a cima disponíveis são baseados no nível de conhecimento
actual, devendo ser utilizado apenas como guia. A geneBOX - R&D Diagnostic
Tests não se responsabiliza por qualquer dano causado pela manipulação
inapropriada ou pelo contacto com os referidos produtos.
Validação - Linhas Celulares
Kit de tipagem por PCR-SSP HLA-B*57 plus
Tipagem celular
Linha celular
HLA-A*
HLA-B*
0202;8001
0702; 5703
9273
LADA
9052
DBB
020101;
9398
FH18
7401;3601
Poços positivos
HLA-Cw*
0701; 0802
1a, 1b, 1c, 1e, 1g
5701
0602
1a, 1b, 1c, 1d, 1g
5301;5703
0401;0701
1a, 1b, 1c, 1e, 1g
Para mais esclarecimentos, por favor contactem com o apoio
técnico para o
+351 231 410 946
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Componentes do HLA-B57 plus Typing Kit
Folha de Dados de Segurança (2/3)
Material Safety Data Sheet (MSDS)
6. Protecção pessoal.
Protecção das mãos: use luvas apropriadas, resistentes a químicos.
Protecção dos olhos: recomenda-se o uso de óculos de protecção química.

+
Placas de tipagem de HLA- B 57 (48 tipagens)
7. Manipulação e armazenamento
16 Placas (3 amostras cada) (conservar de -15 ºC a -30 ºC)

Mistura de reacção (com Taq Polimerase)
16 X 80 µl

(conservar de -15ºC a -30ºC)
Selantes de Placas
48 Cápsulas selantes

Manual de instruções
1 Manual de Instruções
+
com pares de primers específicos desidratados (6 pares de primers
específicos; um controlo positivo e 1 controlo negativo por amostra).
Componentes da PCR Master Mix
Nucleótidos:
concentração final de cada dNTP é 600 µM
Tampão da PCR:
concentrações finais são 3,3x NH4, 2,0 mM MgCl2 e 0,4 u/µl
Taq DNA polimerase, pH 8.3.
Glicerol:
concentração final é 16,6%
Vermelho de cresol:
concentração final é de 300µg/ml
6/24
Manipulação: evite o contacto directo com a substância.
Armazenamento: armazene à temperatura aconselhada, proteja do contacto
com a luz.
Danificação da embalagem protectora: rejeitar o constituinte contido na
embalagem.
8. Perigos
Os componentes da mistura de reacção podem ser perigosos se inalados,
ingeridos ou absorvidos pela pele. Este material pode causar irritação da pele,
dos olhos e do tracto respiratório. A ingestão de grandes quantidades desta
mistura pode causar dores de estômago, vómitos ou diarreia.
9. Medidas de Primeiros Socorros
No caso de contacto com os olhos, deve lavar imediatamente os olhos com
água abundante por cerca de 15 minutos. Deve consultar o seu médico.
No caso de contacto com a pele, deve lavar imediatamente a zona afectada
com água corrente e sabão. Lave a roupa contaminada antes da sua utilização.
No caso de ingestão, lave a boca com água abundante. Deve contactar o seu
médico se necessário.
No caso de inalação, mudar a vítima para um local arejado. Se se encontrar
inanimado aplique respiração artificial. Se apresentar dificuldades respiratórias
aplique oxigénio. Deve consultar o seu médico.
10. Medidas a tomar em caso de incêndio
Meios de extinção: Água, dióxido de carbono, pó químico seco ou espuma
apropriada.
Meios de extinção não aconselhados: não existem restrições conhecidas.
Perigos específicos de exposição: em caso de incêndio podem emitir
fumos tóxicos de dióxido e monóxido de carbono, nitrogénio, fósforo, cloreto
de hidrogénio, e gás hidrogénio.
Equipamento especial de combate ao incêndio: quando são libertadas
grandes quantidades de substância trabalhe apenas com protecção adequada
para olhos e pele.
11. Medidas a tomar no caso de derrame acidental
Precauções pessoais: evite o contacto directo com a substância.
Limpeza: limpe normalmente a área afectada, não são necessários cuidados
adicionais.
Protecção da pele: use uma bata de laboratório.
19/24
Folha de Dados de Segurança (1/3)
Material Safety Data Sheet (MSDS)
Protocolo de amplificação por PCR
Reagentes
Produtos de tipagem SSP da geneBOX TM
Esta folha de dados de segurança é aplicável a todos os produtos de tipagem
por PCR-SSP da geneBOXTM.

Amostra de DNA (100-200 ng/µl)

PCR Master Mix
1. Produtos Químicos e Identificação da Companhia

Água bi-destilada estéril (não fornecida)
Data de realização:
Grupo do produto:
Manufacturação:
tel/fax:
e-mail:
Maio 2010
Produtos de tipagem SSP da geneBOXTM
geneBOX - R&D Diagnostic Tests,
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
3060-197 cantanhede, portugal
+351 231 410 946/ +351 231 410 947
[email protected]
2. Composição e Informação sobre os reagentes
Componente
Placa
Mistura de reacção
Químico
Acido Desoxiribonucleico
Vermelho de Cresol
Desoxiribonucleótidos
Tampão NH4
Cloreto de Magnésio
Vermelho de Cresol
Glicerol
Taq DNA Polimerase
Nome vulgar
Oligonucleótido
Nucleótidos
MgCl2
Extracção de DNA
Para a tipagem por SSP é necessário DNA extra puro. Recomenda-se
que o isolamento de DNA seja efectuado utilizando kits de extracção
com marcação CE, que garantam um rácio DO 260/280 maior do que
1.6 e uma concentração entre 100ng – 200 ng/µl.
Alternativamente, o DNA pode ser extraído utilizando sais de Brometo
de Trimetilamonia (DTAB/CTAB) ou por salting out, dissolvendo-o em
Tampão TE. Devem ser asseguradas o mesmo nível de DO e de
concentração.
NÃO UTILIZE SANGUE HEPARINIZADO COM ESTE MÉTODO
Amplificação por PCR
Taq
1.
Agite brevemente os tubos de DNA e da mistura de reacção.
2.
Junte:
3. Propriedades físico-químicas:
Componente
Placa
Mistura de reacção
Aspecto
seco, no fundo do poço
líquido
Cor
vermelho
vermelho/rosa
4. Informação Toxicológica
Químico
Glicerol
Toxicidade
LD50= oral 4090 mg/kg (ratinho)
LD50= oral 12600 mg/kg (rato)
LD50= oral 1480 mg/kg (humano)
Odor
nenhum
nenhum
25 µl da PCR Master Mix,

50 µl de dd H2O
num tubo de 0,7 ml ou 1,5 ml.
3.
Agite vigorosamente durante 15s.
4.
Pipete 10 µl da mistura para o controlo negativo.
5.
Adicione á mistura de reacção, 7 µl da amostra de DNA (conc.
5. Estabilidade e reactividade
Condições a evitar: Calor e humidade.
Incompatibilidades: Bases e agentes oxidantes fortes.

100-200 ng / l).
6.
Agite vigorosamente durante 15s.
7.
Pipete 10 µl da mistura para cada um dos restantes 7 poços.
8.
Repita os passos anteriores para as restantes amostras de DNA
para completar a placa de tipagem.
9.
Sele a placa de tipagem com as respectivas tampas e ponha-a
num termociclador de 96 poços.
18/24
7/24
Declaração de Conformidade
Parâmetros do programa PCR
Nome do Produto: HLA-B 57 plus
Numero do Produto: GB.03.05
Passo
Temperatura
Tempo
Ciclos
Denaturação
96 ºC
1 min
1
Denaturação
Emparelhamento
Extensão
96 ºC
70 ºC
72 ºC
25 seg
45 seg
30 seg
5
Denaturação
Emparelhamento
Extensão
96 ºC
65 ºC
72 ºC
25 seg
45 seg
30 seg
21
Denaturação
Emparelhamento
Extensão
96 ºC
55 ºC
72 ºC
25 seg
1 min
2 min
4
Extensão
72 ºC
10 min
1
Guardar
(opcional)
4 ºC
25 seg
1
Utilização: HLA-B*57 teste de alelos e associação a doença.
Produção:
geneBOX - R&D Diagnostic Tests,
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
3060-197 cantanhede, portugal
Nós, geneBOX - investigação e desenvolvimento de testes de
diagnóstico, indubitavelmente declaramos que este produto, ao qual
se relaciona esta declaração de conformidade, está em conformidade
com os seguintes documentos normativos, ISO 9001:2008 e ISO
13485:2004. Seguindo ainda, as indicações da Directiva Europeia
98/79/CE sobre dispositivos médicos de diagnóstico in vitro, Anexo II
lista B, conformidade de acordo com o Anexo IV, transposto para as
leis nacionais dos estados membros da União Europeia.
A ficha e os documentos técnicos deste produto são mantidos na
geneBOX, biocant, centro de inovação em biotecnologia, 3060-197
Cantanhede, Portugal.
Organismo Notificador: TÜV Rheinland Product Safety GmbH, TÜV
Rheinland Group, Am Grauen Stein 51105 Köln/Cologne - Germany
(Organismo notificador número: 0197)
10. No final da PCR guarde a placa a 2-8 ºC.
11. Detecte os produtos do PCR com uma electroforese em gel de
agarose a 2%.
12. Use a
Tabela de
interpretação de
resultados para
interpretar os resultados.
Sandra Balseiro
Directora Técnica
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17/24
Aviso de garantia
geneBOX –investigação e desenvolvimento de teste diagnósticos
responsabiliza-se, perante os seus clientes, pelos defeitos no material
e componentes dos seus produtos aplicados em condições normais.
Os produtos da empresa que apresentam esta garantia devem ser
substituídos, sem encargos para o cliente.
Esta garantia aplica-se só para produtos que sejam manipulados e
armazenados de acordo com as especificações e recomendações de
utilização.
As reclamações devem ser enviadas, por escrito, directamente para a
geneBOX e devem ser acompanhadas por uma cópia da guia de
transporte ou factura do produto.
Este produto não pode ser reformulado, reembalado ou revendido em
nenhuma forma sem o expresso consentimento da geneBOX investigação e desenvolvimento de teste diagnósticos.
Protocolo de electroforese em gel de agarose
Preparação do gel de agarose a 2%
1.
Dissolver 4 gramas de pó agarose em 200 ml de tampão TAE
1X.
2.
Dissolver completamente a agarose aquecendo-a no microondas.
3.
Arrefeça o gel até, aproximadamente, 50ºC.
4.
Adicione pelo menos 20 µl de brometo de etídio++ (10 mg/ml)
ou de Sybr Safe (10000x concentrado à agarose). Agite até
estar completamente incorporado.
5.
Numa superfície nivelada, monte a placa do gel com 96 poços.
6.
Verta uma camada de gel com cerca de 5mm.
7.
Deixe o gel arrefecer.
++
Atenção este reagente é um forte agente mutagénico (leia atentamente a MSDS do
produto).
Electroforese
1.
Submirja o gel na tina de electroforese com tampão TAE 1X.
2.
Remova os pentes com cuidado do gel.
3.
Adicione 10 µl do produto de PCR em cada poço.
4.
Ligue a tina de electroforese à corrente com uma voltagem média
(115V).
5.
Deixe a electroforese correr por cerca de 20 minutes, ou até o
corante estar a 2/3 da linha.
6.
Ponha o gel no transiluminador.
7.
Fotografe o gel e identifique-o.
8.
Use a Folha de interpretação de resultados para interpretar
os resultados.
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Esquema da tira HLA-B 57 plus 1.0
Garantia
geneBOX – investigação e desenvolvimento de teste diagnósticos
garante que os primers presentes no kit de tipagem HLA-B 57 plus
apresentam as especificidades dadas nas folhas e tabelas de
interpretação de resultados do produto.
Direcção da pipetagem
NC
PC
*
1
*
NC
PC
2
NC
PC
3
* A numeração pode diferir de placa para placa:
O nº 1 pode ser 4, 7, 10
O nº 2 pode ser 5, 8, 11
O nº 3 pode ser 6, 9, 12
Identificação da Placa HLA-B*57 Plus Box 1.0
Posição
HLA-B*57
1a
5701-14
1b
5701-14 except 5708; 5710; 5712
1c
5701-14 except 5705; 5706; 5711
1d
5701; 5706; 5708; 5710; 5711; 5714
1e
5703 and 5707
1f
5714
1g
Controlo positivo
1h
Controlo negativo
10/24
*
1. Placa de Tipagem
Armazenamento a -20ºC, os primers desidratados permanecem
estáveis durante 12 a 19 meses a partir da data de produção (ver
validade do lote na embalagem).
Armazenamento a 4ºC, os primers desidratados permanecem estáveis
durante 12 meses a partir da data de produção.
À temperatura ambiente, os primers desidratados permanecem
estáveis durante 3 a 4 semanas a partir da data de recepção.
Quando o selante é removido os primers desidratados permanecem
estáveis durante 2 dias, no máximo, desde que não humedeçam.
2. Mistura de Reacção
Armazenamento a -20ºC, a mistura de reacção permanece estável
durante 18 meses a partir da data de produção (ver validade do lote
na embalagem).
Armazenamento a 4ºC, a mistura de reacção permanece estável
durante 15 dias a partir da data de recepção.
À temperatura ambiente, a mistura de reacção permanece estável
durante 3 dias a partir da data de «recepção.
A mistura de reacção nunca deve ser deixada ou armazenada com a
tampa aberta.
3. DNA
O DNA extraído por salting out ou por qualquer outro método deve
ser armazenado a 4ºC ou -20ºC. Ao optar pela congelação das
amostras,
devem
ser
evitadas
ciclos
repetidos
de
congelação/descongelação, de modo a impedir a degradação da
amostra.
As amostras de DNA armazenadas em dH2O permanecem estáveis
durante, pelo menos, 4 semanas (a 4ºC) ou 2 anos (a -20ºC).
As amostras de DNA armazenadas em tampão TE permanecem
estáveis durante, pelo menos, 2 anos (a 4ºC) ou 5 anos (a -20ºC).
15/24
Folha de interpretação de Resultados
Guia Técnico
Posição
1. Pureza e Concentração do DNA
Para obter bons resultados com o HLA-B 57 plus 1.0 Typing KitTM a pureza da
amostra de DNA é crítica. Ter uma amostra pura significa obter uma razão
260nm/280nm de DO superior a 1.6 e uma porção de DNA superior a 9.4 kb.
A elevada degradação do DNA ou uma razão 260nm/280nm inferior a 1.5
requer uma nova extracção de DNA.
Cada amostra de DNA deve ter aproximadamente 100 a 200 ng/µl.
Concentrações elevadas de DNA provocam um declínio considerável na
especificidade da PCR.
Recomenda-se o uso de qualquer kit de extracção de DNA que apresente
marcação CE, de modo a obter um DNA extra puro.
HLA-B 57
1a
2a
3a
5701-14
1b
2b
3b
5701-14 excepto 5708; 5710; 5712
1c
2c
1d
2d
1e
2e
1f
2f
1g
2g
3c
5701-14 except 5705; 5706; 5711
3d
5701; 5706; 5708; 5710; 5711; 5714
2e
5703 e 5707
2f
5714
2g
Controlo Positivo
1h
2h
2h
Controlo negativo
DNA 1
DNA 2
DNA 3
Banda
específica
380
Banda
Controlo**
790
225
790
165
790
165
790
155
790
185
790
790
_
_
_
2. Taq Polimerase
O HLA-B 57 plus 1.0 Typing KitTM foi intensivamente testado utilizando a Taq
da Reagente 5 (Reagente 5, Lisboa, Portugal).
3. Mistura de reacção
Para uma boa performance da tipagem com o HLA-B 57 plus 1.0 Typing KitTM
é obrigatória a utilização da PCR Master Mix fornecida com o Kit.
**Control primer pares match with non-allelic sequences. The internal positive control
primer pairs amplify segments of the HLA-DRB1 gene, giving rise to 1600 base pair
fragments and 796 base pair fragment.
In the presence of the specific band amplification the control band intensity often
decreases.
The PCR reaction is only valid in the presence of control band or, in some cases, in the
presence of the specific band.
In the absence of the control band, please repeat the typing.
4. Procedimentos de amplificação
No fim da PCR, examine o grau de evaporação e de condensação da mistura
de reacção da PCR. Se as perdas de volume forem superiores a 20% não
devem ser validados os resultados obtidos. De forma a prevenir esta situação
devem adicionar previamente óleo mineral à mistura de reacção ou utilizar um
adaptador de silicone para placas de 96. Também se deve ter em atenção a
temperatura de aquecimento do aparelho. Se a temperatura de aquecimento
não for suficiente vão se verificar problemas de condensação.
Tabela de Interpretação de resultados
Poço nº
Associated with disease
1a
1b
1c
1d
Treatment and clinical
+
+
+
+
+
+
symptoms (HLA-B*5701)
5. Termociclador
Recomenda-se utilização de qualquer Termociclador que apresente as
seguintes características:
- “heating rate” superior a 2.5ºC/sec; “cooling rate” superior a 1.5ºC/sec;
gama de temperatures 4-100ºC; uniformidade de temperaturas ±0.5ºC;
“heated lid” superior a 100ºC.
No association
(HLA-B*5706; 5711) 5-14
No association
(HLA-B*5708; 5710) 5-14
(HLA-B*5714) 5-14
Como especificado na embalagem
+351 231 410 946
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Association in Africans,
No association in Caucasoid
Se os problemas persistirem, por favor contactem com o
apoio técnico para o
1f
5-14
No association
6. Validade
1e
(HLA-B*5703)
+
14, 15
+
HLA-B57 NEGATIVO
+
+
+
14/24
11/24
Guia de resolução de problemas
PROBLEMAS
POSSIVEIS CAUSAS
SUGESTÕES
Verifique a qualidade e concentração do DNA
Concentração da amostra de DNA
baixa
Bandas controlo e
específicas fracas
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Presença de inibidores da Taq
polimerase nas amostras de DNA
Presença de inibidores da Taq
polimerase nas amostras de DNA
Os controlos internos
falharam em diversos
poços
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
- Deve sempre utilizar-se equipamentos específicos para cada area de trabalho
(preparação de amostras; pré-amplificação amplificação e pós-amplificação).
Repurifique a amostra de DNA
- Todos os equipamentos utilizados na área de pós-PCR não devem sais desta zona.
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Repita a tipagem utilizando um adaptador de
silicone para placas de 96 e/ou adicione óleo
mineral.
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Verifique a qualidade e concentração do DNA
Amostra de DNA muito concentrada
Dissolva o DNA em ddH2O de forma a obter a
concentração exacta
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Limpe a zona de trabalho
Detecção de mais de dois
alelos específicos
Trabalhe em zonas Pré e Pós-PCR separadas
Contaminação com outros produtos
de PCR ou outras amostras de
DNA durante a preparação do PCR
Utilize batas distintas para a zona Pré e Pós-PCR
Mude de luvas frequentemente
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Reextraia a amostra de DNA de material fresco
Degradação da amostra de DNA
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Verifique a qualidade e concentração do DNA
Esfregaço de bandas
Amostra de DNA muito concentrada
Dissolva o DNA em ddH2O de forma a obter a
concentração exacta
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Problemas com tampão de
electroforese:
Fora de prazo ou composição errada
12/24
- Separe fisicamente as áreas de pré-PCR e de pós-PCR.
- O fluxo Laboratorial deve ser sempre unidireccional da área pré-PCR para a área
pós-PCR.
Reextraia a amostra de DNA de material fresco
Degradação da amostra de DNA
A amplificação por PCR permite-nos obter milhões de cópias de DNA a partir de
uma pequena quantidade de amostra. Infelizmente isto também é verdade para o
DNA contaminante, que pode comprometer performance da nossa reacção.
Consequentemente, práticas laboratoriais específicas podem evitar a presença de
amplificações inespecíficas. Em baixo encontram-se descriminadas as
recomendações da Genebox:
Repurifique a amostra de DNA
Verifique a selagem das placas
Produtos de amplificação secos
Falsos negativos de uma
banda específica com o
controlo interno normal
Reextraia a amostra de DNA ou tente não
adicionar água à mistura de reacção
Avisos e precauções
Use um tampão recomendado novo
- Utilize micropipetas, luvas e batas específicas para cada área.
- Utilize preferencialmente luvas sem talco (uma vez que o talco pode inibir a
reacção de PCR).
- Utilize pontas de filtro de forma a minimizar contaminações cruzadas.
- Verifique periodicamente as micropipetas de forma a assegurar a variação de
pipetagem inferior a 5%.
- Utilize micropipetas adaptadas a cada volume de pipetagem.
- Verifique periodicamente os termocicladores, de forma a assegurar a variação de
temperaturas inferiores a 1%.
- Abra e feche os reagentes com cuidado. Depois de utilizar armazene os restantes
componentes do kit às temperaturas recomendadas devidamente fechados.
- Não utilize o kit com a validade expirada.
- Os componentes dos kits são resistentes às temperaturas de armazenamento
indicadas. O armazenamento dos kits a temperaturas não recomendadas podem
levar à rupturas no material e contaminação dos reagentes dos kits.
- Os materiais plásticos fornecidos neste kit são resistentes à gama de temperaturas
de utilização e armazenamento recomendadas. A sua utilização em gamas distintas
de temperaturas pode causar rupturas impossibilitando a utilização normal do kit.
- Verifique a concentração e qualidade de todas as amostras de DNA antes de
utilizar este kit.
Instruções de gerais de segurança no laboratório:
- Não coma, beba ou fume dentro do laboratório.
- Utilize sempre luvas descartáveis e mude-as com frequência.
- Utilize batas limpas e proteja os olhos (sempre que se justifique).
- Lave as mãos antes e depois de qualquer manipulação de amostras ou reagentes.
- Lave a área de trabalho antes e depois de qualquer manipulação.
- Não pipete com a boca.
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