0406 HLA-DQ Box

0406 HLA-DQ Box
Código do Produto: 0406
HLA-DQ single Box
1.0
Typing Kit
Dispositivo para utilização in vitro
Manual de Instruções
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
3060-197 cantanhede
portugal
tel + 351 231 410 946
fax + 351 231 410 947
e-mail [email protected]
www.genebox.com
p24/24
Versão1.6, Maio de 2010.
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
3060-197 cantanhede
portugal
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
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p2/24
p23/24
Referências
1. Bunce M, O’Neill CM, Barnardo MCNM, Krausa P, Browning MJ, Morris PJ,
Welsh KI. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1,
DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising
sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens 1995; 46: 355-367.
2. Bodmer JG, Marsh SG, Albert ED, Bodmer WF, Bontrop RE, Charron,
Dupont B, Erlich HA, Fauchet R, Bach B, Mayr WR, Parham P, Sasazuki T,
Schreuder GM, Strominger JL, Svejgaard A, Terasaki PI. Nomenclature for
factors of the HLA System, 1996. Hum Immunol 1997, 53: 98-128.
3. Nomenclature for factors of the HLA System. Compiled by Steven G. E.
Marsh for the WHO Nomenclature Committee for Factors of the HLA
System. http://www.anthonynolan.com/HIG/nomenc.html
4. Schaffer M, Olerup O. HLA-AB typing by polymerase-chain reaction with
sequence-specific primers: more accurate, less errors, and increased
resolution compared to serological typing. Tissue Antigens. 2001; 58: 299307.
Índice
Apresentação…………………………………………………………………
4
Alterações e Melhoramento do produto……………………………
4
Controlo da Qualidade …………………………………………………… 5
Validação com linhas celulares ………………………………………… 6
Componentes do HLA-DQ Single 1.0 Typing Kit…………………… 7
Protocolo de amplificação por PCR…………………………………… 8
Reagentes………………………………………………………… 8
Extracção de DNA……………………………………………… 8
Amplificação por PCR ………………………………………… 8
Parâmetros do programa de PCR………………………… 9
Protocolo de electroforese em gel de agarose…………………… 10
Preparação do gel a 2%……………………………………… 10
Electroforese……………………………………………………… 10
Esquema da placa HLA-DQ single 1.0 ……………………………… 11
Identificação da placa HLA-DQ single 1.0 ………………………… 11
Folha de interpretação dos Resultados……………………………… 12
Tabela de interpretação dos Resultados …………………………… 12
Guia de resolução de problemas ……………………………………… 13
Avisos e precauções………………………………………………………… 14
Guia técnico…………………………………………………………………… 15
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
3060-197 cantanhede
portugal
Garantia………………………………………………………………………… 16
tel + 351 231 410 946
fax + 351 231 410 947
e-mail [email protected]
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Folha de dados de segurança…………………………………………… 19
p22/24
Aviso de Garantia…………………………………………………………… 17
Declaração de Conformidade …………………………………………… 18
Referências……………………………………………………………………… 22
p3/24
Folha de Dados de Segurança (3/3)
Material Safety Data Sheet (MSDS)
Apresentação
Este kit contém placas com misturas de primers desidratadas e PCR
Master Mix para efectuar a tipagem genética de baixa resolução dos
genes de HLA-DQ.
12. Informação ecológica
Não existem dados disponíveis.
13. Informação sobre a eliminação de resíduos
Elimine o material de acordo com toda a regulamentação aplicável (os
resíduos devem ser devidamente tratados e/ou incinerados).
14. Informação sobre o transporte
No transporte dos Kits devem estar a seguradas as temperaturas, não
devendo ultrapassar os 25ºC. A duração do transporte não deve ser superior a
3 dias, de modo a garantir que todos os componentes do Kit cheguem em
perfeitas condições aos seus destinatários.
Alterações e melhoramento do Produto
O kit HLA-DQ single está constantemente a ser actualizado, ao nível
da sua especificidade e interpretação, de modo a incluir novos alelos
que venham a ser descritos. Este produto pode também ser
melhorado de modo a aumentar o seu rendimento.
15. Contactos Úteis
Número Nacional de Emergência: 112
Centro de Informação Anti-Venenos: 808 250 143
16. Outras informações
As informações a cima disponíveis são baseados no nível de conhecimento
actual, devendo ser utilizado apenas como guia. A geneBOX - R&D Diagnostic
Tests não se responsabiliza por qualquer dano causado pela manipulação
inapropriada ou pelo contacto com os referidos produtos.
As alterações, adições ou modificações de primers, em relação ao lote
anterior estão detalhadas na tabela abaixo:
Tubo
primers
motivo
N/A
Para mais esclarecimentos, por favor contactem com o apoio
técnico para o
+351 231 410 946
p4/24
p21/24
Folha de Dados de Segurança (2/3)
Material Safety Data Sheet (MSDS)
6. Protecção pessoal.
Controlo de Qualidade
Protecção das mãos: use luvas apropriadas, resistentes a químicos.
Protecção dos olhos: recomenda-se o uso de óculos de protecção química.
Foram usadas amostras de DNA de 38 linhas celulares constantes do
7. Manipulação e armazenamento
verificar a especificidade das misturas de primers.
Manipulação: evite o contacto directo com a substância.
Armazenamento: armazene à temperatura aconselhada, proteja do contacto
com a luz.
Danificação da embalagem protectora: rejeitar o constituinte contido na
embalagem.
Não foram registados Falsos positivos ou falsos negativos.
8. Perigos
Os componentes da mistura de reacção podem ser perigosos se inalados,
ingeridos ou absorvidos pela pele. Este material pode causar irritação da pele,
dos olhos e do tracto respiratório. A ingestão de grandes quantidades desta
mistura pode causar dores de estômago, vómitos ou diarreia.
IHWG Sequence Polymorphism Reference DNA DQ/DP Panel para
O controlo negativo pode detectar contaminação cruzada com
produtos de PCR.
9. Medidas de Primeiros Socorros
No caso de contacto com os olhos, deve lavar imediatamente os olhos com
água abundante por cerca de 15 minutos. Deve consultar o seu médico.
No caso de contacto com a pele, deve lavar imediatamente a zona afectada
com água corrente e sabão. Lave a roupa contaminada antes da sua utilização.
No caso de ingestão, lave a boca com água abundante. Deve contactar o seu
médico se necessário.
No caso de inalação, mudar a vítima para um local arejado. Se se encontrar
inanimado aplique respiração artificial. Se apresentar dificuldades respiratórias
aplique oxigénio. Deve consultar o seu médico.
10. Medidas a tomar em caso de incêndio
Meios de extinção: Água, dióxido de carbono, pó químico seco ou espuma
apropriada.
Meios de extinção não aconselhados: não existem restrições conhecidas.
Perigos específicos de exposição: em caso de incêndio podem emitir
fumos tóxicos de dióxido e monóxido de carbono, nitrogénio, fósforo, cloreto
de hidrogénio, e gás hidrogénio.
Equipamento especial de combate ao incêndio: quando são libertadas
grandes quantidades de substância trabalhe apenas com protecção adequada
para olhos e pele.
11. Medidas a tomar no caso de derrame acidental
Precauções pessoais: evite o contacto directo com a substância.
Limpeza: limpe normalmente a área afectada, não são necessários cuidados
adicionais.
Protecção da pele: use uma bata de laboratório.
p20/24
p5/24
Validação - Linhas Celulares
Folha de Dados de Segurança (1/3)
Material Safety Data Sheet (MSDS)
HLA-DQ low resolution SSP typing kit
Cell Typing
Cell line
HLA-DQB1*
geneBOX - R&D Diagnostic TestsTM PCR-SSP Kits
HLA-DQA1*
HLA-DQB1*
DPB1*
Positive well no.
IHW09008
0102
0602; 0603
02012;2301
7/8
IHW09009
01022
0502
0401;1401
6
IHW09016
05013
0301
0402
4
IHW09021
0401
0402
01011;0402
10
IHW09023
05011
0201
0101
1
IHW09041
0501
0301
0402;1101
4
IHW09047
0201
0201
1501
1
IHW09055
0102
0609
0501
8
IHW09056
0104;0102
0503;0604
02012;1301
6/7
IHW09060
0103
0603
1901
7/8
IHW09064
0503
0301
0501
42
IHW09076
0302
03032
0401;1001
3
IHW09095
0201
0201;03032
0201;0301
1/3
IHW09107
03
0401
1801;5801
5
IHW09138
03;0201
0302;0201
1301;2801
1/3
IHW09151
0104;0201
0201;0501
1601;2201
1/6
IHW09175
03;0201
0201;0402
0401;2101
1/5
IHW09189
0102;0302
06;0303
02012;3201
3/7
IHW09193
0103
0601
02012
7
IHW09198
0102;0601
0301;0502
0501;3101
4/6
2. Composição e Informação sobre os reagentes
IHW09200
0501;0104
0501;0301
0401;3001
4/6
IHW09263
0103;0104
05031;0601
0301;1701
6/7
Componente
Placa
IHW09286
0103
06011
0901
8
IHW09314
0102;03
0605;0302
0201
1/7/8
IHW09323
0101
0501
02012;0402
6
IHW09348
0103;0101
0501;0603
0401;4601
6/8/7
IHW09349
03;0501
0304;0301
0201;20011
4
-
0604;0602
0401;4501
7/8
IHW09366
IHW09367
03
03032
02012;1901
3
IHW09373
0101;0102
0501;0609
0501
6/8
0505
0301;0301
0301;0402
9
IHW09375
IHW09376
0102;0201
0202;0602
0401;0501
1/7
IHW09377
0104;0201
05031;0202
02012;1401
1/6
IHW09381
0301;0501
0201;0302
0401;11011
1/3
IHW09388
0301;0302
0301;0302
0401;0402
3/4
IHW09397
01;0401
0501;0301
0101;2701
4/6
5101;02012
1/4
IHW09404
-
0302;0201
Produtos de tipagem SSP da geneBOX TM
Esta folha de dados de segurança é aplicável a todos os produtos de tipagem
por PCR-SSP da geneBOXTM.
1. Produtos Químicos e Identificação da Companhia
1. Produtos Químicos e Identificação da Companhia
Data de realização:
Grupo do produto:
Manufacturação:
tel/fax:
e-mail:
Mistura de reacção
Maio 2010
Produtos de tipagem SSP da geneBOXTM
geneBOX - R&D Diagnostic Tests,
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
3060-197 cantanhede, portugal
+351 231 410 946/ +351 231 410 947
[email protected]
Químico
Acido Desoxiribonucleico
Vermelho de Cresol
Desoxiribonucleótidos
Tampão NH4
Cloreto de Magnésio
Vermelho de Cresol
Glicerol
Taq DNA Polimerase
Nome vulgar
Oligonucleótido
Nucleótidos
MgCl2
Taq
3. Propriedades físico-químicas:
Componente
Placa
Mistura de reacção
Aspecto
seco, no fundo do poço
líquido
Cor
vermelho
vermelho/rosa
Odor
nenhum
nenhum
4. Informação Toxicológica
Químico
Glicerol
Toxicidade
LD50= oral 4090 mg/kg (ratinho)
LD50= oral 12600 mg/kg (rato)
LD50= oral 1480 mg/kg (humano)
5. Estabilidade e reactividade
Condições a evitar: Calor e humidade.
Incompatibilidades: Bases e agentes oxidantes fortes.
p6/24
p19/24
Declaração de Conformidade
Nome do Produto: HLA-DQ
Componentes do HLA-DQ single Box Typing Kit
Numero do Produto: GB.04.06
Utilização: Tipagem de baixa resolução das moléculas de HLA-DQ.

Placas de tipagem de baixa resolução de HLA-DQ+
(48 tipagens)
Produção:
geneBOX - R&D Diagnostic Tests,
biocant – centro de inovação em biotecnologia
núcleo 4, lote 3
3060-197 cantanhede, portugal
16 placas (3 amostras cada) (conservar de -15 a -30ºC)

Mistura de reacção (com Taq Polimerase)
16 X 80 µl
Nós, geneBOX - investigação e desenvolvimento de testes de
diagnóstico, indubitavelmente declaramos que este produto, ao qual
se relaciona esta declaração de conformidade, está em conformidade
com os seguintes documentos normativos, ISO 9001:2008 e ISO
13485:2004. Seguindo ainda, as indicações da Directiva Europeia
98/79/CE sobre dispositivos médicos de diagnóstico in vitro,
conformidade de acordo com o Anexo IV, transposto para as leis
nacionais dos estados membros da União Europeia.
Europeia.

(conservar de -15 a -30ºC)
Selantes de Placas
48 cápsulas selantes

Manual de instruções
1 Manual de Instruções
+
com pares de primers específicos desidratados
A ficha e os documentos técnicos deste produto são mantidos na
geneBOX, biocant, centro de inovação em biotecnologia, 3060-197
Cantanhede, Portugal.
Componentes da PCR Master Mix
Sandra Balseiro
Directora Técnica
p18/24
Nucleótidos:
concentração final de cada dNTP é 600 µM
Tampão da PCR:
concentrações finais são 3,3x NH4, 2,0 mM MgCl2 e 0,4 u/µl
Amplitaq DNA polimerase, pH 8.3.
Glicerol:
concentração final é 16,6%
Vermelho de cresol:
concentração final é de 300µg/ml
p7/24
Aviso de garantia
Protocolo de amplificação por PCR
Reagentes

Amostra de DNA (100-200 ng/µl)

PCR Master Mix

Água bi-destilada estéril (não fornecida)
Extracção de DNA
Para a tipagem por SSP é necessário DNA extra puro. Recomenda-se
que o isolamento de DNA seja efectuado utilizando kits de extracção
com marcação CE, que garantam um rácio DO 260/280 maior do que
1.6 e uma concentração entre 100ng – 200 ng/µl.
Alternativamente, o DNA pode ser extraído utilizando sais de Brometo
de Trimetilamonia (DTAB/CTAB) ou por salting out, dissolvendo-o em
Tampão TE. Devem ser asseguradas o mesmo nível de DO e de
concentração.
NÃO UTILIZE SANGUE HEPARINIZADO COM ESTE MÉTODO
geneBOX –investigação e desenvolvimento de teste diagnósticos
responsabiliza-se, perante os seus clientes, pelos defeitos no material
e componentes dos seus produtos aplicados em condições normais.
Os produtos da empresa que apresentam esta garantia devem ser
substituídos, sem encargos para o cliente.
Esta garantia aplica-se só para produtos que sejam manipulados e
armazenados de acordo com as especificações e recomendações de
utilização.
As reclamações devem ser enviadas, por escrito, directamente para a
geneBOX e devem ser acompanhadas por uma cópia da guia de
transporte ou factura do produto.
Este produto não pode ser reformulado, reembalado ou revendido em
nenhuma forma sem o expresso consentimento da geneBOX investigação e desenvolvimento de teste diagnósticos.
Amplificação por PCR
1.
Agite brevemente os tubos de DNA e da mistura de reacção.
2.
Junte:

26 µl da PCR Master Mix,

50 µl de dd H2O e

7 µl da amostra de DNA (conc. 100-200 ng/l)
num tubo de 0,7 ml ou 1,5 ml.
3.
Agite vigorosamente durante 15s.
4.
Pipete 10 µl da mistura para cada poço da placa de tipagem (8
pares de primers).
5.
Repita os passos anteriores para mais 2 amostras de DNA para
completar
p8/24
p17/24
Garantia
geneBOX – investigação e desenvolvimento de teste diagnósticos garante
que os primers presentes no kit de tipagem HLA-DQ single apresentam as
especificidades dadas nas folhas e tabelas de interpretação de resultados
do produto.
6.
termociclador de 24 poços.
Parâmetros do programa PCR
1. Placa de Tipagem
Armazenamento a -20ºC, os primers desidratados permanecem estáveis
durante 12 a 19 meses a partir da data de produção (ver validade do lote
na embalagem).
Armazenamento a 4ºC, os primers desidratados permanecem estáveis
durante 12 meses a partir da data de produção.
À temperatura ambiente, os primers desidratados permanecem estáveis
durante 3 a 4 semanas a partir da data de recepção.
Quando o selante é removido os primers desidratados permanecem
estáveis durante 2 dias, no máximo, desde que não humedeçam.
2. Mistura de Reacção
Armazenamento a -20ºC, a mistura de reacção permanece estável
durante 18 meses a partir da data de produção (ver validade do lote na
embalagem).
Armazenamento a 4ºC, a mistura de reacção permanece estável durante
15 dias a partir da data de recepção.
À temperatura ambiente, a mistura de reacção permanece estável
durante 3 dias a partir da data de recepção.
A mistura de reacção nunca deve ser deixada ou armazenada com a
tampa aberta.
3. DNA
O DNA extraído por salting out ou por qualquer outro método deve ser
armazenado a 4ºC ou -20ºC. Ao optar pela congelação das amostras,
devem ser evitadas ciclos repetidos de congelação/descongelação, de
modo a impedir a degradação da amostra.
As amostras de DNA armazenadas em dH2O permanecem estáveis
durante, pelo menos, 4 semanas (a 4ºC) ou 2 anos (a -20ºC).
As amostras de DNA armazenadas em tampão TE permanecem estáveis
durante, pelo menos, 2 anos (a 4ºC) ou 5 anos (a -20ºC).
p16/24
Sele a placa de tipagem com um autocolante e ponha-a num
Passo
Temperatura
Tempo
Ciclos
Denaturação
96 ºC
1 min
1
Denaturação
Emparelhamento
Extensão
96 ºC
70 ºC
72 ºC
25 seg
45 seg
30 seg
5
Denaturação
Emparelhamento
Extensão
96 ºC
65 ºC
72 ºC
25 seg
45 seg
30 seg
21
Denaturação
Emparelhamento
Extensão
96 ºC
55 ºC
72 ºC
25 seg
1 min
2 min
4
Extensão
72 ºC
10 min
1
Guardar
(opcional)
4 ºC
25 seg
1
7.
No final da PCR guarde a placa a 2-8 ºC.
8.
Detecte os produtos do PCR com uma electroforese em gel de
agarose a 2%.
p9/24
Guia Técnico
Protocolo de electroforese em gel de agarose
Preparação do gel de agarose a 2%
1.
Dissolver 4 gramas de pó agarose em 200 ml de tampão TAE
1X.
2.
Dissolver completamente a agarose aquecendo-a no microondas.
3.
Arrefeça o gel até, aproximadamente, 50ºC.
4.
Adicione pelo menos 20 µl de brometo de etídio++ (10 mg/ml)
ou de Sybr Safe (10000x concentrado à agarose). Agite até
1. Pureza e Concentração do DNA
Para obter bons resultados com o HLA-DQ single 1.0 Typing KitTM a pureza da
amostra de DNA é crítica. Ter uma amostra pura significa obter uma razão
260nm/280nm de DO superior a 1.6 e uma porção de DNA superior a 9.4 kb.
A elevada degradação do DNA ou uma razão 260nm/280nm inferior a 1.5
requer uma nova extracção de DNA.
Cada amostra de DNA deve ter aproximadamente 100 a 200 ng/µl.
Concentrações elevadas de DNA provocam um declínio considerável na
especificidade da PCR.
Recomenda-se o uso de qualquer kit de extracção de DNA que apresente
marcação CE, de modo a obter um DNA extra puro.
estar completamente incorporado.
2. Taq Polimerase
5.
Numa superfície nivelada, monte a placa do gel com 96 poços.
O HLA-DQ single 1.0 Typing KitTM foi intensivamente testado utilizando a Taq
da Reagente 5 (Reagente 5, Lisboa, Portugal).
6.
Verta uma camada de gel com cerca de 5mm.
7.
Deixe o gel arrefecer.
++
Para uma boa performance da tipagem com o HLA-DQ single 1.0 Typing KitTM
é obrigatória a utilização da PCR Master Mix fornecida com o Kit.
Atenção este reagente é um forte agente mutagénico (leia atentamente a MSDS do
produto).
Electroforese
1.
Submirja o gel na tina de electroforese com tampão TAE 1X.
2.
Remova os pentes com cuidado do gel.
3.
Adicione 10 µl do produto de PCR em cada poço.
4.
Ligue a tina de electroforese à corrente com uma voltagem média
(115V).
5.
3. Mistura de reacção
Deixe a electroforese correr por cerca de 20 minutes, ou até o
4. Procedimentos de amplificação
No fim da PCR, examine o grau de evaporação e de condensação da mistura
de reacção da PCR. Se as perdas de volume forem superiores a 20% não
devem ser validados os resultados obtidos. De forma a prevenir esta situação
devem adicionar previamente óleo mineral à mistura de reacção ou utilizar um
adaptador de silicone para placas de 96. Também se deve ter em atenção a
temperatura de aquecimento do aparelho. Se a temperatura de aquecimento
não for suficiente vão se verificar problemas de condensação.
5. Termociclador
Recomenda-se utilização de qualquer Termociclador que apresente as
seguintes características:
- “heating rate” superior a 2.5ºC/sec; “cooling rate” superior a 1.5ºC/sec;
gama de temperaturas 4-100ºC; uniformidade de temperaturas ±0.5ºC;
“heated lid” superior a 100ºC.
corante estar a 2/3 da linha.
6.
Ponha o gel no transiluminador.
7.
Fotografe o gel e identifique-o.
8.
Use a Tabela de interpretação de resultados para interpretar
os resultados.
p10/24
6. Validade
Como especificado na embalagem.
Se os problemas persistirem, por favor contactem com o
apoio técnico para o
+351 231 410 946
p15/24
Avisos e precauções
A amplificação por PCR permite-nos obter milhões de cópias de DNA a partir de
uma pequena quantidade de amostra. Infelizmente isto também é verdade para o
DNA contaminante, que pode comprometer performance da nossa reacção.
Consequentemente, práticas laboratoriais específicas podem evitar a presença de
amplificações inespecíficas. Em baixo encontram-se descriminadas as
recomendações da Genebox:
Esquema da placa HLA-DQ single Box 1.0
H
G
F
E
D
C
B
A
1*
- Separe fisicamente as áreas de pré-PCR e de pós-PCR.
- O fluxo Laboratorial deve ser sempre unidireccional da área pré-PCR para a área
pós-PCR.
2*
- Deve sempre utilizar-se equipamentos específicos para cada area de trabalho
(preparação de amostras; pré-amplificação amplificação e pós-amplificação).
3*
- Todos os equipamentos utilizados na área de pós-PCR não devem sais desta zona.
- Utilize micropipetas, luvas e batas específicas para cada área.
- Utilize preferencialmente luvas sem talco (uma vez que o talco pode inibir a
reacção de PCR).
- Utilize pontas de filtro de forma a minimizar contaminações cruzadas.
* A numeração pode variar de placa para placa sendo:
o nº 1 equivalente a 4, 7, 10
o nº 2 equivalente a 5, 8, 11
o nº 3 equivalente a 6, 9, 12
- Verifique periodicamente as micropipetas de forma a assegurar a variação de
pipetagem inferior a 5%.
- Utilize micropipetas adaptadas a cada volume de pipetagem.
- Verifique periodicamente os termocicladores, de forma a assegurar a variação de
temperaturas inferiores a 1%.
Identificação da placa HLA-DQ single Box 1.0
- Abra e feche os reagentes com cuidado. Depois de utilizar armazene os restantes
componentes do kit às temperaturas recomendadas devidamente fechados.
- Não utilize o kit com a validade expirada.
- Os componentes dos kits são resistentes às temperaturas de armazenamento
indicadas. O armazenamento dos kits a temperaturas não recomendadas podem
levar à rupturas no material e contaminação dos reagentes dos kits.
- Os materiais plásticos fornecidos neste kit são resistentes à gama de temperaturas
de utilização e armazenamento recomendadas. A sua utilização em gamas distintas
de temperaturas pode causar rupturas impossibilitando a utilização normal do kit.
- Verifique a concentração e qualidade de todas as amostras de DNA antes de
utilizar este kit.
Instruções de gerais de segurança no laboratório:
Posição
HLA
1a
1b
2a
2b
3a
3b
DQ
DQ
1c
2c
3c
DQ
1d
1e
2d
2e
3d
3e
DQ
DQ
1f
2f
3f
DQ
1g
2g
3g
DQ
1h
2h
3h
DQ
- Não coma, beba ou fume dentro do laboratório.
- Utilize sempre luvas descartáveis e mude-as com frequência.
- Utilize batas limpas e proteja os olhos (sempre que se justifique).
- Lave as mãos antes e depois de qualquer manipulação de amostras ou reagentes.
- Lave a área de trabalho antes e depois de qualquer manipulação.
- Não pipete com a boca.
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Folha de interpretação de resultados
Poço
Guia de resolução de problemas
HLA
alelo
Serotipo
ampl
contr* *
1a
2a
3a
DQ
DQB1*0201-03
DQB1*02
200
790
1b
2b
3b
DQ
DQB1*0302/07/08
DQB1*03
165
790
1c
2c
3c
DQ
DQB1*0303/06
DQB1*03
135
790
1d
2d
3d
DQ
DQB1*0301/04/09/10,
*06012?
DQB1*03;
06
215
790
1e
2e
3e
DQ
DQB1*0401/02
DQB1*04
210
790
1f
2f
3f
DQ
DQB1*0501-04
DQB1*05
215
790
DQB1*06
255
790
DQB1*06
180
790
1g
2g
3g
DQ
1h
2h
3h
DQ
DNA 1
DNA 2
DQB1*060103/052/06/08/10/
11/13/14/16
DQB1*060309/112/12/14/17
PROBLEMAS
POSSIVEIS CAUSAS
Verifique a qualidade e concentração do DNA
Concentração da amostra de DNA
baixa
Bandas controlo e
específicas fracas
Presença de inibidores da Taq
polimerase nas amostras de DNA
Presença de inibidores da Taq
polimerase nas amostras de DNA
Os controlos internos
falharam em diversos
poços
DNA3
Falsos negativos de uma
banda específica com o
controlo interno normal
** Os pares de primers controlo emparelham com sequências não polimórficas. Os primers de
controlo positivo interno amplificam segmentos do gene HLA-DRB1 e PIC1. Originando
fragmentos com 1600 + 796 pares de bases e 256 pares de bases, respectivamente. Na
presença da banda específica a banda controlo pode ver diminuída a sua intensidade. A reacção
de PCR só é valida na presença da banda controlo ou, nalguns casos, na presença da banda
específica.
Na ausência da banda controlo, por favor, repita a tipagem.
Reextraia a amostra de DNA ou tente não
adicionar água à mistura de reacção
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Repurifique a amostra de DNA
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Repurifique a amostra de DNA
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Verifique a selagem das placas
Produtos de amplificação secos
NOTA: Se o PCR tiver bandas com tamanhos diferentes dos previstos não as considere pois
pode tratar-se de bandas não específicas ou artefactos.
SUGESTÕES
Repita a tipagem utilizando um adaptador de
silicone para placas de 96 e/ou adicione óleo
mineral.
Reextraia a amostra de DNA de material fresco
Degradação da amostra de DNA
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Verifique a qualidade e concentração do DNA
Amostra de DNA muito concentrada
Dissolva o DNA em ddH2O de forma a obter a
concentração exacta
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Limpe a zona de trabalho
Detecção de mais de dois
alelos específicos
Trabalhe em zonas Pré e Pós-PCR separadas
Contaminação com outros produtos
de PCR ou outras amostras de
DNA durante a preparação do PCR
Utilize batas distintas para a zona Pré e Pós-PCR
Mude de luvas frequentemente
Tabela de interpretação de resultados
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
Reextraia a amostra de DNA de material fresco
Degradação da amostra de DNA
Tubo nº
Banda
específica
DQB1*02
DQB1*03
DQB1*04
DQB1*05
DQB1*06
1
2
0
0
+
2
1
6
5
3
1
3
5
4
2
1
5
*
*
*
5
2
1
0
6
2
1
5
7
2
5
5
8
1
8
0
Verifique a qualidade e concentração do DNA
Esfregaço de bandas
Amostra de DNA muito concentrada
+
*
Dissolva o DNA em ddH2O de forma a obter a
concentração exacta
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
+
*
Repita a tipagem com um DNA de boa
qualidade
*
Problemas com tampão de
electroforese:
Fora de prazo ou composição errada
Use um tampão recomendado novo
* Positivo para alguns subtipos
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p13/24
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