ivaldo jesus lima de oliveira o papel da vitamina c na ansiedade e

1
IVALDO JESUS LIMA DE OLIVEIRA
O PAPEL DA VITAMINA C NA ANSIEDADE E MEMÓRIA EM DOIS ESTUDOS:
NA COGNIÇÃO EM HUMANOS ESCOLARIZADOS E NO
COMPORTAMENTO DE ANIMAIS CRESCIDOS
EM AMBIENTE ENRIQUECIDO
BRASÍLIA, 2014
2
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE CIÊNCIAS A SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
IVALDO JESUS LIMA DE OLIVEIRA
O PAPEL DA VITAMINA C NA ANSIEDADE E MEMÓRIA EM DOIS ESTUDOS:
NA COGNIÇÃO EM HUMANOS ESCOLARIZADOS E NO
COMPORTAMENTO DE ANIMAIS CRESCIDOS
EM AMBIENTE ENRIQUECIDO
Tese apresentada como requisito parcial para a
obtenção do Título de Doutor em Ciências da
Saúde pelo Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde da Universidade de Brasília.
Orientador: Profº Drº Sérgio Leme da Silva
Brasília
2014
3
IVALDO JESUS LIMA DE OLIVEIRA
O PAPEL DA VITAMINA C NA ANSIEDADE E MEMÓRIA EM DOIS ESTUDOS:
NA COGNIÇÃO EM HUMANOS ESCOLARIZADOS E NO
COMPORTAMENTO DE ANIMAIS CRESCIDOS
EM AMBIENTE ENRIQUECIDO
Tese apresentada como requisito parcial para a obtenção do
Título de Doutor em Ciências da Saúde pelo Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade de
Brasília.
Aprovada em 08 de dezembro de 2014
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Sérgio Leme da Silva (Presidente)
Universidade de Brasília – UnB
Prof. Dr. Nelson Torro Alves (Examinador Externo)
Universidade Federal da Paraíba – UFP
Prof. Dr. Francisco Dyonisio Cardoso Mendes (Examinador Externo)
Universidade de Brasília – UnB
Prof. Dr. Joaquim Pereira Brasil Neto (Examinador Interno)
Universidade de Brasília – UnB
Prof. Dr. Valdir Filgueiras Pessoa (Examinador Interno)
Universidade de Brasília – UnB
Marília Barros (Examinador Suplente)
Universidade de Brasília – UnB
4
Dedico este trabalho a três jóias raras,
que iluminam a minha vida:
minha Lindinha esposa Alessandra,
meu amado filho Lucas Vinícius e
minha doce amada filha Júlia Ronchi.
E também aqueles que me deram a vida:
Luiz Neto (in memorian) e
Maria de Jesus, 83 anos e há 8 anos diagnosticada
com a doença de Alzheimer,
que me ensinaram duas coisas: amar a Deus
e nunca desistir de nada.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo seu imenso amor. Para Deus nada é impossível.
Aos membros da família Oliveira que sempre me incentivaram e
acreditaram que eu seria capaz de alcançar o meu objetivo.
Aos membros da família Ronchi que souberam entender a minha
ausência em alguns momentos festivos.
Ao meu orientador o Profº Dr. Sérgio Leme da Silva, que soube me
ajudar nos momentos mais difícies, me apoiou e me incentivou, com
profissionalismo e paciência, que possibilitaram a conclusão deste trabalho.
Agradeço também pela sua amizade. Muito obrigado.
Ao estudante do curso de graduação em psicologia da UnB Victor
Vasconcelos de Souza, que disponibilizou o seu tempo para a execução dos
experimentos no Centro Universitário de Brasília (UniCEUB/LABOCIEN), bem
como pelas inúmeras colaborações nos artigos.
Ao Profº Dr. Carlos Tomaz por ter compartilhado do seu conhecimento
com sugestões e incentivos, meus sinceros agradecimentos.
Ao Profº Dr. Vitor Augusto Motta Moreira pelas sugestões e
comentários.
Aos Professores da banca Profº Dr. Nelson Torro Alves, Profº Dr.
Joaquim Pereira Brasil Neto, Profº Dr. Valdir Filgueiras Pessoa, Profº Dr.
Francisco Dyonisio Cardoso Mendes e a Profª Drª Marília Barros, agradeço
pelas sugestões e colaboração para engrandecimento deste trabalho.
Ao Profº Dr. Francisco de Assis Rocha Neves Coordenador do
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde-PGCS, pela ajuda
principalmente no início do curso.
6
À equipe da Secretaria do PGCS Jaqueline de Almeida Souza, Edigrês
Alves de Souza, Ingrid Moscardini Torres e Tamires Cristina Carneiro Pinto
pela atenção e pronto atendimento, quando precisei dos serviços da
Secretaria.
À equipe multidisciplinar formada pelas psicólogas Aline Maria Lannone
Alonso e Jaqueline Lopes Barreiro e pela nutricionista Grazielle Gebrim
Santos. Obrigado pela colaboração.
Ao Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal (LACENDF), pelo valioso trabalho na coleta e análise das amostras de sangue dos
estudantes.
A Magda Verçosa Carvalho Branco e Antonio Marcos da Conceição pela
doação dos animais e permissão para que os experimentos fosse realizados
no UniCEUB/LABOCIEN.
Ao estatístico Ms. Guilherme Sousa Rodrigues pelo auxílio nas análises
estatísticas e a Rosimeire Aguiar Pereira Lopes pela revisão dos textos em
Inglês.
Aos estudantes da UnB que participavam do Grupo Bichos Vivos: Pedro
Henrique, Jéssica Felício, Tainã Braúna, Samantha Sousa, Rino Pereira,
Letícia Vitorino, Lara Lívia, João Paulo e a Drª Lucylle Fróis de Melo, pela
amizade e carinho que compartilhamos nesta jornada acadêmica. Obrigado
pela ajuda.
Ao meu sobrinho Rodrigo Moreira, que ajudou a confeccionar as
tampas das caixas de enriquecimento.
Aos amigos do movimento Jovens Organizando e Instituindo Amor
(JOIA) da Arquidiocese de Brasília pelas orações e incentivos para que ao
final tudo desse certo.
7
À Associação São Vicente de Paula, Lar dos Velhinhos de Taguatinga
Sul, através da sua Coordenadora Irmã Marilsa por ter cedido a sala de
leitura São José, construída pela Irmã Maria Celina (in memorian). Meus
agradecimentos.
Aos funcionários da Biblioteca Machado de Assis de Taguatinga que me
incentivaram com alegria e confiança que este trabalho logo seria concluido.
À Secretaria de Estado de Educação do Distrito Federal, pela
concessão da Licença Remunerada para Estudo.
À Editage Cactus Communications pela revisão dos manuscritos para a
submissão dos artigos.
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal pela ajuda de
custo para a Participação no World Congress on Brain, Behavior and Emotion
no Canadá em abril de 2014.
Ao Decanato de Pesquisa e Pós-graduação da UnB pela ajuda de custo
na revisão do artigo.
Aos estudantes do Ensino Médio de Ceilândia que se ofereceram a
participar desta pesquisa. Sem vocês este trabalho não poderia ser
realizado. Que Deus os recompense.
Por todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram para a
concretização deste sonho, que se tornou realidade, celebrando agora a
vitória e confiando ainda mais: “tudo posso naquele que me fortalece”.
8
“Não sou nada, eu bem sei
Tão pequeno, um grão de areia em suas mãos
Barco a vela, que se abandona
Segue o rumo e vai buscando o alto mar
Assim me encontro diante de ti
Um Deus imenso que por amor se deixa alcançar
Te adorarei meu Deus enquanto eu existir
Proclamarei as maravilhas que fizeste em mim
O teu calor me envolve
O teu olhar me acalma
E em teus braços o teu amor inflama a minha alma
Que posso mais dizer se o coração já disse
Te amo...”
Deus Imenso/Vida Reluz/Valmir Alencar
9
RESUMO
A vitamina C (ácido ascórbico) é um antioxidante que está envolvido na
ansiedade, memória, estresse, fadiga, depressão e estado de humor. O estresse
oxidativo pode desencadear distúrbios neuropsicológicos e os antioxidantes
desempenham um importante papel terapêutico e beneficiam funções cognitivas
relacionadas ao processo de envelhecimento. O enriquecimento ambiental promove
bem-estar em animais e reduz níveis de ansiedade e déficits de memória. Neste
contexto, surge a hipótese que a suplementação de vitamina C poderia influenciar a
cognição e potencializar os efeitos comportamentais em animais crescidos em
ambiente enriquecido. Adicionalmente, poucos estudos avaliaram a consequência
dos efeitos da suplementação de vitamina C sobre a ansiedade e memória em
humanos escolarizados, bem como a potencialização de efeitos do enriquecimento
ambiental em animais envelhecidos. Assim, dois estudos foram conduzidos. O
primeiro examinou os efeitos da suplementação da vitamina C em 42 estudantes do
ensino médio, um estudo randomizado, duplo cego, controlado por placebo. Os
estudantes foram suplementados com vitamina C (500 mg/dia) ou placebo. As
concentrações plasmáticas de vitamina C e a pressão arterial foram medidas antes
da intervenção e um dia depois da intervenção e os testes neuropsicológicos de
ansiedade e memória foram conduzidos a cada estudante antes e depois de 14 dias
de suplementação. Os resultados demonstraram que a vitamina C reduziu os níveis
de ansiedade (p ˂ 0,01) e conduziu a um aumento da concentração plasmática de
vitamina C comparada ao placebo (p ˂ 0,001). As médias das frequências cardíacas
foram significativamente diferentes entre o grupo vitamina C e o grupo placebo
(p ˂ 0,05). Ademais, a vitamina C aumentou o escore nas tarefas de cópia (p ˂ 0,05)
e reprodução de memória (p ˂ 0,001) das Figuras Complexas de Rey; na memória
lógica I (p ˂ 0,001) e memória lógica II (p ˂ 0,001) e na repetição de dígitos indiretos
(p ˂ 0,05) da Escala de Memória Weschler, após a intervenção. O segundo estudo
investigou os efeitos da vitamina C combinada com um ambiente enriquecido em
ratos de meia-idade (14 meses de idade). A metade dos animais foi alojada pósdesmame até 13 meses em um ambiente enriquecido, enquanto a outra metade foi
mantida em ambiente padrão. Os animais receberam administração de salina
(controle) ou vitamina C (100 mg/kg) 1 hora antes dos testes comportamentais:
labirinto em cruz elevado e labirinto aquático de Morris. A vitamina C reduziu a
10
ansiedade (p ˂ 0,001) e melhorou a memória de referência espacial em relação ao
controle (p ˂ 0,001). O enriquecimento ambiental aumentou a porcentagem de
tempo gasto nos braços abertos (p ˂ 0,05) e melhorou a memória espacial de
retenção comparado com o ambiente padrão (p ˂ 0,01). O enriquecimento ambiental
potencializou o efeito ansiolítico da vitamina C. Estes achados não somente
fornecem evidências de que a vitamina C desempenha um importante papel
terapêutico sobre estes processos cognitivos em humanos e animais, mas também
aponta para o possível uso de antioxidantes na prevenção ou redução dos níveis de
ansiedade e déficits de memória. Finalmente, sugere-se que uma dieta rica em
vitamina C pode ser um coadjuvante ao tratamento medicinal e psicológico na
melhora da ansiedade e memória, bem como um benefício potencial do
enriquecimento ambiental sobre o declínio cognitivo relacionado ao processo natural
de envelhecimento.
Palavras-chaves: vitamina C; estudantes do ensino médio; ansiedade; memória;
enriquecimento ambiental; testes neuropsicológicos e comportamentais.
11
ABSTRACT
Vitamin C (ascorbic acid) is an antioxidant that is involved in anxiety, memory,
stress, fatigue, depression, and mood state. Oxidative stress can trigger
neuropsychological disorders and antioxidants play an important therapeutic role and
benefit cognitive functions related to the aging process. Environmental enrichment
promotes wellness in animals and reduces anxiety levels and memory deficits. In this
context, the possibility arises that vitamin C supplementation could influence
cognitive and behavioral effects of animals grown in an enriched environment.
Furthermore, few studies have assessed the consequence of the effects of vitamin C
supplementation on anxiety and memory in schooled humans, as well as the
potentiation effects of environmental enrichment in aged animals. Thus, two studies
were conducted. The first examined the effects of supplementation of vitamin C in 42
high school students, a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Students
were supplemented with either vitamin C (500 mg/day) or placebo. Plasma
concentrations of vitamin C and blood pressure were measured before intervention
and one day after the intervention and neuropsychological tests of anxiety and
memory were conducted with each student before and after 14 days of
supplementation. The results showed that vitamin C reduced anxiety levels (p ˂ 0,01)
and led to an increase in plasma vitamin C concentration compared to placebo
(p ˂ 0,001). Mean heart rates were significantly different between the vitamin C group
and the placebo group (p ˂ 0,05). Moreover vitamin C increased the score in the
tasks of copying (p ˂ 0,05 )and reproduction of memory (p ˂ 0,001) of the Rey
Complex Figures, in logical memory I (p ˂ 0,001) and logical memory II (p ˂ 0,001)
and in the repetition of indirect digits (p ˂ 0,05) Wechsler Memory Scale, after the
intervention. The second study investigated the effects of vitamin C with an enriched
environment in middle-aged rats (14 months old). Half of the post-weaning animals
were housed during up to 13 months in an enriched environment, while the other half
was maintained in a standard environment. The animals received administration of
saline (control) or vitamin C (100 mg/kg) 1 hour before behavioral tests: elevated plus
maze, and Morris water maze. Vitamin C reduced anxiety (p ˂ 0,001) and improved
spatial reference memory compared to controls (p ˂ 0,001). Environmental
enrichment increased the percentage of time spent in the open arms (p ˂ 0,05) and
improved spatial memory retention compared to the standard environment
12
(p ˂ 0,001). Environmental enrichment potentiated the anxiolytic-like effect of vitamin
C. These findings not only provide evidence that vitamin C plays an important
therapeutic role of these cognitive processes in humans and animals, but also
indicates the possible use of antioxidants in preventing or reducing the levels of
anxiety and memory deficits. Finally it is suggested that a diet rich in vitamin C could
be an adjunct to medical and psychological treatment in improving anxiety and
memory, as well as a potential benefit of environmental enrichment on cognitive
decline related to the process of natural aging.
Keywords: vitamin C; high school students; anxiety; memory; environmental
enrichment; neuropsychological and behavioral tests.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Biossíntese de L-ácido ascórbico ............................................................... 25
Figura 2. Oxidação do ácido ascórbico ..................................................................... 27
Figura 3. Labirinto em cruz elevado .......................................................................... 45
Figura 4. O conceito de reconsolidação da memória ................................................ 48
Figura 5 . Classificação da Memória ......................................................................... 51
Figura 6. Memória de longo prazo e estruturas cerebrais ......................................... 53
Figura 7. Labirinto aquático de Morris ....................................................................... 56
Figura 8. Deficiência de vitamina C no cérebro ......................................................... 63
Figura 9. Fluxograma dos participantes .................................................................... 87
Figura 10. Centro de ensino médio de Ceilândia ...................................................... 89
Figura 11. Figuras Complexas de Rey ...................................................................... 94
Figura 12. Box plots dos escores de ansiedade ...................................................... 101
Figura 13. Linha do tempo do protocolo experimental ............................................ 111
Figura 14. Ambiente padrão e ambiente enriquecido .............................................. 113
Figura 15. Teste no labirinto em cruz elevado......................................................... 114
Figura 16. Teste no labirinto aquático de Morris ..................................................... 115
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Alimentos selecionados como fonte de vitamina C ................................... 26
Tabela 2. Características demográficas da amostra ................................................. 97
Tabela 3. Distribuição de frequências das variáveis de descrição dos estudantes ... 98
Tabela 4. Recordatório nutricional dos estudantes ................................................... 99
Tabela 5. Parâmetros bioquímicos e fisiológicos dos estudantes ........................... 100
Tabela 6. Desempenho dos estudantes nos testes neuropsicológicos de ansiedade e
memória pré e pós-tratamento com vitamina C ou placebo.......................... 102
Tabela 7. Efeitos do ácido ascórbico ou salina em ratos de meia-idade crescidos em
ambiente enriquecido ou ambiente padrão submetidos ao LCE................... 118
Tabela 8. Efeitos do ácido ascórbico ou salina em ratos de meia- idade crescidos em
ambiente enriquecido ou ambiente padrão submetidos ao LAM .................. 119
15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA – Ácido ascórbico
AI – Adequate Intake, ingestão adequada
AP – Ambiente padrão
B2 (Bcl-2) – Linfoma de células
BAI – Inventário de Ansiedade Beck
CAP – Controle em ambiente padrão
CEA – Controle em enriquecimento ambiental
CAT – catalase
CI – Controle isolado
CM – Subteste controle mental da WMS
CPVC – Concentrações plasmáticas de vitamina C
CS – Controle social
DA – Doença de Alzheimer
DD – Subteste de repetição de dígitos diretos da WAIS
DHA – ácido desidroascórbico
DI – Subteste de repetição de dígitos indiretos da WAIS
DRIs – Dietary Reference Intakes, Ingestão Dietética de Referência
EA – Enriquecimento ambiental
EAP+AA – Experimental em ambiente padrão mais ácido ascórbico
EAR – Estimated Average Requirement, média estimada
EEA+AA – Experimental em enriquecimento ambiental mais ácido ascórbico
FC – Frequência cardíaca
FCRC – Figuras Complexas de Rey Cópia
FCRM – Figuras Complexas de Rey Memória
G6PD – desidrogenase de glicose-6-fosfato
GPx – glutationa peroxidase
GSH – glutationa redutase
GSK-3β – glicogênio sintase-quinase-3β
GST – glutationa-s-transferase
IDR – Ingestão Diária Recomendada
IN-OR – Subteste de informação e orientação da WMS
LAM – Labirinto Aquático de Morris
16
LCE – Labirinto em Cruz Elevado
LPO – nível de peroxidação lipídica
MDA – malondialdeído
ML1 – Subteste de memória lógica imediata da WMS
ML2 – Subteste de memória lógica tardia da WMS
NMDA – N-metil-D-aspartato
NMDAR – N-metil-D-aspartato receptor
NRP – Programa de Reabilitação Neuropsicológica
PAD – Pressão arterial diastólica
PAF1 – Subteste de aprendizagem imediata de pares de fácil associação da
WMS
PAF2 – Subteste de aprendizagem tardia de pares de fácil associação da
WMS.
PAS – Pressão arterial sistólica
RDA – Recommended Dietary Allowance, ingestão diária recomendada
RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
SE – ambiente padrão
SOD – superóxido dismutase
STZ – Streptozotocin
SVCT2 – Transportadores de vitamina C dependente de sódio-2
UL – Tolerable Upper Intake Level, ingestão tolerável sem que haja efeitos
adversos à saúde
TEPT – Transtorno de estresse pós-traumático
WMS – Escala de Memória Wechsler
17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 21
1.1 VITAMINA C................................................................................................. 22
1.1.1 Propriedades e Funções ......................................................................... 24
1.1.2 Biodisponibilidade.................................................................................... 29
1.1.3 Antioxidantes ........................................................................................... 34
1.1.4 Efeito neuroprotetor ................................................................................. 36
1.2 PROCESSOS COGNITIVOS E EMOCIONAIS ............................................ 38
1.2.1 Conceito de ansiedade ............................................................................ 38
1.2.2 Transtorno de ansiedade......................................................................... 39
1.2.3 Ansiedade e desenvolvimento humano ................................................... 42
1.2.4 Modelos animais de ansiedade ............................................................... 43
1.2.5 Formação da memória ............................................................................ 46
1.2.6 Sistemas de memória em humanos ........................................................ 50
1.2.7 Sistema de memória em animais ............................................................ 54
1.2.8
Desenvolvimento
da
capacidade
mnemônica
da
infância
ao
envelhecimento ......................................................................................................... 58
1.2.9 A vitamina C e o desenvolvimento das funções cognitivas ..................... 62
1.3 PLASTICIDADE CEREBRAL, COGNIÇÃO E COMPORTAMENTO ............. 64
1.3.1 Desenvolvimento Neural e Cognitivo ....................................................... 68
1.3.1.1 Comprometimento cognitivo leve ou declínio cognitivo .................. 69
1.3.1.2 Declínio cognitivo em modelos animais .......................................... 70
1.3.1.3 Reserva cognitiva e escolaridade como aprimoramento cognitivo em
humanos.................................................................................................................... 70
18
1.3.1.4
Enriquecimento
ambiental
como
aprimoramento
cognitivo
e
comportamental em animais ..................................................................................... 74
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 81
2.1 GERAIS........................................................................................................ 81
2.2 ESPECÍFICOS ............................................................................................. 81
3 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ................................................................................ 82
4
ESTUDO
1:
EFEITOS
DA
VITAMINA
C
EM
SERES
HUMANOS
ESCOLARIZADOS SOBRE A ANSIEDADE E MEMÓRIA .............................. 83
4.1 MÉTODOS .................................................................................................. 86
4.1.1 Participantes .......................................................................................... 86
4.1.2 Critério de Inclusão................................................................................ 86
4.1.3 Critério de Exclusão .............................................................................. 86
4.1.4 Local da pesquisa.................................................................................. 88
4.1.5 Perfil da equipe multidisciplinar ............................................................. 89
4.1.6 Perfil da equipe do LACEN-DF .............................................................. 90
4.1.7 Compostos ............................................................................................ 90
4.1.8 Procedimentos experimentais ............................................................... 90
4.1.8.1 Aferição da pressão arterial .......................................................... 91
4.1.8.2 Coleta de sangue e procedimentos laboratoriais.......................... 92
4.1.9 Testes neuropsicológicos ...................................................................... 92
4.1.9.1 Ansiedade: Inventário de Ansiedade de Beck .............................. 92
4.1.9.2 Memória: Figuras Complexas de Rey .......................................... 93
4.1.9.3 Memória: Escala de Memória Weschler ....................................... 94
4.1.10 Análise estatística................................................................................ 96
4.2 RESULTADOS ............................................................................................ 97
19
4.2.1 Características descritivas da amostra .................................................. 97
4.3 DISCUSSÃO ............................................................................................. 103
4.4 CONCLUSÃO ........................................................................................... 108
5
ESTUDO 2: EFEITOS COMPORTAMENTAIS DO ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE
A ANSIEDADE E MEMÓRIA EM RATOS CRESCIDOS EM AMBIENTE
ENRIQUECIDO ............................................................................................ 109
5.1 MÉTODOS ............................................................................................... 111
5.1.1 Animais ............................................................................................... 111
5.1.2 Compostos e procedimentos experimentais ....................................... 112
5.1.3 Enriquecimento ambiental .................................................................. 112
5.1.4 Labirinto em cruz elevado .................................................................. 113
5.1.5 Labirinto aquático de Morris ............................................................... 114
5.1.6 Análise estatística............................................................................... 116
5.2 RESULTADOS ......................................................................................... 117
5.2.1 Teste no labirinto em cruz elevado ..................................................... 117
5.2.2 Teste no labirinto aquático de Morris .................................................. 118
5.3 DISCUSSÃO ........................................................................................... 120
5.4 CONCLUSÃO ......................................................................................... 124
6 DISCUSSÃO GERAL ......................................................................................... 125
7 CONCLUSÕES FINAIS ...................................................................................... 127
8 RECOMENDAÇÕES FINAIS ............................................................................. 128
9 PERSPECTIVAS FUTURAS .............................................................................. 129
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 130
ANEXOS ................................................................................................................. 176
20
ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA COM PESQUISA EM
SERES HUMANOS ...................................................................................... 177
ANEXO B – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA COM PESQUISA COM O
USO DE ANIMAIS ........................................................................................ 179
ANEXO C – TERMO DE CONCORDÂNCIA DA COLETA DE SANGUE ........ 182
ANEXO D – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ........ 185
ANEXO E – AUTORIZAÇÃO PARA A COLETA DE DADOS.......................... 188
ANEXO F – DADOS PESSOAIS PARA A COLETA DE SANGUE ................. 190
ANEXO G – DECLARAÇÃO DE COMPARECIMENTO. ................................. 192
ANEXO H – ESCALA DE ANSIEDADE DE BECK .......................................... 194
ANEXO I – ESCALA DE MEMÓRIA WESCHLER .......................................... 196
ANEXO J – DADOS PESSOAIS E SOCIOECONÔMICOS............................. 201
ANEXO K – ESTADO DE SAÚDE FÍSICA E MENTAL ................................... 203
ANEXO L – RECORDATÓRIO ALIMENTAR .................................................. 205
ANEXO M – E-MAIL E CARTA DE ACEITE DO ARTIGO............................... 207
ANEXO N – CÓPIA DA PUBLICAÇÃO DO ARTIGO ...................................... 211
21
1
INTRODUÇÃO
A vitamina C ou ácido ascórbico (AA) é um antioxidante essencial para a
saúde humana (1). Apesar de ter sido descoberta e caracterizada no século XVII,
este micronutriente continua sendo alvo de investigação na comunidade científica e
desperta interesse pelas suas ações em diversos processos
fisiológicos,
neurobioquímicos, neuropsicofarmacológicos e medicinais, e também de algumas
controvérsias (1-5).
Embora um número crescente de pesquisas tenha surgido, nas últimas
décadas, na busca pelo entendimento do possível papel terapêutico desta vitamina,
em distúrbios neuropsicológicos e defícits de memória, através de sua ação como
antioxidante (6, 7), poucos estudos foram conduzidos para avaliar a consequência
dos efeitos da suplementação de vitamina C sobre a ansiedade e memória em
humanos escolarizados, bem como sua associação com o enriquecimento ambiental
em animais envelhecidos.
De forma prévia, apresentamos uma fundamentação téorica a esta pesquisa
abordando os aspectos estruturais, bioquímicos, funcionais e neuroprotetor
desempenhado pela vitamina C e sua influência nos processos cognitivos e
emocionais tais como, ansiedade e memória em humanos e modelo animal. A
plasticidade cerebral, cognição e comportamento, bem como o desenvolvimento
neural em humanos e modelo animal, também são temas aqui abordados.
Adicionalmente, descrevemos à relação da reserva cognitiva e a escolaridade como
aprimoramento cognitivo em humanos e a participação do enriquecimento ambiental
em processos cognitivos e comportamentais em animais.
Em seguida realizamos uma intervenção experimental em humanos
escolarizados, avaliados antes e depois da suplementação de vitamina C, através de
uma bateria de testes neuropsicológicos de ansiedade e memória. Com a finalidade
de dar maior crédito as hipóteses testadas nos humanos, conduzimos outra
intervenção da vitamina C em modelo animal, acrescido de enriquecimento
ambiental, sugerindo analogia do valor da escolarização e do uso da vitamina C,
bem como avaliar o seu papel sobre a ansiedade e memória em humanos e animais.
22
1.1 VITAMINA C
As vitaminas foram, a meu ver, teoricamente desinteressantes. “Vitamina”
significa que a pessoa tem que comer. O que se tem que comer é a primeira
preocupação do chefe de cozinha, não para o cientista. Albert SzentGyörgyi (1963).
Esta célebre frase pronunciada pelo hungáro Albert Szent-Györgyi deu início
a um amplo campo de investigação do papel destes micronutrientes chamados de
vitaminas, que fazem parte do espectro nutricional e exercem inúmeras funções
essenciais para a saúde humana.
A deficiência de vitamina C causa o escorbuto, uma das mais antigas
doenças conhecidas da humanidade. Existem evidências da sua existência no
Antigo Testamento, nos papiros de Ebers e na escrita de Plínio (8). Provavelmente
esta doença apareceu nos hieróglifos Egípcios cerca de 3.000 BC, também foi
descrita por Hipocrates no século V BC (9).
Durante a Idade Média, o escorbuto era endêmico no norte da Europa e no
final do século XVII tornou-se um problema grave entre os marinheiros nas longas
viagens de exploração (9). Estes homens se alimentavam de carne de charque, pão
e rum, mas não ingeriam frutas e verduras. Por esta razão, muitos apresentavam
sintomas como comprometimento das articulações, dos dentes, inflamações das
gengivas e hemorragias em decorrência das rupturas dos vasos sanguíneos da
boca, além das injúrias acometidas no sistema imunológico, que conduziam estes
marinheiros à morte (10).
Com a publicação de “Treatise of the Scurvy”, em 1753, o médico naval
James Lind demonstrou que seria fácil tratar o escorbuto. No seu experimento,
conduzido em 12 pacientes, divididos em seis grupos, cada grupo recebeu
tratamentos diferentes: cidra, vinagre, água do mar ou frutas cítricas. Os resultados
encontrados indicaram que as frutas cítricas melhoraram os sintomas destes
pacientes. A partir destes achados, James Lind passou a receitar laranjas e limões
para a cura do escorbuto (10).
As pesquisas se intensificaram na busca de identificar o princípio
antiescorbuto. Albert Szent-Györgyi (1928) isolou pela primeira vez uma substância
reduzida a seis carbonos com a fórmula C6H8O6 (11) caracterizada estruturalmente
23
por Waugh e King (12). Ele chamou esta molécula de “ignose”, termo derivado da
combinação do ignosco do latim, que significa “não sabe” com o sufixo padrão para
açúcares “ose”. Depois ele resolveu mudar o nome desta substância, para fins de
publicação, para “ácido hexurônico”, porque esta molécula possuia seis átomos de
carbono e apresentação propriedade ácida. O ácido hexurônico estava presente
como um fator em muitas frutas e vegetais frescos (6).
Os laboratórios de Albert Szent-Györgyi e King, independentemente,
confirmaram que a substância analisada apresentava propriedades no combate ao
escorbuto e Szent-Györgyi deu o nome a esta substância de ácido ascórbico,
recebendo o prêmio Nobel em 1937, por esta descoberta. Esta vitamina foi pela
primeira vez sintetizada por Haworth e Hirst (13). Em 1938, o ácido ascórbico foi
oficialmente denominado pelo nome químico de vitamina C (14).
Franz, Sands e Heyl (15) observaram efeito positivo da vitamina C, quanto à
prevenção do resfriado comum. Estes pesquisadores obtiveram 4.6% menos
incidência de resfriado para o grupo tratado com a vitamina C (com ou sem
bioflavonóide) do que o grupo placebo ou bioflavonóide sozinho 14/44 versus 15/45,
testados 15 anos mais tarde por Pauling (16).
O grande defensor da vitamina C foi o cientista Linus Pauling (1901-1994),
vencedor do Prêmio Nobel de Química, principalmente pela obra “A Natureza das
Ligações Químicas” (1954) e Prêmio Nobel da Paz (1962) por participar ativamente
de manifestações contra testes nucleares, o uso de bombas atômicas como armas
de guerra e a construção de usinas nucleares. Com a publicação do livro: “Vitamin C
and the Common Cold” foi inaugurada uma controvérsia sobre o papel da vitamina C
na prevenção contra a gripe e resfriados e também câncer (17).
Em seu estudo de 1971, Linus Pauling também discutiu outros quatro estudos
duplo-cegos que demonstraram o efeito do ácido ascórbico ingerido regularmente,
em doses maiores que 100 mg/dia, em comparação ao grupo placebo. Três outros
trabalhos apresentaram efeito positivo para a vitamina C na prevenção do resfriado
comum: Ritzel (18), Cowan, Diehl e Baker (19), com diminuição de 45% e 31%,
respectivamente, na incidência de resfriado comum; e Wilson e Loh (20), que
demonstraram uma redução significativa na incidência, duração e severidade de
sintomas de resfriados pelo ácido ascórbico.
24
Assim, Linus Pauling concluiu que a ingestão de 1,000 mg de ácido ascórbico,
diariamente, diminui a incidência de resfriado em cerca de 45% e a morbidade em
63%. Ademais, um pequeno efeito protetor (não estatisticamente significante) é
apresentado quando a gripe é induzida por inoculação com vírus em suspensão
(16).
A controvérsia continuava e Linus Pauling mantinha sua postura diante da
defesa em favor da vitamina C. Desta forma tornaram-se necessárias maiores
investigações na tentativa de desvendar o mistério do efeito da vitamina C sobre a
gripe e o resfriado comum.
Além de suas ações importantes para o metabolismo dos seres humanos, a
vitamina C apresenta também funções farmacológicas de grande interesse científico
e acadêmico. Existe uma extensa abordagem na literatura da aplicabilidade dessa
vitamina no tratamento de uma variedade de doenças, e ainda a vitamina C é aceita
por muitos como um comprimido que pode fazer milagres (5).
1.1.1 Propriedades e Funções
A biossíntese de L-ácido ascórbico em vegetais e animais é proveniente da Dglicose ou D-galactose, mas, devido à ausência da enzima L-gulonolactona oxidase,
porcos da guiné, as cobaias, os morcegos frutívoros, macacos e humanos não
podem sintetizar ácido ascórbico (1) (Figura 1). Porém, outros mamíferos sintetizam
a vitamina C a partir da glicose no fígado, enquanto anfíbios, répteis e aves
sintetizam nos rins (21). O nome químico do L-ácido ascórbico (C6H806) é 2-oxo-Ltrio-hexano-1,4-lactona-2,3-enadiol (21).
25
Figura 1. Biossíntese de L-ácido ascórbico Fonte: Adaptado de Naidu (1).
Os seres humanos necessitam ingerir vitamina C através das diversas fontes
de alimentos disponíveis na natureza como frutas e legumes frescos (laranja, limão,
uva, melancia, mamão, morango, melão, manga, abacaxi, framboesas, cerejas,
acerola, caju e goiaba), vegetais folhosos verdes, tomates (brócolis, pimentões
verdes e vermelhos, couve flor e repolho) ou como suplementação na forma de
comprimidos (1, 22, 23) (Tabela 1).
26
A tabela a seguir apresenta alimentos selecionados que contêm vitamina C,
com adaptações.
Tabela 1 – Alimentos selecionados como fonte de vitamina C
Frutas
(1)
Vitamina C
(*)
Vegetais
(1)
Vitamina C
(*)
Banana
8 – 16
Cebola
10 – 15
Maça
3 – 30
Tomate
10 – 20
Manga
10 – 15
Berinjela
15 – 20
Abacaxi
15 – 25
Rabanete
25
Cereja
15 – 30
Espinafre
35 – 40
39
Repolho
30 – 70
Laranja
30 – 50
Couve-flor
50 – 70
Uva
30 – 70
Broccoli
80 – 90
Limão
40 – 50
Coentro
90
Morango
40 – 70
Pimenta
150 – 200
Salsa
200 – 300
Mamão papaya
Frutas
(2)
Acerola
1.369
Caju
219
Goiaba
218
Laranja (suco)
54
(*)
mg/100 g de porção comestível
Fontes:
(1)
(2)
(1)
(22, 23)
27
A vitamina C é um ácido fraco de seis carbonos com um pk 4.2 e peso
molecular de 176.13 Daltons (24). Esta molécula é ionizada em pH fisiológico,
contendo dois grupos ácidos ionizados (pka 4.04 and 11.34). Em solução aquosa é
um poderoso agente redutor, apresentando um potencial redox em torno de 0.05 V
em 30ºC e pH 7.4. Quando submetido à oxidação, é prontamente reversível para
ácido dehidroascórbico que pode por sua vez ser irreversivelmente hidrolisado para
ácido dicetogulônico (3) (Figura 2).
Figura 2. Oxidação do ácido ascórbico. Fonte: Adaptado de Grünewald (3).
28
A vitamina C está presente nos alimentos sob duas formas: a forma reduzida
(ácido ascórbico) e a forma oxidada (ácido dehidroascórbico) os quais são
encontradas nos tecidos orgânicos sob a forma ativa (14). Suas ações no corpo
humano estão relacionadas com ambos os lados da reação de oxido-redução.
Quando se oxida dá origem ao ácido dehidroascórbico, pela retirada de dois átomos
de hidrogênio (ação oxidante). Quando é reduzida forma novamente o ácido
ascórbico através do acréscimo de dois átomos de hidrogênio (25).
O ácido ascórbico é uma substância cristalina de sabor ácido, insolúvel em
maior parte dos solventes orgânicos, é solúvel em água na proporção de 1 g em 3
ml. Ambientes quentes, exposições ao ar e meio alcalino aumentam o processo de
oxidação da vitamina C, principalmente se o nutriente (alimento) estiver em contato
com enzimas oxidativas, como o cobre ou ferro (26).
A vitamina C encontra-se distribuída em alguns tecidos do organismo como
na glândula suprarenal, hipófise, retina (1 a 2 mg/g), fígado, pulmões, pâncreas e
leucócitos (0,1 a 1 mg/g). Nos rins, músculos e eritrócitos, a quantidade de AA é
menor. Contudo, como as reservas totais do organismo humano variam de zero a
3.000 mg, um estoque de 3.000 mg somente será mantido com a ingestão de níveis
elevados, maiores do que 1 g/dia (26).
Esta vitamina possui diversas funções biológicas. Dentre elas participa da
catálise através da doação de elétrons para cofatores de íons metálicos de enzimas
hidroxilase, além de ser importante para a conversão de determinados resíduos de
prolina e lisina, facilitando o processo de hidroxiprolina e hidroxilisina no
desencadeamento da síntese de colágeno e de outros processos pós-translacionais
(27).
Adicionalmente, o AA está envolvido na oxidação de proteínas das cadeias
laterais de lisina com a finalidade de promover a hidroxitrimetilisina para a síntese de
carnitina, a conversão de ácido fólico em ácido folínico, bem como a conversão de
dopamina para noradenalina (27). Ademais, participa também da absorção de ferro e
foi observado que a vitamina C supera o efeito inibitório de quelantes de metal forte
(ácido fítico) que possui a propriedade de reduzir a biodisponibilidade de ferro. Este
efeito pode explicar porque esta molécula é considerada um potente agente que
aumenta a absorção de ferro (28).
29
Finalmente, a vitamina C participa de uma variedade de reações fisiológicas
(6, 29). Além de atuar como um cofator para importantes reações de hidroxilação,
importantes para a síntese de carnitina, colágeno e catecolaminas (29). Na síntese
de dois neurotransmissores importantes, como a serotonina e norepinefrina (1, 24).
Esta vitamina é essencial para a conversão de triptofano a 5-hidroxitriptofano e de
norepinefrina a partir de dopamina (1, 24).
O AA em pH fisiológico é um ânion monovalente e sua forma endógena existe
como ascorbato (7). No cérebro de humanos, o acúmulo de ascorbato é proveniente
do fornecimento de sangue, sendo mantido a uma concentração de milimolar,
relativamente elevada, sobre diversas condições (3, 6; 30, 31). O ascorbato pode
ajudar a prevenir o estresse oxidativo, e tem sido apontado com potencial agente
terapêutico contra uma variedade de doenças neurodegenerativas, tais como as
doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington (4, 32).
1.1.2 Biodisponibilidade
A vitamina C presente nos alimentos é facilmente disponível e absorvida por
transporte ativo no intestino delgado (33). A média de absorção em adulto tem um
pico corporal de 1,2 - 2,0 g de ácido ascórbico, que pode ser mantido com ingestão
de 75 mg/d de ácido ascórbico (34). Os principais metabólitos de ácido ascórbico em
humanos são os ácidos: dehidroascórbico, 2,3-dicetogulônico e oxálico. A principal
via de eliminação do ácido ascórbico e seus metabólitos é através da urina. Esta
excreção é inalterada quando altas doses de ácido ascórbico são consumidas. A
vitamina C não é tóxica, mas em altas doses (2 a 6 g/dia) pode causar distúrbios
gastrointestinais ou diarréia (35, 36), contudo, não existe nenhuma evidência
científica demonstrada, em seres humanos de que a ingestão de doses muito altas
de vitamina C seja tóxica ou apresente efeitos adversos graves à saúde (36, 37).
Os valores de referência para ingestão de nutrientes de indivíduos e grupos,
estabelecidas em conjunto pelos Estados Unidos e Canadá, conhecidas como
Dietary Reference Intakes (DRIs), traduzidas como Ingestão Dietética de Referência
(IDRs), são, portanto, valores de referência da população destes dois países e
30
publicadas no período de 1997 à 2004. As DRIs vieram substituir as antigas
Recommended Dietary Allowances (RDAs) e Dietary Standards/Recommended
Nutrient Intakes (RNIs), padrões de referência dos EUA e Canadá, respectivamente.
Elas foram propostas com o objetivo de não somente nortear a prevenção de
deficiências nutricionais, mas também visando a diminuição do risco de doenças
crônicas não transmissíveis, além de fornecer limites superiores para que se possa
ingerir nutrientes evitando os riscos de efeitos adversos provenientes de um
consumo excessivo destes nutrientes (38).
Assim, as DRIs consistem num conjunto de quatro valores de referência de
ingestão de nutrientes, que incorporam as recomendações dietéticas: necessidade
média
estimada
(Estimated
Average
Requirement–EAR),
ingestão
dietética
recomendada (Recommended Dietary Allowance - RDA), ingestão adequada
(Adequate Intake - AI) e limite máximo de ingestão tolerável sem que haja efeitos
adversos à saúde (Tolerable Upper Intake Level - UL) (39, 40).
A necessidade média estimada (EAR) é o valor de ingestão diária de um
nutriente que se estima para atender às necessidades de 50% de indivíduos
saudáveis de um grupo em determinada faixa etária, condição fisiológica e gênero. A
ingestão adequada (AI) representa um valor de ingestão de nutriente, não de
necessidade, que provavelmente excede a real necessidade de quase todos os
indivíduos saudáveis, dentro de um determinado gênero e estágio de vida. A
ingestão dietética recomendada (RDA) é a quantidade do nutriente suficiente para
atender à necessidade da maior parte da população, aproximadamente em 97 a
98% dos indivíduos saudáveis de um grupo em determinado estágio de vida e
gênero. O limite superior tolerável de ingestão (UL) é o mais alto nível de ingestão
habitual do nutriente, que provavelmente não coloca em risco de efeitos adversos,
em aproximadamente, todos os indivíduos de um determinado estágio de vida e
gênero. Quando a ingestão aumenta acima do UL, aumenta o risco potencial de
efeitos prejudiciais à saúde. Desta forma, a vitamina C tem alta probabilidade de ser
tolerada biologicamente, o que não significa que este valor seja recomendado (IOM,
39, 40).
A Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
estabelece, na Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) nº 269, de 22 de setembro
de 2005, que a “Ingestão Diária Recomendada (IDR) é a quantidade de proteína,
31
vitaminas e minerais que deve ser consumida diariamente para atender às
necessidades nutricionais da maior parte dos indivíduos e grupos de pessoas de
uma população sadia.”.
A ingestão diária é estabelecida com base na ingestão habitual de pessoas
saudáveis e pretende atender à necessidade da maioria da população (98%), sendo
que a ingestão aqui advém do consumo alimentar e não da ingestão de
suplementos. Assim, a IDR é uma ferramenta para avaliar a adequação da dieta
e/ou alimento em relação ao nutriente em questão e não limitar a ingestão do
mesmo (39, 40)
O UL é um parâmetro do Institute of Medicine, no qual a ingestão diária
recomendada de vitamina C para atender a necessidade de homens de 14 a 18
anos é de 75 mg e acima dessa idade, 90 mg. Já para mulheres, a IDR de 14 a 18
anos é de 65 mg e acima dessa idade 75 mg. Os níveis de UL são estabelecidos
com base na observação da presença de efeitos adversos, assim, ingestão abaixo
da UL tem baixa probabilidade de efeitos adversos. O estabelecimento do UL surgiu
com o crescimento da prática de fortificação de alimentos e do uso de suplementos
alimentares dado que este é um valor a partir do qual o risco de toxicidade aumenta
progressivamente (38). Portanto, toda suplementação supre a IDR, visto que o valor
de
IDR
considera
a
ingestão
de
fontes
alimentares
e
não
de
suplementos/medicamentos (38).
Sobre a incidência de cálculo renal pela formação de oxalatos em sujeitos
predispostos, a literatura mostra que cerca de 75% dos cálculos renais contém cálcio
e são normalmente compostos de oxalato de cálcio, porém 5 a 10% deles são
compostos por ácido úrico. Existem suposições de que altas doses de vitamina C
aumentam a excreção de ácido úrico e de oxalato, e este fato poderia, em tese,
facilitar à formação de cálculos renais. Acontece que existem também outros fatores
que estão associados ao aumento do risco de formação de cálculos de oxalato de
cálcio, como exemplo: a ingestão excessiva de proteína, oxalato e sódio, bem como
a ingestão insuficiente de fibras e líquidos, altas temperaturas, além da exposição
excessiva ao sol (41).
Apesar de ter sido observada uma correlação entre a ingestão de vitamina C
e o oxalato urinário, não há demonstração evidente que comprove que a ingestão de
altas doses de vitamina C possa representar um risco na formação de cálculos de
32
oxalato de cálcio em indivíduos saudáveis. Portanto, alguns relatos de formação de
cálculos renais desencadeado pelo consumo excessivo de vitamina C estão
associados a indivíduos com nefropatias (36).
Auer et al. (41) utilizou 4 g/dia de AA durante 5 dias e concluíram que a
ingestão nessa dose não afetou os principais fatores de risco associados com
oxalato de cálcio e formação de cálculos renais. Além disso, grandes doses de
vitamina C (1,5 g ou mais) não produzem cálculos renais (42). Evidências indicam
que o consumo elevado de vitamina C não aumenta a excreção de oxalato ou induz
um aumento potencial na formação de cálculos renais (43, 44, 45). Por fim, nenhum
efeito da ingestão de altas doses de ácido ascórbico foi encontrado na excreção de
ácido úrico presente na urina, verificada diariamente (46).
Levine et al. (24) relataram que doses moderadas de vitamina C apresentam
maior biodisponibilidade, sugerindo que doses compreendidas entre 1.000 e 2.000
mg têm biodisponibilidade mais baixa do que uma dose de 500 mg. Além disso,
dados epidemiológicos demonstraram que o consumo de doses de vitamina C > 750
mg diminuem a mortalidade (47). Porém, doses similares > 715 mg, foram
associadas com a progressão mais lenta para o desencadeamento de AIDS em
homens infectados com o vírus da imunodeficiência humana adquirida-HIV (48). Por
outro lado, as doses de vitamina C ≤ 100 mg não tiveram efeito sobre o
desenvolvimento de câncer (49). Partindo destes e de outros dados epidemiológicos,
a ingestão da vitamina C pode variar de < 100 mg para > 750 mg.
Estudos de Aranha et al. (50) revelaram o tempo necessário de
suplementação com vitamina C, seja em forma de fármaco (comprimidos) ou na
forma natural, presente no suco de acerola (Malpighia glabra L.) em idosos
institucionalizados e residentes em cinco instituições da Grande João Pessoa,
Estado da Paraíba, Brasil, com a finalidade de normalizar os níveis séricos da
vitamina C e comparar qual tipo de suplementação teria melhor efeito na população
estudada.
Os níveis séricos de ácido ascórbico neste estudo foram compreendidos entre
0,20 a 0,80 mg/dL, que correspondiam ao intervalo entre os limites de carência
grave e de normalidade, portanto, estes níveis foram considerados como carência
moderada. Já os valores iguais ou acima de 1,60 mg/dL foram descritos como acima
do normal. O consumo alimentar foi verificado por inquérito dietético, constatando
33
um aumento significativo nas médias dos níveis de ácido ascórbico após 10, 20 e 30
dias, comparados aos níveis iniciais. Foi observado que os idosos suplementados
com suco de acerola com teor de 500 mg de vitamina C por porção, após 10 dias,
apresentaram níveis significativamente mais elevados do que os outros idosos que
foram suplementados com 500 mg de vitamina C em forma de comprimidos.
Estes autores concluíram que no 20º dia de suplementação da vitamina C o
efeito foi satisfatório para normalizar os níveis séricos dos idosos estudados,
sugerindo que este tempo poderia ser utilizado para idosos em geral, e
principalmente aqueles com hipovitaminose C que vivem em instituições que
abrigam idosos carentes, além de indicar o suco de acerola como um suplemento de
fácil aquisição e por ser um produto natural que contêm vitamina C.
Em outro estudo desenvolvido por Costa et al. (51) foi avaliada a prevalência
da deficiência de vitamina C em 104 crianças de 2 a 6 anos de idade, de creches
municipais de João Pessoa, PB. Nesta mesma pesquisa a eficácia da vitamina C foi
analisada, através da suplementação das crianças com suco de acerola. Para isto
foram realizadas dosagens de vitamina C sérica e de hemoglobina antes e depois da
intervenção. Os resultados demonstraram que havia, inicialmente, prevalência de
69,2% de carência de vitamina C (< 0,80 mg/dL) e 35,7% de crianças com níveis
baixos de hemoglobina (Hb < 11,0 mg/dL), indicando anemia. Para aquelas crianças
que apresentaram níveis baixos de vitamina C (72 crianças) foram fornecidos,
durante 35 dias, suco de acerola com um volume de 150 mL (teor médio 565 mg de
ácido ascórbico/100 mL).
Os níveis séricos médios de vitamina C antes e após a suplementação foram
de 0,52 + 0,20 mg/dL e 1,43 + 0,43 mg/dL, respectivamente, apresentando diferença
estatisticamente
significativa.
Também
ocorreu
aumento
significativo
na
concentração média de hemoglobina, que era de 11,17+ 1,46 g/dL passando para
12,22 + 1,52 g/dL. Assim, tomados juntos, estes resultados indicam que a
disponibilidade e o baixo custo da acerola, nesta região, justificariam a proposta de
inclusão desta fruta em programas de alimentação para populações de alto risco
para a anemia, tendo em vista o teor de vitamina C presente neste alimento.
34
Em adição foi demonstrado, também, que a suplementação com comprimidos
de 200 mg de vitamina C, durante 30 dias, corrigiu satisfatoriamente os níveis
séricos de ácido ascórbico de idosos franceses institucionalizados de ambos os
sexos (52).
Em uma revisão, Deruelle e Baron (53) relataram que a vitamina C, em dose
maior do que 400 mg/dia, pode melhorar a proteção contra o estresse oxidativo,
certos tipos de câncer, e doenças degenerativas e crônicas. Além disso, sugere que
a suplementação de vitamina C além de ser segura, também é necessária para
atingir a saúde ideal. Portanto, de acordo com a literatura atual, estes autores
aconselham as pessoas saudáveis a consumirem diariamente cinco porções de
frutas e vegetais, adicionados a 1 g de vitamina C, dividida em duas ou três doses
durante o dia, a fim de assegurar um ajuste ótimo em vitamina C.
Com base em estudos epidemiológicos têm sido sugerido que a ingestão
diária de 100 mg/dia de vitamina C é associado com a redução da incidência de
mortalidade provocada por ataques cardíacos, isquemia e câncer (54). Mas é
oportuno observar que estresse, hábito de fumar, alcoolismo, febre e infecções virais
podem causar um declínio acentuado dos níveis sanguíneos de AA (1).
1.1.3 Antioxidantes
Antioxidantes são substâncias que, em baixa concentração, são capazes de
retardar o processo oxidativo de proteínas, carboidratos, lípidios e DNA (55),
podendo ser classificadas em dois grupos: enzimáticos e não-enzimáticos. Alguns
antioxidantes podem ser sintetizados endogenamente, como enzimas e cofatores
enzimáticos. Porém, os antioxidantes não-enzimáticos são obtidos de fontes
dietéticas e são classificados como: polifenóis, os quais consistem de ácidos
fenólicos e flavonóides. Outras classes de antioxidantes incluem vitaminas,
carotenóides, compostos organossulfurados e minerais (56).
As primeiras linhas de defesa antioxidante no sistema biológico incluem
superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR) e alguns
35
minerais, tais como selênio (Se), cobre (Cu) e Zinco (Zn). Para a segunda linha de
defesa antioxidante estão presentes a glutationa (GSH), vitamina C, vitamina E,
albumina, carotenóides e flavonóides. Na terceira linha de defesa encontra-se um
complexo grupo de enzimas com a finalidade de reparar o dano ocorrido no DNA,
proteínas, oxidação de lipídios e peróxidos como, por exemplo, as enzimas
reparadoras do DNA, proteases, lipases, transferases e metionina sulfóxido redutase
(55).
Os antioxidantes têm se destacado, nos últimos anos, devido ao seu
importante papel como agentes profiláticos e terapêuticos em diversas doenças (56).
O estresse oxidativo pode provocar danos celulares e teciduais como consequência
do desequilíbrio entre espécie reativa de oxigênio (ROS) e as defesas antioxidantes,
resultando em uma série de comprometimentos celulares que podem conduzir a
diversas patologias, como artrite, asma, carcinogênese, disfunção cardiovascular,
cataratas, doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson, bem como
diabetes e outras doenças autoimunes (55).
A vitamina C exerce ação como antioxidante por agir como um doador de
elétrons ou como um eficiente sequestrador de radicais livres (7). Apresenta,
portanto, efeitos neuroprotetores provenientes de sua ação antioxidante (27).
Estudos têm mostrado que o tratamento com os antioxidantes podem
beneficiar as funções cognitivas em animais idosos e em seres humanos (57, 58).
Isto pode ser devido ao envolvimento dos antioxidantes na redução do estresse
oxidativo combinado com uma maior sensibilidade para a geração de espécies
reativas de oxigênio em animais e idosos, o que pode levar à morte da célula e
comprometimento cognitivo (59, 60). Kolosava et al. (61) demonstraram que
suplementação com antioxidantes a longo prazo atenua déficits cognitivos e
marcadores de estresse oxidativo em ratos senescent-accelerated OXYS em
comparação com ratos Wistar. No entanto, o mecanismo exato de neuroproteção
atribuído aos antioxidantes in vivo e do impacto do estresse oxidativo na disfunção
cognitiva continua a ser investigado.
O processo de envelhecimento tem sido muitas vezes associado com o
aumento do dano oxidativo, o que conduz à hipótese de que os antioxidantes devem
prolongar a vida útil, reduzindo os danos causados pelo estresse oxidativo (62). Há
especulações sobre a ingestão diária de vitamina C e sua capacidade de retardar o
36
processo de envelhecimento e aumentar a longevidade (63). AA foi usado como um
suplemento em dietas para humanos. No entanto, a sua participação na expectativa
de vida em humanos e modelos animais ainda não está claro. Por esta razão,
Pallauf et al. (62) avaliaram o efeito de AA no tempo de vida. Estes autores
descobriram que alguns estudos sugerem um aumento na expectativa de vida,
enquanto outros estudos não mostraram nenhum efeito benéfico do AA sobre a
longevidade.
1.1.4 Efeito neuroprotetor
Para acessar o cérebro e vários outros tecidos, a vitamina C tem que ser
oxidado a ácido dehidroascórbico, que por sua vez necessita ser transportado por
difusão facilitada via transportadores de glicose (GLUT) antes de ser reduzido, no
meio intracelular, de volta a ácido ascórbico (30, 64). Desta forma ascorbato é
transportado para dentro do cérebro e neurônios via transportadores de vitamina C
dependente de sódio-2 (SVCT2), os quais promovem acúmulo de ascorbato dentro
das células contra um gradiente de concentração (65, 66).
A vitamina C é altamente concentrada no sistema nervoso central (67), onde
possui várias funções: é essencial para a síntese de noradrenalina a partir de
dopamina (6), está envolvida na libertação de acetilcolina a partir das vesículas
sinápticas de diferentes espécies e de noradrenalina em preparação de vesículas
sinápticas do cérebro de ratos (68); exerce ação como um neuromodulador no
cérebro,
estando
envolvido
na
transmissão
glutamatérgica,
dopaminérgica,
colinérgica e GABAérgica (3, 6, 7). Estudos prévios indicam que a vitamina C
previne déficit de memória em decorrência deste efeito antioxidante (69). Em adição,
tem sido mostrado que sua aplicação local aumenta a resposta de neurônios
dopaminérgicos e glutamatérgicos, portanto, é possível que parte de seus efeitos
seja devido às suas funções modulatórias do neurotransmissor glutamato (70).
Existe uma clara relação entre o ácido ascórbico e os sistemas colinérgicos e
dopaminérgicos, pois há evidência de que o ácido ascórbico pode se comportar
como um antagonista do receptor de dopamina. Ademais, o ácido ascórbico inibe a
37
ligação de agonistas específicos dos receptores D1 ([3H]SKF 38393) e D2 ([3H] N0437) de dopamina (71).
Tem sido proposto que o ascorbato age como um neuromodulador envolvido
nos sistemas glutamatérgicos e dopaminérgicos (3, 6). Embora os mecanismos
pelos quais o ascorbato afeta a neurotransmissão não tenha sido bem estabelecida.
Acredita-se que isto possa estar relacionado, em parte, pela mudança redox no
receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Esta molécula pode proteger neurônios da
excitotoxicidade induzida pela ativação do receptor NMDA e previne injúria celular
induzida por glutamato e morte em culturas de células granulares do cerebelo (72,
73). Estes efeitos podem ser devidos à modulação redox do receptor pelo ascorbato
(74, 75) ou do direto sequestro de ROS pela ativação do receptor NMDA. Quando
ocorre um severo estresse causado por isquemia aumenta a liberação de grande
quantidade de ascorbato proveniente de células neuronais (76), os quais são
associados com recaptação de glutamato pelas células da glia e neurônios (7, 77). A
remoção de glutamato extracelular por este processo estaria também relacionado
com a diminuição da excitotoxidade causada pela ativação de células e receptores
de glutamato (3, 6, 76).
Existem projeções ricas de neurônios glutamatérgicos provenientes do córtex
para o neostriato. Quando ocorre uma injúria no córtex, interferindo nessa conexão,
os níveis basais de ascorbato diminuem no neostriato (6, 78). O aumento dos níveis
de ascorbato extracelular que são vistos depois da atividade ou administração de
anfetaminas não são uniformes através das diversas áreas cerebrais e
possivelmente devem implicar no sistema de troca entre o neurotransmissor
glutamato e ascorbato no controle dessas mudanças (79).
Estudos de voltametria in vivo da atividade induzida por anfetamina indicam
que ocorre um aumento dos níveis de ascorbato no núcleo caudado. Além disso,
administração de ambos scopolamina e MK-801 (antagonista clássico do receptor
NMDA) diminui o aumento no pico de ascorbato, sugerindo a relação entre a
liberação de ascorbato e a estimulação do receptor colinérgico (80).
Diversos resultados de estudos in vivo suportam a hipótese da concepção
que ascorbato intracelular é crucial para proteção contra estresse oxidativo. Um
aumento intracelular de ascorbato em fatias de cérebros de ratos diminuiu o edema
induzido por estresse oxidativo (81).
38
Algumas doenças neurodegenerativas têm sido avaliadas devido a inúmeras
evidências do envolvimento do estresse oxidativo em processos cerebrais,
observando os aspectos importantes da participação do ascorbato neste contexto
(4). Tudo indica que neurônios são especialmente sensíveis à deficiência de
ascorbato, talvez porque os neurônios tenham metabolismo oxidativo 10 vezes mais
alto do que células da glia (82; 83). Possivelmente, esta sensitividade neuronal é
mais expressiva quando o suprimento de ascorbato é baixo sob certas condições,
principalmente quando existe excesso de estresse oxidativo.
A relação do ROS em doenças neurodegenerativas desperta interesse para a
busca do entendimento das ações do ascorbato, como um agente antioxidante, pela
sua
abordagem
terapêutica,
apesar
de
sua
interação
com
sistemas de
neurotransmissores, ainda é difícil discernir qual seria o específico mecanismos que
esteja envolvido em doenças neurodegenerativas, tais como Alzheimer, Parkinson,
Huntington e outras e a participação do ascorbato neste circuito neuronal (4).
1.2
PROCESSOS COGNITIVOS E EMOCIONAIS
1.2.1 Conceito de ansiedade
A ansiedade é uma resposta diante da percepção de um perigo ou ameaça
que pode ser acompanhada de componentes comportamentais, fisiológicos e
cognitivos. Os componentes comportamentais estão relacionados à maneira como
evitar a situação que provoca a ansiedade. As reações fisiológicas podem incluir o
aumento da frequência cardíaca e sudorese. Os componentes cognitivos estão
associados com crenças e pensamentos adversos e uma expectativa de dano (84,
85).
A ansiedade pode ser caracterizada como traço e estado. A ansiedade traço é
identificada por diferentes situações e é estável, enquanto a ansiedade estado é
transitória, apenas é vivenciada em situações específicas (86). Estes componentes
da ansiedade podem ser adaptativos quando expressam sobrevivência ou melhoram
39
desempenho. Desta forma, por exemplo, a adrenalina é liberada para os indivíduos
diante do perigo ou quando ocorre um aumento da atenção para ajudar estudantes
em seus exames e tarefas escolares (87).
1.2.2 Transtorno de ansiedade
Os transtornos de ansiedade são um dos tipos mais comuns de doença
diagnosticadas na infância, adolescência e idade adulta, incluíndo também
estudantes do ensino médio. As causas e fisiopatologia não estão completamente
esclarecidas. Estudos têm revelado que os transtornos de ansiedade afetam em
torno de 28,8% da população dos EUA (88), e correspondem a um custo total de
42,300 milhões dólares (89). Estima-se que um oitavo do total da população mundial
sofre de ansiedade inapropriada (90).
Quando a ansiedade se torna persistente, excessiva, e compromete
significativamente as atividades da vida diária é classificada como um transtorno
mental que pode ser diagnosticada, conforme o Manual de Diagnóstico e Estatístico
de Transtornos Mentais (DSM-5) (91).
A mais nova edição do Manual de Diagnóstico e Estatístico de Transtornos
Mentais (DSM-5) da American Psychiatric Association foi publicada
oficialmente em 18 de maio de 2013. Esta edição é fruto de um trabalho de
doze anos de estudos, revisões e pesquisas de campo, que resultou do
esforço e dedicação de centenas de profissionais divididos em grupos com
diferentes atribuíções. A meta final estabelecida foi garantir que esta nova
versão abrangesse a inclusão, reformulação e exclusão de diagnósticos,
que possibilitaria uma fonte segura e científica com vistas à aplicabilidade
em pesquisas, bem como na prática clínica (92).
Nesta nova edição da DSM-5, o capítulo referente ao Transtorno de
Ansiedade foi reformulado e os diagnósticos de Transtorno Obsessivo Compulsivo
(TOC), Transtorno de Estresse Agudo e Transtorno de Estresse Pós-Traumático
foram realocados em novos capítulos (92).
Os quadros fóbicos conhecidos por Agorafobia, Fobia Específica e Transtorno
de Ansiedade Social deixaram de exigir que o indivíduo com mais de dezoito anos
identifique seu medo como “medo excessivo ou irracional”, tendo em vista que
40
diversos pacientes buscam supervalorizar o perigo disponibilizado pelo objeto ou
mesmo pelo evento fóbico experimentado. Para o diagnóstico desses transtornos é
necessário uma duração mínima de seis meses, não delimitando a idade do
paciente, ou seja, para todas as idades (92).
Outros transtornos, tal como o Transtorno de Pânico e a Agorafobia, foram
separados como diagnósticos independentes. Isto possibilitou o reconhecimento de
casos nos quais a Agorafobia pode aparecer sem a presença de sintomas de
pânico. Por sua vez, o Ataque de Pânico pode ser observado como comorbidade em
outros transtornos mentais não essencialmente ligados à ansiedade. Este fato levou
o DSM-5 à inclusão do Ataque de Pânico como especificador para todos os demais
transtornos (92).
A American Psychiatric Association (91) descreve os transtornos de
ansiedade especificados abaixo, DMS-5 (2013):
Transtornos de Ansiedade
Transtorno de Ansiedade de Separação
Mutismo seletivo
Fobia Específica
Transtorno de Ansiedade Social (Fobia Social)
Transtorno de Pânico
Ataque de Pânico (especificador)
Agorafobia
Transtorno de Ansiedade Generalizada
Transtorno de Ansiedade induzido por medicamentos/substâncias
Transtorno de Ansiedade devido a outra condição médica
Outro Transtorno de Ansiedade especificado
Transtorno de Ansiedade não especificado
Obsessivo-Compulsivo e Doenças Relacionadas
Transtorno Obsessivo-Compulsivo
Transtorno Dismórfico Corporal
Transtorno entesouramento
Tricotilomania (Transtorno de puxar os cabelos)
Transtorno de Escoriação (Skin-Picking – doença da pele picking)
41
Transtorno Obsessivo-Compulsivo induzido por medicamentos/substâncias e
Transtorno relacionado
Transtorno Obsessivo-Compulsivo e devido a outra condição médica e
Transtorno relacionado
Outro
Transtorno
Obsessivo-Compulsivo
especificado
e
transtorno
relacionado
Transtorno Obsessivo-Compulsivo não especificado e transtorno relacionado
Trauma e Transtornos relacionados ao Estresse
Transtorno de Apego Reativo
Transtorno de Engajamento Social Desinibido
Transtorno de Estresse Pós-Traumático
Transtorno de Estresse Agudo
Transtornos de Adaptação
Outro Trauma especificado e Transtorno relacionado ao Estresse
Trauma não especificado e Transtorno relacionado ao Estresse
Uma diversidade de fatores pode desencadear o desenvolvimento dos
transtornos de ansiedade, dentre eles incluem: influência genética, ambiental,
familiar, temperamento e estílo cognitivo (93, 94, 95). Transtornos de ansiedade
também são associados com uma gama de consequências negativas, tais como:
redução da autoestima e da qualidade de vida; aumento do risco de depressão e
abuso de substâncias (96-101). Ademais, os transtornos de ansiedade estão
envolvidos com ônus econômico substancial devido à participação na força de
trabalho e gastos com altos custos medicinais e dependência de assistência médica
dos governantes (102, 103, 104).
Pesquisas têm revelado que pessoas diagnosticadas com o TOC apresentam
vieses no processamento da informação, ressaltando a atenção (105, 106), memória
(107, 108, 109) e vieses de interpretação para informações que representem
ameaças (110-113). Além disso, outros estudos identificaram que indivíduos com
TOC mostram prejuízo de memória (114, 115, 116); na organização visuoespacial
(117, 118, 119), bem como nas funções executivas (120, 121, 122).
42
1.2.3 Ansiedade e desenvolvimento em humanos
As condições nutricionais do recém-nascido e da gestante estão relacionadas
com o peso ao nascer, mensurado na primeira hora após o nascimento, e que
indicam condições apropriadas de saúde dos indivíduos, e pode influenciar o
crescimento, desenvolvimento e, em longo prazo, também pode indicar as condições
de saúde dos adultos (123). Alguns estudos têm apontado que a ansiedade na
gestação
pode
ser
considerada
um
possível
fator
determinante
para
a
prematuridade e o baixo peso dos bebês ao nascer (124-127).
A ansiedade pode interferir negativamente na gestação devido a mudanças
endócrinas e comportamentos de risco, como, por exemplo: o hábito de fumar e
ingestão de bebidas alcóolicas pela gestante; prénatal inadequado ou tardio; ganho
de peso gestacional e alimentação inadequada (128, 129). Sintomas de ansiedade
são frequentes e prejudiciais às mulheres em idade cronológica propícia à fertilidade.
Na verdade, muitas mulheres apresentam quadros de ansiedade no período
gestacional (130).
Os transtornos de ansiedade são os tipos mais comuns de psicopatologia
encontrados em crianças (131, 132). Estão relacionados a aspectos negativos,
social, escolar e ajustamento pessoal. Nem sempre ocorrem de forma passageira e
podem persistir na adolescência e na fase adulta, caso não forem adequadamente
tratados (133, 134).
Estudos têm revelado que problemas de ansiedade na infância podem
desencadear outras formas de psicopatologia, tais como transtornos de conduta,
transtornos de humor, depressão e tentativas e concretização de suicídio (135, 136),
além de outros problemas sociais, como, por exemplo, dificuldades em resolver
problemas, impopularidade e relacionamentos entre casais fragilizados (137, 138,
139). Desta maneira, crianças ansiosas apresentaram menos sucesso para constituir
amizades do que aquelas que não manifestavam transtorno de ansiedade,
caracterizando que a ansiedade na infância exibe dificuldades sociais significativas
(140, 141).
Os sintomas físicos dos transtornos de ansiedade são provenientes da
liberação dos hormônios relacionados com o estresse como adrenalina e cortisol,
43
pelos quais produzem efeitos sobre a maioria dos órgãos do corpo. Quando os
transtornos de ansiedade não são tratados adequadamente, podem conduzir a
quadros depressivos, os quais, por sua vez, podem resultar no aumento da pressão
arterial, palpitações cardíacas, dor no peito, respiração rápida ou falta de ar,
sudorese excessiva, aumento da tensão muscular, bem como irritação e diminuição
do fluxo sanguíneo intestinal, provocando náuseas ou diarréia. Pode haver ainda
diminuição na atividade sexual. Crianças com quadros de ansiedade podem ter
medo de estar distante de seus familiares, não querer mais frequentar a escola,
desencadear medo de pessoas estranhas ou medo de dormir ou terem pesadelos
recorrentes (142).
1.2.4 Modelos animais de ansiedade
Os modelos animais de ansiedade podem ser utilizados com a finalidade de
contribuir para o entendimento de mecanismos moleculares e na busca de novos
agentes farmacológicos, com vista ao tratamento da ansiedade, que possivelmente
seria inviável em seres humanos. Modelos animais para avaliação de fatores
psicopatológicos têm se tornado uma valiosa ferramenta na análise de uma
variedade de causas tanto genéticas, ambientais ou farmacológicas, que estão
envolvidas com os sintomas homológos àqueles apresentados em pacientes com
transtornos específicos (143).
A validade do modelo é um critério determinante para o desenvolvimento de
modelos animais com a finalidade de estudar fatores psicopatológicos que
representem o processo estudado de forma mais real e fidedigna possível. Existem
três tipos de parâmetros aplicados para a validade dos modelos animais, como se
segue: (1) validade de fase; (2) validade de constructo e (3) validade preditiva (144).
A validade de fase consiste de um modelo fenotipicamente semelhante, que
possa emitir respostas detectadas no modelo animal que represente idênticas
respostas comportamentais e fisiológicas encontradas nos seres humanos. A
validade de constructo está associada com a semelhança entre uma base téorica e
lógica, subjacente ao modelo comportamental observado em animais e humanos. Já
44
a validade preditiva está envolvida na sensibilidade do modelo animal a agentes
farmacológicos efetivos na prática clínica. Compostos ansiogênicos devem produzir
efeitos opostos, enquanto agentes que clinicamente não apresentam nenhum efeito,
também não devem ter efeitos sobre os testes aplicados no modelo animal (144).
Os três tipos de validade podem ser independentes entre si, por exemplo, um
modelo animal por ter validade preditiva e de constructo, mas não a validade de
face. O modelo ideal seria aquele que apresenta as duas validades (preditiva e
constructo) para ser utilizado em pesquisa na busca do entendimento dos
mecanismos, da etiologia, bem como dos aspectos biológicos e comportamentais
envolvidos na patologia estudada; que pode ser semelhante, tanto em animais como
em humanos (144, 145).
Em adição, modelos animais usados na prática experimental podem ser
avaliados através de procedimentos laboratoriais em uma espécie específica, com o
objetivo de verificar fenômenos que devem ser detectados numa outra espécie, que
propiciam identificar possíveis intervenções no tratamento de determinado transtorno
que está sendo estudado (146, 147, 148).
Os humanos compartilham cerca de 90% dos seus genes com ratos, portanto,
este modelo animal parece ser uma ferramenta biológica importante em estudos
relacionados às ciências biomédicas, visto o aumento da quantidade de laboratórios
ativos que utilizam ratos em seus protocolos experimentais (146, 147, 149).
Adicionalmente, modelos animais auxiliam a avaliação de situações estressantes
que não podem ser aplicadas em seres humanos, por inúmeras razões, bem como
por comprometimentos éticos (147).
Modelos animais de ansiedade podem ser classificados como respostas
condicionadas e respostas não condicionadas (144). O primeiro modelo está
associado a respostas condicionadas emitidas pelo animal após eventos
estressantes (exposição a choque elétrico) e na maioria das vezes provoca dor no
animal; já o segundo modelo inclui paradigmas de base etológica, com um repertório
de comportamentos espontâneos e de reações naturais (fuga, esquiva e
congelamento), quando o animal é submetido ao estímulo estressante sem a
presença explícita de eventos dolorosos, ou que causem desconforto para o animal
45
no momento do teste (câmaras iluminadas ou exposição ao cheiro do predador)
(144).
O labirinto em cruz elevado (LCE) é um dos mais conhecidos modelos
etológicos de teste comportamental para avaliar níveis de ansiedade. Foi idealizado
inicialmente para ratos por Pellow et al. (150), mas atualmente pode ser utilizado
também com outras espécies, tais como camundongos, porcos da guiné, voles,
hamsters e gerbils. Outros tipos de labirintos foram desenvolvidos em derivação ao
LCE, e incluem labirinto em T elevado, labirinto zero e LCE instável (144).
O LCE é construído sob a forma de uma cruz que tem dois braços abertos,
em oposição um ao outro, por uma plataforma central. Os outros dois braços
possuem as mesmas dimensões, mas as paredes laterais são fechadas. O labirinto
formado é elevado do chão para que os braços abertos possam fornecer um
ambiente desconhecido, aberto e elevado. Uma ligeira borda saliente é colocada
sobre os braços abertos com a finalidade de proporcionar aderência adicional aos
animais, evitando possíveis quedas do labirinto (Figura 3).
Figura 3. Labirinto em cruz elevado
46
Os ensaios experimentais podem ser gravados com o uso de câmeras de
vídeo. No teste, o animal é colocado individualmente sobre a plataforma central do
LCE. O número de entradas e o tempo gasto nos braços abertos e fechados podem
ser registrados durante o teste com o tempo máximo de 5 min. Cada entrada em um
dos braços é definida quando o animal coloca as quatro patas sobre o braço. Após o
término de cada teste, o LCE é limpo com uma solução de 10% de etanol (151).
Este paradigma tem como base a aversão natural que roedores emitem a
espaços abertos e proporciona conflito entre exploração e aversão a locais abertos e
elevados. Perfis comportamentos exibidos no LCE incluem elementos de neofobia,
abordagem de exploração e conflito de esquiva. Desta forma, o LCE é referido como
um modelo de conflito comportamental espontâneo não condicionado (144), portanto
etológico. Em adição, o LCE é sensível aos agentes com propriedades ansiogênicas
e ansiolíticas, validado tanto para ratos como para camundongos (152, 153).
A principal limitação para uso de modelos etológicos é a falta de padronização
entre os diversos laboratórios de pesquisa. A diversidade é observada em diferentes
perfis: alguns modelos utilizam equipamentos quadrados, outros circulares;
ambientes claros, outros escuros; ambientes bem iluminados, outros totalmente
escuros; alguns são abertos e outros são fechados. O tempo de registro do teste
também pode variar de 2 a 20 min, mas geralmente se utiliza 5 min de exposição ao
LCE (145).
1.2.5 Formação da Memória
O conceito de memória, descrito por Izquierdo (154), envolve operações de
aquisição, formação, conservação e evocação de informações. Nesta definição o
termo “aquisição” seria o sinônimo de “aprendizagem”, gravado por ter sido
aprendido. Assim, estímulos sensoriais convertidos pela ação neuronal, em código
de sinais elétricos e neuroquímicos complexos são reconvertidos durante a
evocação, tornando-se compreensíveis pela consciência.
47
A aprendizagem é definida como uma mudança comportamental, mais ou
menos permanente, que acontece devido à prática (155). Segundo Eric Kandel
(156), a aprendizagem e a memória são processos contínuos.
“A aprendizagem é o processo pelo qual se adquire conhecimento sobre as
coisas em volta do mundo e a memória é o processo pelo qual o
conhecimento adquirido deste mundo é codificado, armazenado e,
posteriormente, recuperado” (156).
Desta forma, a aprendizagem é o processo que altera o comportamento
subsequente, enquanto a memória é a capacidade de recordar os acontecimentos e
experiências do passado (157).
No decorrer de mais de um século assumiu-se que memórias adquiridas
recentemente permaneciam em um estado dinâmico por um período de tempo bem
curto, depois ela era fixada ou consolidada. Pensava-se, portanto, que memórias
consolidadas eram persistentes e insensíveis a interrupções (158). Nos últimos 15
anos esta visão clássica da consolidação tornou-se objeto de contestação.
Evidências mostram que a recuperação ou reativação de memórias consolidadas
voltam a um estado de memória instável. Por sua vez, estas memórias reativadas
necessitam ser novamente reestabilizadas (reconsolidação) (159).
Durante este processo, as memórias reconsolidadas podem ser fortalecidas,
enfraquecidas ou mesmo atualizadas, possibilitando modificações em memórias
aparentemente estáveis, até para aquelas memórias de década (159). Assim as
memórias são suscetíveis a novas alterações, desencadeando, desta maneira, uma
oportunidade para que memórias aparentemente estáveis sejam atualizadas (159)
(Figura 4).
Esta idéia de que as memórias retornam de um estado vulnerável depois da
sua recuperação não é totalmente recente. Já na década de 1960, experimentos
utilizando choques “eletroconvulsoterapia”, um tratamento amnésico, propiciava
perda de memória, quando era administrada logo em seguida a recuperação (160,
161). Respostas similares eram encontradas nos anos seguintes (162, 163). Estes
resultados foram interpretados como sinais para uma distinção entre traços de
memórias inativas, não vulneráveis dentro do cérebro, bem como traços de
memórias ativas passíveis de interrupção, independemente do tempo de codificação
48
(164). Identificado como amnésia dependente (162, 163) e tempo mais tarde
chamado de reconsolidação (165, 166).
Figura 4. O conceito da reconsolidação da memória. Depois de um estímulo novo ser aprendido, a
memória encontra-se no estado ativo até passar para a consolidação. No momento da recuperação a
memória consolidada que está inativa passa para um estado ativo novamente, a partir deste ponto a
memória precisa ser estabilizada de novo. O processo pelo qual memórias são reativadas novamente
é conhecido por reconsolidação. Durante o processo de reconsolidação os traços de memória ativos
são vulneráveis para as modificações. Fonte: Adaptado de Schwabe et al. (159).
A capacidade para que ocorram alterações das memórias emocionais
estabelecidas revelam importantes implicações para o tratamento de diversas
perturbações mentais, dentre elas o transtorno de ansiedade, como no transtorno de
estresse pós-traumático (TEPT) (167). Neste transtorno de ansiedade o evento que
provocou o trauma pode ser considerado o resultado da superconsolidação da
memória envolvida em eventos traumáticos, pela ação de hormônios do estresse,
49
tais como os glicocorticóides e noradrenalina, que são liberados em respostas a
inúmeras situações de experiências traumáticas (168).
Estes hormônios são descritos como promotores da formação de memórias
duradouras (158, 169). Desta maneira uma estratégia para tratar memórias
traumáticas seria o bloqueio da ação destes hormônios, após um evento
potencialmente estressante e traumático que ocorreu, interferindo no processo de
consolidação. Existem evidências que esta abordagem pode ser bem sucedida (170,
171, 172). Por exemplo, pacientes que sofreram um acidente de carro e foram
tratados com o antagonista do receptor β-adrenérgico propranolol pouco tempo
depois do acidente, tornaram-se menos propensos para o desenvolvimento dos
sintomas do TEPT nos três meses que sucederam ao acidente, em comparação aos
pacientes que receberam placebo (170).
Nestes casos, a formação da memória somente poderá ser modulada no
período de tempo relativamente curto após o evento traumático, durante os quais
muitas pessoas não conseguem acesso ao tratamento clínico. Aqui a reconsolidação
da memória é acionada. Se as memórias são suscetíveis a alterações novamente
após a recuperação, isto pode gerar uma oportunidade para modificações da
memória traumática. Pacientes com TEPT crônico foram solicitados a escrever um
roteiro de algum evento traumático pessoal, abordando a situação traumática que
provocou o TEPT (173). Os pacientes receberam logo em seguida propranolol ou
placebo. Após uma semana todos os pacientes foram submetidos a um
procedimento de imagens orientado para roteiros psicofisiológicos. Os resultados
encontrados revelaram que as respostas psicofisiológicas durante a exposição da
imagem mental de situações traumáticas eram significativamente mais baixas em
pacientes tratados uma semana antes com propranolol do que os pacientes do
grupo placebo.
Outros três estudos replicaram estes resultados (174). Apesar da falta de
grupo controle apropriada, estes estudos, possibilitaram concluir que os efeitos
observados eram em decorrência das alterações na reconsolidação da memória,
não sugeriram que manipulações depois da recuperação da memória devam ser
uma estratégia promissora para o tratamento da TEPT, mesmo quando o evento
traumático ocorreu a décadas passadas (159).
50
1.2.6 Os sistemas de Memória em Humanos
A memória de curto prazo, conhecida como sistema unitário, começa a ser
questionada devido a novos estudos experimentais, com a introdução do conceito de
memória operacional sugerido por Baddeley e Hitch (175). Assim, a memória de
curto prazo, também definida como memória imediata, por se tratar de uma memória
de funcionamento rápido, que dura cerca de alguns segundos e no máximo de três
minutos (154), portanto, é uma memória que mantém os indivíduos integrados aos
fatos vivenciados da realidade imediata.
Memória operacional, por sua vez, é um sistema que processa e armazena e
opera informações por um determinado período de tempo curto, que pode variar de
minutos a horas, com uma limitada capacidade para armazenar a informação. Esta
memória exerce ação na execução de tarefas complexas e rotineiras, tais como a
compreensão da linguagem, raciocínio lógico e matemátio. Ela pode se comunicar
com retenção e troca de informações com a memória de longo prazo. Baddeley
(176) propôs uma divisão para a memória operacional em subsistemas: o executivo
central, que desempenha gerenciamento das operações cognitivas e controle da
atenção, embora, apresente uma capacidade atencional limitada.
Dois outros subsistemas integram o executivo central, são eles: a alça
fonológica, que mantém por um tempo reduzido o processamento das informações
verbais e auditivas e o esboço visuoespacial, que apresenta funções similares
quanto às informações de aspecto visual e espacial. Existe ainda, um terceiro
subsistema, proposto por Baddeley (177), chamado de retentor episódico, que
exerce função de integrar as informações fonológicas, visuais e espaciais
provenientes do ambiente externo ou da memória de longo prazo. Este subsistema
representa uma situação multimodal e temporal (178, 179).
Evidências mostram que o sistema do laço fonológico é bem estabelecido, e
funcionaria independente do sistema de memória visuoespacial. Este, porém,
poderia ser mais bem entendido caso houvesse uma divisão em dois componentes:
um para as informações visuais e outro para as espaciais. Isto levaria a melhores
interpretações dos resultados experimentais, além de melhorar as estratégias para
modificações de memórias traumáticas (180) (Figura 5).
51
Figura 5. Classificação da Memória. Fonte: Adaptado de Andrade et al. (181); (Repovs e Baddeley
(178).
52
No caso da memória de longo prazo, os sistemas múltiplos de memórias
foram classificados e definidos como memórias declarativas (explícita) que poderiam
ser prejudicadas em pacientes amnésicos, por lesão hipocampal (182) e não
declarativa (implícita). Este primeiro tipo de memória envolvia a lembrança de fatos e
eventos conscientes, decompostas em memória semântica (para fatos) e memória
episódica (para eventos) (Figura 6).
A memória declarativa foi considerada associada a uma rede altamente
flexível, que permite que estas memórias sejam acessadas conscientemente e
“declaradas”, ou seja, memória explicita na consciência (183). Além disso, danos no
hipocampo estão envolvidos nestes processos mnemônicos, enquanto outros são
preservados. O sistema de memória poupado representa as memórias que não
compõe arquivos conscientes, portanto, memória implícita à consciência (184). Este
sistema de memória que poderia estar preservado na amnésia ou em animais com
injúria hipocampal foi descrito como memórias não declarativas (implícitas) definidas
como memórias que são apresentadas por meio do desempenho e do
reconhecimento, como habilidades, priming (pré-ativado), condicionamento clássico
e aprendizagem não associativa (Figura 6).
53
Figura 6. Memória de longo prazo e estruturas cerebrais envolvidas nos múltiplos sistemas de
memória. Fonte: (185) adaptado de Mullaly e Maguire (186). © National Academy of Sciences.
54
1.2.7 Os sistemas de Memória em Animais
Os animais demonstram possuir conhecimento do mundo que os cercam e
que é necessário para que ocorra a sua reprodução e sobrevivência. O
comportamento animal se organiza através da informação adquirida e antecipa os
eventos externos que ultrapassam as condições ambientais (187).
A etologia encarrega-se de fornecer uma fonte de informações em relação
aos eventos externos, tomando como base fatores genéticos e a história seletiva do
organismo. Campan e Breugnon (188) se referem a estas informações como uma
visão extremamente genética “memória-restrita-à-leitura”. Por outro lado, Ades (187)
apontou que esta memória de contéudo hereditário está também respaldada na
experiência, capaz de exercer um controle e orientar a vida dos animais no
ambiente.
Existe um consenso que a memória é composta por vários sistemas ou
módulos, que funcionam e atuam de modo específico. Por exemplo, a memória de
hábitos (189) está envolvida na aquisição de novas habilidades, melhor desempenho
motor e no comportamento operante, como na memória implícita. Se um esquilo
nunca abriu uma avelã irá perder um bom tempo roendo-a de um lado para o outro,
mas com a prática, logo chegará a uma solução simples, que apenas com uma
dentada, consegue partir a casca da avelã em duas partes, incorporando esta ação
ao seu repertório de comportamento (190). Portanto, a memória de hábito se
desenvolve a partir das repetições e de acordo com Sherry e Schacter (189), este
tipo de memória depende “da detecção e da preservação da invariância durante a
repetição dos episódios”.
A memória de eventos adotada por Sherry e Schacter (189), também
chamada memória episódica (191), refere-se à preservação na entrada da
informação recebida através da percepção, com suas variáveis específicas. Este tipo
de memória é visto como memória de eventos particulares, das localizações, das
sequências emitidas de respostas prévias e das interações sociais. É formada a
partir de estímulos apropriados e imediatos, bem como específicos. Ela mantém os
pormenores contextuais, promovendo algumas experiências do indivíduo como um
evento único (189). Um experimento realizado com a rã (Rana pipiens) consistia da
55
apresentação de um cartão preto em rápida aproximação da rã. O animal se sente
ameaçado e pula para o lado oposto onde se encontra o cartão. Mesmo sendo uma
resposta automática tem um fundo contextual: quando existe um obstáculo na frente
ou do lado da rã, o animal desvia o pulo. Desta maneira, Ingle e Hoff (192)
demonstraram que a rã se lembra dos obstáculos, por alguns segundos, após a
remoção do cartão, contudo o animal continua a direcionar o pulo como se a barreira
ainda estivesse presente. Este comportamento do animal tem sentido porque a
experiência inicial com o cartão foi codificada e resultou em traços mais ou menos
lábeis no sistema nervoso do animal, que passou a incorporar a experiência
passada no seu repertório e a memória recebe o status de conceito etológico básico
(189).
Sobre o aspecto da orientação, em animais, é importante que o refúgio, o
local de coleta ou o ambiente da caça e o lugar apropriado das atividades
reprodutivas sejam locais para onde o animal possa voltar, depois de eventuais
afastamentos. Esta capacidade de armazenar as experiências anteriores e de poder
usá-las posteriormente, como verdadeiros guias de trajetórias, são essenciais para
os animais, e apresentam diversas vantagens, tais como: diminuição dos esforços e
tempo gasto com investidas aleatórias em busca de alimento; redução das chances
de encontro casual com predadores, proporcionando liberdade para o animal realizar
outras atividades importantes para sua sobrevivência. Por consequência, esta
capacidade é selecionada em várias espécies, levando em conta fatores genéticos e
ambientais ecologicamente relevantes (189). Desta maneira, cada evento se torna
uma pista de extrema importância para se armazenar e orientar o comportamento e
cada hábito que se aprimora com a experiência se torna uma vantagem etológica
para o desempenho de um comportamento eficiente.
O labirinto aquático de Morris (LAM) foi idealizado por Richard G. M. Morris
em (193), como um equipamento alternativo ao labirinto radial (194). Este teste é
amplamente utilizado (195, 196, 197). O LAM consiste de uma piscina redonda com
água (Figura 7). O animal aprende a localizar a plataforma oculta de acordo com
quatro pontos de partida diferentes. Após certo número de ensaios, utilizando-se de
pistas distais, os animais demonstram que a latência para a localização da
plataforma oculta, diminui. Outra estratégia para avaliar a aprendizagem é testar os
animais com a remoção da plataforma escondida, mediando-se a quantidade de
56
tempo gasto com o nado dos animais nas proximidades da antiga localização da
plataforma (194). Camundongos podem usar três diferentes estratégias para
localizar a plataforma oculta (198), como se segue: (1) estratégia “práxica”, que
ocorre no aprendizado de uma sequência de movimentos que devem ser
executados para chegar à plataforma; (2) estratégia “táxica”, quando o animal utiliza
sinais ou guias visuais proximais para alcançar a plataforma; e (3) estratégia
“espacial”, quando o animal atinge o alvo, utilizando-se informações sobre a
localização espacial da pataforma, conforme a configuração espacial das pistas
distais disponíveis no momento dos ensaios. Poderíamos entender que a estratégia
práxica estaria relacionada à memória de hábito, enquanto que as estratégias táxica
e espacial estariam associadas à memória de eventos.
Figura 7. Labirinto aquático de Morris
Para o teste no LAM, o tamanho da piscina utilizada com camundongos pode
ser de 75 a 150 cm de diâmetro e, para ratos, de 150 a 180 cm. O diâmetro da
piscina pode ou não comprometer o desempenho dos animais nos ensaios, mas
depende também da cepa do animal utilizado (199, 200). Diversos parâmetros
podem ser avaliados no LAM, tais como latência para localizar a plataforma oculta e
medida do comprimento do caminho usado pelo animal para atingir a plataforma,
57
velocidade do nado, tempo gasto nos quatro quadrantes, números de cruzamentos
próximos da plataforma, e porcentagem de ensaios que foram detectados nos
animais que não conseguiram encontrar a plataforma no tempo limite de 2 min (157).
Existem, porém, outros fatores que podem estar associados ao desempenho dos
animais no LAM, como por exemplo, o número de ensaios por dia, o número de dias
de treino, o tempo de duração dos ensaios e tempo de intervalo entre um ensaio e
outro subsequente (201).
O teste do LAM permite a reprodução de estudos relacionados com a
memória de referência (memória de eventos), memória de trabalho (memória de
hábito) e aprendizagem (195, 202). Além disso, foi demonstrado que o LAM é
altamente sensível para avaliar danos no hipocampo (197, 203, 204). Em adição
animais idosos exibem prejuízo de aprendizagem para localizar a plataforma de
escape (205, 206, 207). Um estudo longitudinal em camundongos revelou que a
aprendizagem ocorrida anteriormente no LAM pode prevenir defícits de memória
espacial envolvida com o processo do envelhecimento (208).
O LAM é um paradigma de fácil construção e também de boa adaptação,
contudo, requer sistemas de gravação de vídeos com a utilização de softwares
sofisticados, que auxiliam na análise de parâmetros comportamentais, às vezes, não
prontamente com livre acesso para todos os pesquisadores. Para amenizar os níveis
de estresse no teste do LAM, alguns pesquisadores acreditam que é necessário um
período de habituação antes de iniciar os ensaios (194), entretanto, outros não
concordam (209). O uso de pistas visuais “extra-labirinto”, pistas difusas e ausência
de pistas podem interferir no desempenho da memória espacial dos animais
testados no LAM (210).
58
1.2.8 Desenvolvimento
da
capacidade
mnemônica,
da
infância
ao
envelhecimento
Os correlatos neurais da memória episódica humana têm sido o alvo de
inúmeras investigações, pelos neurocientistas, nos últimos 60 anos. O primeiro ano
pós-natal é caracterizado por mudanças dramáticas no desenvolvimento da
memória, principalmente na idade crítica de (9 meses aproximadamente) em que os
bebês humanos possivelmente começam a evidenciar rudimentar memória
dependente do hipocampo (186).
“Temos que começar a perder a memória, para perceber que ela é o que
torna a nossa vida. Pois a vida sem memória não é vida. Nossa memória é
nossa coerência, nossa razão, nosso sentimento, até mesmo nossa própria
ação. Portanto, sem ela, não somos nada...” (211).
Imaginemos a vida sem memória, seria quase impossível realizar todas as
tarefas que desempenhamos no dia a dia. Professores não poderiam ensinar, sem a
lembrança do que já haviam aprendido nas aulas da universidade. Músicos teriam
muita dificuldade para tocar e cantar onde estariam as notas musicais e as
partituras. Na verdade, quase todas as profissões estariam comprometidas. De fato,
aprendizagem e memória fazem parte da nossa vida.
Este sentimento de vazio tem sido experimentado, muitas vezes, pelos
indivíduos que sofrem perda de memória na idade adulta, e estudos com pacientes
amnésicos tem investigado essa condição (212).
Muitas pessoas acreditam que um bebê apresenta capacidade mnemônica
semelhante a pacientes gravemente amnésicos (212), mas isto não é verdade (213).
As crianças não vivem como propôs William James (214), em um estado de bagunça
e confusão. Pelo contrário, crianças possuem uma capacidade surpreendente para
codificar e reter o conhecimento que são próprias de suas necessidades (215).
Seguem alguns exemplos: recém-nascidos podem distinguir a voz de sua mãe (216)
e aprendem a modificar seu comportamento de sucção em resposta ao reforço da
amamentação (217); com 3 a 4 dias de idade são capazes de reconhecer a face de
sua mãe (218) e com 8 a 10 dias podem identificar o leite materno próprio de sua
mãe em relação ao leite de outra mãe (219). Porém, um forte contraste desta
59
capacidade mnemônica, é detectado em humanos adultos, que não conseguem
lembrar nenhum episódio de sua infância, tendo em vista que durante este período
da vida, os bebês sofrem profundamente de uma perda de memória, chamada de
amnésia infantil (220).
Para desvendar esta aparente discrepância, foi apresentada na comunidade
científica, teorias a respeito da literatura da memória infantil, através da publicação
de trabalhos conduzidos por Nadel e Zola-Morgan (221), Schacter e Moscovitch
(212) e Bachevalier e Mishkin (222) que estão diretamente ligados à mudança no
paradigma conceitual de memória como uma entidade unitária (223). O ponto de
partida é baseado no perfil cognitivo e da memória do interessante paciente Henry
Gustav Molaison (1926-2008), conhecido por H.M.
“Quando tinha 27 anos de idade H.M. foi submetido a uma cirurgia de
remoção dos focos epilépticos. Nessa cirurgia foram removidos, de ambos
os lados, o lobo temporal medial (MTL), amígdala e os 2/3 anteriores do
hipocampo. Depois da cirurgia, H.M. perdeu a capacidade de formar novas
memórias. Para ele tudo era novo, cada refeição, cada novo amigo, novo
caminho, novo lugar… tudo para ele era como se fosse a primeira vez”
(224).
Este evento tornou H.M. um amnésico para novas experiências, ou seja, para
memórias episódicas. Assim, o hipocampo foi identificado como estrutura neural
crítica para a aquisição e reconhecimento de memórias episódicas. Apesar deste
prejuízo de memória, o paciente H.M. apresentava novas habilidades processuais
como desenhar no espelho (225). O caso H.M. levou ao conceito de um mútiplo
sistema de memórias. Habilidades preservadas em pacientes amnésicos eram
registradas através de inúmeras tarefas cognitivas e perceptuais (182). Achados
provenientes de trabalhos com modelo animal indicavam que o hipocampo
sustentava tipos específicos de memória (226-229), e conduziram à idéia de que
havia múltiplos sistemas de memória (230). Isto foi posteriormente apoiado com a
descoberta da existência de estruturas neurais para cada tipo específico de memória
(186).
O envelhecimento é caracterizado pelo processo de transformação de um
indivíduo adulto saudável em mais frágil, com a diminuição das reservas dos
sistemas fisiológicos e por um aumento exponencial para adquirir a maioria das
doenças. Pela vulnerabilidade que este processo propicia, pode conduzir o
indivíduo, em muitos casos, à morte (231).
60
Ainda no processo relacionado ao envelhecimento ocorrem mudanças no
cérebro, como a atrofia, alargamento dos sulcos, estreitamento nos giros e
diminuição da matéria cinzenta cortical (232). Em consequência destas alterações
morfológicas no cérebro pode haver um declínio nas habilidades cognitivas.
Salthouse e Czaja (233) demonstraram que idosos apresentavam desempenhos
mais baixos em testes cognitivos do que indivíduos mais jovens. Em adição, o
estudo da cognição em idosos vem focando em alguns processos atencionais e no
funcionamento cognitivo relacionados com o lobo frontal e a memória episódica,
incluíndo conteúdos visuoespaciais (234).
A população mundial de idosos tem crescido de forma significativa nas
últimas décadas. Com este aumento, muitos pesquisadores estão interessados em
avaliar e estudar esta clientela, em decorrência de alterações naturais do processo
de envelhecimento (235). Neste processo ocorrem mudanças físicas, psicossociais,
funcionais e socioeconômicas. Mudanças físicas são graduais e progressivas,
caracterizadas pelo declínio das funções de determinados órgãos vitais e dos
sistemas do corpo de forma diferenciada; as alterações psicossociais estão
envolvidas
nas
modificações
afetivas
e
cognitivas,
associados
aos
comprometimentos fisiológicos do processo de envelhecimento. Em relação às
mudanças funcionais, existe a necessidade de ajuda, com o intuito de facilitar o
desempenho dos idosos nas atividades básicas do cotidiano. Já as modificações
socioeconômicas
estão
intrisicamente
relacionadas
com
os
aspectos
da
aposentadoria dos idosos (236).
Dentre as alterações cognitivas do idoso, a memória vem se destacando.
Muitos idosos reclamam de falhas de memória. Eles podem avaliar a sua memória a
partir da sua importância para o desempenho das atividades do dia a dia. Este
aspecto é chamado de “percepção subjetiva de memória”. Quando o idoso relata
deficiência da sua própria memória, desencadeia em si um momento de reflexão,
que por muitas vezes passa despercebido das dificuldades do cotidiano, e neste
momento, o idoso pode refletir nas várias abordagens envolvidas com problemas de
memória (237, 238).
Alguns aspectos da cognição podem ser prejudicados pelo processo do
envelhecimento, enquanto outros são preservados (239). Avaliações de idosos
saudáveis, submetidos a testes neuropsicológicos, têm indicado que as funções
61
cognitivas permanecem estáveis (239). Porém, existem os chamados “brancos
ocasionais”, representado pelo fato do idoso não se lembrar onde colocou seus
óculos e esquecer o nome de um amigo que não vê há um bom tempo. Com o
passar da vida, os reflexos de falhas de memória, os constantes esquecimentos
cotidianos, os efeitos das relações com a familia e os amigos, propiciam aos idosos
sentimentos de um futuro incerto e preocupante, evidênciado através do papel vital
da memória na vida humana.
Dentro desta ótica se faz necessário ofertar atividades para os idosos,
visando a sua qualidade de vida, bem como estimular funções cognitivas e
emocionais para a manutenção da sua autonomia nas atividades diárias e
prevenção de um possível quadro de declínio cognitivo. Programas com atividades
deste tipo são ofertadas em ambiente hospitalar e monitoradas através de
pesquisas, como por exemplo, em Brasília, pelo grupo de Da-Silva (240, 241, 242).
Estudos randomizados e controlados têm evidenciado que o treino cognitivo
pode melhorar a memória, a atenção, o humor e o bem estar psíquico, contudo, a
duração e o impacto no cotidiano dos idosos são desconhecidos (241-246).
No passar de décadas, fortes evidências têm sugerido que o hipocampo é
uma estrutural neural importante para a aprendizagem e memória, bem como está
relacionado com déficits cognitivos associados ao processo de envelhecimento (224,
247-254). Além disso, estudos envolvendo seres humanos com danos no hipocampo
têm revelado que está região encefálica desempenha um importante papel na
memória espacial (255-261). Desta forma, pacientes que apresentam dano no lobo
temporal medial bilateral demonstram prejuízo da memória declarativa tipo
episódica, mas evidenciam o tipo semântica que se mantém relativamente
preservado (262, 263).
Adicionalmente,
estes
pacientes
possuem
boas
habilidades
para
desempenhar atividades de procedimentos e hábitos, ou seja, memória de
procedimentos ou não declarativas e apresentam, também, vocabulário normal e
conhecimento dos fatos aprendidos anteriormente. Alta atividade hipocampal tem
sido observada, através de imagem funcional, em pessoas, durante a navegação em
uma cidade virtual (264, 265). Similarmente, outro estudo envolvendo motoristas de
taxi de Londres mostrou que uma vasta experiência de navegação em uma cidade
está relacionada a um maior volume de substância cinzenta no hipocampo em
62
comparação ao grupo controle (266). Ademais, estudos com modelos animais (ratos
e macacos) com lesões hipocampais ou alterações ligadas à idade acometidas no
hipocampo mostraram prejuízos no aprendizado em tarefas de memória espacial
(267-272).
Desta forma, o hipocampo caracteriza-se como uma estrutura primordial para
a memória declarativa, bem como vulnerável aos efeitos do processo de
envelhecimento (273, 274), portanto, injúria nesta região encefálica resulta em
deficiências cognitivas semelhantes àquelas identificadas em pessoas idosas (275278). Outros estudos com humanos revelam que ocorre, com o avanço da idade,
uma diminuição de 30 a 80% no desempenho das pessoas na execução de tarefas
que estejam envolvidas com a memória espacial (279-283).
1.2.9 A vitamina C e o desenvolvimento das funções cognitivas
A vitamina C é um micronutriente de vital importância para o cérebro e tem
sido relatados inúmeras funções, tais como a neuromodulação e o envolvimento na
angiogênese. Ausência de vitamina C no cérebro tem sido mostrada como
prejudicial à sobrevivência em ratos SVCT2 recém-nascidos (-/-), e sua deficiência
perinatal reduz o volume do hipocampo, número de neurônios e causa diminuição da
cognição espacial em cobaias, sugerindo que a deficiência materna de vitamina C
pode ter consequências graves para a prole. Além disso, a deficiência de vitamina C
tem sido proposta como importante fator no declínio cognitivo e no risco de derrame
e gravidade relacionada à idade (284).
A proposta das causas e consequências da deficiência de vitamina C no
cérebro pode ser explicada por diversos fatores, dentre eles doenças, uso constante
do tabaco, inadequada ingestão de vitamina C, bem como fatores genéticos e
gravidez. Em adição, a vitamina C modula os sistemas colinérgicos, catecolinérgicos
e glutamatérgicos. O AA também desempenha função no desenvolvimento neuronal
através da maturação, diferenciação e formação da bainha de mielina (Figura 8).
63
Figura 8 – Deficiência de vitamina C no cérebro. Adaptado de Hansen (284).
Evidências têm apontado para a vitamina C como um importante fator da
homeostasia redox no SNC, associado à inadequada suplementação de AA na
dieta, resultando efeitos negativos sobre o desempenho cognitivo (285, 286, 287). O
SNC apresenta alta concentração de vitamina C em comparação com outros órgãos
do corpo (7, 288). Dados têm revelado redução no volume do hipocampo e prejuízo
de memória espacial em porcos da guiné induzidos pela deficiência de AA na dieta
(285, 289). No cérebro a vitamina C é regionalmente distribuída com altas
concentrações, no hipocampo, córtex occipital e frontal (290, 291). Na verdade,
64
neurônios possuem alta concentração de vitamina C, cerca de 10 mM, comparados
com as células da glia que apresentam cerca de 1 mM (292).
1.3
PLASTICIDADE CEREBRAL, COGNIÇÃO E COMPORTAMENTO
A plasticidade neural consiste em uma mudança adaptativa que acomete o
sistema nervoso nas suas funções e estruturas, podendo ocorrer em qualquer
momento do estágio da ontogenia, permitindo a interação do ambiente interno ou
externo, ou ainda como resposta aos danos, traumas ou lesões que atingiram o
circuito neuronal (293).
Segundo Pia (294), o termo plasticidade foi introduzido pelo fisiologista
Alemão Albrecht Bethe, nos anos de 1930. Este cientista define a plasticidade neural
como a capacidade do organismo de adaptar-se às alterações que comprometem o
ambiente externo e interno, pela ação sinérgica de vários órgãos, com a
coordenação do sistema nervoso central (SNC).
Uma das mais importantes descobertas científicas na área da neurociência,
que culminou com o fim de um dogma a respeito dos neurônios foram conduzidas
por Eriksson et al. (295) que publicaram, pela primeira vez, evidências concretas de
que o cérebro de um indivíduo adulto humano possuia a capacidade de regenerar
novos neurônios. Acreditava-se que neurônios não se reproduziriam em humanos
adultos. Partindo desta premissa estes pesquisadores evidenciaram em modelos
animais que apenas uma pequena porção de neurônios sobrevive, como
consequência da tentativa de aumentar a quantidade de neurônios. Os autores
concluiram que, através do enriquecimento ambiental (EA), que propicia constantes
desafios, é possível duplicar a quantidade de neurônios, após o período de
enriquecimento (295).
Santiago Ramón y Cajal e Eugênio Tanzi desenvolveram trabalhos pioneiros
sobre a regeneração neural, que revelaram existir uma relação mais direta entre a
plasticidade neuronal e o SNC (296). Cajal afirmou que haveria uma possibilidade de
que a prática do exercício mental pudesse desencadear maior crescimento das
65
ramificações neuronais, enquanto Tanzi propôs a hipótese de que, nas junções
neurais, ocorreriam alterações plásticas, durante o processo da aprendizagem (296).
Estudos da plasticidade neural podem ser classificados em situações que
manipulam o ambiente e avaliam as alterações morfológicas e/ou funcionais no
ambiente neural, ou a nível comportamental, após traumatismo ou lesões do SNC,
conhecidos como “recuperação de funções” (297). O processo agudo consiste em
mudança do tecido nervoso para manter a homeostasia do organismo, bem como
para realizar a cicatrização e o reparo tecidual (297, 298).
A plasticidade neural tem sido investigada ao nível molecular, visando
identificar possíveis mecanismos e processos celulares, bem como ao nível
comportamental e da interação com o sistema neural. Neste contexto, pode-se
destacar o desenvolvimento neuronal, a recuperação das funções neurais e a
reorganização morfofuncional da circuitaria nervosa envolvida nos processos de
aprendizagem, consolidação de memória ou de lesões cerebrais (299, 300).
Pesquisas envolvendo a plasticidade cerebral, propostas por Kolb e Whishaw
(297), seguem três categorias gerais: metabólicas, neuroquímicas e morfológicas.
(1) As alterações das atividades metabólicas são avaliadas em áreas corticais e
subcorticais, tanto no hemisfério onde ocorreu a lesão (ipsilaterais) como no
hemisfério oposto (contralaterais); (2) As mudanças neuroquímicas são focalizadas
em função das sinapses, com a investigação dos processos e mecanismos que
promovem um aumento da síntese de neurotransmissores e sua liberação ou a
potencialização das respostas pós-sinápticas, em decorrência de eventos que
estimulam a aprendizagem ou por lesões neuronais; (3) as alterações morfológicas
acometem as estruturas das sinapses e dos neurônios, tais como: a regeneração e
ramificação de axônios, com aumento do tamanho dos corpos celulares, do número
de dendritos, da quantidade de neurônios e das sinapses.
Para a análise comportamental, é necessário garantir as seguintes
características: (1) após a lesão, o comportamento deve manter as suas
características topográficas e funcionais presentes como linha de base em relação
ao comportamento, antes da lesão ter acontecido; (2) a recuperação de um
determinado comportamento não deve interferir de forma negativa em outros
comportamentos; e (3) o comportamento deve ser regular na sua frequência e se
mantém a longo prazo (297).
66
Relatos do século XVIII já demonstravam interesse pelos efeitos na
experiência, no treino e no exercício, eventos, portanto, relacionados com o SNC.
Assim Bonnet e Malacarne (1779 e 1783), de acordo com as citações de
Rosenzweig (296), demonstraram que os encéfalos de animais que foram
submetidos a treinos sistemáticos, durante vários anos, apresentavam um cerebelo
bem mais desenvolvido e possuiam uma maior quantidade de circunvoluções
comparadas àqueles animais sem treino. Entretanto, conceitos relacionados com a
plasticidade do SNC e do comportamento só foram comprovados através de
experimentos, mais tarde, na década de 1960.
Experimentos com gaiolas-viveiro, utilizando técnicas de enriquecimento
realizados por Rosenzweig et al. (301) demonstraram que em diferentes idades,
havia uma interação dos animais com esse ambiente repleto de estímulos, que
resultou em modificações específicas no SNC. Foram encontrados alterações com o
aumento das seguintes estruturas cerebrais: na espessura das camadas do córtex
visual; no tamanho dos corpos dos neurônios e dos núcleos; no número de sinapses
e na fenda sináptica; na quantidade de dendritos e espículas dendríticas; no volume
e no peso do encéfalo, bem como nos níveis dos neurotransmissores. Portanto,
alterações morfológicas e funcionais ocorreram em áreas corticais através da
exposição e da interação dos animais em ambientes ricos em diversidade de
estímulos (289).
Os mecanismos celulares subjacentes à aprendizagem e memória são
considerados como eventos que ocorrem na plasticidade sináptica, com alterações
na estrutura ou bioquímica das sinapses, que resultam em mudanças nos efeitos
pós-sinápticos. O psicólogo Donald Hebb (1940) hipotetizou que traços da memória
permanente poderiam ser formados e sustentados através das interações de redes
neurais (302). Cerca de 30 anos depois, Bliss e colaboradores em 1973 detectaram
um aumento de longa duração na intensidade sináptica no giro dentado, em coelhos,
como resposta à estimulação de alta frequência (303, 304). Este fenômeno passou a
ser conhecido como potenciação de longa duração (LTP) bastante estudada no
hipocampo (305).
A LTP é estudada em finos cortes de fatias de hipocampo que são
preservadas vivas em solução artificial do líquido cefaloespinal. Lesões no
hipocampo afetam a LTP e podem conduzir a déficits de memória. A LTP, como
67
fenômeno subjacente ao armazenamento da memória, em animais, pode ocorrer em
duas fases: (1) fase inicial da LTP, que ocorre geralmente por um tempo menor do
que uma hora após a estimulação; esta LTP não requer a síntese de proteínas e da
transcrição gênica; (2) fase tardia, que ocorre pelo período maior do que 3 horas
após a estimulação; esta LTP envolve a síntese de proteínas e a transcrição gênica
(306, 307). Na fase tardia da LTP foram relatados déficits associados ao processo
de envelhecimento (308, 309, 310). Ademais, depois de múltiplas sessões diárias
que induziam LTP, foi demonstrado que a LTP foi deteriorada mais rápidamente em
ratos idosos, quando comparados com os ratos adultos (275).
Estudos têm demonstrado que o receptor de glutamato N-metil-D-aspartato
(NMDA) está envolvido na grande maioria das formas da LTP (311-315), onde o
influxo de cálcio para o interior da célula é estimulado pela ativação do receptor
NMDA. A entrada de cálcio no neurônio pós-sináptico ativa proteínas quinases,
como a cálcio/calmodulina quinase, em seguida ocorre a ativação do ácido α-amino3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico
(AMPA),
que
produz
um
aumento
da
condutância de moléculas de sódio e potássio, aumentando a capacidade de
responder ao estímulo emitido pelo glutamato (316). Este influxo de cálcio
proporciona também a ativação de adenil-ciclase, que ativa adenosina trifosfato
(ATP) para o AMPc. Esta molécula ativa a proteína cinase C que promove a
fosforilação do fator responsivo de transcrição do AMPc (CREB), bem como a
síntese de proteínas e mudanças estruturais (317). A ativação do receptor NMDA
desempenha importante papel na aquisição de memória espacial (318, 319).
Quando ocorre um bloqueio farmacológico deste receptor ou deleção da subunidade
NR1, ocorrem injúrias substanciais da memória de referência espacial (313, 314,
319, 320). De maneira similar, camundongos nocaute NR1 apresentam também
comprometimento da LTP (321).
68
1.3.1 Desenvolvimento Neural e Cognitivo
O sistema nervoso está relacionado ao estresse, onde é percebido e
determinado o que é ameaçador, além de emitir respostas comportamentais e
fisiológicas em combate ao agente estressor. O desenvolvimento cerebral possui
uma grande capacidade de adaptar-se e promover mudanças às situações
estressantes e outras experiências, tais como estrutural e de substituição neuronal,
remodelação dendrítica e alteração do volume sináptico. Estes eventos são
características de respostas neurais emitidas por um adulto, em detrimento a fatores
ambientais. O hipocampo é uma estrutura onde os três tipos de plasticidade
estrutural foram observadas e investigadas, com o uso da combinação de
abordagens comportamentais, eletrofisiológicas,
morfológicas,
moleculares e
farmacológicas (322).
Da mesma maneira, novos dados de regiões cerebrais envolvidas na
ansiedade, medo, humor, função cognitiva e controle comportamental, como a
amígdala e o córtex pré-frontal também demonstram que o cérebro de um indivíduo
adulto é na verdade maleável, e, portanto, uma estrutura adaptável, que apresenta
uma capacidade de plasticidade estrutural reversível (322).
Os hormônios esteróides possuem um papel importante, atuando nesta
plasticidade, tanto por via genômica como também via mecanismos não-genômicos.
Em
adição,
outros
mediadores
intracelulares,
bem
como
sistemas
de
neurotransmissores também participam da plasticidade estrutural (322).
O estresse desencadeia um desequilíbrio dentro do circuito neural
encarregado de auxiliar a cognição, a tomada de decisões. A ansiedade e o humor
podem aumentar ou diminuir a expressão destes comportamentos. O aumento da
vigilância, do medo e da ansiedade em um ambiente ameaçador pode ser
caracterizado como uma mudança adaptativa. Contudo, se a fonte de perigo passa,
mas o estado comportamental persiste, bem como as mudanças no circuito neural,
esta inadaptação pode necessitar de uma intervenção, realizada através da
combinação de terapia comportamental e farmacológica, como por exemplo, em
casos crônicos de transtorno de ansiedade e de estado de humor (322).
69
1.3.1.1 Comprometimento Cognitivo Leve ou Declínio Cognitivo
O
conceito
de
Comprometimento
Cognitivo
Leve
(CCL)
vem
se
desenvolvendo na última década, com a finalidade de compreender a relação entre
o envelhecimento saudável e patológico (323, 324, 325). Indivíduos que apresentem
CCL nem sempre evoluem para a demência, apresentando quadros estáveis e
também podem demonstrar diminuição do déficit cognitivo. Este fato pode ser
associado a diversos quadros clínicos, tais como: doenças metabólicas, eventos
traumáticos, bem como doenças vasculares e psiquiátricas e também depressão
(326). Este conceito pode ser classificado dentro de alguns subtipos, que podem ou
não apresentar reclamações a respeito dos déficits de memória pelos idosos. Os
subtipos são denominados: CCL amnéstico de único domínio; amnéstico múltiplos
domínios; não amnéstico de múltiplos domínios e não amnéstico de único domínio.
O subtipo CCL amnéstico (CCL-A) é o mais evidente e que comumente desencadeia
a doença de Alzheimer (325, 326).
Para se diagnosticar o CCL nos indivíduos se utiliza o critério apresentado no
CCL-A, ou seja, o subtipo amnéstico. Estes critérios incluem: (1) queixa subjetiva de
memória; (2) déficits de memória em decorrência da idade e anos de escolaridade,
que foram detectadas em testes neuropsicológicos; (3) observação que as
atividades da vida diária e as demais funções cognitivas são preservadas; e (4)
ausência de demência (325).
Estudos longitudinais revelam que ocorre uma taxa de conversão de 10% a
15% ao ano de pessoas identificadas com CCL-A, para a doença de Alzheimer (DA).
Por outro lado, indivíduos saudáveis podem evoluir para DA em uma taxa de apenas
1% a 2% ao ano (325, 327). Desta forma, se faz necessário a busca de intervenções
para este grupo de pessoas, visando à qualidade de vida (328).
70
1.3.1.2 Declínio Cognitivo em Modelos Animais
O processo de envelhecimento está associado ao declínio das funções
cognitivas, tanto em humanos como em animais de laboratório. Roedores jovens
adultos desempenham tarefas de aprendizagem melhor e mais rápidas do que
animais idosos. Esses animais envelhecidos, quando expostos ao enriquecimento
ambiental, podem melhorar sua capacidade de aprendizagem e desempenhar suas
tarefas cognitivas como um animal jovem. O cérebro dos animais idosos ainda retém
apreciável plasticidade para desencadear melhora nos processos cognitivos pelos
quais estes animais são submetidos (329).
Lesões semelhantes, com a presença de depósitos amilóides já foram
encontradas em animais idosos como cães, primatas, roedores e ursos (330, 331,
332). Cães idosos foram utilizados num estudo para avaliar a acumulação de βamilóide (constituintes de depósitos amilóides) e também das funções cognitivas. A
acumulação deste peptídeo se relacionou à queda global da cognição e afetou
apenas algumas tarefas comportamentais. No entanto, o nível de defícit cognitivo
estava mais associado ao grau de deposição do que com a idade do animal, já que
indivíduos diferentes do mesma faixa etária apontavam graus de acumulação
diferenciados (329).
1.3.1.3
Reserva cognitiva e escolaridade como aprimoramento cognitivo em
humanos
A reserva cognitiva (RC) ou reserva cerebral é a capacidade do indivíduo de
tolerar as mudanças associadas com a idade e com doenças envolvidas com
patologias cerebrais, sem o desencadeamento de sintomas clínicos ou sinais
fisiológicos em decorrência da doença (333). A RC sugere, ainda, que a inteligência
inata ou experiências da vida cotidiana podem fornecer reserva, que consiste de um
conjunto de habilidades ou repertórios que possibilitam aos indivíduos a lidar com o
desenvolvimento progressivo de demências, DA ou demência vascular, de uma
71
maneira melhor do que outras pessoas (334, 335). Ademais a RC também explica a
relação entre a escolaridade, a complexidade ocupacional, a habilidade para a
leitura, o índice de inteligência (IQ) e a demência. A RC é vista como modificações
de estruturas do próprio cérebro e processamento (336). Efetivamente, alterações
cerebrais morfológicas e neuroquímicas foram detectadas em animais crescidos em
ambientes enriquecidos com vários fatores estimulantes (337).
A RC é utilizada para explicar como os indivíduos podem variar
significativamente em termos do declínio cognitivo, bem como a manifestação dos
sintomas para a demência, em relação às alterações neurodegenerativas que são
semelhantes nos aspectos da natureza e da extenção (338). A RC pode assumir
duas características, conforme entendimento de Stern et al. (339). (1) reserva
neuronal formada por redes cerebrais que são mais eficientes ou demonstram
grande capacidade neural e podem ser menos susceptíveis a injúrias e (2)
compensação neural nas quais as redes cerebrais alternativas podem compensar os
danos induzidos por patologia em redes neuronais preexistentes.
Desta forma, tem-se postulado a hipótese que a RC atua através de ambos
os mecanismos: de proteção e compensatórios. As pessoas que possuem altos
níveis de RC terão uma menor prevalência e incidência de desenvolver demências,
principalmente DA. Existem ambos os caminhos: patológico e clínico. O patológico
se inicia em um tempo fixo no percurso da vida. Isto pode sugerir que o indivíduo
que possui maior RC levaria mais tempo para o inicio da DA e, portanto, morreria
também mais tarde. Porém, pode-se supor que o tempo do início da DA pode variar
e ter desdobramento lento e silencioso. Então a hipótese da RC sugere pouco ou
nenhum efeito sobre a idade do paciente para que o aparecimento de sintomas
clínicos de demência se manifeste (340).
A hipótese explícita para a RC é a noção de um limiar, porque, neste caso, a
RC já não pode compensar a injúria cerebral subjacente. Finalmente, pode-se
esperar que entre os pacientes demenciados, aqueles indivíduos com maior RC irão
demonstrar uma maior patologia cerebral comparada àqueles pacientes com menor
RC (340).
Em conclusão uma estimulação mental e física mais intensa no início e
durante toda a vida pode aumentar a RC, permitindo que as funções cognitivas
sejam mantidas em idosos e com a finalidade de proteger e retardar o aparecimento
72
de demência ou DA. Em relação à escolaridade como uma medida substituta para a
RC, fica evidente a ligação das demências com a educação, postulada que a
hipótese da RC para o ensino superior pode ser: (1) reduzir a prevalência e
incidência de demência; (2) apresenta pouco ou nenhum efeito sobre a idade no
início da demência; (3) possui um efeito limiar, como resultado de um declínio
cognitivo acelerado; (4) não tem efeito sobre a morte do paciente (335).
O papel da escolaridade vem crescendo, ao longo do tempo, como uma
variável sociodemográfica importante para o processamento neuropsicológico. Neste
sentido dados coletados em indivíduos saudáveis tem evidenciado que, quanto
maior forem os anos de estudos, melhor será o desempenho em inúmeras tarefas
neurocognitivas, com alterações estruturais, volumétricas e funcionais do cérebro.
No que se refere aos dados coletados de amostras de pacientes com lesão cerebral
adquirida, foi observada uma tendência de sobreposição do efeito da escolaridade
sobre o da lesão; e com pacientes portadores de quadros demenciais houve uma
relação de maior escolaridade com o aumento da RC (341).
As várias áreas da neuropsicologia clínica, cognitiva, do desenvolvimento,
experimental, de avaliação e reabilitação vem buscando novos entendimentos sobre
as influências sociais e culturais nas diversas funções cognitivas. Essas influências
incluem a escolaridade, experiências pessoais e a quantidade de atividades
desempenhadas pelos indivíduos no seu cotidiano (342).
Pesquisas comportamentais e de neuroimagem destacam o papel da
escolaridade no desempenho de tarefas neuropsicológicas, na organização cerebral,
bem como um fator neuroprotetor em algumas patologias cerebrais (341). Estudos
em indivíduos saudáveis revelam que a quantidade de anos de estudo é um fator
importante para se determinar o desempenho neuropsicológico em atividades que
envolvem a memória, a atenção, a linguagem e as funções executivas. Até mesmo
em tarefas cognitivas não verbais têm-se observado o impacto dos anos de
escolaridade (343).
Estudos que têm como objetivo uma análise comparativa entre grupos ou
normatização, evidenciam que a variável escolaridade desempenha papel relevante,
sendo acompanhada pelo fator idade (344). Na análise comparativa entre indivíduos
analfabetos, que não tenham frequentado nenhuma aprendizagem formal escolar, e
pessoas escolarizadas, a avaliação da influência da variável escolaridade e da
73
aquisição da linguagem na cognição humana, ao nível comportamental, revelou que
os indivíduos escolarizados tiveram melhor desempenho das tarefas em relação aos
não escolarizados (343, 345, 346).
Outro estudo conduzido por Meguro et al. (347), com idosos de 65 anos ou
mais, demonstraram efeitos sobre a educação em algumas tarefas cognitivas, tais
como: fluência verbal de geração de listas e de palavras; Trail Making Test (A e B);
memória episódica de curto prazo e abstração e julgamento. De acordo com a idade
dos participantes, somente foram observados efeitos no subteste de símbolo de
dígitos da Escala Wechsler de Inteligência revisado (WAIS-R), quando o efeito da
variável escolaridade foi controlado. Estes achados sugerem que a escolaridade
como uma reserva cognitiva desempenha um papel importante no processo de
envelhecimento, de um modo mais ativo do que em relação à variável idade.
Estes autores apontaram a escolaridade como uma variável que está
envolvida em experiências ambientais, que promove também efeitos na cognição e
indicaram que as diferenças encontradas entre os grupos podem ser devido a
alterações estruturais do cérebro, resultando no aumento das sinapses e na
vascularização cerebral (347).
Outro estudo longitudinal foi realizado com uma população de idosos
chineses investigou variáveis sociais, de estilo de vida e de saúde (348). Os
resultados encontrados sugerem que os efeitos da escolaridade foram indicadores
independentes do prejuízo cognitivo, mesmo após as variáveis como risco
cardiovascular e as variáveis socioculturais e de saúde serem controladas. Por outro
lado, outro estudo comparativo com idosos de 60 a 64 anos demonstrou que o grau
de atrofia cerebral associada com a idade não estava relacionada com a
escolaridade dos idosos na execução das tarefas cognitivas. Os grupos analisados
quanto à variável escolaridade apresentavam o seguinte perfil: menos de 10 anos de
estudo, de 10 a 12 anos de estudo e o último grupo de 13 anos de estudo ou mais.
Portanto, não havia grupo de pessoas com baixa escolaridade. Estes resultados
sugerem que a educação exerceu um efeito protetor contra o declínio cogntivo
apenas em indivíduos com altos níveis de atrofia (349).
A heterogeneidade cognitiva parece estar relacionada a fatores genéticos e
psicológicos, com a predisposição para doenças crônicas e degenerativas, bem
como a personalidade e fatores envolvidos no histórico de vida de cada indivíduo
74
com o passar dos anos de idade (350, 351). Assim, maior heterogeneidade está
presente no desempenho neuropsicológico em pessoas que possuem baixa
escolaridade, quando comparadas àquelas de alta escolaridade. Isto pode ser
explicado provavelmente em decorrência da interação da escolaridade com o meio
social (352, 353). A heterogeneidade também ocorre na avaliação do desempenho
cognitivo em adultos jovens, podendo influenciar os diferentes níveis de estimulação
cognitiva que estão sendo avaliados (341).
Técnicas
complementares
de
neuroimagem
estão
associadas
às
investigações de tarefas neuropsicológicas relacionadas aos efeitos da escolaridade
sobre os processos cognitivos. Estudos conduzidos por Solé-Padullés et al. (354),
utilizando ressonância magnética funcional (fMRI), mostraram que, entre grupos de
adultos saudáveis, a maior RC, está associada ao tamanho do cérebro e à menor
ativação cerebral durante a execução de tarefas cognitivas. Participantes que
possuem maior RC usam menos redes neurais, contudo, desempenham com maior
eficiência as tarefas propostas, em comparação com idosos que demonstram pouca
RC e, portanto, ativam mais regiões encefálicas para desempenharem as mesmas
tarefas, como por exemplo: as regiões fronto-temporais, núcleos subcorticais e o
cerebelo. O fenômeno está relacionado a respostas compensatórias (355).
1.3.1.4 Enriquecimento ambiental como aprimoramento cognitivo e comportamental
em animais
Donald Hebb (1940) formalizou a importância do enriquecimento para
roedores em laboratório. Este pesquisador demonstrou que, quando ratos de
laboratórios que tinham liberdade para explorar suas caixas, semelhantes a animais
de estimação, apresentavam melhores respostas para resolver problemas e exibiam
maior habilidade em tarefas que avaliavam a aprendizagem do que ratos alojados
em condições laboratoriais padrão (356).
Atualmente, o termo “enriquecimento ambiental” foi proposto como um
conjunto de atividades que possibilita melhorar as necessidades etológicas e
psicológicas dos animais, com modificações no seu recinto e na sua rotina, visando
75
ofertar desafios ou aparatos ecológicos, cognitivos, ocupacionais ou artificiais, para
otimizar o bem-estar fisiológico e psicológico dos animais (357). Estes estímulos não
são recebidos pelos animais, quando expostos a condições de alojamento padrão
(296).
O EA tem sido avaliado desde 1960, por inúmeros pesquisadores que visam
observar seus efeitos de estimulação ambiental, experiência e treino sobre o
cérebro. Rosenzweig et al. (301) realizou um experimento clássico. Estes autores
utilizaram “gaiolas viveiros” com uma rica variedade de estímulos, tais como diversos
objetos de formas e tamanhos diferentes, espelhos, rodas de atividade, escadas e
espaço mais amplo, bem como diferentes estratégias para obtenção de alimentos.
Os resultados demonstraram que em diferentes idades, a interação com esse
ambiente enriquecido em estímulos houve um aumento da espessura das camadas
do córtex visual, do tamanho do núcleo e do corpo celular do neurônio, aumento do
número de sinapses e das fendas sinápticas, do número de dendritos e de espículas
dendríticas, bem como maior volume e aumento do peso cerebral e, por fim,
alterações nos níveis dos neurotransmissores (301).
Pesquisadores como Widman et al. (358), Tomaz e Costa (359) e Ferrari et al.
(360) revelaram alterações neuroquímicas em decorrência da exposição de animais
em ambiente enriquecido, como síntese de proteínas no córtex e aumento da
porcentagem de RNA. Em adição, o EA altera os níveis de cortisol. Por exemplo,
Carlstead et al. (361), trabalharam com ambiente enriquecido para leopardos
(Prionailurus bengalensis) em cativeiro, que possibilitava que estes animais
pudessem se esconder de outros felinos maiores (Panthera spp) que viviam em
cativeiro vizinho. Estes autores observaram que houve uma redução de
comportamento e de estereotipias motoras denominadas “pacing” (i.e., andar de um
lado para outro sem uma finalidade aparente) seguido da diminuição dos níveis de
cortisol.
Outro grupo de pesquisadores (362, 363) constataram que EA aplicado no
cativeiro de grande felinos (Panthera tigris tigris) no Zoológico de Brasília, Distrito
Federal, desinibiram as atividades locomotoras desses animais quando exposto à
presença de visitantes. Ademais, o EA acentuou as atividades comportamentais
cognitivas e diminuiram anormalidades, tais como o pacing. Estes resultados
demonstraram o efeito terapêutico de EA, amenizando os níveis de estresse no
76
cativeiro induzido pela ausência de estímulos, e também pela presença dos
visitantes, sugerindo uma correlação biológica propiciada pela intervenção do EA,
pelas quais estes felinos foram submetidos (241).
Roedores crescidos em ambiente enriquecido apresentam uma série de
respostas plásticas no cérebro, dentre elas: neurogênese, aumento da ramificação
dendrítica, aumento do tamanho celular, que podem ter como consequências
melhoras na aprendizagem e memória (364, 365, 366). Estes eventos podem
conduzir na busca do entendimento de doenças neurodegenerativas em modelos
animais, bem como de lesões cerebrais e transtornos psiquiátricos (367-371).
Estudos que envolvem o uso de EA em ratos de laboratório dependem de
diversos fatores. (1) tamanho das caixas e o número de animais alojados em cada
caixa; (2) tipos de objetos utilizados no período de enriquecimento; (3) a idade dos
animais no ínicio da manipulação experimental; (4) o período de duração que os
animais são mantidos na caixa de enriquecimento (5) A cepa e o sexo dos animais
utilizados no protocolo experimental e (6) os tipos de controles utilizados, controle
social (CS) ou controle isolado (CI) (372).
A média da densidade das caixas utilizadas no EA em vários estudos foi
estimada em 1.039 cm3/animal e 4 a 5 animais por caixa. A quantidade de ratos
alojados juntos variou muito, no máximo 15 e no mínimo 2 ratos por caixa. Brown e
Grunberg (373) constataram que animais expostos em caixas lotadas produziu um
efeito elevado dos níveis de corticosterona e também elevados níveis de ansiedade
quanto mantidos em condições de isolamento. Ademais, ratos crescidos em
isolamento exibem um padrão comportamental conhecido por “síndrome do
isolamento social”, que está ligado à hiperatividade na exploração por ambientes
novos, mas pobre para a adaptabilidade (374) e maior impulsividade (375), quando
comparados a ratos crescidos em EA. Adicionalmente, ratos CI submetidos ao LCE
apresentaram maior nível de ansiedade, evitando explorar os braços abertos do que
os animais CS (376, 377). Finalmente, ratos alojados em condições de isolamento
demonstram comportamento depressivo, quando testados no teste do nado forçado
(TNF) (374, 378), maturação sexuais tardia (379) e são mais afetados
negativamente pelos estímulos estressantes do que os animais alojados em EA
(372).
77
Laviola et al. (370) propôs que animais mantidos em EA devem ser usados
com o objetivo de testar a validade de modelos animais de transtornos psiquiátricos
e neurodegenerativos, contudo é necessário a padronização do EA para se obter
bons resultados.
Estudos conduzidos por Zimmermann et al. (380) notaram que ratos mantidos
em EA, submetidos ao teste do campo aberto, demonstraram capacidade para
explorar os conflitos gerados pela emocionalidade/medo, pois o comportamento
exploratório pode ser reduzido pela expressão de medo manifestada pelo animal. EA
diminui este medo e desencadeia a habituação mais rápida a novos ambientes,
comparados com CI ou CS. Em adição, se houver uma habituação mais rápida,
melhor será o processamento da informação, e consequentemente, melhor
habilidade de enfrentamento (372).
Em relação à emocionalidade da ansiedade, estudos têm mostrado que o EA
reduz os níveis de ansiedade em ratos com a idade de 4 semanas, mantidos em EA
por 9 a 13 semanas, quando submetidos ao LCE, exibindo significativamente maior
porcentagem de tempo gasto nos braços abertos e entradas nos braços abertos em
comparação com os controles CI ou CS. O grupo controle CI revelou,
significativamente, porcentagem mais baixa de tempo gasto nos braços abertos e
entradas nos braços abertos, do que ambos os grupos alojados em condições de EA
ou controle CS, apresentando o efeito da interação social, mesmo na ausência de
EA físico (381).
Sobre os aspectos de gênero, ao avaliar ratas fêmeas expostas ao EA com 9
a 13 semanas de idade, alojadas por 4 a 8 semanas no EA e com o uso de controle
CI, obteve-se como resultado o aumento do tempo gasto nos braços abertos e
redução da porcentagem de tempo gasto nos braços fechados (382). Além disso,
animais expostos ao EA pós desmame, com duração de EA de 9 a 13 semanas,
aumentaram o número e a porcentagem de entradas nos braços abertos no LCE
(383, 384) em comparação com os controles CS. Todos estes achados corroboram
com a sugestão de que EA reduz os níveis de ansiedade em animais submetidos ao
LCE. Porém, dois trabalhos contraditórios foram encontrados, demonstrando que
nenhuma diferença significativa ocorreu no tempo gasto ou na porcentagem de
entradas nos braços abertos sobre ratos alojados em AE, controles CI ou CS (378,
385).
78
O estudo conduzido por Brenes et al. (378) demonstrou que os ratos machos
mantidos em EA apresentaram significativamente mais entradas nos braços
fechados do que os seus controles CI ou CS, pelos quais sugerem aumento dos
níveis de ansiedade nestes animais. Estes autores indicam que possivelmente estes
resultados possam ter sido devido a fatores de procedimentos laboratoriais, como
por exemplo: local de aplicação do LCE muito iluminado e alterações nos níveis de
ansiedade promovida pela manipulação dos animais no momento da marcação do
rabo (378). Outras avaliações dos níveis de ansiedade com animais alojados em EA,
por 2 semanas, revelaram que EA foi capaz de reduzir o comportamento defensivo
em ratos Wistar adultos em relação ao CS (386).
O teste no LAM é utilizado para avaliar a aprendizagem e a memória, bem
como efeitos de EA. Neste caso, ratos mantidos em EA têm mostrado redução na
latência para localizar a plataforma oculta no teste do LAM em relação ao CI (387) e
também comparados aos controles CS (388, 389, 390). Animais alojados em EA
com 4 semanas de idade, mantidos em EA por 4 a 8 semanas e controles CI e SC
também apresentaram redução da latência para localizar a plataforma oculta no
LAM (391).
Outro estudo registrou que os animais CI demoraram 6 dias para localizar a
plataforma oculta com o tempo mínimo de 7 a 10 s, enquanto o grupo dos animais
mantidos em EA atingiram estes mesmos critérios apenas em 3 dias de treino (388).
Resultados contraditórios também foram revelados no teste do LAM em animais
alojados em EA. Estudos conduzidos por Ueda et al. (392) não encontraram nenhum
efeito na latência de localização da plataforma oculta em animais alojados em EA.
Estes autores sugerem que possivelmente os animais CS apresentaram bom
desempenho no LAM e caso fosse utilizado CI a diferença significativa poderia ter
sido detectada.
Adicionalmente, animais crescidos em EA, por 1 ano, apresentaram
diminuição da latência em relação aos CI (393). Ademais, EA foi capaz de reduzir a
latência em animais alojados por 9 a 13 semanas em condições de EA (394) além
de diminuir thigmotaxia em comparação com o grupo CI (382) e com o grupo SC
(395).
79
Ratos expostos ao teste do campo aberto tendem a explorar a zona
periférica deste equipamento. Este comportamento de permanecer perto
das paredes laterais do aparato é chamado de thigmotaxia. Porém, a
thigmotaxia diminui lentamente durante os primeiros minutos após a
introdução do animal no teste. Experimentos anteriores têm considerado o
grau de thigmotaxia como indicativo de ansiedade. Esta hipótese foi
validade com o uso de drogas ansiogênicas, que aumentam a thigmotaxia e
ansiolíticas que reduzem este comportamento (396).
Finalmente, Cui et al. (397) não observaram nenhum efeito do AE em ratos
normais mantidos por 4 a 8 semanas, em EA, no desempenho do teste do LAM.
Contudo, condições de EA restauraram os déficits de aprendizagem espacial devido
a estímulos estressantes sofridos pelos animais no início da vida.
Estudos envolvendo condições de EA avaliados sobre teste no LAM
apresentam principalmente efeitos de EA sobre o processo de envelhecimento ou
declínio cognitivo, proveniente de resultados de lesão ou injúria cerebral. Em geral,
pelo que foi demonstrado em diversos estudos, tudo indica que os efeitos
encontrados com o uso de EA em experimentação animal revelam efeitos positivos
sobre a aprendizagem espacial e memória analisados no teste do LAM, embora com
algumas exceções, em decorrência de resultados contraditórios publicados na
literatura (372).
O EA por um período curto de tempo, todos os dias ou contínuo, de 3 a 4
semanas, não atingiu efeitos benéficos em camundongos (398), Por outro lado,
quando os animais são submetidos a mais de 10 semanas, continuamente em EA,
disponibilizando interações sociais, atividades físicas e desempenho de funções
intelectuais ocorre redução do declínio da memória espacial envolvida com o
processo de envelhecimento (399). Em adição, EA, por um período longo de tempo,
aumenta a neurogênese hipocampal até 5 vezes em animais idosos (400). Em
camundongos idosos transgênicos (modelo animal de Alzheimer) também ocorreram
melhoras cognitivas (401), bem como diminuiram a incidência e severidade de
transtornos neurodegenerativos relacionados ao processo de envelhecimento (402).
A habilidade de EA sobre a longevidade foi investigada por Lores-Arnaiz et al.
(403) onde se considerou marcadores de plasticidade sináptica durante o processo
de envelhecimento. Os experimentos foram conduzidos em ratos machos e fêmeas
mantidos em EA com SC por 107 semanas (a idade final dos animais era de 27
meses). Os resultados revelaram que o EA aumentou significativamente a
80
longevidade dos animais idosos e o efeito foi mais evidente em ratos machos do que
nas fêmeas. Estes animais apresentavam níveis elevados de óxido nítrico sintase
(NOS) tanto mitocondrial com citosólico, além de um significante aumento nas áreas
dendríticas e do corpo celular dos neurônios corticais e hipocampais, em
comparação com o SC (403).
O tempo de exposição prolongado de animais ao EA preveniu declínio de
memória relacionado à idade, avaliado no LAM, e ocorreu um aumento da
plasticidade neuronal, quando comparado ao SC. Um efeito relacionado ao sexo
também foi observado nas fêmeas alojadas em EA, que apresentaram um aumento
nas atividades complexas do cérebro, quando foram avaliadas pelos níveis de NOS,
comparadas ao SC. Em contrapartida, não houve diferenças significativas entre EA
e SC nos animais machos (402).
Em conclusão, experimentos com a prática do EA têm crescido nos últimos
anos. Animais crescidos em EA apresentam efeitos positivos em relação aos
aspectos fisiológicos e psicológicos, comprovando que o EA promove bem-estar
para estes animais (404). Animais saudáveis e bem adaptados contribuem
significativamente para a qualidade dos dados coletados em pesquisas científicas
(405). Para a neurociência, a aplicação de EA tem ampla investigação sobre
diversas áreas de atuação, tais como: sobre a depressão, ansiedade, dependência
de drogas, doenças de Alzheimer e Parkinson, além de lesões cerebrais traumáticas
e lesão da medula espinal, dentre outras. Contudo, ainda existe a necessidade de
mais pesquisas a respeito dos efeitos de EA e o bem-estar animal. É viável ressaltar
que a EA não é a única solução para amenizar os problemas dos animais de
cativeiro. EA tem suas limitações, mas se executada com eficiência, produzirá um
impacto favorável na vida dos animais (406).
81
2
OBJETIVOS
2.1 GERAIS
Investigar os efeitos da vitamina C sobre a ansiedade e memória em dois
estudos: o primeiro em estudantes do Ensino Médio de Escola Pública, visando
avaliar e comparar parâmetros fisiológicos e desempenho cognitivo, e o segundo em
ratos de meia-idade, crescidos em ambiente enriquecido, para verificar a influência
da vitamina C sobre os efeitos comportamentais em modelo animal de ansiedade e
memória, associada com o enriquecimento ambiental.
2.2 ESPECÍFICOS
a) Investigar os efeitos da suplementação da vitamina C sobre os níveis de
ansiedade e defícits de memória dos estudantes, antes e após as intervenções
da vitamina C (experimental) ou placebo (controle), em um estudo randomizado
e duplo cego.
b) Avaliar os parâmetros fisiológicos dos estudantes, tais como: aferição da
pressão arterial sistólica, diastólica e frequência cardíaca e as medidas da
concentração plasmática de vitamina C, antes e após as intervenções.
c) Avaliar e comparar o desempenho cognitivo dos estudantes suplementados com
vitamina C ou placebo, antes e após as intervenções, através de uma bateria de
testes neuropsicológicos de ansiedade e memória.
d) Investigar a influência da vitamina C (experimental) e solução salina (controle)
em
ratos
de
meia-idade
(14
meses),
crescidos
em
ambiente
enriquecimento, sobre a ansiedade e memória, avaliadas no LCE e no LAM.
com
82
3
CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O primeiro estudo envolveu estudantes do Ensino Médio de Escola Pública.
Os
pesquisadores
garantiram
total
privacidade
e
seguro
anonimato
aos
participantes, na confidencialidade dos dados coletados, bem como proporcionaram
liberdade para a desistência em qualquer etapa da pesquisa, sem nenhum prejuízo,
no decorrer dos procedimentos laboratoriais e testes neuropsicológicos de
ansiedade e memória.
Todos os participantes foram informados dos detalhes do estudo e o termo de
consentimento livre e esclarecido, foi assinado pelo participante maior de idade (18 a
70 anos) ou pelos pais responsáveis pelo estudante menor de idade (14 a 17 anos).
O protocolo experimental está de conformidade com a Declaração de Helsinki e
Guia de Boas Práticas Clínicas, e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
com Seres Humanos da Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília,
sob o nº 022/12 (Anexo A).
O segundo estudo foi conduzido em modelo animal de ansiedade e memória.
Todos os procedimentos utilizados estão de acordo com as orientações contidas no
Manual de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. Os protocolos experimentais
foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade de
Brasília (UnB, Brasil), conforme Publicação NIH Nº 85-23 que rege os “Princípios de
cuidados com animais de laboratório”, revisado em 1985, sob o nº 59616/2010
(Anexo B).
Todos os esforços foram realizados para evitar o sofrimento dos animais
durante os procedimentos laboratoriais e no período de manutenção e limpeza das
caixas dos animais, tanto em ambiente enriquecido, quanto no ambiente padrão.
83
4
ESTUDO 1: EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO ORAL DE VITAMINA C EM
SERES HUMANOS ESCOLARIZADOS SOBRE A ANSIEDADE E MEMÓRIA
A ansiedade é acompanhada de alterações dos sinais fisiológicos, em
decorrência a uma resposta produzida por uma ameaça aparente, vaga ou interna
(407) e serve como uma função adaptativa, preparando o indivíduo para o potencial
perigo, bem como alertando a pessoa para estar preparada para uma ameaça
iminente (407, 408). No entanto, quando a ansiedade é extremamente elevada e
persistente, pode ser considerada, dentro dos critérios dos transtornos, como um
evento patológico (408).
A ansiedade também está associada a problemas secundários, como falta de
autoconfiança e dificuldades acadêmicas (409). Nesses casos, a ansiedade pode
causar irritabilidade, inquietação, distúrbios do sono, preocupação persistente,
náuseas, palpitações, dores de cabeça, dores de estômago (410). Além disso, para
os estudantes, outros sintomas podem ser expressos em sala de aula e contribuir
para o baixo desempenho acadêmico, tais como: pânico, medo de falhar nos
exames, nervosismo, incapacidade de realizar tarefas, e batimentos cardíacos
acelerados (411). Altos níveis de ansiedade podem prejudicar a memória de trabalho
e aumentar a distração dos estudantes (412, 413) e obtenção de notas mais baixas
(414). A ansiedade vem sendo o principal preceptor do desempenho acadêmico dos
estudantes (415), pois um aumento dos níveis de ansiedade pode estar associado a
um desempenho acadêmico inferior (416, 417).
Estudos têm mostrado que a vitamina C está relacionada com o
comportamento ansioso e psicológico desencadeado por situações de estresse. O
tratamento por 14 dias com doses elevadas de vitamina C (1,000 mg três vezes por
dia) reduziu a pressão arterial, diminuição do cortisol, e reduziu respostas subjetivas
associadas ao estresse psicológico agudo (418). Níveis de concentração plasmática
de vitamina C foram inversamente associados com a pressão arterial sistólica e
diastólica em estudos transversais (419, 420).
Mazloom
et
al.
(421)
demonstraram
que
a
vitamina
C
reduziu
significativamente os escores de ansiedade, em comparação com vitamina E e
placebo em pacientes diabéticos tipo 2; no entanto, não foram encontradas
84
diferenças significativas entre os grupos experimental e controle para os escores de
depressão ou estresse.
Recentemente, Aburawi et al. (422) investigaram a eficácia da vitamina C
como tratamento para a depressão e a sua ação associada com antidepressivos, tal
como paroxetina, fluoxetina, clomipramina, fluvoxamina, e a combinação de
olanzapina e clomipramina. Os autores concluíram que a combinação de vitamina C,
com antidepressivos, resultou em uma melhor resposta terapêutica para a
depressão. Da mesma forma, Amr et al. (423) também demonstraram a eficácia da
adição de vitamina C à fluoxetina como um coadjuvante para o tratamento do
transtorno depressivo maior em pacientes pediátricos. Adicionalmente, numerosos
estudos de modelos animais de depressão têm mostrado os efeitos antidepressivos
de vitamina C (424-429).
A suplementação de vitamina C tem produzido resultados inconsistentes para
o tratamento da fadiga em seres humanos. No entanto, um ensaio clínico realizado
por Suh et al. (430) forneceu resultados positivos. A administração intravenosa de
vitamina C diminuiu a fadiga em trabalhadores de escritório após duas horas, e os
níveis de fadiga permaneceram inferiores por um dia, com altos níveis de vitamina C
no plasma e redução do estresse oxidativo em relação ao grupo placebo. Além
disso, outros estudos têm indicado uma alta prevalência de hipovitaminose C e D em
pacientes com cuidados agudos e melhora do humor, reduzindo o distresse em
pacientes hospitalizados (431, 432, 433).
O estresse oxidativo pode contribuir para a fisiopatologia dos transtornos de
ansiedade (409, 434). Um estudo demonstrou que há associações entre níveis de
oxidantes/antioxidantes e transtornos de ansiedade em crianças e adolescentes
(409). Isto sugere que o estresse oxidativo pode ser prejudicial em crianças e
adolescentes com transtornos de ansiedade. Neste sentido, o elevado consumo de
oxigênio que ocorre no cérebro e a sua constituição rica em lípidios (435, 436)
podem contribuir para o estresse oxidativo, e isto pode promover ou provocar
distúrbios psiquiátricos (437, 438). Entre outros fatores, tais como genético,
neuroquímico, neurobiológico e psicológico, o estresse oxidativo pode ser um fator
importante para a etiopatogenia de transtornos de ansiedade (401).
Outros estudos também encontraram uma ligação entre estresse oxidativo e
transtorno obsessivo compulsivo e transtorno de pânico, indicando que o
85
metabolismo oxidativo pode afetar a regulação da ansiedade (439, 440). Para
combater essas alterações neuroquímicas, os sistemas biológicos são equipados
com defesas antioxidantes. Portanto, a suplementação com antioxidantes podem
desempenhar um papel terapêutico importante para combater o estresse oxidativo
em indivíduos que sofrem de ansiedade (407).
O objetivo deste primeiro estudo foi verificar se um importante antioxidante
como a vitamina C exerce um efeito ansiolítico em estudantes do Ensino Médio. Os
níveis de ansiedade dos estudantes foram avaliados por um instrumento validado
conhecido como Inventário de Ansiedade de Beck. Além de analisar e comparar o
desempenho cognitivo dos estudantes suplementados com vitamina C ou placebo,
antes e após a intervenção, através de uma bateria de testes neuropsicológicos de
memória. Isto possibilitou a investigação do suposto papel terapêutico da vitamina C
na cognição de humanos escolarizados e sua relação com a ansiedade e a
memória.
Os efeitos da suplementação da vitamina C sobre a ansiedade em estudantes
do Ensino Médio, que fazem parte deste estudo, já foram publicados no Pakistan
Journal of Biological Sciences e uma cópia é apresentada no Anexo N.
86
4.1
MÉTODOS
4.1.1 Participantes
Estudantes do Ensino Médio de Escola Pública, de ambos os sexos, foram
convidados a participar neste estudo. Foram entrevistados 99 estudantes, sendo
70,7% do sexo feminino e 29,3% do sexo masculino. Destes, 97 foram selecionados,
conforme os critérios de inclusão e exclusão descritos abaixo. Na 1ª avaliação
realizada por psicólogas, 2 estudantes foram excluídas, por estarem ingerindo
medicamentos de uso controlado para epilepsia e disfunção da tireóide. Na coleta de
dados do 1º dia do experimento (linha de base) 22,68% dos estudantes desistiram e
34,02% dos estudantes não participaram dos procedimentos laboratoriais póstratamento, caracterizando duas perdas amostrais. Assim, 42,29% dos estudantes
completaram todas as etapas do estudo. O fluxograma dos participantes é
apresentado na Figura 9.
4.1.2 Critérios de Inclusão
Todos os estudantes que apresentavam pleno gozo da saúde física e mental
foram incluídos no corrente estudo. Não havia histórico de tabagismo entre os
participantes.
4.1.3 Critérios de Exclusão
Foram excluídos os estudantes que estavam ingerindo regularmente
suplementos de vitamina C ou medicamentos restritos a pacientes psiquiátricos,
bem como aqueles que tinham histórico de doença tais como: diabetes, hipertensão,
problemas de coração, pulmão, predisposição para doença renal, desnutrição,
87
raquitismo, baixo peso para a sua idade. Também foram excluídas deste estudo as
estudantes grávidas.
Figura 9. Fluxograma dos participantes
88
4.1.4 Local da Pesquisa
O Centro de Ensino Médio de Escola Pública (CEM) foi criado pelo Decreto
nº 108, de 28 de novembro de 1978 (Figura 10). É uma entidade de caráter
educacional e ocupa um espaço de grande importância no contexto históricoeducacional da comunidade de Ceilândia. Como Instituição de Ensino Médio (IE), o
CEM é destaque na comunidade do Setor “O”, Ceilândia/Distrito Federal, sendo
responsável pela inserção de vários jovens no contexto universitário do DF. A IE
passou a ser atendida pelo Programa de Desenvolvimento Educacional (PDE) em
2009, bem como em consonância com as políticas públicas do MEC e da Secretaria
de Educação do Distrito Federal.
A clientela do CEM é formada por estudantes na faixa etária a partir de 13
anos no turno vespertino, 15 anos no turno matutino e 17 anos até 70 anos no turno
noturno. A grande maioria dos estudantes são trabalhadores, estagiários, menor
aprendiz ou desempenham serviços diversos ou são filhos(a) de trabalhadores(as)
em geral, isto é, comunidade de médio a baixo poder aquisitivo. Existem também no
corpo
discente
02
estudantes
com
necessidades
educacionais
especiais
matriculados em séries regulares com acompanhamento da coordenação e da
orientação educacional.
89
Figura 10. Centro de Ensino Médio de Escola Pública
4.1.5 Perfil da Equipe Multidisciplinar
Os estudantes foram avaliados por uma equipe multidisciplinar com
experiência em bioquímica, nutrição, psicologia e neurociências. A equipe era
formada pelas Psicólogas Aline Maria Lannone Alonso (CRP 01/8637), Doutoranda
em Ciências do Comportamento, do Instituto de Psicologia, da Universidade de
Brasília - UnB e Jaqueline Lopes Barreiro (CRP 01/13581) com as seguintes
atribuições: aplicação dos testes neuropsicológicos, entrevistas semi-estruturada e
avaliação psicológica dos estudantes. A Nutricionista Dra. Grazielle Gebrim Santos
(CRN 3655), responsável pela descrição nutricional, recordatório nutricional e
ingestão de nutrientes. Todas as profissionais eram devidamente credenciadas
pelos seus respectivos Conselhos Regionais de Psicologia (CRP) e de Nutrição
(CRN).
90
4.1.6 Perfil da Equipe do LACEN-DF
O Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal (LACEN-DF) é um
órgão vinculado à Subsecretaria de Vigilância à Saúde, da Secretaria de Estado de
Saúde. Sua criação se deu em setembro de 2000, em substituição ao Instituto de
Saúde do DF - ISDF, então com 22 anos de atividade. O LACEN-DF tem como
objetivo realizar pesquisas científicas e exames laboratoriais como atividades de
vigilância sanitária e epidemiológica.
O LACEN-DF integra a Rede Nacional de Laboratórios de Vigilância
Epidemiológica do Ministério da Saúde e está sob a Gerência do Mestre em
Ciências Farmacêuticas e Farmacêutico, Ms Nelson Frick da Silva Fagundes,
Gerência de Medicamentos e Toxicologia do LACEN-DF, que realizou juntamente
com sua Equipe de Bioquímicos a coleta e análise de sangue dos estudantes,
cumprindo as normas de segurança e procedimentos, visando à proteção dos
sujeitos de pesquisa e seus responsáveis legais.
4.1.7 Compostos
As cápsulas de vitamina C e as cápsulas de placebo foram obtidas da
Farmacotécnica (Farmácia de Manipulação de Medicamentos – Brasília, Distrito
Federal).
4.1.8 Procedimentos Experimentais
Quarenta e dois estudantes foram recrutados e designados aleatoriamente (n
= 21 para cada grupo) para receber a vitamina C ou placebo. Não houve
desistências. Os participantes tomaram cápsulas de placebo ou cápsulas de
suplemento de vitamina C (500 mg/dia), todos os dias, durante 14 dias. Apenas a
91
nutricionista responsável pelo acompanhamento e distribuição das cápsulas estava
ciente da composição das cápsulas. Os estudantes foram avaliados por uma equipe
multidisciplinar com experiência em bioquímica, nutrição, psicologia e neurociência.
A equipe realizou entrevistas com todos os estudantes. Os estudantes foram
informados sobre a finalidade e os procedimentos experimentais. O primeiro dia do
experimento começou às 08h00, com a recepção dos estudantes no laboratório,
onde eles receberam um kit de um nutricionista contendo cápsulas de vitamina C ou
placebo. As cápsulas de placebo eram idênticas na aparência como as cápsulas de
vitamina C (ambas em cores verdes e brancas). Em seguida, foi aferida a pressão
arterial sistólica e diastólica, a frequência cardíaca e foram coletadas amostras de
sangue (5 mL) dos estudantes Todos os estudantes foram informados que para a
coleta das amostras de sangue seria necessário jejum de oito horas e que a coleta
de sangue teria início às 09h00. A coleta de sangue terminou às 10h00 e as
amostras foram encaminhadas para análise. Após a coleta de sangue foi oferecido
café da manhã aos estudantes participantes. No dia seguinte, os estudantes foram
então avaliados pelas psicólogas da equipe, em ordem aleatória, com uma bateria
de testes neuropsicológicos de ansiedade e memória. Estes testes do 1º dia
constituíram as medidas iniciais (linha de base). Estes procedimentos experimentais
foram repetidos no 15º dia (pós-tratamento), após a sequência da suplementação.
4.1.8.1 Aferição da Pressão Arterial
Antes das amostras de sangue serem coletadas, as medidas da pressão
arterial sistólica e diastólica e a frequência cardiáca dos estudantes foram aferidas
através de um esfigmomanômetro autoinflável automática portátil (Powerpack MS918). O procedimento foi repetido no décimo quinto dia pós-tratamento.
92
4.1.8.2 Coleta de Sangue e Procedimentos Laboratoriais
A aferição da concentração plasmática de ácido ascórbico foi inicialmente
baseada
na
oxidação
do
ácido
ascórbico
por
ácidos
dicetogulônico
e
ácidoshidroascórbico. Estes produtos reagem com 2,4 dinitrofenilhidrazina para
formar 2,4-dinitrofenilhidrazona. Este composto, após reação com o ácido sulfúrico
(H2S04), forma um produto com uma banda de absorção que pode ser medida a 520
nm. Neste estudo, a concentração de ácido ascórbico no plasma foi avaliada
segundo o protocolo proposto por Bessey (441) com uma metodologia semelhante a
estudos anteriores (442, 443). Amostras de sangue venoso (5 mL) foram coletadas
de todos os alunos com uso de agulha hipodérmica. Uma solução de 100 ml
contendo 2,4-dinitrofenilhidrazina (2%), tioureia (5%), e sulfato de cobre (0,6%)
(DTC) foi preparada imediatamente após isso, uma amostra de 0,4 mL (soro) foi
removida e adicionada a 1,6 mL de ácido tricloroacético (TCA) mistura de 5%
durante 30 segundos, e centrifugado a 2.500 rpm durante 10 min. Em seguida, 0,2
mL de reagente de DTC foi adicionado a 0,6 mL de sobrenadante e a solução foi
posteriormente agitada durante 30 s. Este procedimento foi realizado em triplicata.
Para completar a solução padrão, 1 ml de H2S04 a 65% foi adicionado e as amostras
foram agitadas durante 30 s. Após 30 minutos, na proteção da luz, a leitura foi feita
em espectrofotômetro (SpectraMax M5, Molecular Devices) a 520 nm. A
concentração de ácido ascórbico no plasma foi calculada usando uma curva de
calibração.
4.1.9 Testes Neuropsicológicos
4.1.9.1 Ansiedade: Inventário de Ansiedade de Beck
O Inventário de Ansiedade de Beck (BAI) foi projetado por Beck, Epstein,
Brown e Steer em 1988 (444, 445). Vinte e um itens foram projetados para medir os
sintomas somáticos, afetivos e cognitivos característicos de ansiedade. Este
93
inventário foi construído para evitar confusão com os sintomas de depressão.
Pontuação entre 8 e 15 são interpretados como ansiedade leve, entre 16 e 25, como
ansiedade moderada, e entre 25 e 63 ansiedade grave (445).
4.1.9.2 Memória: Figuras Complexas de Rey
As Figuras Complexas de Rey (FCR) objetivam avaliar a atividade perceptiva
e a memória visual, nas fases de cópia e reprodução de memória. Seu idealizador
foi André Rey (446) e padronizado por Osterrieth (447). Este teste tem por objetivo
verificar o modo como o sujeito apreende os dados perceptivos que lhe são
apresentados e o que foi conservado espontaneamente pela memória, não existindo
limite de idade, e podendo ser utilizado para qualquer idade.
O teste consiste em apresentar ao participante o cartão com a figura A na
horizontal, e duas folhas de papel branco, sem pautas, que serão utilizadas para
desenhar a figura em dois momentos: no primeiro, foi solicitado ao participante que
copiasse a figura A, prestando atenção às proporções, sem precisar fazer uma cópia
exata, mas copiando o maior número de detalhes possíveis. O tempo gasto com a
tarefa foi registrado com a utilização de um cronômetro, assim que se iniciou a
cópia. O segundo momento do teste aconteceu após três minutos da apresentação
da figura, e consistiu em reproduzir, de memória, a figura A copiada anteriormente,
em outra folha de papel em branco, disponibilizada pelo examinador. O participante
é convidado a desenhar de memória tudo o que se lembrar da figura A. Não há
necessidade de limitar o tempo para a reprodução da figura A e o participante avisa
ao examinador quando considerar que já terminou a tarefa. Contudo, é necessário
acionar o cronômetro para registrar quanto tempo o participante gastou para
executar a tarefa proposta.
As FCR são amplamente usadas para avaliar a memória visuo-espacial e
memória não verbal, não apenas em pacientes com epilepsia, mas também em
diferentes áreas das neurociências (448). Este teste permite explorar as habilidades
de organização visuo-espacial, planejamento e desenvolvimento de estratégias. A
figura modelo é composta das seguintes propriedades: (1) ausência de signifcação
94
evidente; (2) realização gráfica fácil e (3) Estrutura do conjunto suficientemente
complicada, com o objetivo de exigir do participante ou paciente uma atividade
perceptiva analítica e organizada (Figura 11) (449).
Figura 11. Figura Complexa de Rey. Fonte: (449).
4.1.9.3 Memória: Escala de Memória Weschler
Este teste de memória foi idealizado para propiciar informações importantes
nas avaliações neuropsicológicas e clinicas em gerais, além da reabilitação dos
aspectos ligados ao bom funcionamento da memória. O objetivo deste teste de
memória é avaliar a memória declarativa episódica (informações específicas de uma
situação ou contexto), bem como memória de curto e longo prazo e discrepâncias
acerca do nível intelectual e da capacidade mnésica dos participantes. O teste é
composto por 11 (onze) subtestes, aplicados individualmente, porém é importante
disponibilizar um tempo em torno de 35 minutos para a realização total do teste.
Foram utilizados 6 (seis) subtestes nesta pesquisa, listadas abaixo:
95
1) Informação: necessária para a avaliação da memória imediata e passada
relacionadas com conteúdos episódicos; este subteste é caracterizado por
meio de perguntas autobiográficas, como por exemplo: data e local de
nascimento, nomes de pessoas da história remota e atual do governo;
2) Orientação: importante para avaliar a noção de espaço e tempo, dia, mês,
ano que o participante acredita se encontrar no momento do teste;
3) Controle Mental: relacionado com raciocínio lógico simples, atenção e
evocação livre ligado a memória imediata;
4) Digítos em ordem direta e inversa: útil para avaliar a atenção e
evocação verbal de números. Este subteste verifica se o participante
consegue responder um estímulo verbal e é capaz de manter a atenção,
enquanto estiver executando a tarefa no teste. O subteste da ordem
inversa consiste em verificar o raciocínio lógico;
5) Memória Lógica I e II: relacionado com a memória declarativa verbal
imediata e tardia. Este subteste garante que o participante memorize um
contexto verbal de uma estória a curto e longo prazo. O subteste se inicia
quando o examinador conta duas estórias curtas e de lembranças
imediatas e o participante tem que relatá-las de acordo com o que
consegue se lembrar das estórias. São anotados quantos itens o
participante recordou dentre 25 itens presentes em cada estória. O escore
máximo é de 50 pontos de cada fase.
6) Aprendizagem de Pares Associados I e II: envolvido na aprendizagem e
memorização imediata de 8 pares de palavras com associação óbvia e
não óbvia.
96
4.1.10 Análise Estatística
O programa software GraphPad Prism foi utilizada para a construção da figura
deste experimento. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS IBM
versão 20.0 para Windows (IBM Corp NY, EUA). Os dados são expressos em média
± desvio padrão (DP). Para avaliar a normalidade das distribuições das variáveis,
foram realizados testes de Kolmogorov-Smirnov. Quando os resultados foram
normalmente distribuídos, as diferenças entre os grupos foram avaliadas utilizando o
teste paramétrico teste t. Quando os resultados não foram normalmente distribuídos,
foram utilizados os testes não paramétricos de Wilcoxon signed-rank e MannWhitney. As variáveis categóricas foram analisadas por meio de testes quiquadrado. Os níveis de significância foram fixados em p <0,05.
97
4.2
RESULTADOS
4.2.1 Características descritivas da amostra
As características demográficas dos estudantes encontram-se na Tabela 2.
Em relação à idade o teste t indicou que o grupo vitamina C não era
significativamente diferente em comparação com o grupo placebo (p = 0,125). Não
houve diferenças entre os sexos (p = 1,000). As avaliações de altura, peso e índice
de massa corporal (IMC) também foram equiparadas não havendo diferenças
demográficas significativas entre o grupo da vitamina C, em comparação ao grupo
placebo. Em resumo, os dois grupos não diferiram entre si em relação às
características descritivas.
Tabela 2 - Características demográficas dos estudantes
(1, 2)
.
Vitamina C
Placebo
Valor de
(n=21)
(n=21)
p
30,43 ± 14,35
24,24 ± 11,07
0,125
Masculino (%)
5 (23,80)
5 (23,80)
1,000
Feminino (%)
16 (76,19)
16 (76,19)
Altura (m)
1,62 ± 0,09
1,63 ± 0,09
0,930
Peso (kg)
61,43 ± 14,46
59,00 ± 11,59
0,624
23,32 ± 4,77
22,27 ± 3,76
0,513
Variáveis
Idade (anos)
(3)
Gênero (N)
2
IMC (kg/m )
(4)
(5)
(5)
(5)
IMC, Indice de massa corporal.
(1)
Todos os valores são expressos com médias ± desvio padrão (DP).
(2)
Teste de Kolmogorv-Smirnov para a normalidade das distribuições das variáveis.
(3)
t-test.
(4)
Teste do Qui-quadrado.
(5)
Mann-Whitney U test.
Os dados da distribuição de frequências das variáveis de descrição dos
estudantes encontram-se na Tabela 3. Não houve diferença estatísticamente
significativa entre os grupos e as variáveis: faixa etária (p = 0,819), escolaridade (p =
0,564), estado civil (p = 0,445), atuação profissional (p = 0,757), situação financeira
(p = 0,251) e religiosidade (p = 0,268).
98
Tabela 3 - Distribuição de frequências das variáveis de descrição dos estudantes.
Variáveis
Vitamina C
Placebo
Total
(n=21)
(n=21)
(n=42)
N
%
N
%
N
%
14 a 17 anos
7
33,34
8
38,09
15
35,71
18 a 49 anos
12
57,14
12
57,14
24
57,14
50 a 70 anos
2
9,52
1
4,76
3
7,14
1º Ano
3
14,28
5
23,80
8
19,04
2º Ano
5
23,80
3
14,28
8
19,04
3º Ano
0
0
1
4,76
1
2,38
3º EJA
13
61,90
12
57,14
25
59,52
Casado
8
38,09
6
28,57
14
33,34
Solteiro
12
57,14
15
71,42
27
64,28
Separado
1
4,76
0
0
1
2,38
Sim
11
52,38
12
57,14
23
54,76
Não
10
47,61
9
42,85
19
45,23
Até 2 SM
6
28,57
8
38,09
14
33,34
3 a 4 SM
5
23,80
9
42,85
14
33,34
5 a 6 SM
4
19,04
1
4,76
5
11,90
7 a 8 SM
2
9,52
0
0
2
4,76
Não declarou
4
19,04
3
14,28
7
16,67
Católica
8
38,09
4
19,04
12
28,57
Evangélica
5
23,81
4
19,04
9
21,42
Sem religião
8
38,09
13
61,90
21
50
(1)
p
Faixa Etária
0,819
Escolaridade (*)
0,564
Estado Civil
0,445
Trabalha
0,757
Renda Familiar
0,251
Religião
0,268
(*) Estudantes do Ensino Médio Regular e Educação de Jovens e Adultos (EJA) cursando o periodo
letivo 2013. Turnos: matutino (2º e 3º anos), vespertino (1º ano) e Noturno (3º EJA) = 3º seguimento
da EJA; N = número de participantes, SM = salário mínino, % = frequência.
1
Teste do Qui-quadrado.
99
Adicionalmente, em termos de nutrição os estudantes foram avaliados através
do recordatório nutricional, os dados estão apresentados na Tabela 4. Verificou-se
que de modo geral, os estudantes são considerados eutróficos. Não houve diferença
estatisticamente significativa entre os grupos vitamina C e placebo sobre as
variáveis das refeições (p = 0,569), consumo de alimento (p = 0,807) e bebidas (p =
0,816), indicando que os grupos são homogêneos em relação aos aspectos
nutricionais.
(1)
Tabela 4 - Recordatório Nutricional dos estudantes .
Vitamina C
Placebo
Total
(n=21)
(n=21)
(n=42)
Variáveis
N
%
N
%
N
%
Café da manhã
15
19,23
19
21,83
34
20,60
Lanche da manhã
11
14,10
7
8,04
18
10,90
Almoço
18
23,07
20
22,98
38
23,03
Lanche da tarde
16
20,51
14
16,09
30
18,18
Jantar
15
19,23
19
21,83
34
20,60
Ceia
3
3,84
8
9,19
11
6,67
Subtotal
78
100
87
100
165
100
Saladas
16
57,14
19
65,51
35
61,40
Frutas
7
25
6
20,68
13
22,80
Verduras
5
17,85
4
13,79
9
15,78
Subtotal
28
100
29
100
57
100
Refrigerantes
10
71,42
15
75
25
73,52
Sucos
4
28,57
5
25
9
26,47
120
100
136
100
256
100
p
(2)
Nome das Refeições
0,569
Alimentos
0,807
Bebidas
Total
(1)
Todos os valores são expressos com médias. N = número de participantes, % = frequência.
(2)
Teste do Qui-quadrado.
0,816
100
A concentração plasmática de vitamina C, a pressão arterial sistólica, pressão
arterial diastólica e frequência cardíaca são apresentadas na Tabela 5, tanto no
início do estudo e após a intervenção experimental (pós-tratamento). O teste de
Wilcoxon Signed Rank revelou que houve uma diminuição significativa entre o grupo
vitamina C pós-tratamento em comparação com o tratamento inicial (p = 0,010). A
concentração plasmática de vitamina C foi maior no grupo vitamina C do que no
grupo placebo após o período de intervenção (p = 0,001). Da mesma maneira, foram
encontradas diferenças significativas na média da frequência cardíaca do grupo
vitamina C (p = 0,032) comparado com o grupo placebo (p = 0,741). No entanto, não
houve diferença significativa entre os grupos vitamina C (p = 0,933) e placebo (p =
0,965) e da pressão diastólica entre os grupos vitamina C (p = 0,698) e placebo (p =
0,728) pré ou pós-tratamento sobre a média da pressão sistólica e pressão arterial
diastólica. Estes resultados sugerem que o grupo experimental da vitamina C tinha
melhor resposta fisiológica comparada com o grupo controle placebo, apenas na
média da frequência cardiáca, indicando que a vitamina C melhorou este parâmetro
que está envolvido com os sintomas de ansiedade. Como mostrado na Figura 12, os
escores de ansiedade após a intervenção foram significativamente menores para a
vitamina C (p = 0,010) do que o grupo controle placebo (p = 0,050), indicando que os
suplementos orais de vitamina C melhoraram os níveis de ansiedade dos
estudantes.
Tabela 5: Parâmetros bioquímicos e fisiológicos dos estudantes pré e pós-tratamento com suplementação de
(1, 2)
vitamina C ou placebo, conforme análise não paramétrica Wilcoxon signed rank test
.
Vitamina C
Placebo
(n = 21)
Variáveis
p
Antes
Depois
CPVC (mg/dl)
1,09 ± 0,52
1,85 ± 0,46
PAS (mm Hg)
121,70 ± 23,84
PAD (mm Hg)
FC (bpm)
(2)
(n = 21)
p
(2)
Antes
Depois
0,001***
1,19 ± 0,38
1,31 ± 0,53
0,741
119,00 ± 13,16
0,933
114,30 ± 11,85
114,20 ± 9,41
0,965
76,10 ± 13,03
75,70 ± 8,49
0,698
73,20 ± 10,57
72,00 ± 9,59
0,728
79,20 ± 11,98
74,70 ± 9,36
0,032*
81,50 ± 13,85
81,00 ± 12.90
0,476
CPVC, concentração plasmática de vitamina C; PAS, pressão arterial sistólica; PAD, pressão arterial diastólica;
FC, frequência cardíaca.
(1)
Todos os dados são expressos como médias ± DP.
(2)
Teste de Kolmogorv-Smirnov para a normalidade das distribuições das variáveis.
(3)
*(p ˂ 0,05) e ***(p ˂ 0,001).
101
60
E scores de B A I
50
40
30
20
10
0
_ _A_n_te
_ _s _ _ _ _ _ _D_e_ p_ o
_ _is_
V ita m in a C
_A
_ _n_te_ s_ _ _ _ _ _ _D_e_p_o_ is
__
P la c e b o
Figura 12: Efeitos da vitamina C ou placebo sobre a ansiedade avaliada pelo BAI. Box plots dos
escores de ansiedade dos estudantes do grupo vitamina C (n = 21) e do grupo placebo (n = 21). A
ansiedade foi avaliada antes (linha de base) e depois (14 dias de tratamento) pelo BAI em ambos os
grupos (p = 0,010), conforme análise não paramétrica de Wilcoxon signed-rank test.
Os escores médios de ansiedade e a bateria de testes neuropsicológicos de
memória são apresentados na Tabela 6, tanto no início do estudo e após a
intervenção experimental (pós-tratamento). A análise não paramétrica de Wilcoxon
signed rank test revelou que houve uma diminuição significativa entre o grupo
vitamina C [(Z = -2,57 (p = 0,010)] e o grupo controle placebo [(Z = -0,67 (p =
0,501)], pós-tratamento em comparação com o tratamento inicial. O Wilcoxon signed
rank test apresentou também diferenças significativas no desempenho dos
estudantes, após a suplementação de vitamina C [(Z = -2,25 (p = 0,024)] ou placebo
[(Z = -1,81 (p = 0,070)], nas tarefas de cópia, e vitamina C [(Z = -3,23 (p = 0,001)] ou
placebo [(Z = -0,48 (p = 0,627)], para a reprodução de memória das Figuras
Complexas de Rey. E ainda revelou um aumento nos escores do subteste de
memória lógica imediata (ML1) da escala de memória de Wechsler (WMS) do grupo
102
vitamina C [(Z = -3,73 (p = 0,001)] ou do grupo placebo [(Z = -0,72 (p = 0,468)] e
subteste de memória lógica tardia (ML2) da WMS do grupo vitamina C [(Z = -3,54
(p = 0,001)] ou do grupo placebo [(Z = -1,38 (p = 0,165)], bem como do subteste de
repetição de dígitos indiretos (DI) da WMS do grupo vitamina C [(Z = -2,35 (p =
0,020)] ou do grupo placebo [(Z = -0,40 (p = 0,688)]. Não foram encontradas
diferenças significativas para os demais subtestes tais como: subteste de informação
e orientação; subteste controle mental; subteste de repetição de dígitos diretos;
subteste de aprendizagem imediata de pares de fácil associação e subteste de
aprendizagem tardia de pares de fácil associação da WMS.
Tabela 6 - Desempenho dos estudantes nos testes neuropsicológicos pré e pós-tratamento com suplementação
(1, 2)
de vitamina C ou placebo, conforme análise não paramétrica Wilcoxon signed rank test
.
Testes
Vitamina C
(n = 21)
Antes
Depois
BAI
22,33 ± 10,35
16,86 ± 10,19
IN-OR
14,71 ± 0,56
CM
Escore Z e
Placebo
Escore Z e
(3)
(n = 21)
valor de p
valor de p
(3)
Antes
Depois
-2,57 0,010**
25,43 ± 10,56
24,95 ± 13,11
-0,67 0,501
14,48 ± 0,68
-1,18 0,236
14,67 ± 0,66
14,43 ± 0,51
-1,50 0,132
4,39 ± 0,66
4,52 ± 0,59
-0,25 0,803
4,70 ± 0,82
4,52 ± 0,73
-1,15 0,248
FCRC
29,93 ± 5,18
31,79 ± 4,58
-2,25 0,024*
29,86 ± 6,00
31,43 ± 3,88
-1,81 0,070
FCRM
16,10 ± 6,20
19,38 ± 5,55
-3,23 0,001***
17,90 ± 6,89
17,19 ± 4,98
-0,48 0,627
ML1
10,95 ± 3,56
13,24 ± 3,69
-3,73 0,001***
12,45 ± 3,09
12,55 ± 3,23
-0,72 0,468
ML2
10,76 ± 3,77
13,17 ± 4,02
-3,54 0,001***
11,79 ± 2,90
12,10 ± 3,40
-1,38 0,165
DD
9,62 ± 1,91
9,05 ± 2,58
-1,36 0,172
9,57 ± 1,57
9,81 ± 2,64
-0,63 0,527
DI
5,62 ± 1,72
6,10 ± 1,67
-2,35 0,020*
5,71 ± 1,10
5,57 ± 1,75
-0,40 0,688
PAF1
5,98 ± 2,08
5,83 ± 1,82
-0,90 0,363
6,81 ± 1,33
6,43 ± 1,60
-0,95 0,341
PAF2
6,05 ± 1,53
5,95 ± 1,88
-0,12 0,901
6,34 ± 1,63
6,90 ± 1,30
-1,18 0,234
BAI: Inventário de Ansiedade de Beck; IN-OR: subteste de informação e orientação da WMS (Escala de Memória
Wechsler); CM: subteste controle mental da WMS; FCRC: Figuras Complexas de Rey – Cópia; FCRM: Figuras
Complexas de Rey – Memória; ML1: subteste de memória lógica imediata da WMS; ML2: subteste de memória
lógica tardia da WMS; DD: subteste de repetição de dígitos diretos da WAIS; DI: subteste de repetição de dígitos
indiretos da WAIS; PAF1: subteste de aprendizagem imediata de pares de fácil associação da WMS; PAF2:
subteste de aprendizagem tardia de pares de fácil associação da WMS. Antes e depois da intervenção.
(1)
Todos os dados são expressos como médias ± DP.
(2)
Teste de Kolmogorv-Smirnov para a normalidade das distribuições das variáveis.
(3)
*(p ˂ 0,05), (p<0,01**) e (p<0,001***).
103
4.3.
DISCUSSÃO
O primeiro estudo avaliou os efeitos da suplementação de vitamina C sobre a
ansiedade e memória em estudantes do Ensino Médio de Escola Pública. A vitamina
C mostrou um efeito ansiolítico, conforme indicado pela redução dos escores de
ansiedade de BAI. Adicionalmente, a vitamina C também diminuiu a frequência
cardíaca quando comparado com o placebo. Estes resultados estão de acordo com
um estudo anterior que investigou os efeitos de seis semanas de suplementação
com a vitamina C (1.000 mg/dia) e vitamina E (400 UI/dia) nos níveis de ansiedade,
depressão e estresse em pacientes diabéticos tipo 2. Os resultados desse estudo
mostraram que a vitamina C reduziu significativamente os escores de ansiedade em
relação ao placebo e à vitamina E. Em contraste, a vitamina E aumentou
significativamente os escores de ansiedade. Esse estudo também mostrou que a
vitamina C diminuiu os níveis de estresse em comparação com o grupo placebo
(421).
As baixas frequências cardiácas decorrentes da suplementação da vitamina C
encontradas em nossa pesquisa apresentam-se convergentes aos níveis reduzidos
de ansiedade, conferidos por baixos escores de respirações por minutos (bpm)
aferidas por outros autores (411) que estavam associadas também a desempenhos
acadêmicos de boa qualidade de estudantes de engenharia.
Ansiedade e depressão são transtornos psiquiátricos comuns, induzidos pelo
estresse (407). A deficiência de vitamina C pode desencadear sintomas depressivos.
Baixos níveis de ácido ascórbico têm sido associados com sintomas depressivos e
maiores taxas de mortalidade em pessoas idosas (450). Adicionalmente, Amr et al.
(423) demonstraram que a vitamina C melhorou a eficácia da fluoxetina no
tratamento da depressão e, dada a ausência de efeitos adversos substanciais em
paciente pediátrico com diagnóstico de transtorno depressivo maior, pode ser
considerada um atraente coadjuvante terapêutico. Os autores ressaltaram a
necessidade de testes clínicos em maior escala para avaliar a eficácia terapêutica
da vitamina C como um coadjuvante para o tratamento da depressão e sua ação
associada a medicamentos antidepressivos (423).
104
Estudos epidemiológicos têm mostrado que os transtornos de ansiedade de
início precoce podem contribuir como disparadores para o desenvolvimento de
depressão e outros transtornos do humor que surgem mais tarde na vida (451, 452).
Da mesma forma, transtornos de ansiedade e perturbações do humor estão
associados com mecanismos patogênicos envolvidos com a via oxidativa (409).
Para estes autores a suplementação de vitamina C pode atuar como um
antioxidante que conduz a alterações bioquímicas e comportamentais, reduzindo a
ansiedade, por mecanismos similares aqueles efeitos observados sobre os sintomas
depressivos, fadiga, e estado de humor. Assim os dados aqui coletados reforçam
essa hipótese.
Existem anormalidades que podem alterar a função do eixo hipotálamohipófise-adrenal (HPA), que está envolvido com a resposta ao estresse e transtorno
de ansiedade, e implicado na resposta emocional (453, 454). Por exemplo, a
exposição crônica ao estresse tem sido associada ao dano oxidativo, e ativação do
eixo HPA (455). Outro estudo descobriu que altos níveis de ansiedade aumentam
significativamente o estresse oxidativo (456). Além disso, o estresse oxidativo gera
uma produção excessiva de radicais livres e falhas do mecanismo de defesa
antioxidante (457). O déficit de antioxidantes pode diminuir a proteção contra ROS e
espécies reativas de nitrogênio (RNS), que são altamente reativo e tóxico, causando
danos a proteínas, lipídios, carboidratos, DNA e mitocôndrias (458, 459). Os
antioxidantes neutralizam os efeitos do ROS e exercer ação prevenindo diversas
doenças (55). Esses autores sugerem que indivíduos com transtornos de ansiedade
podem ser deficientes em antioxidantes. Neste contexto os dados coletados nesta
pesquisa corroboram a ideia de que a suplementação de compostos com
propriedades antioxidantes pode ser uma nova estratégia para prevenção e redução
de níveis de ansiedade.
Os resultados desse estudo demostraram que, após a intervenção, o grupo
da vitamina C obteve médias das frequências cardíacas menores em comparação
com o grupo placebo. O neurotransmissor Ácido γ-aminobutírico (GABA) está
envolvido na regulação cardiovascular. Administração intracerebroventricular de
agonistas de GABA diminui a pressão arterial e a frequência cardíaca; a vitamina C,
por sua vez, estimulou a ligação do 3H-GABA (460). Outro estudo encontrou um
aumento na pressão arterial e também na frequência cardíaca depois da
105
microinjeção de glutamato dentro do núcleo paraventricular. O antagonista do
receptor
NMDA
DL-2-amino-5-ácido
fosfonovalérico
(AP-5)
bloqueou
estas
respostas (461). Em contraste, altos níveis de ansiedade traumática indicada pela
elevada frequência cardíaca desencadeada pelo aumento da liberação de
catecolaminas (422). Ácido ascórbico pode modular a atividade catecolaminérgica e
diminuir reações de estresse (422). Esta hipótese baseia-se em várias descobertas.
O ácido ascórbico tem sido descrito como um fator de regulação de Na +/K+-ATPase
por meio da modulação de catecolaminas. Também atua sobre o volume de
neurotransmissores no sistema nervoso central, como demonstrado por um estudo
em que o TOC foi tratado com a vitamina C (462).
Da mesma forma, a vitamina C pode reduzir a ansiedade e aliviar o estresse
tanto pela estimulação da ligação do GABA e bloquear a função do receptor NMDA
ou agir através da ativação dos sistemas dopaminérgicos e glutamatérgicos (422).
Níveis de ansiedade reduzidos podem estar associados com a diminuição da
frequência cardíaca, pelos quais são indicativos da liberação diminuida de
catecolaminas. Como sugerido anteriormente o ácido ascórbico pode modular a
atividade catecolaminérgica (422) e, consequentemente, pode ser responsável por
esta baixa frequência cardíaca encontrada no presente estudo.
Bruno et al. (463) investigaram o efeito da administração aguda de vitamina C
sobre a atividade simpática do músculo cardíaco e balanço simpático cardíaco em
pacientes hipertensos. Nesse estudo, a vitamina C foi capaz de reduzir a
movimentação adrenérgica cardiovascular em pacientes hipertensos, o que indica
que o estresse oxidativo pode contribuir para a ativação simpática na hipertensão.
Portanto, isto sugere que os antioxidantes podem ser capazes de restaurar o
controle vagal da frequência cardíaca. Ademais, altas doses de vitamina C
reduziram a pressão arterial sistólica e diastólica, estresse subjetivo e respostas
ansiosas a um estressor psicológico interpessoal agudo e, ainda, após o estresse, a
vitamina C promoveu uma queda mais rápida do cortisol salivar (418). Porém, o
resultado do corrente estudo não sugere nenhuma diferença significativa na pressão
sanguínea (sistólica e diastólica) entre o grupo da vitamina C e o grupo placebo,
embora os participantes desse estudo não apresentassem histórico de hipertenção.
A vitamina C reduziu significativamente a pressão arterial em pacientes hipertensos,
106
mas não em indivíduos normotensos (463) o que foi similar aos achados no presente
estudo, visto que os nossos sujeitos eram estudantes normotensos.
Em adição, os dados apresentados aqui estão de acordo com os resultados
encontrados por Brody et al. (418), que verificaram que os níveis de vitamina C
plasmática aumentaram significativamente, para o grupo vitamina C (médias de 1,55
para 2,65 mg/dL), mas não do grupo de placebo (médias de 1,36 para 1,40 mg/dL).
Além disso, o tratamento com a vitamina C aumentou os níveis plasmáticos de
vitamina C no sangue, sugerindo que a deficiência de vitamina C está envolvida com
alterações psicológicas (464, 465). Adicionalmente, outro estudo revelou que há um
aumento na concentração plasmática de vitamina C, por cerca de 50%, após a
suplementação de vitamina C, a uma dose de 500 mg/dia, durante oito semanas
(466), e que também a meia-vida de vitamina C em um adulto é em torno de 10-20
dias (1). Assim, estes resultados foram semelhantes aos detectados no corrente
estudo (vêr Tabela 5).
A melhora significativa do desempenho cognitivo nas tarefas de cópia e
memória das Figuras Complexas de Rey (Mémória Visuo Construtiva), ML1 e ML2
(Memória Lógica Declarativa Episódica) e dígitos indiretos (Memória Operacional),
após a intervenção da vitamina C, possivelmente, pode ser em decorrência da
estimulação dos neurônios que contém vitamina C e que já foram mapeados no
hipocampo e córtex frontal e occipital por (290, 291). Isto porque a área hipocampal
é substrato neural para a Memória Declarativa Episódica e a área frontal é substrato
da Memória Operacional e as áreas conjuntas frontal e occipital são substrato da
Memória Visuo Construtiva (186).
No presente estudo não foram encontradas diferenças significativas no
subteste de Dígitos em ordem direta, em ambos os grupos vitamina C ou placebo.
Os estudantes apresentaram médias em torno de 9 dígitos. Contudo, no subteste de
Dígitos em ordem inversa, o grupo vitamina C, após a suplementação, apresentou
escore maior (6,10 ± 1,67, p ˂ 0,05), sugerindo que a vitamina C melhorou a
memória dos estudantes nessa tarefa. Pesquisadores revelaram que indivíduos com
bom desempenho em tarefas de memorização de dígitos tem maior motivação para
as atividades intelectuais, indicado pelo bom controle e flexibilidade mental e, ainda,
um bom nível de tolerância às situações que provoquem tensão (467), ou seja,
sujeitos mais resistentes à ansiedade.
107
Finalmente, cada tarefa do subteste Dígitos (direta e indireta) está relacionada
com processos cognitivos diferentes. Os comandos da ordem inversa estão mais
ligados ao sistema executivo central e da atenção componentes da memória
operacional e importantes participantes da consolidação de memória de longo prazo,
enquanto o da ordem direta envolve apenas reverberação de sistema de memória
de curto prazo (468). A vitamina C, de alguma maneira, favoreceu o melhor
desempenho na tarefa de dígitos na ordem inversa e não na ordem direta,
possivelmente por estar ativando neurônios dos substratos frontais e temporais do
sistema executivo central, componente da memória operacional.
108
4.4.
CONCLUSÃO
No primeiro estudo ficou demonstrado que a vitamina C melhorou os níveis de
ansiedade avaliados através do
BAI, nos estudantes do
Ensino
Médio,
suplementados com vitamina C, e também apresentou melhor resposta na
frequência cardíaca, indicando que este antioxidante pode estar envolvida neste
parâmetro fisiológico relacionado com sintomas de ansiedade.
Estes achados não só reforça a evidência de que a vitamina C desempenha
um importante papel terapêutico na ansiedade, mas também aponta para a
possibilidade do uso de antioxidantes na prevenção e redução dos níveis de
ansiedade.
Adicionalmente, a vitamina C aumentou os escores nas tarefas de cópia e
memória das FCR (Mémória Visuo Construtiva), ML1 e ML2 (Memória Lógica
Declarativa Episódica) e dígitos indiretos (Memória Operacional), sugerindo que a
vitamina C apresentou um efeito positivo nestes tipos de memória, medidas nos
estudantes do Ensino Médio.
Em síntese, este estudo sugere que uma dieta rica em vitamina C pode ajudar
a reduzir os níveis de ansiedade, e, possivelmente, aumentar a eficiência cognitiva
em tarefas de memória visuo construtiva, memória operacional e memória lógica.
109
5. ESTUDO 2: EFEITOS COMPORTAMENTAIS DO ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE
A ANSIEDADE E MEMÓRIA EM RATOS CRESCIDOS EM AMBIENTE
ENRIQUECIDO
O ácido ascórbico (AA), conhecido como vitamina C, é um micronutriente que
está envolvido em modelo animal de ansiedade, memória e estado de humor em
humanos. Estudos têm revelado que AA reduz a imobilidade tônica e a reação de
medo em codornas japonesas (469, 470), bem como em frangos de corte (470).
Estes autores concluiram que o AA pode atenuar o medo subjacente e deve ter
implicações no bem-estar destes animais.
Estudos utilizando modelos animais têm demonstrado uma melhora na
aprendizagem e memória depois do tratamento com vitamina C, sozinha, ou
combinada com a vitamina E (471, 472, 473). A administração crônica de vitamina E
(250 mg/kg por dia) ou vitamina C (300 mg/kg por dia) por 60 dias, em camundongos
jovens (3 meses) e camundongos idosos (15 meses), e a combinação de vitamina C
e vitamina E, melhora as funções cognitivas dos animais idosos, mas não a dos
camundongos jovens (471). Em adição, AA sozinho, ou em combinação com
oxiracetam, uma droga nootrópica, teve suas ações investigadas sobre a amnésia
induzida por escopolamina em teste de habituação (teste de aversão ao claro versus
escuro) em camundongos idosos. Os resultados deste estudo mostraram que o AA
reduziu o tempo gasto dos animais no compartimento claro versus escuro. Esses
autores concluiram que AA preveniu a amnésia induzida por escopalamina nestes
camundongos (472). A combinação de vitamina C e vitamina E melhorou a
aprendizagem e memória em ratos normais e reverteu defícits de aprendizagem e
memória em ratos diabéticos (473). Porém, a vitamina E não é muito efetiva (474),
pelo menos combinada com a vitamina C, confirmando a nossa escolha da vitamina
C para o corrente estudo.
Adicionalmente, estudos têm indicado uma alta prevalência de hipovitaminose
C e D em pacientes com cuidados agudos e melhora do humor, reduzindo o
distresse em pacientes hospitalizados (431, 432, 433).
O enriquecimento ambiental (EA) é um paradigma experimental que permite a
estimulação cognitiva entre animais tanto social e/ou física, sensorial e motora, com
110
a finalidade de reduzir problemas como a ansiedade e déficits de memória (368,
372, 475). Na EA, roedores são expostos a grandes caixas contendo vários objetos
(372, 476) e comparados com dois tipos de controle: controle isolado (CI), mantidos
individualmente; ou controle social (CS), alojados em grupos de animais do mesmo
sexo (399, 477, 478). Ambos são alojados em ambiente padrão (AP).
Existem evidências de que o EA reduz o declínio cognitivo relacionado com a
idade (479). Em um estudo, camundongos NMR1 foram alojados em ambiente
enriquecido por um período de 14 a 20 meses e seguidos de avaliação de
desempenho da memória e teste de ansiedade, bem como medidas as propriedades
eletrofisiológicas das redes neuronais do hipocampo. Nesse estudo, EA reduziu a
ansiedade e preveniu déficits de memória nesses animais envelhecidos (479). Da
mesma forma, outros estudos indicam que EA reduz os níveis de ansiedade e
melhora fatores relacionados à emocionalidade (480). O EA em combinação com o
estradiol, também melhora as respostas mnemônicas de memória espacial em
camundongas fêmeas jovens, de meia-idade e idosas, testadas no LAM e na tarefa
de reconhecimento de objetos (481).
Experimentos têm mostrado que EA favorece as intervenções farmacológicas
para proteger contra várias doenças neurodegenerativas, tais como, DA (482),
Parkinson (483), e doença de Huntington (484). Os resultados têm contribuído para
a compreensão dos mecanismos de plasticidade neural, que pode ocorrer devido à
complexa
estimulação
desencadeada
por
exposição
de
modelos
animais
submetidos ao EA (368), tais como a neurogênese no giro dentado do hipocampo,
aumento da densidade sináptica, e aumento das ramificações dendríticas (485). Em
termos de alterações neurobiológicas, EA melhora a potencialização de longo prazo
e a atividade monoaminérgica e a transmissão sináptica colinérgica (368), bem
como a formação de novas sinapses em áreas como o córtex cerebral e gânglios
basais (364, 368, 486-488). EA também aumenta o número de células gliais (489) e
de astrócitos (490).
Este segundo estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do AA sobre a
ansiedade e memória em ratos de meia-idade crescidos em ambiente enriquecido.
Neste contexto, foram utilizados como medidas comportamentais as respostas
emitidas pelos animais no LCE e no LAM, para investigar os efeitos deste
antioxidante associado ao EA.
111
5.1.
MÉTODOS
5.1.1. Animais
Vinte e oito ratos Wistar machos e 32 fêmeas, com 25 dias de idade, pesando
cerca de (100 a 150 g), foram disponibilizados, para este estudo, provenientes do
Centro Universitário de Brasília (UniCEUB, DF, Brasil), que também autorizou a
execução do protocolo experimental nas dependências do Laboratório de Ciências
da Saúde (LABOCIEN) do UniCEUB. Depois de cinco dias de habituação no
laboratório, os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos: metade dos
animais machos e metade das fêmeas foram alojados em caixas grandes contendo
vários objetos, paradigma experimental característico do EA. A outra metade dos
animais foi alojada em caixas de mesmas dimensões sem nenhum objeto, ou seja,
em condições AP. Todos os animais permaneceram em suas caixas, até que os
testes comportamentais fossem realizados e foram mantidos em um ambiente com
temperatura controlada (21 ± 2° C) e humidade (55 ± 10%) e um ciclo de luz-escuro
de 12 horas (luzes acesas às 07:00 horas). Os animais tiveram livre acesso à
comida e água. Os experimentos foram realizados durante o ciclo diurno (9:00-16:00
horas). A linha do tempo do protocolo experimental está apresentada na Figura. 13.
Início
Habituação
25 dias
5 dias
Enriquecimento ambiental
30 dias até 13 meses
Testes comportamentais
14 meses
Idades dos animais
Figura 13. Linha do tempo do protocolo experimental
112
5.1.2. Compostos e procedimentos experimentais
O ácido ascórbico foi obtido da Vetec Ltda, Brasil e dissolvidos em solução
salina (0,9% NaCl). Solução salina (controle) ou com ácido ascórbico (100 mg/kg) foi
administrada via oral (gavage) a um volume de 1 ml/kg de peso corporal, uma hora
antes dos testes comportamentais. Devido a sua alta sensibilidade à degradação, a
solução de ácido ascórbico foi preparada no dia em que foi usada, sempre no início
da experiência. Depois de um período de 13 meses, quando os animais atingiram a
idade de 14 meses de idade (ou seja, de meia-idade), pesando cerca de (220 a 350
g), os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de tratamento: (1)
controle solução salina e ambiente padrão (CAP); (2) controle solução salina e
enriquecimento ambiental (CEA); (3) experimental em ambiente padrão mais ácido
ascórbico (EAP + AA), e (4) experimental em enriquecimento ambiental mais ácido
ascórbico (EEA + AA). Esta metodologia foi semelhante a estudos anteriores (478,
491, 492).
5.1.3. Enriquecimento Ambiental
O EA começou quando os animais atingiram 30 dias de idade e continuou por
13 meses. O EA consistiu de caixas de vidro grandes (70 × 50 × 40 cm) contendo
vários objetos, tais como túneis de plástico, bolas, rampas, escadas, e vários
brinquedos de vários tamanhos, formas e texturas (354). Cada caixa alojava ratos
machos (n = 7) e fêmeas (n = 8), tanto em AP como em EA. Condições de
alojamento dos animais em AP e EA são mostradas na Figura 14.
As gaiolas eram limpas uma vez por semana e todos os objetos eram
trocados por novos objetos com posições alteradas, com a finalidade de ofertar um
ambiente que favorecesse a oportunidade para a interação social e comportamento
exploratório. Os animais alojados na condição AP eram mantidos sob as mesmas
113
condições, com a ressalva de que os seus habitat eram desprovidos de qualquer
tipo de objeto, salvo serragem, comida e água ad libitum (Figura 14).
Figura 14. Ambiente padrão e enriquecimento ambiental
5.1.4. Labirinto em Cruz Elevado
As especificações do aparelho utilizado, nesse estudo, foram fundamentadas
em pesquisas conduzidos por Pellow et al. (150), tomando com base a capacidade
do LCE para detecção de agentes com efeitos ansiogênicos e ansiolíticos em ratos.
O dispositivo era feito de madeira e composto por dois braços abertos e dois
fechados (com as mesmas dimensões, 50 x 10 cm), opostos entre si e elevados a
50 cm a partir do piso. Os braços fechados foram cercados por paredes laterais com
50 centímetros de altura, exceto para a entrada, que encerrava uma plataforma
central de 10 x 10 cm. Os braços abertos foram cercados por uma borda de acrílico
transparente de 1 cm de altura, para evitar que o animal caisse do aparelho. A
superfície e paredes laterais internas do labirinto foram pintadas com uma resina
escura, à prova de água para evitar permeação de urina.
As sessões experimentais foram realizadas em um ambiente com baixa
intensidade de luz e (atenuada) de som apropriado. Cada animal foi colocado no
centro do LCE, de frente para o braço fechado e foram autorizados a explorar
livremente o equipamento por 5 min. Foram registradas as frequências de entradas
114
nos braços abertos, as frequências de tempo gasto nos braços, e o número absoluto
de entradas nos braços fechados do LCE. Uma entrada foi gravada quando o animal
colocou as quatro patas em um braço. A porcentagem de entradas nos braços
abertos e a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos eram indicativas de
efeito ansiolítico, e o número total de entradas nos braços fechados foi usado como
uma medida de atividade locomotora. Após cada sessão de teste, o labirinto era
limpo com uma solução de etanol (10% v / v) e secado com papel absorvente a fim
de evitar o odor e impregnação (Figura 15).
Figura 15. Teste no labirinto em cruz elevado
5.1.5. Labirinto Aquático de Morris
Para avaliar a memória de referência espacial dos ratos, uma versão descrita
por Morris (193) foi usada com um protocolo semelhante ao descrito por Angelucci et
al. (493). O LAM consiste de uma piscina circular de 170 centímetros de diâmetro e
70 cm de profundidade, de cor azul, preenchida aproximadamente por 30 cm de
água a uma temperatura de 24 ± 1°C com uma plataforma de 11 × 14 cm, submersa
115
2 cm abaixo da superfície da água. A plataforma foi posicionada no mesmo lugar
para todos os testes experimentais, nomeadamente no centro de um dos quatro
quadrantes da piscina (193).
A sessão de treino foi executada em um único dia, num ambiente com baixa
intensidade de luz e (atenuada) de som apropriado e constou de três tentativas
consecutivas, que consistia em colocar os animais na água, com cabeça em frente à
parede da piscina. Foi permitido que os ratos nadassem livremente para localizar a
plataforma oculta de fuga. A latência para encontrar a plataforma foi medida em
segundos e a média da latência para o número de tentativas foi calculada. Quando
um animal não encontrava a plataforma dentro de 120 segundos, este era
gentilmente conduzido para ela pelo experimentador, onde permanecia por 20
segundos (Figura 16). Após este tempo, os animais eram removidos da plataforma e
devolvidos para as caixas, e esperavam por mais dois minutos antes de começar o
próximo treino. Os ratos eram secos e devolvidos para as suas caixas após o
término da sessão de treino. A sessão de teste foi realizada 24 horas após a sessão
de treino, seguindo os mesmos procedimentos, contudo, sem a administração, nos
animais, de AA e nem solução salina.
Figura 16. Teste no labirinto aquático de Morris
116
5.1.6. Análise Estatística
A análise estatística dos dados foi realizada através do programa SPSS
versão 20.0 para Windows (IBM Corp, NY, EUA). Em geral, os dados são expressos
como média ± erro padrão da média (EPM). Para avaliar os resultados no LCE, uma
ANOVA foi utilizada como fatores entre-sujeitos o “ambiente” e o “tratamento”. Já
para as análises estatísticas no LAM, foi usada uma two way ANOVA de medidas
repetidas com o “ambiente” e “tratamento”, como variáveis independentes e “número
de tentativas” como medidas repetidas. Os dados foram combinados para machos e
fêmeas para cada grupo de tratamento, por ter sido observado em preliminar
ANOVA que não houve diferença estatisticamente significativa entre os sexos,
semelhante ao estudo de Frick et al. (399). O nível de p < 0,05 foi considerado como
estatisticamente significativo para todos os testes.
117
5.2.
RESULTADOS
5.2.1 Teste do Labirinto em Cruz Elevado
Os resultados relativos aos testes comportamentais de ansiedade no LCE,
após a administração de ácido ascórbico (100 mg/kg), nos ratos de meia-idade
associados ao enriquecimento ambiental estão apresentados, na (Tabela 7). A
ANOVA revelou um efeito principal, significativo de AA, nas medidas clássicas
avaliadas no LCE. O AA mostrou um efeito ansiolítico nos animais, como mostrado
pelo aumento na porcentagem de entradas nos braços abertos (F (1,59) = 84,82,
p = 0,001) e um aumento na porcentagem de tempo gasto nos braços abertos (F
(1,59) = 49,29, p = 0,001), em comparação com o grupo controle (salina). A análise
estatística para o número de entradas nos braços fechados não diferiu (F (1,59) =
0,12, p = 0,73), indicando que o AA não teve efeito sedativo na locomoção dos
animais.
A diferença estatisticamente significativa também foi observada para o EA,
em comparação com o AP, na porcentagem de tempo gastos nos braços abertos (F
(1,59) = 4,16, p = 0,047). Não foram encontradas diferenças significativas quando
comparados os grupos EA e AP para outros parâmetros, tais como a porcentagem
de entradas nos braços abertos (F (1,59) = 2,14, p = 0,15) e o número de entradas
nos braços fechados (F (1,59) = 1,45, p = 0,23). O EA favoreceu uma melhora dos
níveis de ansiedade e este efeito tornou-se mais pronunciado na presença de AA.
Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o EA potencializou o efeito
ansiolitico do AA.
118
Tabela 7. Efeitos da administração aguda de AA (100 mk/kg) ou salina em ratos de meia-idade
(1)
crescidos em AP ou AE submetidos ao teste comportamental no LCE .
Teste comportamental
CAP
CAE
EAP+AA
EEA+AA
14,19 ± 3,95
18,34 ± 4,17
50,68 ± 2,99
(2)
58,73 ± 5,36
% tempo gastos BA
5,78 ± 2,28
9,40 ± 4,11
33,72 ± 4,13
(2)
50,01 ± 7,41
Número de entradas BF
4,33 ± 0,81
4,07 ± 0,54
4,67 ± 0,64
% entradas BA
(2)
(2,3)
3,27 ± 0,75
CAP, controle salina e ambiente padrão; CEA, controle salina e enriquecimento ambiental; EAP+AA,
experimental em ambiente padrão mais ácido ascórbico; EEA+AA, experimental em enriquecimento
ambiental mais ácido ascórbico; BA, braços abertos; BF, braços fechados. Machos (n = 7) e fêmeas
(n = 8) para cada grupo.
(1)
Os dados são expressos com médias ± EPM
(2)
Diferença significativa entre AA versus Controle (p ˂ 0.001).
(3)
Diferença significativa entre EA versus AP (p ˂ 0.05)
5.2.2 Teste do Labirinto Aquático de Morris
No teste comportamental no LAM, o AA melhorou o desempenho dos animais
na sessão treino e na sessão teste sobre a mémoria de referência espacial em
relação aos controles (Tabela 14). A análise estatística ANOVA two-way para
medidas repetidas sobre a latência de escape revelou efeitos significativos de
tratamento AA (F (1,59) = 28,25, p = 0,001), enriquecimento ambiental (F (1,59) =
4,11 p = 0,05), e sessão de treinamento (F (1,59) = 25,90, p = 0,001), mas não
houve interação significativa entre estes fatores (F (1,118) = 2,03, p = 0,16). Houve
diferença significativa na latência de escape ao comparar AA ao grupo controle no
1º, 2º e 3º treinos (F (1,59) = 19,48, p = 0,001, F (1,59) = 10,54, p = 0,010 e F (1,59)
= 21,31, p = 0,001, respectivamente). Por outro lado, não houve diferença
estatisticamente significante para os animais alojados no AE versus AP, no 1º, 2º e
3º treinos (F (1,59) = 3,76, p = 0,06, F (1,59) = 2,10, p = 0,09 e F (1,59) = 0,65, p =
0,43, respectivamente).
119
Na sessão teste, ANOVA two-way para medidas repetidas sobre a latência de
escape revelou um efeito principal significativo do tratamento de AA (F (1,59) = 9,80,
p <0,001), o ambiente (F (1,59) = 5,11, p <0,01), e uma sessão de teste (F (1,59) =
7,03, p <0,01), mas não houve interação significativa entre esses fatores (F (1,118) =
0,25 p = 0,62). Diferenças significativas foram observadas na latência de escape
entre o grupo de AA e o grupo controle nos testes 1º e 3º (F (1,59) = 4,12 p <0,05 e
F (1,59) = 10,65, p <0,01, respectivamente). No entanto, não houve diferença
estatisticamente significativa no 2º teste (F (1,59) = 1,25, p = 0,27). Curiosamente, o
ANOVA revelou um efeito principal significativo do ambiente no 1º teste (F (1,59) =
5,84, p = 0,05) e 2º teste (F (1,59) = 8,62, p = 0,010), mas não houve diferença
significativa para o 3º teste (F (1,59) = 2,90, p = 0,09). Por outro lado, uma diferença
significativa ocorreu na 1ª tentativa depois de 24 horas no LAM, indicando que os
animais mantidos em EA demonstraram melhor evocação de memória do que os
animais alojados em AP.
Tabela 8. Efeitos da administração aguda de AA (100 mk/kg) ou salina em ratos de meia-idade
(1)
alojados em AP ou AE submetidos ao teste comportamental no LAM .
Teste comportamental
CAP
CAE
EAP+AA
EEA+AA
(3)
95,00 ± 11,16
66,87 ± 11,69
41,20 ± 11,54
Treino 2
60,40 ± 12,75
29,87 ± 8,95
16,87 ± 5,33
(3)
13,71 ± 5,03
(3)
Treino 3
46,07 ± 10,87
35,67 ± 9,33
8,27 ± 1,24
(4)
7,14 ± 1,94
(4)
Teste 1
37,33 ± 7,23
21,20 ± 6,20
25,53 ± 7,11
(2)
13,29 ± 5,34
Teste 2
18,53 ± 4,07
10,13 ± 1,01
15,42 ± 3,98
Teste 3
26,53 ± 10,87
16,93 ± 3,58
10,93 ± 2,18
(3)
19,43 ± 6,27
(4)
Treino 1
(2,5)
7,71 ± 1,02
(6)
6,86 ± 1,10
(3)
CAP, controle salina e ambiente padrão; CEA, controle salina e enriquecimento ambiental; EAP+AA,
experimental em ambiente padrão mais ácido ascórbico; EEA+AA, experimental em enriquecimento
ambiental mais ácido ascórbico. A média da latência para localizar a plataforma é expressa em
segundos. Machos (n = 7) e fêmeas (n = 8) para cada grupo.
(1)
Os dados são expressos com médias ± EPM .
(2)
Diferença significativa entre AA versus Controle (p ˂ 0.05).
(3)
Diferença significativa entre AA versus Controle (p ˂ 0.01)
(4)
Diferença significativa entre AA versus Controle (p ˂ 0.001)
(5)
Diferença significativa entre EA versus AP (p ˂ 0.05)
(6)
Diferença significativa entre EA versus AP (p ˂ 0.01)
120
5.3
DISCUSSÃO
O segundo estudo avaliou os efeitos do ácido ascórbico, combinado com um
ambiente enriquecido, em ratos de meia idade submetidos a testes comportamentais
de ansiedade e memória. Os resultados indicaram que o AA apresentou um efeito
ansiolítico observado no aumento da porcentagem de entradas nos braços abertos e
tempo gasto nos braços abertos no LCE, sem afetar o número de entradas nos
braços fechados, o que indica que o efeito ansiolítico de AA é específico e não
envolve um efeito sedativo. Além disso, o ambiente enriquecido favoreceu a melhora
dos níveis de ansiedade e este efeito tornou-se mais pronunciado na presença de
AA. Desta maneira, os resultados aqui apresentados indicam que o EA potencializou
o efeito ansiolítico de AA.
Os resultados do corrente estudo estão de acordo com uma pesquisa que
investigou os efeitos da vitamina C e vitamina E, separadamente e em conjunto, em
ratos machos e fêmeas (cerca de 110 dias de idade) nos comportamentos
relacionados com a ansiedade em campo aberto e a resposta de sobressalto ao
alarme sonoro (494). Estes autores misturaram doses diferentes de ácido ascórbico
para os ratos machos (1,6 mg/ml) e para fêmeas (0,76 mg/ml) na água potável, e
observaram que essas doses de vitamina C e vitamina E aumentaram a locomoção
no campo aberto, a ocupação dos quatro quadrantes e do centro do aparelho,
enquanto diminuiram a amplitude da resposta de sobressalto. Quando os animais
foram tratados com as vitaminas, separadamente, ou em conjunto, os efeitos
sinérgicos não foram detectados. Os efeitos destas vitaminas, em diminuir a
ansiedade podem ter sido devido às suas propriedades antioxidantes, à atenuação
da atividade do cortisol, ou ao envolvimento de estruturas cerebrais e
neurotransmissores (494).
Estudos em animais e humanos têm mostrado que altos níveis de AA podem
ser detectados em estruturas neurais envolvidas na ansiedade, tais como a
amígdala e o hipocampo (291, 495). A função da vitamina C como sequestradora de
radicais livres é bem conhecida, e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuídos
as suas ações antioxidantes, que reduzem o estresse oxidativo neural (57). O efeito
ansiolítico desta vitamina pode estar relacionado com a modulação induzida pela
vitamina C no estresse oxidativo, em decorrência da maior atividade da glutationa-s-
121
transferase (GST), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), e diminuição da
peroxidaçao lípidica (496).
O antagonismo do NMDAR tem sido associado com propriedades ansiolíticas
em ratos e camundongos, com efeitos semelhantes aos dos benzodiazepinicos
(497). É possível que as ações do AA possam inibir a atividade de NMDAR, o que
poderia levar a uma redução dos níveis de ansiedade (498). Além disso, vários
estudos têm mostrado que a vitamina C pode normalizar a atividade dos neurônios
serotoninérgicos (499) envolvidos na ansiedade em humanos (500), o que
normalmente é tratada com inibidores seletivos da recaptação de serotonina (501).
Em relação ao envolvimento do AA sobre o estresse oxidativo, estudos
conduzidos por El-Gendy et al. (502) avaliaram o papel do AA como um antioxidante
para proteger contra o estresse oxidativo induzido pela administração aguda de
imidacloprida, um pesticida relativamente novo, pertencente à classe de compostos
neonicotinóides. Pesticidas podem levar ao estresse oxidativo e aumento de radicais
livres e uma opção é usar antioxidantes que podem sequestrar estes radicais livres.
O efeito neuroprotetor de AA (200 mg/kg) foi avaliado 30 minutos antes ou após a
administração de imidacloprida (502). Os resultados encontrados por estes autores
revelaram que a dose letal média (LD50) de imidacloprida, após 24 horas foi de
149,76 mg/kg. A administração oral de imidacloprida desencadeou elevação
significativa sobre o nível de peroxidação lipídica (LPO), e nas atividades de enzimas
antioxidantes, incluindo CAT, SOD, GPx e GST. O nível de GSH foi diminuído;
contudo, a atividade de G6PD permaneceu inalterada. Por sua vez, o AA reduziu o
dano oxidativo induzido por administração aguda de imidacloprida, diminuiu os
níveis de LPO e alterou o sistema de defesa antioxidante no fígado dos animais.
Além disso, o efeito neuroprotetor do pré-tratamento com o AA foi superior ao póstratamento, no combate ao estresse oxidativo induzido por imidacloprida (502).
Em relação aos resultados dos testes no LAM, o presente estudo está de
acordo com vários autores que avaliaram medidas semelhantes (503-507). A
administração de α-tocoferol (40 mg/kg) e de AA (100 mg/kg) preveniu defícits de
memória de referência espacial, avaliados no LAM, em ratos tratados com prolina
(503). Ademais, o AA atenuou os déficits de aprendizagem espacial, também no
LAM, induzida por escopolamina em camundongos jovens (504). O AA também
reduziu deficits de aprendizagem espacial em camundongos transgênicos
122
APP/PSEN1 de meia-idade (12 meses), e mais velhos (24 meses), no LAM (505).
Em adição, o tratamento com o AA (60 e 120 mg/kg), por três e oito dias
consecutivos, melhorou a aprendizagem e memória de camundongos envelhecidos
no teste da esquiva passiva tipo “step-down” (506). Outro estudo que avaliou o efeito
de AA injetado sozinho, ou em combinação com o ácido propiônico, substância
envolvida no estresse oxidativo, indicou que o AA foi capaz de reverter o defícit de
memória espacial induzido pela administração do ácido propiônico (507).
Assim, a dose de AA utilizada no presente estudo (100 mg/kg) foi selecionada
depois de avaliar o efeito do AA em condições agudas e crônicas em uma
experiência anterior em nosso laboratório, no qual observou-se que, com doses mais
elevadas de AA, houve uma melhor resposta em termos de melhoria dos níveis de
ansiedade e déficit de memória, em comparação com o controle (solução salina), no
LCE e no LAM. Ademais, a via de administração oral aguda, adotada no presente
experimento, e o tempo de espera para que os animais fossem submetidos aos
testes no LCE e LAM, ou seja, uma hora depois, com uma única dose, estão de
acordo com vários estudos de modelos animais de depressão, que têm demonstrado
os efeitos antidepressivos da vitamina C (424-429).
Esses resultados aqui coletados são consistentes com um estudo que
demonstrou que ratos envelhecidos, expostos ao EA, não apresentaram efeitos
nocivos provocados pelo envelhecimento sobre a ansiedade e memória (479). Este
estudo também sugeriu que a diminuição da ansiedade, nestes animais, poderia ser
responsável pela melhora do desempenho de tarefas de memória, como relatado em
ratos (386) e em seres humanos (508). Alta ansiedade está associada com pior
desempenho na memória. O EA melhora a memória, diminuindo o nível de
ansiedade e este mecanismo previne déficit de memóra relacionado à idade (386,
399). Frick et al. (399) revelaram que o EA reduziu o prejuízo relacionado à idade na
aquisição e retenção de memória espacial em camundogos machos e fêmeas
C57BL/6 (18 meses de idade), testados por um dia, no LAM. Esta redução foi similar
aos camundongos de ambos os sexos. EA também reduziu a ansiedade em ratos
jovens em comparação ao CI (381, 382) ou CS (384). Em contraste, Hellemans et al.
(381) demonstraram que os animais CI exibem uma menor percentagem
estatisticamente significativa para as entradas nos braços abertos e gastam menos
tempo nos braços abertos, em comparação com animais expostos ao EA e com CS.
123
Isso indica que os animais CI apresentam níveis mais elevados de ansiedade em
relação aos animais CS, sugerindo que animais CS, sem enriquecimento físico,
comprometem a redução da ansiedade no LCE.
A ausência de diferenças estatisticamente significativas na porcentagem de
entradas nos braços abertos (Tabela 7) pode ser explicado pela mais baixa
locomoção dos animais alojados em EA comparada com AP; portanto, animais
enriquecidos tendem a explorar menos o LCE do que animais alojados em AP. Por
outro lado, acredita-se que os baixos níveis de atividade locomotora aumentam
significativamente a ansiedade (509). No entanto, os resultados encontrado no
corrente estudo são consistentes com Pham et al. (391), que verificaram que os
ratos mantidos em EA, desde a idade de dois meses, durante um período de 12
meses, mostraram menor mobilidade no teste do campo aberto do que os ratos CI.
Estes autores sugeriram que ratos alojados em EA habituam-se mais rápidamente
do que os ratos CI em novos ambientes, uma vez que os animais percebem
estímulos novos como menos aversivos, devido a experiências anteriores em um
ambiente enriquecido, repleto de vários estímulos.
Em outro estudo, Harati et al. (395) investigaram a memória espacial em ratas
Long-Evans de 1 mês de idade, que foram alojadas em AP ou EA e testados após 3,
12 ou 24 meses (jovens, de meia-idade, e idosos, respectivamente). Quando
testadas no LAM, as ratas alojadas em EA apresentaram melhor desempenho da
memória espacial para todas as idades. No entanto, há estudos com resultados
contraditórios. Harburger et al. (510) avaliaram o efeito de EA contínuo em
camundongos machos jovens (3 meses), de meia-idade (15 meses), e idosos (21
meses) e indicou que o enriquecimento de 24 horas, durante seis semanas, levou a
uma diferença significativa na memória de referência espacial apenas em animais
idosos, e não nos animais jovens e de meia-idade.
De fato, os resultados aqui apresentados, nesse estudo mostram que o EA
melhorou a memória de longo prazo, na sessão teste, em animais de meia-idade, a
partir da primeira tentativa no LAM, indicando que o EA teve efeito sobre a memória
de retenção, 24 horas após a sessão de teste.
124
5.4
CONCLUSÃO
O segundo estudo demonstrou o efeito ansiolítico do ácido ascórbico em ratos
de meia-idade crescidos em ambiente enriquecido, avaliados no LCE, além de
indicar que este efeito tornou-se mais pronunciado, quando o ácido ascórbico foi
combinado com o enriquecimento ambiental, sugerindo que este antioxidante pode
influenciar os níveis de ansiedade de animais idosos.
Em adição, o ácido ascórbico melhorou a aprendizagem e a memória espacial
na sessão treino, demonstrado pela diminuição da latência para localizar a
plataforma oculta, no LCE, nas três tentativas consecutivas, indicando a melhora da
memória de curto prazo nesses animais. Além disso, ficou demonstrado que o AA
apresentou uma melhor resposta sobre a memória de retenção, quando os animais
foram testados no LAM, 24 horas depois, sugerindo a influência do AA também
sobre a memória de longo prazo, em ratos envelhecidos.
Por outro lado, o EA somente apresentou efeito sobre a memória de longo
prazo, nas 1ª e 2ª tentativas, avaliados na sessão de teste, indicando que o
paradigma experimental do EA apresentou efeito positivo sobre a memória dos
animais envelhecidos.
Em conclusão, estes achados não só proporcionam evidência de que o ácido
ascórbico desempenha um papel terapêutico importante nos processos cognitivos
de ansiedade e memória em ratos idosos mantidos em um ambiente enriquecido,
mas sugere o importante papel do enriquecimento ambiental como determinante na
eficiência de tarefas que envolvem níveis de ansiedade e memória.
125
6
DISCUSSÃO GERAL
Estudos com crianças com muito baixo peso ao nascer tem relevado
comprometimento cognitivo (511, 512, 513). Tomando como referência altos níveis
de vitamina C detectadas no cérebro de jovens e o aumento da taxa metabólica que
ocorre durante o processo de crescimento, estes eventos indicam que a deficiência
da vitamina C pode apresentar consequências negativas, tais como demonstradas
pelos estudos de Tolsa et al. (513) que ao analisar bebês prematuros (idade
gestacional, 32,5 semanas) e baixo peso corporal (1.246 g), revelaram redução do
volume cerebral, bem como da substância cinzenta, comparados aos bebês
prematuros que apresentavam peso normal.
Outro estudo que acompanhava bebês com nascimento prematuro (mediana
28 semanas) e peso variando entre 840 a 1.490 g também demonstrou efeitos na
cognição a longo prazo. A avaliação por meio de ressonância magnética demonstrou
atrofia persistente no hipocampo, substância branca perioccipital e do corpo caloso,
além do aumento dos ventrículos laterais e do terceiro ventrículo. Estes sujeitos
apresentaram, também, após testes neuropsicológicos, memória prejudicada e
baixas habilidades matemáticas (512).
Os eventos descritos acima podem ser associados à deficiência de vitaminas,
principalmente a vitamina C. Portanto, esta pesquisa sugere a ingestão diária deste
micronutriente, através de uma dieta contendo frutas, legumes e vegetais, fontes
ricas em vitamina C, que podem propiciar a regulação da homeostasia corporal,
prevenindo, assim, possíveis injúrias neuropsicológicas, associadas ao estresse
oxidativo e outros fatores, que comprometem o bom funcionamento do sistema
nervoso.
Estudos epidemiológicos têm revelado que existe uma associação entre
concentração sanguínea, antioxidante e injúria cognitiva (514, 515). Foi detectada a
correlação entre escores em teste de memória e níveis plasmáticos de vitamina C
em sujeitos idosos saudáveis de 60 anos de idade (516). Estes autores sugeriram
que a malnutrição pode ser uma possível causa ou efeito do declínio cognitivo em
pessoas idosas (516).
126
Outro estudo conduzido por Ortega et al. (517) em uma população de idosos
que recebiam ingestão na dieta de vitamina C, revelou que os indivíduos
apresentaram funções cognitivas melhores em relação àqueles que não recebiam a
vitamina C na dieta. Perrig et al. (518) demonstrou que altas concentrações
plasmáticas de AA eram relacionadas com melhor desempenho em tarefas de
memória realizadas por indivíduos idosos. Ademais, ingestão de vitamina C, por um
período de 4 anos protege contra o declínio cognitivo (519). Em contraste, Kalmijn et
al. (520) não observou nenhuma associação entre a ingestão de vitaminas
antioxidantes sobre o declínio cognitivo.
Pacientes com DA apresentavam baixa concentração plasmática de vitamina
C, mesmo com ingestão de vitamina C semelhante, comparados com o grupo
controle e suas concentrações eram correlatas com declínio cognitivo. Estudos
prospectivos também revelou uma associação entre a vitamina C com o baixo risco
de desencadear a DA (521, 522).
Finalmente, este estudo indica o importante papel terapêutico da vitamina C
sobre os processos cognitivos e emocionais, avaliados tanto em humanos
escolarizados como em modelo animal de ansiedade e memória, aplicado em
ambiente enriquecido.
Assim, a educação, a escolarização, a prática de atividade física, o lazer, o
divertimento, à leitura de bons livros, o bom relacionamento com as pessoas, ou
seja, situações claras de enriquecimento ambiental, junto à alimentação saudável,
com nutrientes balanceados em vitamina C, certamente irão favorecer uma melhor
eficiência dos componentes neuropsicológicos emocionais e cognitivos desses
indivíduos, estejam eles em faixas etárias jovens ou adultas, e possivelmente em
faixas senis.
127
7
CONCLUSÕES FINAIS
 A vitamina C apresentou perfil ansiolítico em humanos escolarizados e
também em ratos de meia-idade crescidos em ambiente enriquecido.
 A vitamina C melhorou a resposta da frequência cardíaca, parâmetro
fisiológico, relacionado com sintomas de ansiedade.
 A vitamina C aumentou os escores nas tarefas de cópia e memória das
Figuras Complexas de Rey, memória lógica I e II, e na repetição de dígitos
indiretos, subtestes da Escala de Memória de Weschler, indicando uma
melhora da memória nos estudantes avaliados.
 A administração do ácido ascórbico promoveu a melhora da memória de curto
e longo prazo, nos ratos de meia-idade crescidos em ambiente enriquecido.
 O enriquecimento ambiental potencializou o efeito ansiolítico do ácido
ascórbico e melhorou a memória de longo prazo.
128
8
RECOMENDAÇÕES FINAIS
 Recomendar a implantação de programas nutricionais nas Escolas Públicas,
com a inclusão de alimentos saudáveis ricos em vitamina C, visto que a
vitamina C se revelou como um eficiente antioxidante na redução dos níveis
de ansiedade e defícits de memória.
 A vitamina C pode ser recomendada como um coadjuvante ao tratamento
medicinal e neuropsicológico sobre os distúrbios cognitivos em humanos.
 Recomendar o uso de dietas ricas em vitamina C, na alimentação diária de
idosos, tendo em vista suas ações sobre a ansiedade e memória em animais
envelhecidos.
 O enriquecimento ambiental desempenhou um papel determinante na
eficiência da execução de tarefas envolvidas com a memória em ratos
envelhecidos. Assim, esses dados de certa forma validam técnicas de
estimulação cognitiva envolvendo enriquecimento de vida, muito utilizada em
Programas de Reabilitação Neuropsicológicos dirigidos a idosos demenciados
ou com declínio cognitivo.
129
9
PERSPECTIVAS FUTURAS
 Em pesquisas futuras, sugerimos avaliar mudanças nos parâmetros de
estresse oxidativo, em pacientes diagnosticados com transtorno de ansiedade
e outros transtornos neuropsiquiátricos.
 Sugerimos também investigar a relação entre a suplementação de vitamina C,
estresse oxidativo e antioxidantes, como coadjuvante no tratamento de outras
patologias.
 Ainda, sugerimos a replicação da intervenção da vitamina C em estudantes
universitários e indivíduos idosos, com a finalidade de avaliar a influência
deste antioxidante sobre a escolaridade e o declínio cognitivo associado à
idade.
 A ingestão de suplementos nutricionais, através da alimentação, tais como
vitamina C, é susceptível de ter um impacto sobre os hábitos alimentares de
forma diferenciada entre os indivíduos, visando à promoção da saúde, humor
e bem-estar, assim como controlar os níveis de ansiedade e déficits de
memória. Assim, sugerimos a investigação do potencial da vitamina C nos
individuos que praticam a alimentação regada de vitamina C.
130
REFERÊNCIAS
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519. Paleologos M, Cumming RG, Lazarus R. Cohort study of vitamin C intake and
cognitive impairment. Am. J. Epidemiol. 1998; 148:45-50.
520. Kalmijn S, Feskens EJ, Launer LJ, Kromhout D, Polyunsaturated fatty acids,
antioxidants, and cognitive function in very old men. Am. J. Epidemiol. 1997; 145:3341.
521. Morris MC, Beckett LA, Scherr PA, Hebert LE, Bennett DA, Field TS, Evans
DA, Vitamin E and vitamin C supplement use and risk of incident Alzheimer disease.
Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 1998; 12:121-126.
522. Parigi AD, Panza F, Capurso C, Solfrizzi V. Nutritional factors, cognitive
decline, and dementia. Brain Res. Bull. 2006; 69:1-19.
176
ANEXOS
177
ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA COM SERES HUMANOS
178
179
ANEXO B – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA COM USO DE ANIMAIS
180
181
182
ANEXO C – TERMO DE CONCORDÂNCIA DA COLETA DE SANGUE
183
184
185
ANEXO D – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
186
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE
O (a) Senhor(a) estudante do Centro de Ensino Médio de Ceilândia (CEM), maior de
idade (18 a 74 anos) está sendo convidado(a), a participar do projeto de pesquisa com o
título: ESTUDO DA INTERFERÊNCIA DA VITAMINA C NOS COMPORTAMENTOS
DE ANSIEDADE E DÉFICIT DE MEMÓRIA E O ABANDONO DOS ESTUDOS E
REPROVAÇÃO ESCOLAR. Caso o(a) senhor(a) seja o responsável legal pelo seu(a)
filho(a) menor de idade (14 a 17 anos) convidamos a autorizar a participação deles no
referido projeto de pesquisa.
O objetivo desta pesquisa é investigar o efeito da suplementação da vitamina C (ácido
ascórbico) nos níveis de ansiedade e déficit de memória e o fenômeno social do abandono
dos estudos e da reprovação escolar em estudantes do CEM 09 de Ceilândia.
O(a) Senhor(a) ou o seu(a) filho(a) menor de idade receberá todos os esclarecimentos
necessários antes e no decorrer da pesquisa e lhe asseguramos que seu nome e/ou de seu(a)
filho(a) não aparecerá sendo mantido o mais rigoroso sigilo através da omissão total de
quaisquer informações que permitam identificá-lo(a)s.
Esclarecemos que a sua participação ou de seu(a) filho(a) menor de idade, será através
da aferição da pressão arterial sistólica, diastólica e frequência cardíaca; da coleta de (5 ml) de
amostra de sangue, após 8 (oito horas) em jejum, por uma Bioquímica responsável do
Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal – LACEN-DF, vinculado a
Subsecretaria de Vigilância à Saúde, da Secretaria de Estado de Saúde do Distrito Federal,
que utilizará luvas, seringas e agulhas descartáveis, no 1º dia do experimento e no 15º dia (no
início e no final dos tratamentos) sob a responsabilidade do Gerente da Gerência de
Medicamentos e Toxicologia Mestre em Ciências Farmacêuticas e Farmacêutico Ms. Nelson
Frick da Silva Fagundes, bem como de entrevistas, testes neuropsicológicos, avaliação
psicológica, descrição nutricional, recordatório nutricional e ingestão de nutrientes aplicados
por Psicólogas e Nutricionistas devidamente credenciadas pelos seus respectivos Conselhos
Regionais de Psicologia (CRP) e de Nutrição (CRN) não havendo nenhum incômodo para os
participantes. O(a) senhor(a) ou seu(a) filho(a) deverá comparecer a todos os procedimentos
experimentais com a equipe multidisciplinar, nos laboratórios do CEM, na data e horário
combinado antecipadamente. Estes procedimentos serão realizados em duas visitas (no 1º e
15º dia). Informamos que o(a) senhor(a) ou seu(a) filho(a) pode se recusar a responder (ou
participar de qualquer procedimento) qualquer questão que lhe traga constrangimento,
podendo desistir de participar da pesquisa em qualquer momento sem nenhum prejuízo para
187
o(a) senhor(a) ou seu(a) filho(a). Esclarecemos, ainda, que a sua participação ou do seu(a)
filho(a) é voluntária, isto é, não há pagamento por sua colaboração. Solicitamos também
permissão para gravar as entrevistas semi-estruturadas que serão utilizadas durante os
procedimentos da execução deste projeto.
Os resultados da pesquisa serão divulgados na Universidade de Brasília, Faculdade de
Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde podendo ser publicados
posteriormente. Os dados e materiais utilizados na pesquisa ficarão sobre a guarda do
pesquisador.
Se o(a) Senhor(a) ou seu filho(a) tiver qualquer dúvida em relação à pesquisa, por
favor telefone para: Profº Drº Sérgio Leme da Silva, Coordenador Geral da Pesquisa,
Psicólogo do Instituto de Psicologia, Departamento de Processos Psicológicos Básicos, do
Programa de Pós-graduação de Ciências do Comportamento telefone: (61) 3307-2625 Ramal:
515, (61) 9143-3003, no horário: 8:00 às 12:00 e 14:00 às 18:00 ou ao doutorando Ivaldo
Jesus Lima de Oliveira, telefone: (61) 3536-7057 ou (61) 9301-9855, responsável pela
pesquisa ou ainda para o Ms Nelson Frick da Silva Fagundes, telefone: (61) 3225-2394.
Este projeto foi Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências
da Saúde da Universidade de Brasília. As dúvidas com relação à assinatura do TCLE ou os
direitos do sujeito da pesquisa podem ser obtidos através do telefone: (61) 3107-1947.
Este documento foi elaborado em duas vias, uma ficará com o pesquisador
responsável e a outra com o sujeito da pesquisa.
______________________________________________
Nome / assinatura
____________________________________________
Pesquisador Responsável
Nome e assinatura
Brasília, ___ de __________de _________
188
ANEXO E – AUTORIZAÇÃO PARA A COLETA DE DADOS
189
190
ANEXO F – DADOS PESSOAIS PARA A COLETA DE SANGUE
191
Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal – LACEN-DF, vinculado a
Subsecretaria de Vigilância à Saúde, da Secretaria de Estado de Saúde do Distrito Federal.
ESTUDO DA INTERFERÊNCIA DA VITAMINA C NOS COMPORTAMENTOS
DE ANSIEDADE E DÉFICIT DE MEMÓRIA E O ABANDONO DOS ESTUDOS E
REPROVAÇÃO ESCOLAR.
Nome do Paciente: __________________________________________________________
Sexo: ( ) Masculino ( ) Feminino
Data de Nascimento: ___/___/___
Estado Civil: _____________________________
Idade: ____ Série: ___ Turma: ___ Turno:________
Nome da Mãe: ______________________________________________________________
Nome do Pai: _______________________________________________________________
Endereço: __________________________________________________________________
Telefone: (___) ______________________ Celular: (___) ___________________________
Solicitante: Farm. Bioq. Nelson Frick Fagundes
Exame solicitado: Teor sérico de Vitamina C
Observação: 1º Coleta em paciente sem intervenção (linha de base)
data: ____/____/____
2º Coleta em paciente (pós-tratamento)
data: ____/____/____
Estudantes do Centro de Ensino Médio 09 de Ceilândia
Pesquisador responsável: Ivaldo Jesus Lima de Oliveira
Matrícula: UnB-10/0072330
Matrícula: SEDF-32.635-6
192
ANEXO G – DECLARAÇÃO DE COMPARECIMENTO
193
Governo do Distrito Federal
Secretaria de Estado de Educação
Diretoria Regional de Ensino de Ceilândia
Centro de Ensino Médio 09 de Ceilândia
DECLARAÇÃO
Declaramos para os devidos fins que o(a) estudante do Centro de Ensino Médio de
Ceilândia ____________________________________________, Série: _____ Turma: _____
Turno: ______ Modalidade ___________ foi submetido à aferição da pressão sanguínea
sístole, diástole e frequência cardíaca, coleta de sangue, e bateria de testes neuropsicológicos
de ansiedade e memória, como participante da pesquisa de doutorado do Profº Ivaldo Jesus
Lima de Oliveira, Matrícula UnB-10/0072330, do Programa de Pós-graduação da Faculdade
de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília – UnB, com o título: ESTUDO DA
INTERFERÊNCIA DA VITAMINA C NOS COMPORTAMENTOS DE ANSIEDADE E
DÉFICIT DE MEMÓRIA E O ABANDONO DOS ESTUDOS E REPROVAÇÃO
ESCOLAR, aprovada pelo CEP/FS/UnB 022/12, de 08.05.12.
Esclarecemos, ainda que os procedimentos da coleta de sangue foram realizados pelo
Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal – LACEN-DF, vinculado a
Subsecretaria de Vigilância à Saúde, da Secretaria de Estado de Saúde do Distrito Federal, no
dia: ___/___/___ horário: ______ se iniciou a partir das 8:00 hs e se finalizou às 10:00 hs,
devendo o(a) estudante retornar ao local de trabalho assim que for concluído todos os
procedimentos experimentais e laboratorias desta pesquisa.
Brasília,
de
de 2012.
Ms Nelson Frick da Silva Fagundes
Gerente da Gerência de Medicamentos e Toxicologia
Mestre em Ciências Farmacêuticas e Farmacêutico
LACEN-DF
Ciente: Direção do CEM 09 de Ceilândia
194
ANEXO H – ESCALA DE ANSIEDADE DE BECK (BAI)
195
ESCALA DE ANSIEDADE DE BECK (BAI)
Nome:______________________________________________________________
0
AUSENTE
1 – Dormência ou
formigamento
2 – Sensações de
calor
3 – Tremor nas
pernas
4 – Incapaz de
relaxar
5 – Medo de
acontecimentos
ruins
6 – Confuso ou
delirante
7 – Coração
batendo forte e
rápido
8 – Inseguro(a)
9 – Apavorado(a)
10 – Nervoso(a)
11 – Sensação de
sufocamento
12 – Tremor nas
mãos
13 – Trêmulo(a)
14 – Medo de
perder o controle
15 – Dificuldade
de respirar
16 – Medo de
morrer
17 – Assustado(a)
18 – Indigestão
ou
desconforto
abdominal
19 – Desmaios
20 – Rubor facial
21 – Sudorese
(não devido ao
calor)
1
SUAVE
Não me
incomoda
muito
2
MODERADO
É desagradável,
mas consigo
suportar
3
SEVERO
Quase não
consigo
suportar
196
ANEXO I – ESCALA DE MEMÓRIA WESCHELR (WMS)
197
INFORMAÇÃO E ORIENTAÇÃO
Nome: _________________________________________________________________
Informação
1 – Qual o seu nome completo?
2 – Quantos anos você têm?
3 – Quando você nasceu?
4 – Onde você nasceu?
5 – Qual o primeiro nome da sua
mãe (ou pai)?
6 – Quem é o Presidente do
Brasil?
7 – Quem foi anterior a ele?
8 – Quem é o Governador?
9 – Quem é o Papa? Ou o Rei do
Futebol?
10 – Em que ano estamos?
11 – Em que mês estamos?
12 – Que dia do mês é hoje?
13 – Em que lugar você está
agora?
14 – Em que cidade estamos?
15 – Que horas são agora?
Resposta
Ponto
1
1
1
1
1
Escore
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
CONTROLE MENTAL
Resposta
Tempo
Ponto
20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
30`
0,1 ou 2
ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ
30`
0,1 ou 2
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
45`
0,1 ou 2
Escore
198
DÍGITOS DIRETOS
Nome: ___________________________________________________________
Item resposta
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1-7
6-3
5-8-2
6-9-4
6-4-3-9
7-2-8-6
4-2-7-3-1
7-5-8-3-6
6-1-9-4-7-3
3-9-2-4-8-7
5-9-1-7-4-2-8
4-1-7-9-3-8-6
5-8-1-9-5-1-7-4
3-8-2-9-5-1-7-4
2-7-5-8-6-2-5-8-4
7-1-3-9-4-2-5-6-8
Ponto na tentativa
Ponto no Item
(0 ou 1)
(0, 1 ou 2)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Ponto máximo: 16
DÍGITOS INVERSOS
Item resposta
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
2-4
5-7
6-2-9
4-1-5
3-2-7-9
4-9-6-8
1-5-2-8-6
6-1-8-4-3
5-3-9-4-1-8
7-2-4-8-5-6
8-1-2-9-3-6-5
4-7-3-9-1-2-8
9-4-3-7-6-2-5-8
7-2-8-1-9-6-5-3
Ponto na tentativa
Ponto no Item
(0 ou 1)
(0, 1 ou 2)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Ponto máximo: 14
199
MEMÓRIA LÓGICA I E II
Nome: _______________________________________________________________
História A
ML 1
ML 2
ANA SOARES* DO SUL* DO PARANÁ*
EMPREGADA* COMO FAXINEIRA* NUM
PRÉDIO* DE ESCRITÓRIOS* RELATOU*
NA DELEGACIA* DE POLÍCIA* QUE
TINHA SIDO* ASSALTADA* NA RUA DO
ESTADO* NA NOITE ANTERIOR* E
ROUBADA* EM 150 REAIS* ELA DISSE
QUE TINHA* QUATRO* FILHINHOS.* O
ALUGUEL* NÃO TINHA SIDO PAGO, E
ELES NÃO COMIAM HÁ DOIS DIAS.* OS
POLICIAIS,* TOCADOS PELA HISTÓRIA
DA MULHER,* FIZERAM UMA COLETA*
PARA ELA.
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
História B
ML 1
ML 2
ROBERTO* MOTA* ESTAVA DIRIGINDO*
UM CAMINHÃO MERCEDES* NUMA
RODOVIA* À NOITE,* NO VALE* DO
PARAÍBA* LEVANDO OVOS* PARA
TAUBATÉ.*
QUANDO
O
EIXO*
QUEBROU* O CAMINHÃO* CAIU NUMA
VALETA* FORA DA ESTRADA.* ELE FOI
JOGADO* CONTRA O PAINEL.* E SE
ASSUSTOU
MUITO*
NÃO
HAVIA
TRÂNSITO* E ELE DUVIDOU QUE
PUDESSE SER SOCORRIDO* NAQUELE
INSTANTE SEU RÁDIO PX* TOCOU* ELE
RESPONDEU IMEDIATAMENTE* “AQUI
FALA TUBARÃO”.
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
_____________
200
PARES DE FÁCIL ASSOCIAÇÃO I E II
Nome: ______________________________________________________________
Palavra
Par
1ª
Tentativa
Tipo
Evocação
tardia
Tipo
1 – ROSA
2 – METAL
3 – ESCOLA
4 – REPOLHO
5 – BEBÊ
6 – ESPREMER
7 – OBEDECER
8 – FRUTA
FLOR
FERRO
DROGARIA
CANETA
CHORO
ESCURO
CENTÍMETRO
MAÇÃ
F
F
D
D
F
D
D
F
F
F
D
D
F
D
D
F
Palavra
1 – FRUTA
2 – ROSA
3 – METAL
4 – REPOLHO
5 – OBEDECER
6 – ESCOLA
7 – ESPREMER
8 – BEBÊ
Par
MAÇÃ
FLOR
FERRO
CANETA
CENTÍMETRO
DROGARIA
ESCURO
CHORO
2ª Tentativa
Tipo
F
F
D
D
D
D
D
F
Palavra
1 – OBEDECER
2 – REPOLHO
3 – ROSA
4 – ESCOLA
5 – ESPREMER
6 – BEBÊ
7 – METAL
8 – FRUTA
Par
CENTÍMETRO
CANETA
FLOR
DROGARIA
ESCURO
CHORO
FERRO
MAÇÃ
3ª Tentativa
Tipo
D
D
F
D
D
F
D
F
201
ANEXO J – DADOS PESSOAIS E SOCIOECONÔMICOS
202
DADOS PESSOAIS E SOCIOECONÔMICOS
Identificação do entrevistado(a)
Data da Entrevista: ___/___/___
Horário de início ______
Término ___________
Nome: ___________________________________________________________________
Sexo: ( ) Masculino
( ) Feminino
Data de Nascimento: __/__/__
Estado Civil: ____________________________
Idade: ____ Série: ___Turma:___ Turno: ___________
Endereço: _________________________________________________________________
Telefone: (___) __________________ Celular: (___) _______________________________
Peso: ______ Kg
Estatura: _______ cm
Profissão: __________________________________________________________________
Você está trabalhando atualmente? ______________________________________________
Local de trabalho: ____________________________________________________________
Horário de trabalho: __________________________________________________________
Renda Familiar
Até 2 SM
( )
3 a 4 SM
( )
5 a 6 SM
( )
7 a 8 SM
( )
Não declarou ( )
Nº de componentes da família: ___
Imóvel: ( ) próprio ( ) alugado
Veículo próprio: ( ) sim ( ) não
( ) outros
203
ANEXO K – ESTADO DE SAÚDE FÍSICA E MENTAL
204
ESTADO DE SAÚDE FÍSICA E MENTAL
Nome do entrevistado(a): ____________________________________________________
Informe se é portador ou se já sofreu de:
Nº
Enfermidade
01 Doenças do aparelho cardiocirculatório (angina, infarto,
pressão alta, arritmias, aneurisma de aorta, cirurgias
anteriores e doenças cardíacas congênitas)
02 Doenças
endócrinas
e
metabólicas
(diabetes,
hipertireoidismo e hipotireoidismo)
03 Doenças do sangue, imunológicas e do colágeno ou
autoimune (anemias, púrpuras, talassemias, AIDS e suas
complicações, lúpus eritematoso e artrite reumatóide)
04 Doenças do sistema nervoso e cerebrovasculares (derrame,
aneurisma cerebral, paralisia cerebral, Parkinson, Alzheimer,
epilepsia, esclerose múltipla lateral, Huntington e doenças
congênitas do sistema nervoso)
05 Doenças ou tomorizações malignas (leucemia, mieloma
múltiplo, carcinoma, melanoma, linfoma e todos os tipos de
câncer)
06 Doenças do aparelho urinário e do aparelho reprodutor
masculino ou feminino (cálculo renal, insuficiência renal,
infecção urinária de repetição, incontinência urinária,
doenças da próstata, cistos de ovário, mioma uterino e
nódulos de mama)
07 Qualquer outra doença que não esteja descrita acima,
constante dos itens anteriores, que tenha gerado ou não
intervenção médica.
SIM
NÂO
Declaro para os devidos fins, que me encontro em plena saúde física e mental e estou
apto(a) a participar desta pesquisa e não estou grávida (feminino) e nem ingerindo
suplementação regular de vitamina C, nem medicamentos controlados restritos aos pacientes
psiquiátricos não tenho nenhuma doença grave, principalmente predisposição a doenças renais
e nefropatias, bem como aspectos relacionados à prática nutricional: raquitismo, desnutrição,
baixo peso corporal relacionado com a idade e problemas mentais.
Ciente: _____________________________________________________________
Assinatura do Participante
205
ANEXO L – RECORDATÓRIO ALIMENTAR
206
RECORDATÓRIO ALIMENTAR
Nome: _________________________________________ Sexo: Masculino
1
Feminino
2
Idade: _______ Série: _____ Turno: ______________
Nº do questionário ________________ Entrevistador: ___________________________
Data da Entrevista: ___/___/___
Dia da semana do Recordatório _____________ Horário: ________________________
Anote bebidas e alimentos (ingredientes de preparações) consumidos no dia anterior e os
horários. Anote o nome das refeições. Não esqueça das marcas comerciais, medidas caseiras,
utensílios (tipo de colher, copo, prato, etc).
Nome das
Refeições
Horário
Local
Alimentos,
bebidas e/ou
preparações
Ingredientes Quantidades
e forma de
ingeridas
preparo
(colheres,
copo, xícara
– medida
caseira)
Café da manhã
Lanche
da
manhã
Almoço
Lanche da tarde
Jantar
Ceia
Intervalos
de
refeições
O(A) Entrevistado(a) consumiu:
Refrigerante ( ) Sim
( ) Não
( ) Light/Diet
( ) Normal
Leite
( ) Sim
( ) Não
( ) Integral ( ) Desnatado ( ) Semidesnatado
Salada
( ) Sim
( ) Não
Descrever o tempero utilizado
Bebidas
( ) Sim
( ) Não
Apetite:
( ) Pouco
Verificar se adicionou algo
Normal ( )
Muito ( )
207
ANEXO M – E-MAIL E CARTA DE ACEITE DO ARTIGO
208
209
210
Dec 22, 2014
Mr. Ivaldo Jesus Lima de Oliveira,
nill
Subject: Acceptance Letter for Article No. 67854-PJBS-ANSI
It's a great pleasure for us to inform you that below mentioned manuscript has been
accepted for publication in Pakistan Journal of Biological Sciences as Research
Article on the recommendation of the reviewers.
Title: Effects of Oral Vitamin C Supplementation on Anxiety in Students: A Double-Blind
Randomized, Placebo-Controlled Trial
Author's Ms. Ivaldo Jesus Lima de Oliveira, Victor Vasconcelos de Souza, Dr. Vitor Augus
Name: Motta Moreira and Phd Sérgio Leme Da-Silva
Receiving October 02, 2014
Date:
Revised on: November 30, 2014
Accepted on: December 03, 2014
Published on: December 13, 2014
Regards
211
ANEXO N – CÓPIA DA PUBLICAÇÃO DO ARTIGO
.
212
213
214
215
216
217
218
219
220
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