Akai | QX-3700 | Pokaż treść!

POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE
PL ISSN
0032-5422
Advances in Biochemistry
TOM 46, NR 2, 2000
Priony d ro ż d ż y .................................
Heterodimery I .................................
Heterodimery I I .................................
Geny syntaz tlenku a zo tu ..................
Kinaza białkowa CKI..........................
Kinaza białkowa C K I I ......................
Dehydrogenaza NADH......................
Podjednostki kompleksu I ...................
Antyportery Na+/H + .........................
Genom człow ieka..............................
http://rcin.org.pl
108
115
125
130
140
148
154
163
177
187
6 k w ietnia br. ob iegła św iat sen sacyjn a w ia d o ­
m ość o od czytaniu p rzez firm ę C elera całkow itej
sekw encji genom u człow iek a. N ie oznacza to w c a ­
le, że zakończony został najw iększy i najam bitniej­
szy program badaw czy w historii biologii i m e d y cy ­
ny. Osiągnięto je d n a k w ażny etap na drodze do
całkowitego p oznania inform acji, w edług której
funkcjonuje ludzki organizm.
Gdyby zapis zaw arty w genom ie człow ieka p o ­
równać do treści książki, to na tym etapie Celera p o ­
znała ju ż poszczególne słowa (w szystkie drobne ele­
menty „pociętej” na fragm enty sekwencji). Dopiero
ułożenie tych słów, zgodnie z oryginałem , w zdania
(geny), akapity (grupy sprzężonych sekwencji) i ro z­
działy (poszczególne chrom osom y), nada tej infor­
macji sens. N a to trzeba jeszc ze poczekać, według
różnych szacunków od kilku m iesięcy do trzech lat.
Jak obliczono, zapisanie całej sekwencji ludzkiego
genom u zajęłoby około 500 tysięcy stron drobnego
druku. Gdy Celera zakończy etap składania fragm en­
tów sekwencji w całość, najpraw dopodobniej p o zo ­
staną tysiące pustych kartek (przerw w ciągłości se­
kwencji). W ynikiem system atycznego podejścia
m iędzynarodow ego P rojektu B ad aw czeg o — G e ­
nom Człowieka (HGP - H um ań G enom e P ro ject), z
którym ryw alizuje firm a Celera, m a być księga ludz­
kiego genom u, ze znacznie m n iejszą liczbą nie zapi­
sanych stron.
W realizację HGP, rozw ijanego od 10 lat zaanga­
żow anych je st około 1 1 0 0 b adaczy z kilkunastu
ośrodków w 6 państw ach. D otychczasow e nakłady
na ten projekt w U S A w y n o szą około 2,5 mld USD,
w tym 250 min U SD to koszty sam ego etapu sekwencjonowania. Sekw encja geno m u człowieka, w w y d a ­
niu HGP, m a być m o z a ik ą sekwencji genom ów 10 lu­
dzi.
Potencjał firmy Celera, powstałej niespełna 2 lata
temu, której siedziba m ieści się w Rockville, M ary ­
land w USA, to ponad 500 badaczy i 300 min U SD
zainw estow anych w sekw encjonow anie genomów.
B adania prow adzone na skalę „przem ysłow ą” , ce­
chuje odw aga w p o dejm o w an iu ryzyka. M otto firmy
brzmi „O dkrycie nie m oże czekać” . Na sekw encję
ludzkiego genom u m ają się złożyć całkowite se­
kw encje gen om ów 5 ludzi, m ężczyzn i kobiet, o ró ż­
nym pocho dzeniu etnicznym.
G racjan M ichlew ski, W łodzim ierz K rzyżo sia k
Od R edakcji
Z przyjem nością inform ujem y, że 6 kw ietnia b. r. w płynął do naszej Redakcji artykuł p.t. „S ekw en cjo now a­
nie genom u c z ł o w i e k a - d w a projekty badawcze, dwie strategie” autorstw a kol. G racjana M ichlew skiego i kol.
W łodzim ierza Krzyżosiaka.
Tekst artykułu p ublikujem y na stronie 187
Z ofia Z ieliń ska
17 kw ietnia 2000
Kwartalnik "Postępy Biochemii" w ydaw any z po­
mocą finansową Komitetu Badań Naukow ych
Indeksowany w Medline, A gro lib rex i M ediClub
http://rcin.org.pl
Kwartalnik "Postępy Biochemii" w ydaw any z
pom ocą finansową Komitetu Badań Naukowych
indeksowany w Medline, A grolibrex i M ediClub
W YDAW CA
Editor
POLSKIE TOW ARZYSTW O
BIOCHEM ICZNE
Polish Biochemical Society
ul. Pasteura 3,
02-093 Warszawa, Poland
tel/fax 658-20-99
e-mail — ptbioch@ nencki.gov.pl
www.ptbioch.edu.pl
R ED AK TO R NAC ZELNY
SPI S T RE Ś CI
CONTENTS
Priony drożdży i grzybów nitkowatych
Prions in yeast and filamentous fungi
MAGDALENA BOGUTA.............................
Heterodimeryczne receptory jądrowe. I. Receptory wita­
min i hormonów
Editor in chief
ZOFIA ZIELIŃSKA
tel. 831-24-03
Heterodimeric nuclear receptors. I. Vitamin and hormone
receptors
ZASTĘPCA
REDAK TO RA NAC ZELNEG O
Heterodimeryczne receptory jądrowe. II. Regulacja przemiany kwasów tłuszczowych i steroidów
Executive Editor
GRAŻYNA PALAM ARCZYK
tel. 658-47-02
Heterodimeric nuclear receptors. II. Fatty acid and steroid
metabolism
REDAK TO RZY
Editors
IW ONA FIJAŁKOW SKA
A NDRZEJ JERZM ANOW SKI
LILIANA KONARSKA
A NNA SZAKIEL
ADAM SZEW CZYK
BIURO REDAK CJI
Editorial office
SEKRETARZ
Secretary
HANNA LASKOW SKA
poniedziałki, czwartki
monday— thursday
14— 16
tel. 659-85-71 w. 441
SKŁAD I ŁAM ANIE
Typesetting
MAŁGORZATA BASAJ
RECENZENCI ZESZYTU
Referees o f this issue
MAŁGORZATA MANTEUFFELCYM BOROW SKA (Warszawa)
GRAŻYNA M USZYŃSKA
(Warszawa)
ADAM SZEW CZYK (Warszawa)
W OJCIECH URACZ (Kraków)
LECH W OJTCZAK (Warszawa)
MACIEJ ŻYLICZ (Gdańsk)
ADRES REDAK CJI
Address
REDAKCJA KWARTALNIKA
„POSTĘPY BIOCHEM II”
ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa
e-mail: postepy@nencki.gov.pl
108
DANUTA KWIATKOWSKA, JANINA KWIATKOWSKA-KORCZAK.
JANINA KWIATKOWSKA-KORCZAK, DANUTA KWIATKOWSKA.
115
125
Geny syntaz tlenku azotu: struktura, regulacja ekspresji,
proaukfy białkowe
Genes of nitric oxide synthases: structure, regulation of
expression, protein products
NATALIA DEREBECKA, MARCIN HOŁYSZ, WIESŁAW H. TRZECIAK
130
Grupa kinaz białkowych CKI
The group of protein kinases CKI
IWONA WOJDA.........................................................................
140
Kinaza białkowa CKII
Protein kinase CKII
IWONA W O JD A .......................................................................
148
Dehydrogenaza NADH kompleksu I łańcucha oddecho­
wego. Podstawowe podjednostki kodowane przez ge­
nom jądrowy
Complex I NADH-dehydrogenase of the respiratory chain.
The basic subunits encoded by a nuclear genome
DOROTA PIĘKNA.......................................................................
154
Mitochondrialne geny podjednostek dehydrogenazy
NADH kompeksu I łańcucha oddechowego. Redagowa­
nie ich transkryptów
Mitochondrial genes of complex I NADH dehydrogenase
of the respiratory chain subunits. The editing of their trans­
cripts
MICHAŁ RUREK...........................................................................
163
Antyportery N a+/H+ w komórkach ssaczych
Mammalian N a +/ H + exhangers
ANNA KICIŃSKA.......................................................................
177
Sekwencjonowanie genomu człowieka — dwa projekty
badawcze, dwie strategie
Sequencing of human genome — two projects, two strate­
gies
GRACJAN MICHLEWSKI, WŁODZIMIERZ KRZYŻOSIAK.............
http://rcin.org.pl
187
ARTYKUŁY
Priony u drożdży i grzybów nitkowatych
Priony in yeast and filamentous fungi
MAGDALENA BOGUTA*
Spis treści:
Contents
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
Wstęp
Priony u drożdży i grzybów nitkowatych
Cechy genetyczne prionów
Domenowa struktura białek, które tworzą priony
Hipotezy powstawania prionów
Badania biochemiczne i obserwacje mikroskopowe
prionów
VII.Fizjologiczna rola prionów u niższych eukariontów
I. Introduction
II. Prions in yeast and fdamentous fungi
III. Genetic features of prions
IV. Domain structure of proteins able to prion formation
V. Hypothesis of prions generation
VI. Biochemical and microscopy studies of prions
VII.Physiological function of prions in lower eucaryotes
Wykaz stosowanych skrótów: PrPSc — prion ssaczy, zakaźna
forma białka PrP wywołująca pasażowalne amyloidozy mózgo­
we; PrPc — białko komórkowe PrP, forma nie zakaźna; Ure2 —
represor katabolizmu związków azotu u drożdży Saccharomy­
ces cerevisiae', [URE] — prion drożdżowy, zagregowana forma
białka Ure2, jednocześnie oznaczenie mutantów drożdży Sac­
charomyces cerevisiae, w których ten prion występuje; Sup35
— czynniki terminacji translacji (eRF3) drożdży Saccharomy­
ces cerevisiae', [PSI] — prion drożdżowy, zagregowana forma
białka Sup35, jednocześnie oznaczenie mutantów drożdży Sac­
charomyces cerevisiae, w których ten prion występuje; het-s,
het-S— różne allele genu kodującego białko odpowiedzialne za
krzyżowanie się szczepów grzyba nitkowatego Podospora anserina', [het-s], [het-s*] — cechy fenotypowe Podospora anserina związane ze zdolnością do krzyżowania, przy czym [het-s]
oznacza prion odpowiedzialny za tworzenie bariery uniemożli­
wiającej określone krzyżówki
utraty aktywności białka. A gregaty prionów m ają
postać włókien am yloidow ych o charakterystycz­
nym obrazie m ikroskopow ym .
Termin „prion” został pierw otnie w prow adzony w
celu określenia infekcyjnego czynnika PrP Sc
w yw ołującego śm iertelne choroby m ózgowe ssa­
ków. C horoby w yw oływ ane przez prion to p asa­
żow alne amyloidozy, m iędzy innymi ludzka choroba
Creutzfelda-Jacoba, choroba w ściekłych krów i ch o ­
I. W stęp
Prion jest to białko o szczególnej, „zaraźliw ej”
konformacji, która je s t p rzek azy w an a cząsteczkom
tego samego białka o konform acji normalnej. P rze­
miana do konformacji prionu prow adzi do agregacji i
*Doc. dr hab, Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki
PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa, tel. 659 7072 w.
1312, email: magda@ibbrain.ibb.waw.pl
108
roba scrapie u owiec.
Zgodnie z hipotezą P r u s i n e r a , przem iana k o n ­
formacji prow adząca do pow stania prionu zachodzi
bez udziału kwasu nukleinowego. Białko komórkowe PrP , kodow ane przez gen P rP gospodarza, sa­
m orzutnie ulega konwersji do konform acji prionu,
P rP Sc. K onw ersja może zachodzić spontanicznie lub
może być w yw ołana poprzez w prow adzenie cząste­
czki prionu, który pow oduje law inow ą reakcję z m ia ­
ny konform acji całej puli ko m órkow ego białka P rP c
do formy P rPSc. Efektem końcow ym je s t p o w staw a­
nie agregatów am yloidow ych i śm ierć komórki [ 1 ].
Zdarza się, że szczególnie interesujące teorie n a ­
ukow e ro dzą się poprzez skojarzenie zjawisk, które
pozornie nie w iążą się zupełnie ze sobą. Tak właśnie
powstała teoria prionów drożdżow ych sform uło w a­
na przez W i c k n e r a w 1994 roku [2]. W i c k n e r
połączył niestandardow e cechy cytoplazm atycznych
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 20 00
czynników [PSI] i [URE] u drożdży Saccharom yces
cerevisiae z cecham i prionu, w yjaśniającym i m ech a­
nizm infekcji w yw o łujący śm iertelne choroby m ó z­
gowe u ssaków. Skojarzenie to pozw oliło na zrozu ­
mienie kłopotliw ych w interpretacji w yników g en e­
tycznych i niezrozum iałych obserw acji dotyczących
czynników [PSI] i [URE], nagrom adzo nych w ciągu
blisko 30 lat. H ipoteza W i c k n e r a została poparta
serią p om ysłow ych d ośw iadczeń genetycznych, a
następnie ugrun tow ana poprzez badania z zakresu
biologii m olekularnej, biochem ii i obserw acje m i­
kroskopowe.
Ostatnio na podstaw ie analogicznych kryteriów
genetycznych zdefiniow ano jak o kolejny prion cz yn ­
nik [Het-s], p rzenoszony przez cy toplazm ę grzyba
nitkowatego P o dospora anserina [3],
Ryc. 1. Prion [PSI]: interpretacja fizjologiczna. Zagregowane białko
Sup35 (prion [PSI]) um ożliwia translacją mimo kodonu nonsens
w mRNA. Aktywne białko Sup35 jest czynnikiem terminacji
translacji u drożdży.
prion [URE] stanowi nieaktyw ną, zagregow aną for­
II. Priony u drożdży i grzybów nitkow atych
W przeciw ieństw ie do PrP, priony w ystępujące u
grzybów nie p o w o d u ją śmierci kom órki. Priony d ro ­
żdży są czynnikam i dziedzicznym i, które m o d y fi­
kują p odstaw ow e procesy m etaboliczne. Prion
[het-s] P o dospora pełni określon ą funkcję fizjolo­
giczną. Podobnie ja k w p rzypadku prionów ssaczych, fenotyp prionów [PSI], [URE] i [het-s] nie
wynika ze zm iany na poziom ie kw asu nukleinow ego,
lecz na poziom ie konform acji białka. A więc, w obu
przypadkach czynnikiem determ inującym pew n ą ce­
chę dziedziczną je s t nie DNA lecz szczególna struk­
tura białkowa.
Czynnik [PSI] u drożdży, odkryty przez C o x a w
1965 roku, pow oduje słabą supresję kodonów stop w
m RNA [4], W w yniku badań p row adzonych w ostat­
nich latach wykazano, że [PSI] jest k onform acją
prionow ą czynnika term inacji translacji, białka
Sup35 [5].
A ktywna term inacja zachodzi wtedy, gdy białko
Sup35 występuje w formie rozpuszczalnej. W ystępo­
wanie Sup35 w formie zagregowanej jak o prion
[PSI] powoduje defekt w term inacji i supresję k odo ­
nów stop (Ryc. 1).
Czynnik [URE], opisany został w 1971 roku przez
L a c r o u t a [6 ] pow oduje brak represji enzym ów
katabolizmu zw iązków azotu. Jak w ykazano na p o d ­
stawie w spółcześnie prow adzonych badań, prion
[URE] je s t form ą białka Ure2 [2], Białko Ure2 jest z
kolei represorem Gln3, czynnika transkrypcyjnego
aktywującego geny zw iązane z m etabolizm em azotu.
Na pożyw ce pełnej, przy dostępności zw iązków
będących dobrym i źródłami azotu, ja k amoniak,
białko Ure2 blokuje ekspresję genów zaan g aż o w a­
nych w katabolizm gorszych źródeł azotu. N atom iast
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
m ę białka Ure2, która u m ożliw ia wykorzystanie gor­
szych źródeł azotu w obecności amoniaku. Cecha ta
stanow iła podstaw ę pozytywnej selekcji m utantów
[URE] (Ryc. 2).
Ryc. 2. Prion [URE]: interpretacja fizjologiczna. Zagregowana forma
białka Ure2 (prion [URE]) umożliwia pobieranie N-karbamoiloasparaginianu (związku bądacego gorszym źródłem azo­
tu) w obecności amoniaku. Aktywne białko Ure2 jest represo­
rem tego procesu u drożdży.
Fenotyp [het-s] został opisany przez R i z e t a w
1952 roku jak o cecha zw iązana z tworzeniem tzw.
bariery m iędzyszczepow ej u P odospora anserina
[7].
Efektyw na krzyżów ka dwóch szczepów P odospo ­
ra je s t m ożliw a tylko wtedy, gdy ściśle określone
geny, nazwane genami h e t, m ają identyczną sekw en­
cję w obu szczepach. W przeciw nym w ypadku w z a ­
je m n e przenikanie się grzybni nie jest m ożliwe ze
w zględu na tworzenie bariery. Jeden z genów het w y ­
stępuje w postaci dwóch alleli, het-s i het-S. K rzy­
ż ó w k i het-s x het-s oraz h et-S x het-S zachodzą efek­
tywnie, dając odpow iednio potom stw o het-s i het-S,
podczas gdy w potom stw ie krzyżówki het-s x het-S
http://rcin.org.pl
109
pojaw iają się fenotypy [het-s] i [het-s*], gdzie [het-s]
oznacza prion, zaś [het-s*] — je g o brak. W łaśnie
prion [het-s] tworzy akty w n ą barierę w krzyżów ce ze
szczepem het-S, podczas gdy szczepy o fenotypie
[het-s*] nie m ają ograniczenia w krzyżow aniu z het-s
i het-S [3]. Podczas gdy fenotypy [PSI] i [URE]
w iążą się z brakiem aktyw ności Sup35 i Ure2, detek­
cja [het-s] odbyw a się na podstaw ie jeg o pozytywnej
aktywności w kontroli fuzji dwóch grzybni [3].
zap ew niają jedy nie dzikie, nie zm utow ane geny
SU P 35 i URE2 [9, 10].
Jest regułą, że częstość indukcji prionu wzrasta j e ­
śli spow odow ać nadprodukcję białka-matrycy. Nadekspresja genów SU P 35 i URE2 ja k również allelu
het-s p ow oduje odpow iednio wzrost częstości w y ­
stępow ania kolonii [PSI], [URE] i [het-s] [3, 8 ].
III. C echy genetyczne prion ów
C echy genetyczne prionó w opisano ju ż szereg lat
temu, ale dopiero obecnie ich interpretacja stała się
możliwa.
[PSI], [URE] i [het-s] d ziedziczą się w sposób d o ­
minujący, gdyż cała pula białka kom ó rko w eg o w p o ­
wstającym diploidzie przechodzi w konform ację
prionu. Prion dziedziczy się w całym potom stw ie
m ejotycznym (4:0). Taki sposób dziedziczenia, nie­
zgodny z prawam i M endla, byłby łatw y do w ytłu m a­
czenia w przypadku cech p rzenoszonych przez
m t-DNA, plazm idy bądź wirusy, lecz [PSI], p o d o b ­
nie ja k [URE] i [het-s], nie w iąże się ze zm ianam i w
pozachrom osom alnym D N A czy RNA. Chodzi
wyłącznie o konform ację białka, która przenosi się
przez cytoplazm ę do kom órek potom nych [ 8 ],
Stwierdzono, że cechy [PSI] i [URE] zanikają j e ­
śli komórki są traktow ane chlorow odorkiem guan i­
dyny dodanym do pożyw ki. C hlorow odorek guani­
dyny jest czynnikiem denaturującym białka. Pod
jego w pływ em konform acja prionu przechodzi w
konform ację aktyw nego białka. Prion [het-s] nie jest
wrażliwy na działanie chlorow odorku guanidyny
lecz ulega neutralizacji pod w pływ em szoku osmotycznego. Po usunięciu czynnika inaktywującego, w
kom órkach poto m ny ch po kilku generacjach zaczy ­
nają się pojawiać z n iew ielk ą częstością cechy fenotypowe prionu. Jest to kolejna obserwacja, która nie
może być w y tłum aczona zm ianam i w D N A [ 8 ]
(Ryc. 3).
Znane są punktow e m utacje recesyw ne w genach
SU P35 i URE2, które w y k a zu ją reg ularną segregację
m ejotyczną 2:2. Fenotyp m utacji recesyw nych p rzy­
pom ina fenotypy [PSI] i [URE], gdyż m utacje p o w o ­
dują brak aktywnych białek. M etodam i genetyki k la­
sycznej wykazano, że w chrom oso m alnych m u tan ­
tach sup35 i ure2 cechy [PSI] i [URE] są eliminiwane. Teoria prionów d rożdżow ych stanowi logiczną
interpretację tej obserwacji. Do propagacji cech
[PSI] i [URE] konieczna je st norm aln a forma białek
Sup35 i Ure2, gdyż one stan ow ią „m atrycę” do p ro ­
dukcji prionu. Istnienie norm alnej form y tych białek
110
Ryc. 3. Własności genetyczne prionów drożdżowych. Segregacja mejotyczna.
IV. D om enow a struktura białek, które tw orzą
priony
Białka Ure2 i Sup35 nie w ykazują żadnej w z a je m ­
nej hom ologii sekwencji, jed n ak m ają pewne p o d o ­
bieństwo struktury. W obu przypadkach jest to struk ­
tura dom enow a [10, 11]. Funkcja biologiczna białek
Ure2 i Sup35 jest zdeterm inow ana przez ich C-końcowe domeny. Znacznie krótsze dom eny N -końcow e
p osiadają n iezw yk łą ko m pozycję am inokwasów. W
części N-term inalnej białka Sup35 znajduje się czte­
rokrotne pow tórzony układ dziew ięciu am in o k w a­
sów P Q G G Y Q Y N . Sekwencja ta przypom ina układ
am inokw asów P H G G G W G Q , pięciokrotnie p o w tó ­
rzony w prionie PrP ssaków. Stwierdzono ek spery ­
mentalnie, że sekwencje P Q G G Y Q Y N odpow iadają
za pow staw anie prionu [PSI]. Delecja takich se­
kwencji pow odow ała zm niejszenie ilości g en e ro w a­
nych m utantów [PSI], zaś w prow adzenie do d atk o ­
wych traktów P Q G G Y Q Y N pow odow ało zw ię k sze­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
nie ich indukcji, połączone ze zw iększon ą szyb ko ­
ścią tw orzenia agregatów prionu [12] (Ryc. 4).
6 5 ____________________
1
Ure2:
P
1
Sup35
im
pU
w skutek proteolizy w iększego prekursora [17]. Nie
jest wykluczone, że rów nież pow staw anie włókien
R ep resor
11 4
am yloidow ych prionów bierze początek od m niej­
szych fragm entów białka-matrycy.
S ek w en cje j
pow tó rzo n e ]
PQGGYQYNj
V. H ipotezy pow staw ania prionów
Ryc. 4. Domenowa struktura białek Sup35 i Ure2. Literą P. oznaczono
dom eny odpowiedzialne za powstawanie prionów.
C hociaż w dom enie N -końcow ej białka Ure2 nie
w ystępu ją podobne pow tórzenia, to specyficzny
układ am inokw asów — trakty asparaginy i w ysoka
zaw artość seryny oraz glutam iny — zapew nia p o d o ­
bieństwo struktury drugorzędowej do N -końcow ych
dom en Sup35 i PrP. Struktura ta charakteryzuje się
kom pletnym brakiem m otyw ów typu alfa-helisy i beta-kartki, a w ystępow aniem skrętów [13]. Białko k o ­
dow ane przez gen h et-s nie posiada rejonów b o g a­
tych w glutam inę czy asparaginę [3]. W idocznie m e ­
chanizm pow staw ania prionu [het-s] jest odm ienny
od w ystępującego u drożdży.
D om ena N odpow iada za transm isję struktury
prionów. Dom ena ta przybiera konform ację prionu, a
następnie, oddziałując z dom enam i N kom órkow ych
białek Sup35 i Ure2, w ym usza zm ianę ich k o nfo rm a­
cji. Dełecja fragm entu DNA kodującego dom enę
N -ko ńco w ą nie pow oduje inaktywacji aktywności
biologicznej białek Sup35 i Ure2, lecz elim inuje w y ­
stępowanie fenotypów [PSI] i [URE], N atom iast w
obu przypadkach nadekspresja dom eny N -końcowej
z plazm idu kodującego tylko 5 ’ cześć genu, zw iększa
znacznie, nawet do 1 0 0 0 razy, częstość indukcji prio ­
nów [9,10], A nalogiczna nadekspresja w szczepach,
które posiadają prion działa destrukcyjnie, osła­
biając wzrost takich szczepów [11, 14]. D om eny C
o dpow iadają w zasadzie za funkcję katalityczną
białek Sup35 i Ure2, lecz w skutek określonych m o ­
dyfikacji (np. delecji kilku am inokw asów z C-końca)
m o g ą stym ulow ać indukcję prionu [15, 16]. Z nale­
ziono taki fragm ent w ew nątrz dom eny C białka
U re 2 , który odpow iada za indukcję prionu niezależ­
nie od dom eny N [15].
Wysoka aktyw ność generow ania prionów przez
N -końcow e fragm enty Sup35 i Ure2 sugeruje m ożli­
wość pow staw ania analogicznych, generujących
priony fragm entów w kom órce w skutek proteolizy
POSTĘPY BIOCHEMII 46(2), 2000
przypadku gdy geny SU P 35 i URE2 w ystępują w p o ­
staci kompletnej [15]. W iadom o, że agregaty
P-am yloidu pow stające w chorobie A lzheim era tw o ­
rzy peptyd 40- lub 42-am in okw aso w y powstający
K onw ersję białka Sup35 do formy prionu [PSI]
odtworzono w w arunkach in vitro, a [PSI] efektyw ­
nie inicjuje tego typu przem ian ę [18]. Niezależnie
pokazano, że czyste białka Sup35 i Ure2 m o g ą tw o­
rzyć w roztw orze w łókna, podobne w swojej struktu­
rze do w łókien am yloidow ych [19, 20]. Odkrycie to
w skazuje na istnienie analogii m iędzy prionem i
am yloidem [ 2 1 ].
W literaturze opisano dwie alternatywne hipotezy
pow staw ania prionów. Z godnie z hipotezą heterodim eru sform ułow aną przez P r u s i n e r a [22] infek­
cyjne białko P rpSc m oże istnieć jak o m onom er i jako
taki wiązać się z P rpc . Przem iana Prpc w prion jest
katalizow ana poprzez utw orzony heterodimer. N a ­
stępnie odbyw a się dysocjacja dwóch cząsteczek
P rpSc, które inicjują kolejny cykl. M odel P r u s i n e ­
r a zakłada, że agregacja P rpSc je s t procesem w tó r­
nym.
Druga hipoteza zakłada, że w łókna am yloidowe
prionu są regularnym i polim eram i, które służą jako
„zarodki” przyszłej polim eryzacji [23]. Szybkość
konwersji jest lim itowana pow staw aniem takich „za­
ro dk ów ” , a dodanie polim erów powstałych w c ze­
śniej znacznie przyspiesza proces. Zm iana konfor­
macji cząsteczki białka zachodzi bądź spontanicznie,
bądź jest w ym uszana w m om encie włączania do p o ­
limeru.
Choć obecnie trudno rozstrzygnąć, która z hipotez
jest prawdziwa, należy zaznaczyć, że dane dośw iad­
czalne potw ierdzają raczej hipotezę polimeryzacji.
Frakcje „zaro dkó w ” prionów Prp czy też Sup35, k tó­
re przyspieszają konw ersję czystego białka w prion,
identyfikowano w formie agregatów, a nigdy jako
cząsteczki m onom erów. H ipotezę polimeryzacji
tłumaczy rów nież ob serw ow ane doświadczalnie
zróżnicowanie prionów. A nalogicznie jak odmienne
jednostki chorobowe w iążą się z różnymi konform a­
cjami prionu PrP [24], tak różne formy [PSI] po w o ­
dują zróżnicowane fenotypy supresji w szczepach
drożdży [25]. Trudno sobie wyobrazić, że cząsteczka
m onom eru może przybierać różne trwałe formy kon-
http://rcin.org.pl
111
formacyjne, m ożna natom iast założyć, że takie for­
my są stabilizowane w polimerze. M ożliwość p o ­
wstawania różnego typu polim erów Sup35 pokazano
także w systemie in vitro [23].
Poparcie dla rewolucyjnej hipotezy prionów drożdżowych stanowi odkrycie, że k luczow ą rolę w
dziedziczeniu [PSI] pełni białko opiekuńcze
H s p l0 4 . Okazało się, że nadprodukcja białka
H S p l0 4 w kom órce pow oduje inaktyw ację fenotypu
[PSI] [26]. Jedy ną z n an ą fun kcją ko m ó rk o w ą białka
H s p l0 4 jest reaktyw ow anie struktur białkowych
zm ienionych w skutek stresu [27], a więc w pływ tego
białka na dziedziczenie [PSI] stanowi dodatkow y ar­
gum ent przem aw iający za tym, że przekazyw anie in­
formacji genetycznej m oże opierać się na transmisji
konformacji białka.
Paradoksalnie, rów nież H s p l 0 4 jest niezbędne do
indukcji prionu, gdyż m utanty [PSI] nie po w stają w
szczepie z nieaktyw nym genem H SP 104 w chrom o ­
somie [26]. A więc stabilna konform acja prionu w y ­
maga określonego poziom u białka H s p l0 4 ; gdy tego
białka jest w kom órce zbyt mało, lub też za dużo nie obserwuje się fenotypu [PSI]. W badaniach in vi­
tro z udziałem oczyszczonych białek w roztworze
wykazano, że H s p l0 4 oddziałuje bezpośrednio z
Sup35 i przyspiesza jeg o przem ianę w prion [28].
Według hipotezy sform ułow anej przez L i n d q u i s t rola H s p l0 4 polegałaby na nadaniu Sup35 takiej
konformacji przejściowej, która um ożliw iłaby jego
oddziaływanie z „z arod kiem ” prionu. W nieob ecno­
ści H s p l0 4 taka konform acja nie byłaby możliwa,
zaś w jeg o nadm iarze - skupiska Sup35 za bardzo
rozproszone, aby utw orzyć agregaty [26] (Ryc. 5).
K u s h n i r o v i T e r - A v a n e s y a n proponują
inne
w ytłum aczenie
podkreślając
aktywność
H s p l0 4 we fragm entacji agregatów prionu [21].
nych, co zachodzi pod w arunkiem rozbicia włókien
agregatów na m niejsze cząsteczki. Taka fragmentacja generuje nowe końce włókien i stymuluje dalszą
polimeryzację. W nieobecności H s p l0 4 prion p o ­
wstaje, ale, jak o zbyt duży agregat, nie jest przekazy­
wany do komórki potomnej. W nadm iarze H s p l0 4
agregaty ulegają rozbiciu, co obserwuje się jako in­
aktywację fenotypu [PSI],
Istnieją tylko pew ne przesłanki na temat roli
białek opiekuńczych w kontroli struktury prionu PrP
u ssaków. W iadom o, że do pow stania prionu PrPSc
konieczne je s t białko Prpc , ale bynajmniej nie jest
powiedziane, że jest to elem ent wystarczający.
Według K u s h n i r o v a i T e r - A v a n e s y a n a
różny stopień fragm entacji agregatów PrP decyduje
o różnych w łasnościach prionów PrP stanowiących o
syndrom ach różnych chorób u człow ieka [2 1 ],
W eksperym entach in vitro stwierdzono specy­
ficzne oddziaływanie H s p l0 4 z białkami Sup35, Prp
a także z P-am yloidem [28]. Stwierdzono także, że
Hsp 104 ułatwia konw ersję PrP do prionu. Wynik ten
potwierdza sugestie udziału chaperonów w p o w sta­
waniu prionów i am yloidów u człowieka. Być może
sterowanie ilością białek opiekuńczych m ogłoby sta­
nowić zasadę m echanizm u terapeutycznego w p rz y ­
padku chorób określanych jak o pasażowalne amyloidozy mózgowe.
VI. B adania bioch em iczn e i obserw acje m i­
kroskopow e prionów
Kolejnym poparciem teorii prionów u niższych
eukariontów są wyniki badań biochem icznych i m i­
kroskopowych. Podobnie ja k prion ssaczy P rP Sc w y ­
kazuje zw ięk szo ną oporność na dzałanie proteazy w
porów naniu z białkiem ko m ó rkow ym PrPc , białko
Sup35 ze szczepu [PSI] je s t oporniejsze na trawienie
p ro te a z ą n iz białko Sup35 ze szczepu konrolnego [5,
29]. N iezależnie stwierdzono, że białko Ure2 w y k a ­
zuje zw iększoną oporność na działanie proteazy w
szczepach [URE] [10]. A nalogicznie różnice o b ser­
wowano dla produktu genu het-s u Podosporci, który
Ryc. 5. Rola H spl04 w dziedziczeniu [PSI], Model S. L i n d q u i s t .
Według tych autorów H s p l0 4 nie je st niezbędne do
pow staw ania prionu, lecz jeg o rola polega na um ożli­
wieniu przekazyw ania prionów do k om órek potom112
był oporniejszy na działanie proteaz w ekstraktach
szczepu [het-s] w p orów naniu do [het-s*] [3].
W m utantach [PSI] i [URE] obserw ow ano o d p o ­
wiednio frakcje białek Sup35 i Ure2 w postaci wysokocząsteczkow ych agregatów. Stwierdzono także, że
lizat z kom órek [PSI] indukuje agregację Sup35 w
szczepach kontrolnych [18, 29, 30],
K onw ersję białka Sup35 do formy prionu m ożna
obserw ow ać bezpośrednio w kom órkach pod m ik ro ­
skopem. W tym celu skonstruow ano fuzję frag m en ­
tów DNA kodujących N -term in alną dom enę Sup35 i
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
GFP, białko fluoryzujące na zielono. Po w p ro w ad ze­
niu fuzji do szczepu kontrolnego obserw ow ano w
m ikroskopie fluorescencyjnym rozproszenie zabar­
wienia w obrębie komórki. N atom iast w szczepie
[PSI] obserw ow ano świecące skupiska białka fuzyjnego. W ystępow anie takich agregatów było p o w ta­
rzalne i obraz dziedziczył się w kom órkach p o to m ­
nych [29]. A nalogiczne obserw acje u dok u m en to w a­
no dla fuzji U re2-G F P [30].
twem z innymi organizm am i. Cenne okazać się m og ą
m echanizm y pozw alające na przetrwanie w określo­
nych niszach ekologicznych, m echanizm y p ole­
gające na uruchom ieniu ekspresji szczególnych g e­
nów. Udział prionu [PSI] w tego rodzaju m echani­
zm ach je s t w ysoce praw dopodobny, tym bardziej, że
prion ten jest kontrolow any przez białko H s p l0 4 ,
które pom aga kom órce w obronie przed stresami
w yw ołanym i w arunkam i środow iska naturalnego
[31].
VII. Fizjologiczna rola p rion ów u niższych
eukariontów
N a zakończenie pytanie o funkcję fizjologiczną
prionów u niższych eukariontów. Rola fizjologiczna
[PSI] i [URE] nie je s t jasna. Badano szczegółowo
wpływ tw orzenia prionu [URE] na regulację k atabo ­
lizmu zw iązków azotu i stw ierdzono brak zależności
m iędzy tymi procesam i. W świetle ostatnio o trzym a­
nych w yników nie m ożna je d n a k w ykluczyć, że m u ­
tacje w dom enie C, uniem ożliw iając oddziaływanie
białka Ure2 z czynnikiem transkrypcyjnym Gln3,
zw iększają indukcję prionu [URE], D om ena C
pełniąc po d staw o w ą funkcję jak o represor Gln3, sta­
bilizuje także do m enę N, a w spom niane m utacje inaktywują obie funkcje dom eny C [15]. Istnieje tu
analogia z dom inującym i m utacjam i w genie k o ­
dującym PrP u człow ieka [24]. Tego typu mutacje
pow odują pow stanie prionu, praw do po dob nie p o ­
przez elim inację oddziaływ ań stabilizujących, które
zostają zastąpione oddziaływ aniam i prowadzącym i
do lawinowej agregacji. Rola w zajem nych o d ­
działywań dom en Ure2 w regulacji m etabolizm u
związków azotu w ym aga dalszych badań.
Analiza [PSI] w skazuje na udział prionów w adap ­
tacji do w arunków środow iska u drożdży. Dom ena
N -końcowa białka Sup35 nie ma znaczenia dla jego
funkcji fizjologicznej, a jed n ak je s t konserw ow ana w
ewolucji. W skazuje to na rolę bio log iczn ą w a ru n k o ­
wanego przez tę d om enę prionu. Być m oże rola [PSI]
polega na zapew nieniu pew nego naturalnego p ozio ­
mu supresji kodonów nonsens. K om p lek sow a anali­
za sekwencji genom u drożdży pozw oliła na identyfi­
kację kilku nieznanych, długich ramek odczytu za­
wierających w ew nątrz pojedynczy kodon stop. Jed ­
nym z takich genów je s t F L 0 8 , w ym ag any do w z ro ­
stu w w arunkach niedoboru zw iązków azotu. Rola
prionu [PSI] m ogłaby polegać na kontroli supresji
kodonu stop w takich szczególnych w arunkach śro­
dowiska (Ryc. 6 ).
W naturalnym otoczeniu kom ó rka drożdży musi
borykać się z niekorzystnym i zm ianam i temperatury,
brakiem dostępu do pożyw ienia, w sp ółzaw odn ic­
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Ryc. 6. Hipotetyczna rola [PSI] w ekspresji genów posiadających w
swojej sekwencji kodon stop. Miejsce mutacji nonsens w
przykładowym genie F L 0 8 Saccharomyces cerevisiae ozna­
czono gwiazdką.
Spośród poznanych dotychczas prionów, jedynie
prion [het-s] pełni określoną rolę w komórce. Bierze
on aktywny udział w tw orzeniu bariery, która u nie­
możliwia krzyżow anie odm iennych grzybni Podospora. Sens fizjologiczny takiej bariery polega p raw ­
dopodobnie na uniem ożliw ieniu rozprzestrzeniania
się wirusów. Zakłada się, że te same szczepy Podospora p rzen oszą te same wirusy, podczas gdy fuzje z
odm iennym i grzybniam i niosą praw dopodobieństw o
infekcji odm iennym i wirusami.
Istnienie prionów u grzybów nitkowatych wydaje
się być bardziej powszechne. G rzybnia Podospora
a n serin a , podobnie ja k innych grzybów nitkow a­
tych, składa się ze strzępków zw anych sepiami. P o je­
dyncze komórki w ew nątrz septum oddzielone są po­
rowatą bło n ą um o żliw iającą przepływ cytoplazmy. Z
tego pow odu rola czynników cytoplazm atycznych
m oże być u tych grzybów znacząca. Ostatnio opisano
u P odospora anserina cytoplazm atyczny czynnik C
odpow iedzialny za specyficzny proces degeneracji
grzybni w fazie stacjonarnej [32], Propagacja czyn ­
nika C zależy od wierności translacji cytoplazmatycznej. Czynnik C dziedziczy się niezgodnie z p ra­
wami Mendla, istnieje praw dopodobieństw o, że jest
http://rcin.org.pl
113
to kolejny prion o konkretnej funkcji fizjologicznej
w procesie starzenia.
Nie w iadom o ja k szeroko w przyrodzie występuje
zjawisko przenoszenia dziedzicznej informacji przez
priony. Być m oże priony p ośre dn ic zą w procesach
rozwoju i różnicow ania u o rganizm ów wyższych,
lecz nie m a na to konkretnych danych.
Artykuł otrzymano 10 listopada 1999 r.
Zaakceptowano do druku 3 lutego 2000 r.
Piśm iennictw o
1. C o h e n F E , P a n K M , H u a n g Z, B a l d w i n M . , F l e t t e r i c k RJ , P r u s i n e r S B (1994) Science 264: 530-531
2. W i c k e r R B (1994) Science 264: 530-531
3. C o u s t o u V, D e l e u C, S a u p e S, B e g u e r e t J (1997)
Proc Natl A cad Sci USA 94: 9773-9778
4. C o x B S (1965) Heredity 20: 505-521
5. P a u s h k i n
SV,
Kushnirov
V,
Smirnov
VN,
T e r - A v a n e s y a n M (1996) EM BO 15:3127-3134
6. L a c r o u t e F (1971) J B a c te rio l 106: 519-522
7. R i z e t G (1952) Rev Cytol B iol Weg 13:51-92
8. W i c k n e r R B , E d s k e s H K , M e d d e l e i n M L , T a y l o r
K, M o r i y a m a H (1999) J B iol Chem 274: 555-558
9. T e r - A v a n e s y a n M . , D a g k e s m a n s k a y a A R , K u s h ­
n i r o v V, S m i r n o v V N (1994) Genetics 137:671-676
10. M a i s s o n D N , W i c k n e r R B (1995) Science 270: 93-95
11. T e r - A v a n e s y a n M . , , K u s h n i r o v V, D a g k e s m a n ­
s k a y a A R , D i d i c h e n k o S . A . , C h e r n o f f Y O , Ing e - V e c h t o m o v S G , S m i r n o v V N (1993) M ol M icrobiol
7: 683-692
12. L i n d q u i s t S, L i u JJ (1999) Nature 400: 573-576
114
13. T u i t e M F (1994) Nature 370: 327-328
14. M a i s s o n D C , M a d d e l e i n M L , W i c k n e r R B (1997)
Proc Natl Acad Sci USA 94:12503-12508
15. M a d d e l e i n M L , W i c k n e r R B (1999) M ol Cell Biol 19:
4516-4524
16. K o c h n e v a - P e r v u k h o v a N V , P o z n y a k o v s k i A I ,
S m i r n o v V N , T e r - A v a n e s y a n M (1998) Curr Genet 34:
146-151
17. K i s i l e v s k y R, F r a s e r P E (1997) Crit Rev Biochem Mol
Biol 32: 361-404
18. P a u s h k i n S V , K u s h n i r o v V V , S m i r n o v V N ,
T e r - A v a n e s y a n M D (1997) Science 211: 381-383
19. G l o v e r J R , K o w a l A S , S c h r i m e r E C , P a t i n o M M ,
L i u J J , L i n d q u i s t S (1997) Cell 88: 811-819
20. T h u a l C, K o m a r A A , B o u s s e t L, F e r n a n d e z - B e l 1 o t E, C u l l i n C, M e l k i R (1999) J Biol Chem 274:
13666-13674
2 1 . K u s h n i r o v V V , T e r - A v a n e s y a n M D (1998) Cell 94:
13-16
22. P r u s i n e r S B (1991) Science 252: 1515-1522
2 3 . J a r r e t J T , L a n s b u r y P T (1993) Cell 73: 1055-1058
24. G o g i e 1 T (1998) Biotechnologia 42: 36-98
2 5 . D e r k a t c h I L, C h e r n o f f Y O , K u s h n i r o v V V , I ng e - V e c h t o m o v S G , L i e b m a n S W (1996) Genetics 144:
1375-1386
26. C h e r n o f f Y , L i n d q u i s t S, O n o B , I n g e - V e c h t o m o v S G , L i e b m a n S W (1995) Science 268: 880-884
27. P a r s e 11 D A , K o w a l A S , S i n g e r M A , L i n d q u i s t S
(1994) Nature 372:475-477
28. S c h r i m e r E C , L i n d q u i s t S (1997) Proc N atl A cad Sci USA
94: 13932-13937
29. P a t i n o M M , L i u J J , G l o v e r J R , L i n d q u i s t S (1996)
Science 273: 622-628
30. E d s k e s H K , G r a y V T , W i c k n e r R B (1999) Proc Natl
A cad Sci USA 96:1498-15003
31. L i d q u i s t S (1997) Cell 89: 495-498
32. S i 1a r P . , H a e d e n s V , R o s s i g n o l M . , L a l u c q u e H
(1999) Genetics 151:87-95
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 20 00
Heterodimeryczne receptory jądrowe. I. Receptory
witamin i hormonów
Heterodimeric nuclear
hormone receptors
receptors.
I. Vitamin
and
DANUTA KWIATKOWSKA1, JANINA KWIATKÓWSKA-KORCZAK2
Spis treści:
Contents:
I.
II.
III.
IV.
Wstęp
RXR — stały partner w heterodimerach
Asocjacja heterodimerów z DNA
Receptory witamin i hormonów
IV-1.Receptory kwasu retinowego
IV-2. Receptor witaminy D
IV-3. Receptory hormonów tarczycy
V. Uwagi końcowe
I.
II.
III.
IV.
Wykaz stosowanych skrótów: ATRA — kwas a ll-tr a n s - retinowy; CAR — konstytutywny receptor androstanu; CYP — cytochrom P450; DBD — domena receptora wiążąca DNA, domena
C; DR —- proste powtórzenie oligonukleotydu w HRE; EcR —
receptor 20-hydroksyekdyzonu; ER — odwinięte powtórzenie
w HRE; FXR — receptor famezoidów X; HETE — hydroksy­
lowe pochodne kwasu eikozatetraenowego; HRE — element
odpowiedzi hormonalnej, region DNA wiążący receptor; LBD
— domena receptora wiążąca ligand , domena E; LXR — recep­
tor wątrobowy X; PPAR — receptor aktywowany przez czynni­
ki proliferacji peroksysomów; PTH — parathonnon; PTHrP —
peptyd pokrewny PTH (P arathyroid horm one-related peptide)',
PXR — receptor pregnanu X; RA — kwas retinowy; RAR —
receptor kwasu retinowego; RXR — receptor kwasu 9-m -retinowego; T3— trójjodotyronina; TR — receptor hormonów tar­
czycy; TRE — element rozpoznania receptora hormonów tar­
czycy w DNA; Usp — produkt genu ultraspiracle; VD — wita­
mina D3; VDR — receptor witaminy D3; VDRE — element
rozpoznania receptora VD w DNA.
przez ligandy. Cechuje je w ysoka hom ologia struktu­
ralna, obecność dom en o jednakow ej funkcji oraz
zdolność w iązania się ze sw oistym regionem DNA,
zw anym elem entem odpowiedzi horm onalnej, HRE
{horm one responsive elem ent), lub elem entem do ce­
lowym, TE {target elem ent). Region HRE w iększo­
ści znanych receptorów jąd ro w y ch (za wyjątkiem
pew nych receptorów sierocych, działających jako
V.
I. W stęp
Jądrowe receptory steroidów, retinoidów i innych
hydrofobowych substancji są zaliczane do nadrodziny czynników transkrypcyjnych aktyw ow anych
‘Dr hab., :prof. dr hab., Zakład Biochemii Lekarskiej AM,
ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Introduction
RXR — common partner in heterodimers
Heterodimer-DNA association
Vitamin and hormone receptors
IV-1. Retinoic acid receptors
IV-2. Vitamin D receptor
IV-3. Thyroid hormone receptors
Final remarks
m onom ery) składa się z dwu półmiejsc. Półm iejscem
nazwano sekw encję nukleotydów , wiążących się z
m onom erem receptora. Zajęcie obu półmiejsc jest
koniecznym
w arunkiem
aktywności,
dlatego
wyłącznie dim er receptora spełnia sw ą funkcję b io ­
logiczną. R eceptory zw iązane z HRE ujaw niają zd ol­
ność transaktywacji, tzn. aktywacji lub represji tran­
skrypcji docelow ych genów poprzez asocjację z p od­
stawowym i czynnikam i transkrypcyjnym i, lub ich
koaktywatoram i.
Pierwsze odkryte u ssaków czynniki transkrypcyjne należące do tej nadrodziny, receptory horm onów
steroidowych, są aktywne jak o homodimery. W krót­
ce jednak odkryto receptory kw asu retinowego (RA),
występujące w postaci dwu form: RAR (receptor
kwasu retinowego, retinoic acid receptor) i R XR (re­
ceptor kwasu 9 -cis retinowego, retinoid X receptor)
[ 1]. W ślad za tym w ykazano, że receptor horm onów
tarczycy (TR), zw iązany z RXR ma daleko wyższe
http://rcin.org.pl
115
pow inow actw o do swoistego elem entu rozpoznan ia
w DNA niż hom odim er. R eceptor w itam in y D 3,
V D R (vitam in D 3 rec ep to r) oraz receptor a k ty w o w a ­
ny przez czynniki proliferacji p eroksyso m ó w , P PA R
(p eroxisom e p ro life ra to r-a c tiv a te d rec ep to r) a k ty ­
polipeptydow ego. W LBD mieści się kilka regionów
heterodimeryzacji, nie całkow icie pokrywających
w ują ekspresję genów w yłącznie jak o d im ery z R X R
[2]. W krótce zaczęły też napływ ać inform acje o
obecności licznych hom o log icznych b iałek j ą d r o ­
się z m odułem hom odim eryzacji [7], Transaktywacyjny region AF-2 m oże działać autonomicznie, z a ­
zwyczaj jed nak funkcjonuje synergicznie z dom ena­
wych, w ystępujących w k om órkach ssaków, z d o l­
nych do dim eryzacji z R X R i asocjacji z D N A . U z n a ­
mi A i B. Jak się wydaje, współdziałanie to ma
w pływ na stopień i intensywność aktywacji prom oto­
rów genów docelow ych [ 8 ].
no je za potencjalne receptory i określono m ianem
„receptorów sierocych” . Z czasem udało się ustalić
ligandy niektórych z nich [3].
Okazuje się, że nie tylko u ssaków, ale rów n ież u
owadów w ystępują czynniki transkrypcyjne, zależne
od liganda i tworzące heterodimery. U D ro so p h ila
receptor steroidowego horm onu ekdyzonu je s t a k ­
tywny w połączeniu z analogiem RXR, białkiem
Usp. M ożna więc sądzić, że zjaw isko h etero dim ery zacji pojawiło sie w rozw oju filo gen ety czn ym przed
rozdzieleniem się b ez kręg ow có w i kręgow ców [4].
nych receptorów je st znacznie wyższe. Powierzchnię
hom odim eryzacji w LBD tw o rzą dwie helisy i pętla.
Stabilizują j ą dwa hydrofobow e odcinki łańcucha
Trzy odrębne geny k odu ją główne formy RXR.
R X R a jest zbudow any z 467 reszt am inokw aso­
wych, RXRP — z 410, a RXR% — z 463 reszt. Formy
te są w zajem nie h om ologiczne w obrębie domen
LBD w 8 8 %, DBD — w 93%.
D odatkow e podtypy RXR, występujące w róż­
nych tkankach i na różnych etapach rozwoju osobni­
czego p ow stają drog ą alternatyw nego składania [ 6 ,
8].
III. A socjacja h eterodim erów z DNA
II. R X R — stały p artn er w h eterod im erach
R XR wykazuje cechy strukturalne, w łaściw e
wszystkim przedstaw icielom nadrodziny recepto rów
jądrow ych. Szczególnie w ysoka h om ologia łączy go
z rodziną, w skład której w c h o d zą recepto ry k w asu
retinowego, horm onów tarczycy, w itam in y D 3, k w a ­
sów tłuszczowych i pochodnych cholesterolu.
W cząsteczce R X R w yróżnia się w szystkie dom eny,
charakterystyczne dla całej nadrodziny. P o łożona na
C-końcu w ielofunkcyjna d om ena E albo LBD (li­
g a n d bin d in g dom ain) uczestniczy w w iązaniu lig an ­
da i dimeryzacji, a jej C -term inalny region, AF-2, ta ­
kże w transaktywacji. W ysoce kon serw aty w n a d o ­
mena C albo DBD (DN A bin d in g dom ain) z b u d o w a ­
na z 6 6 reszt am inokw asow ych, zaw ierająca dw a
multicysteinow e palce cynkow e, rozpoznaje i w iąże
region HRE w DNA. N -koń co w e dom eny A i B b io rą
udział w transaktywacji.
RXR łączy się z w yłącznie je d n y m izom erem
kwasu retinowego, 9-cA-RA, podczas gdy Ugandami
RAR m og ą być w szystkie izom ery RA, za rów n o n a ­
turalne, jak i ich syntetyczne analogi [5, 6 ].
Struktura m iejsca w iążącego ligand w cząsteczce
R XR została określona krystalograficznie. S k ła d ają
się nań dwie antyrów nolegle, a-h e lik a ln e „k a n a p k i” ,
ułożone w postaci dim eryczny ch jed no stek . Sposób
ułożenia kieszonki sugeruje, że ligand m oże w niej
oddziaływać z w szystkim i m o dułam i LB D , łącznie z
AF-2. R X R tworzy zarów no h o m o - j a k i h e te ro d im e ­
ry, ale jego pow inow actw o w zględem heterologicz116
Sekwencja nukleotydów, rozpoznaw ana przez
m onom er i stanowiąca m iejsce jego wiązania jest
identyczna w przypadku w szystkich znanych hetero­
dim erów w ystępujących u ssaków. Stanowi j ą heksanukleotyd A G G T C A . Oba półm iejsca są przew a­
żnie ułożone jak o proste pow tórzenie, DR (direct re­
p e a t, -> n ->). Są one oddzielone od siebie o jed en do
pięciu nukleotydów, co określa się jako reguła 1-5.
Zdarzają się też ułożenia typu odwróconego, palindrom ow ego powtórzenia, IR (inverted repeat,
—» n <—), również zgodne z regułą 1-5. Odstępstwem
od tej reguły okazały się HRE typu odwiniętego p o ­
wtórzenia, ER (everted repeat, <— n —>). R eceptor
horm onów tarczycy wiąże się z E R - 6 . Receptory RA
i witam iny D, m o g ą wiązać się z E R - 8 , ale o bserw o­
wano to jedy nie w sztucznych układach in vitro i nie
w iadom o, czy taki układ istnieje w komórkach.
Liczba nukleotydów oddzielających półm iejsca
determ inuje rodzaj heterodim eru w iązanego przez
HRE. W Tabeli 1 przedstaw iono typy HRE oraz li­
gandy receptorów tw orzących dimery. Tak np. dimer
R A R /R X R wiąże się z HRE typu DR-5 i DR-2,
V D R /R X R — DR-3, T R /R X R — DR-4. RXR za jm u ­
je półm iejsce w 5 ’-odcinku DNA , zaś jego p a r t n e r —
w odcinku 3 ’. Jedynym w yjątkiem okazał się dim er
R A R /R X R , który wiąże się z nietypow ym dlań HRE
typu DR-1 w odwrotnej kolejności. Taki układ działa
w wielu kom órkach jak o silny represor transaktywacyjnej funkcji h om odim eru R X R [9].
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Przy ułożeniu typu D R oba m onom ery znajdują
się po tej samej stronie helisy DNA , zajm ując przy­
ległe głębokie rowki. D odatkow a a-helisa , znaj­
dująca się w C-końcow ej w ypustce LBD cząsteczki
R XR um ożliw ia jej oddziaływ anie także z płytkim
rowkiem DNA, co rozszerza p ow ierzchnię kontaktu
poza HRE.
Zastanaw iający w ydaw ał się fakt, że tak wiele
różnych receptorów wiąże się z tym sam ym p artne­
rem, a każdy heterodim er rozpoznaje swoisty HRE w
zależności od niewielkiej przecież różnicy liczby nu-
ra ty w n ość i w zm acnia w iązania powstające między
D B D obu m onom erów a półm iejscam i HRE [10].
P rzyjęto dw ustopniow y m odel w iązania receptora
z D N A po zw iązaniu ligandów. Zakłada on, że naj­
pierw łącz ą się odpow iednie m otyw y LBD obu m o ­
n o m eró w i tworzy się rozpuszczalny dimer. N a stę p­
nie D B D cząsteczki R X R wiąże się z 5 ’-półmiejscem HRE, co udostępnia półm iejsce 3 ’ partnerowi.
Po połączeniu dom en E z HRE, także dom eny C obu
m o n o m eró w asocjują ze sobą. W zależności od ro ­
dzaju partnera oraz lokalizacji tkankowej, RXR
Tabela 1
Przykłady receptorów, tworzących dimery z RXR
Ligand
Konfiguracja HRE
Receptor
RXR
DR-1, IR-0
kwas 9-cis-retinowy
PPAR
DR-1
kwasy tłuszczowe, HETE, PGJ, fibraty, rezulina
RAR
DR-2, DR-5, IR-0
kwas retinowy
RAR*
DR-1
kwas retinowy
VDR
DR-3
1,25-dihydroksykalcyferol
TR
DR-4
hormony tarczycy
LXR
D RA
oksosterole
FXR
deoksycholany, fam ezoidy u myszy
PXR
IR -1
?
CAR**
DR-5
hamowany przez androstanol
NGFIB**
DR-5
COUP**
DR-0
ksenobiotyki, endogenne steroidy
* — hamuje transkrypcją, ** — aktyw uje transkrypcją w nieobecności liganda; HRE — elem ent odpow iedzi horm onalnej w DNA; DR —
proste pow tórzenie; IR — odw rócone (palindrom ow c) pow tórzenie
kleotydów oddzielających półmiejsca. K rystalogra­
ficzne badania dim eru T R /R X R przyczyniły się do
zrozumienia tego zjawiska. Tworząc m odele o
zmiennej długości łącznika w ykazano, że zm iana o
jeden nukleotyd pow oduje obrót m onom eru partnera
o 36° wokół płytkiego rowka DNA, co w ym usza
zm ianę położenia RXR i udostępnienie od pow ied ­
niej powierzchni heterodim eryzacji w jeg o dom enie
E. Jak się wydaje, każdy z receptorów jąd ro w y ch ma
tylko jeden m otyw dim eryzacji, zaś RXR — kom plet
motywów, swoistych dla każdego partnera. Badania
te wykazały także, że m otywy dim eryzacji w ystępują
nie tylko w LBD, ale i w DBD. Inaczej niż w sy m e­
trycznych HRE horm onów steroidowych, ułożenie
m onom erów na DR w ym usza w zajem ne interakcje
odm iennych miejsc dom en DBD w R XR i jego part­
nerze. Reszty am inokw asow e drugiego palca cynk o­
wego RXR reagują z pierw szym palcem cynkow ym
partnera dimeru. Utworzenie innego dimeru, niż jest
to zaprogram ow ane w danym HRE stanow iłoby sfe­
ryczna przeszkodę asocjacji DBD z DNA. Interakcja
HRE z w łaściw ym heterodim erem um ożliw ia koopePOSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
m oże pełnić rolę biernego czynnika „naprow a­
d za ją c e g o ” w łaściw y receptor , bądź też wykazywać
zdolność transaktyw acyjną, w łaściw ą dla swego li­
ganda. W dimerach T R /R X R i V D R /R X R aktywność
9-c/s-R A jest tłumiona, natom iast w PPAR/RXR i
F X R /R X R oba m onom ery zacho w u ją zdolność akty­
wacji transkrypcji odpow iednich genów [3, 11].
IV.
R eceptory w itam in i horm onów
IV -1. Receptory kwasu retinowego
R eceptor kwasu retinowego (RAR) wiąże się ze
w szystkim i izom eram i kwasu retinowego jak ATRA,
9 -c is -R A i 13-cA-RA. W obrębie tej grupy stw ier­
dzono obecność trzech izoform RAR, oznaczanych
od pow iednio jak o a , P i y. Izoform y różnią się sw o ­
imi w łaściw ościam i, a ich profil może się zmieniać w
zależności od okresu rozwoju płodowego [5, 12].
W swojej budow ie RAR jest bardzo zbliżony do
R X R i z wyjątkiem dom en A / B oraz obszaru AF-2
w yk azu je znaczną z nim hom ologię. Domeny A i B
http://rcin.org.pl
117
są odpowiedzialne za aktyw ność transaktyw acyjną,
niezależną od liganda. D om ena C zawiera m otywy
charakterystyczne dla białek w iążących DNA, tzw.
palce cynkowe. M iejsce w iązania RA znajduje się w
dom enie E (LBD), gdzie stw ierdzono osobne centra
dla poszczególnych ligandów. D om ena E uczestni­
czy ponadto w dim eryzacji receptorów , ja k również
poprzez specyficzny region A F-2 m a zdolność o d ­
działywania z białkam i aparatu transkrypcyjnego i
dzięki temu m oże regulow ać ekspresję odp ow ied­
nich genów [13].
Stwierdzono, że R A R nie tw orzy hom odim erów i
jedynie heterodim er R A R /R X R w ykazuje akty w ­
ność biologiczną. E lem ent odpow iedzi na RA składa
się z dwóch heksanukleotydów (A G G T C A ) oddzie­
lonych od siebie pięciom a nukleotydam i (DR-5).
Kwas retinowy poprzez swój receptor je s t regula­
torem wielu w ażnych przem ian zarów no w życiu
pre- i postnatalnym . R eguluje ekspresję genów hox
uczestnicząc w tworzeniu architektury ciała i w p ły ­
wając na odpow iednie ułożenie k om órek wzdłuż
przednio-tylnej osi ciała . N iedo bór RA, ale również
i jego nadm iar są p rzy czy n ą p ow ażnych n iepra­
widłowości rozwoju płodu [14, 15, 16].
Stwierdzono, ze kwas retinow y w yw iera istotną
rolę m iędzy innymi w proliferacji i różnicow aniu k o ­
mórek nerw ow ych [17], k eratynocytów [18, 19], k o ­
mórek nabłonka oskrzeli [20]. Jest niezbędny w p ro ­
cesach widzenia, w pływ a na rozwój fotoreceptorów
oraz na procesy kształtow ania siatkówki, soczewki i
rogówki [ 2 1 ].
Kwas retinowy m oduluje działanie wielu h o rm o ­
nów w pływając zarówno na syntezę, w ydzielanie jak
i ekspresję genu ich receptorów. RA stym uluje eks­
presję genu receptorów adrenaliny, insulino-podobnego czynnika wzrostu (IGF), D2 dopam iny [22, 23,
24, 25], obniża syntezę receptora neuropeptydu Y
[26]. Pod kontrolą RA je s t synteza niektórych interleukin (IL-2, IL-4-, IL-4 ) [ 27, 28, 29].
RA w pływ a na syntezę w ielu enzymów, między
innymi acylotransferazy lizofosfatyd-retinol [30],
transferazy glutationowej [31], glukokinazy [32],
karboksykinazy PEP [33], syntazy k w asów tłu szczo­
wych [34].
Ze względu na swoje działanie prow adzące do za­
ham ow ania procesów w zrostu i podziałów k o m ó rk o­
wych, stym ulację p rocesów różnicow ania ja k ró w ­
nież przypisyw aną mu ostatnio zdolność u ru ch am ia­
nia sygnałów p row adzących do apoptozy, RA jest od
szeregu lat przedm iotem szczególnego zaintereso­
wania w terapii now otw orow ej. B adania wykazały,
że w niektórych typach n ow otw orów dochodzi do
obniżenia lub zah am ow ania ekspresji genu R A R [3
118
[35- 37]. W licznych eksperym entach na kom órkach
pochodzących zarówno z linii praw idło w ych jak i
now otw orow ych stwierdzono, że w obecności RA
dochodzi do zatrzym ania cyklu ko m ó rkow eg o w fa­
zie G l , obniżenia ekspresji cyklin D l , E [25], a w
niektórych kom órkach obserwuje się zw iększenie
aktywności transglutam inazy oraz endonukleaz [38].
Wydaje się że RA m oże rów nież w yw ierać h a­
m ujący w pływ na progresję nowotworów . U żywając
selektywnie działających agonistów receptorów retinoidów, wykazano, że praw d opo dob nie dimer
R A R /R X R ham uje ekspresję genów niektórych proteinaz jak strom ielizyny i kolagenazy, zw iązanych z
pow staw aniem przerzutów [39].
M im o wielu doniesień m olekularny m echanizm
ewentualnego antynow otw orow ego działania RA nie
został jedn ak jeszc ze w pełni wyjaśniony, a wyniki
nie zawsze całkowicie zgodne. Od szeregu lat RA
stosowano w leczeniu białaczek prom ieloblastycznych. P raw dopodobnie je d n a k droga do szerokiego
zastosow ania RA w antynow otw orow ej terapii kli­
nicznej je s t jeszcze daleka.
IV-2. Receptor w itam iny D.
A ktyw na forma w itam iny D 3 [1,25-dihydroksykalcyferol] ujawnia sw oją aktyw ność bio log iczną
dzięki obecności w ew n ątrzk om órk ow eg o receptora
(VDR). W itam ina D 3 (VD) łączy się z receptorem ,
tworząc kom pleks V D /V D R , który po przyłączeniu
RXR rozpoznaje charakterysty czną sekw encję
(VDRE, elem ent rozpoznania VD), znajdującą się
zw ykle przy 5' końcu prom otorow ego regionu genu
docelow ego. Składa się ona z dwóch h ek sa n u k le o ty ­
dów o sekwencji A G G T C A oddzielonych od siebie
trzem a nukleotydam i (Dr-3). RXR w iąże się do 5'
końca ramienia VD R E, podczas gdy V D R do ra m ie ­
nia 3' [40].
Gen odpow iedzialny za syntezę V D R znajduje się
na 12 chrom osom ie. Zaw iera 11 eksonów, które w raz
z intronami o bejm ują około 75 kb. Z identyfikiw ano
3 unikalne rodzaje m R N A pow stające w w yn iku al­
ternatywnego składania eksonów. Sekw encja DN A ,
znajdująca się przed pierw szym eksonem 1 A je s t b o ­
gata w zasady GC i zawiera liczne potencjalne centra
dla wiązania czynników transkrypcyjnych i innych
kofaktorów [41].
Obecność V D R w ykazano w szeregu tkanek jak
jelito, kości, nerka, m ięśnie, serce i m ózg, głó w nie w
jądrze kom órkow ym [42]. Ostatnie badania z u ż y ­
ciem pochodnej w itam iny D 3 o norm alnej a k ty w n o ­
ści biologicznej i w ysokim pow ino w actw ie w iązan ia
z receptorem, a ponadto wykazującej sp ecy ficzn ą
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 20 00
właściwość wzm ocnionej fluorescencji po zw iąza­
niu z VDR, pozw oliły wykryć obecność V D R ró w ­
nież w cytoplazmie, w en do plazm atycznym retikulum, aparacie Golgiego, m ikrotubulach jak również
w m itochondriach [43],
V D R zbudow any je s t z około 420 am inokw asów i
ja k u pozostałych przedstaw icieli rodziny, w jego
cząsteczce m ożna w yróżnić dom eny charaktery­
styczne dla tej grupy czynników transkrypcyjnych.
W dom enie E położonej w C -końcow ym fragm encie
łańcucha polipeptydow ego znajduje się w ysoce k o n ­
serwatywny region AF-2, który ja k w ykazały b ad a­
nia może oddziaływać z koaktyw atoram i lub składni­
kami podstaw ow ego kom pleksu transkrypcyjnego.
N iezbędna dla tej aktyw ności w ydaje się być obec­
ność Leu 4 1 7 i Glu 4 2 0 [44]. B adania receptorów VD z
m utacjam i w obrębie regionu AF-2 wykazały, że
m imo w ykazyw ania praw idłow ości w w iązaniu liganda, m ożliwości tw orzenia heterodim erów z R XR
i rozpoznawania V D R E, nie dochodziło do transm i­
sji sygnału [45].
Stym ulowany przez VD proces transkrypcji w y ­
m aga specyficznego oddziaływ ania V D R z TFIIB,
który jest składnikiem po dstaw ow ego kom pleksu
transkrypcyjnego. TFIIB jest w ielo do m en ow ą
cząsteczką białkową, której N -k oń cow y fragm ent
jest niezbędny przy oddziaływ aniu z d o m en ą AF-2
VDR, podczas gdy pozostałe dom eny um ożliw iają
wiązanie z innymi składnikam i kom pleksu tran­
skrypcyjnego. U w aża się, ze interakcja V D R z TFIIB
je st kluczow ym etapem aktywacji indukow anego
przez VD procesu transkrypcji [46],
C echą charakterystyczną V D R jest krótka dom ena
N-końcowa. D om ena wiążąca DNA tworzy strukturę
przestrzenną typu palców cynkow ych ja k u w szy st­
kich przedstawicieli tej rodziny receptorów j ą d r o ­
wych, a w jej obrębie znajdują się sekwencje o dp o­
wiedzialne za rozpoznanie i łączenie z V D R E oraz za
dimeryzację. Pom iędzy palcami cynkow ym i zid en­
tyfikowano sekw encję zaw ierającą 5 am inokw asów
zasadowych. Jeżeli w wyniku mutacji dojdzie do
zastąpienia am inokw asów zasadow ych am in o k w asa­
mi o innym charakterze lub ma m iejsce delecja, taki
receptor nie jest zdolny do łączenia z V D R E [47].
VDR jak wiele innych receptorów m oże ulegać
fosforylacji. Jednym z centrów fosforylacyjnych jest
Ser 5 i leżąca w obszarze m iędzy palcam i cy n kow y ­
mi. Ser 5 i jest zachow ana we w szystkich poznanych
dotąd VDR i jak się okazało może być substratem dla
kinazy białkowej C-(3. Ponieważ obecność am in o ­
kwasów zasadowych odgrywa szczególną rolę w
wiązaniu VDR do VDRE, w prow adzenie ujem nego
ładunku w tym obszarze p raw dopodobnie osłabia
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
wiązanie V D R z DNA, co może mieć znaczenie re­
gulatorowe [48].
Jak w ykazały badania, stabilność kom pleksu
V D R /R X R zależy od obecności i kolejności w iąza­
nia ligandów czyli VD i 9-cA-RA. Uważa się, że heterodim er V D R /R X R m oże pow stać w nieobecności
ligandów. Jest to tzw. apoheterodim er, który po p o ­
łączeniu z VD ulega zm ianom konform acyjnym ,
praw dopodobnie w dom enie wiążącej ligand. Z m ia ­
ny m o g ą być przenoszone na inne obszary cząstecz­
ki, um ożliw iając wiązanie kom pleksu RXR/ VDRVD do VDRE. Istniejący w takiej konformacji k o m ­
pleks nie jest jed n ak trwały. Przyłączenie 9 -c is-R A
pow oduje jeg o dysocjację, prow adząc do utworzenia
dim erów R X R /R X R , w iązania go do odpowiedniego
VD R E i ew entualnego uruchom ienia innych szlaków
sygnałowych. Jeżeli D 3 przyłączy się do V D R przed
utw orzeniem heterodim eru, to dochodzi do zmian
konform acyjnych, które sprawiają, że kom pleks jest
trwały, nie ulega rozpadow i w obecności 9-cA-RA i
w iążę się z V D R E z dużym pow inow actw em i specy­
ficznością [49] (Ryc. 1).
Najw cześniej pozn a n ą fun kcją VD jest udział w
utrzym aniu hom eostazy wapnia, co przejawia się w
regulacji ekspresji genów białek wiążących wapń
oraz enzym ów i horm onów zaangażow anych w ten
proces. Sekwencje V D R E znaleziono w prom otorow ym regionie ludzkiej i szczurzej osteokalcyny [50]
i mysiej osteoponiny [51],
VD indukuje w zm o ż o n ą syntezę kalbindyny,
białka wiążącego wapń w jelicie (Ca BP 9K). W b a­
daniach in vitro i in vivo pokazano, że trójjodotyronina (T 3) m oże osłabiać działanie VD. Nie zaobser­
wowano je d n ak tworzenia dim erów TR /V D R i
wiązania do VDRE. Wydaje się, że efekt słabszej o d ­
powiedzi mógł być spow odow any odłączeniem RXR
od heterom eru V D R /R X R i w ykorzystaniem go do
utworzenia innego heterodim eru TR /R X R [52].
Wyniki badań pokazują, że VD może m odulować
metabolizm w apnia w wielu kom órkach. W h o d o w ­
lach osteoblastów w zm aga syntezę kalbindynyD28K i osteoponiny jak również ma w pływ na fosfo­
ry lację tego białka [53].
Wykazano, ze TNFa, który przyczynia się do u tra­
ty m asy kostnej w osteoporozie, obniża zdolność
w iązania V D R /R X R do V D R E genu osteoponiny
praw dopodobnie poprzez aktyw ację jądrow ego inhi­
bitora [54].
A ktyw na forma VD w zm aga stym ulow any przez
PTH transport wapnia w kanalikach dystalnych. Z a ­
obserw ow ano w z m o żo ną ekspresję genu receptora
PTH/PTHrP. Stym ulacja jest specyficzna, dotyczy
tylko receptora PTH/PTHrP, nie mając wpływu na
http://rcin.org.pl
119
receptory adrenergiczne ani na w ym ieniacze Na/H.
N ieaktyw na forma VD, 2 4 ,2 5 (O H )2-D 3 nie w pływ a
na ekspresję receptora parathorm onu. W zm ożenie
syntezy receptora PT H /PT H rP zaobserw ow ano w
obecności obydw u ligandów, VD i 9-cA-RA, p o d ­
[55].
Jak się okazuje VD je s t rów nież w ażnym regu lato­
że zarówno 9-cA-RA ja k i ATRA znosiły pro-różnicującą aktywność VD [57, 58],
M echanizm y prow adzące do ham ow ania p o ­
działów kom órkow ych nie sąje s z c z e całkowicie w y ­
jaśnione. Zaobserw ow ano, że w iązanie heterodimeru V D R /R X R w regionie prom otora genu inhibitora
kinaz cyklinozależnych, białka p 2 1 w pływ a pozy­
tywnie na jeg o transkrypcję. Stw ierdzono również,
że VD m oże mieć w pływ na zm iany aktywności en ­
zymów, które są zaangażow ane w inne szlaki sy­
gnałowe. Inkubacja m ysich keratynocytow z VD sty­
rem hom eostazy fosforanów. W pływ a na ekspresję
genów nerkow ych transporterów Pp W regionie p ro ­
motora genu transportera fosforanu typu II, za le żn e­
m ulowała ekspresję genu odpow iedzialnego za syn­
tezę fosfolipazy D -l. Stwierdzano w zrost całkowitej
aktywności fosfolipaz ja k również w zm o ż o n ą a k ­
go od Na zidentyfikow ano sekwencję, która je s t roz­
poznaw ana przez heterodim er V D R /R X R [56],
tywność transglutam inazy uważanej w tych kom ór­
kach za m arker różnicow ania [59].
czas gdy sam 9-cA-RA nie posiada takich w łaśc iw o ­
ści. W badaniach in vitro stwierdzono, że obecność
obydwu ligandów w z m a g a rów nież oddziaływ anie
receptora P TH /PTH rP z błonam i kom órkow ym i
R yc.l. Rola ligandów w wiązaniu heterodimerów VDR/RXR do DNA (wg [49], za
zgodą autora). VDR i RXR mogą łączyć
się ze sobą w nieobecności ligandów
tworząc
tzw.
apoheterodimer.
Po
przyłączeniu D3 do VDR, hetcrodimcr
wiąże się z VDRE, lecz utworzony kom­
pleks nie jest stabilny i w obecności
9-cis RA może ulegać dysocjacji [A],
Połączenie D3 z VDR przed utworze­
niem heterodimeru prowadzi do zmian
konformacyjnych, dzięki którym po­
wstający hetcrodimcr jest trwały, nie­
wrażliwy na 9-cis RA i wiąże się z
VDRE z dużą specyficznością i powino­
wactwem [B],
DRE
W ostatnich latach pojaw ia się coraz więcej d on ie­
sień o udziale VD w procesach w zrostu i różn ic o w a­
nia wielu typów kom órek, zarów no norm alnych jak i
nowotworow ych. W kom órkach keratynocytow
ludzkich posiadających receptory zarów no dla VD
ja k i retinoidów stwierdzono, że VD w yw iera w y ra­
źny wpływ ham ujący na proliferację kom órek oraz
w zm aga procesy różnicowania. Retinoidy, zarów no
9-cA-RA ja k i ATRA w y kazyw ały słaby sty m u ­
lujący w pływ na proliferację, natom iast w k o m b in a ­
cji z VD częściowo znosiły jej an typroliferacyjną ak­
tywność. W obecności VD w wielu kom órkach
stwierdzano zatrzym anie cyklu kom órkow ego w fa­
zie G l , podczas gdy obecność RA w yraźnie to
działanie VD osłabiała. B adania w ykazały również,
120
A ntyproliferacyjne i proróżnicujące działanie VD
potwierdzono w badaniach na wielu liniach komórek
now otw orow ych. VD jest potencjalnym n egatyw ­
nym regulatorem wzrostu kom órek raka sutka
(M CF-7). Indukuje ona pow staw anie m orfo log icz­
nych i biochem icznych m arkerów apoptozy (kon­
densację m atriks jądro w ego i fragm entację DNA)
[60],
W kom órkach now otw orow ych prostaty (LN
CaP) zaobserw ow ano zm niejszoną ilość kom órek w
fazach G2, M i S, za to zw iększoną ilość w fazie
G l/G o , zw iększenie stężenia inhibitora kinaz cykli­
nozależnych p 2 1 i obniżenie aktyw ności kinazy
CDK2. W tym p rzypadku 9-cA-RA działał synergistycznie z VD [61]. Również w kom órkach adenom a
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
prób w ykorzystania tych właściw ości in vivo w n o ­
recepto rów horm onów tarczycy tylko w jądrze k o ­
m órkow ym i sądzono, że są one związane z DNA
rów nież w nieobecności liganda. Bardziej czułe m e­
tody z zastosow aniem fluoryzującego białka GFP
w otworach jelita [62],
W ostatnich latach p ojaw ia się coraz więcej don ie­
sień o now ych aktyw nościach biologicznych VD.
Wydaje się, że VD m oże mieć w pływ na ekspresję
{green flu o r e sc e n t p ro tein ), które połączono z
N -k o ń c o w y m fragm entem TR Pi, co nie powodowało
je d n a k zm ian w zdolności łączenia z T 3 ani nie zm ie­
niało transkrypcyjnej aktywności receptora, w y k a ­
genu ludzkiego horm onu w zrostu [63], oraz czy nn i­
ka wzrostu nerw ów (NGF) [64-66], w zm agać eks­
zały obecność TRPi rów nież w cytoplazmie. Stosu­
nek T R pi znajdow anego w jąd rz e do ilości w y stę­
presję genu 24-hydroksylazy [67], anhydrazy w ę g la ­
nowej [ 6 8 ], receptora LD L [ 6 8 ], ham ow ać ekspresję
genu ANP [70] oraz genu IL - 8 indukow anego przez
pującej w cytoplazm ie zależał od obecności T 3. W
nieobecności T 3 wynosił około 1,5, podczas gdy w
obecności T 3 wartość ta w zrastała do 5,5. Na p od sta­
wie tych badań m ożna sądzić, że T 3 w zm aga translo-
VD i jej aktywne analogi w yraźnie osłabiały tempo
podziałów kom órkow ych, co w skazuje na p o zy ­
tywną rolę VD i uzasadnia podjęcie ewentualnych
T N F a [71].
Pojaw iają się rów nież doniesienia o działaniu VD
na system im munologiczny. Eksperym enty na m y ­
szach sugerują, że V D i jej aktywne analogi m o g ą
być użyteczne w leczeniu schorzeń autoim m unologicznych, a w przyszłości być m oże stosowane jako
leki przeciwdziałające odrzucaniu przeszczepów w
terapii im m unosupresyjnej [40].
IV-3. Receptory horm onów tarczycy
Receptory horm onów tarczycy T R a i T R p k o d o ­
wane są przez geny znajdujące się na chrom osom ach
17 i 3. W wyniku alternatyw nego składania p ierw ot­
nego transkryptu m ożliw e jest pow staw anie czterech
izoform TR oznaczanych odpow iednio jak o T R a i i
a 2 oraz TRPi i p 2 [72,73]. TR posiada wszystkie d o ­
m eny charakterystyczne dla tego typu receptorów
w ew nątrzkom órkow ych. D om ena AF-1 w regionie
A/B jest odpow iedzialna za transm isję sygnału n ie­
zależną od liganda. Okazuje się, że w przypadku tego
receptora utrata dom eny A/B nie w pływ a na jego
właściwości [74]. Pozostałe dom eny w y k a zu ją typo ­
we funkcje charakterystyczne dla całej rodziny re ­
ceptorów jądro w ych [3, 75].
Stwierdzono, ze w obrębie dom eny D niezw ykle
istotna jest obecność dwóch sekwencji zaw ie­
rających am inokw asy zasadowe: Lysi 3 4 -Arg-Lys
oraz A rg 1 8 8 -Arg-Lys w T R a i i podobnych sekwencji
w receptorze T R a 2. Okazuje się, że je d n a z tych se­
kwencji jest niezbędna w procesie translokacji re ­
ceptora do jąd ra kom órkow ego, podczas gdy ob ec­
ność obydwu warunkuje m ożliwość transm isji sy ­
gnału i dzięki temu regulację ekspresji o d p ow ied­
nich genów [76],
Porównanie sekwencji am inokw asow ej T R a i
T R p wskazuje na znaczny stopień hom ologii z
wyjątkiem dom en A/B [77],
Badania im m unologiczne z użyciem przeciwciał
skierowanych przeciw ko TR sugerow ały obecność
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
kację receptora z cytopazm y do jądra, a możliwość
zm ian w dystrybucji TR pom iędzy jąd rem a cytop lazm ą zależna od T 3 m oże być czynnikiem reg u­
lującym aktywność transkrypcyjną.[78].
T R re gulu ją transkrypcję genów docelow ych
w iążąc się do odpow iedniego TR E składającego się z
dw óch 6 -nukleotydow ych sekwencji rozdzielonych
przez 4 nukleotydy (Dr-4) lub do tzw. odwiniętego
pow tórzenia heksapeptydów rozdzielonych sześcio­
m a nukleotydam i, określanych jak o E R - 6 [79,80],
T R m oże wiązać się z TR E w nieobecności ligandów ja k o monom er, h om od im er lub heterodim er z
RXR . D odanie T 3 osłabia wiązanie dim erów T R a i ,
T R a 2 ja k rów nież T R a / T R p do TRE, co może w
efekcie prow adzić do odłączenia receptorów i braku
odpowiedzi. Takiego efektu nie obserwuje się w
obecności T 3 i heterodim eru TR /RX R. P raw dopo­
dobnie obecność RXR w dim erze zw iększa p ow in o ­
w actw o do TRE. Wydaje się więc, że heterodim er
T R /R X R jest najbardziej stabilny i odgrywa najw a­
żn iejszą rolę w regulacji transkrypcji genów zależnej
od T 3 [81, 82, 83],
O becnie wiadom o, że procesy regulacji transkryp­
cji z a le żą nie tylko od obecności receptorów, ich ligandów i określonego typu TRE, ale również od sze­
regu innych białek zw anych korepresoram i i koaktywatoram i.
Receptor, który nie je s t zw iązany z ligandem po
połączeniu z TRE może ham ować transkrypcję
wiążąc się z białkow ym i korepresoram i. Takim zn a­
nym korepresorem je s t kom pleks trzech białek, z
których jed n o posiada aktyw ność deacetylazy histonów. Jakkolw iek proces ten nie jest jeszcze całkow i­
cie wyjaśniony, to uw aża się, że deacetylacja histonów pow oduje zm iany konform acyjne w budowie
chromatyny, czego w ynikiem je s t utrudniony dostęp
czynników transkrypcyjnych i co w efekcie prow a­
dzi do za ham ow ania transkrypcji. Wiązanie liganda
indukuje zm iany konform acyjne prowadzące do
http://rcin.org.pl
121
uwolnienia korepresorów , pow iązania z koaktywatorami poprzez d o m eną AF-2, acetylację histonów
przez jed en z koaktyw atorów jak im je s t acetylotransferaza,
„rozluźnienie”
struktury
chrom atyny
ułatwiające dostęp czynnikom transkrypcyjnym i ak­
tywację transkrypcji [84, 85, 8 6 , 87].
H orm ony tarczycy uważa się za niezbędne dla
prawidłow ego rozwoju, wzrostu i regulacji szeregu
procesów m atabolicznych. O becność izoform TR
wykryto w większości tkanek. Ekspresję genów T R a
i TR|3 stwierdzono na różnych etapach rozwoju em ­
brionalnego oraz różnych stadiach m etam orfozy
płazów [ 8 8 , 89]. Zarów no TR ja k i R X R sąn iez b ęd n e
do przekazyw ania sygnałów T 3 w rozw oju em brio­
nalnym X en o p u s L aevis [90].
Sekwencje TRE znaleziono m iędzy innymi w prom otorow ym obszarze szczurzego genu horm onu
wzrostu [91], genu tyreotropiny (3 [92], głównego
białka m ieliny [93], ciężkiego łańcucha m iozyny
[94], dehydrogenazy jabłczan ow ej dekarboksylującej [95], anhydrazy węglanow ej II [96] i lizozymu [97],
Stwierdzono, że T R a i TRP m o g ą różnić się w
swoim działaniu, jak k o lw iek m olekularne podstawy
takiej odmiennej aktywności nie zostały dotąd dosta­
tecznie wyjaśnione. W iadom o, że np. T 3 poprzez re ­
ceptor TRPi ham uje ekspresję genu tyreotropiny,
podczas gdy T R a i takiego działania nie wykazuje
[98], Być m oże jest to zw iązane z w łaściw ościam i
poszczególnych izoform TR. W iadom o, że TRPi
częściej tworzy h om odim ery niż T R a i co może być
przyczyną różnic w pow inow actw ie do określonego
TRE [77].
Jednym z w ażniejszych docelow ych organów
działania horm onów tarczycy jest wątroba, gdzie
ekspresja wielu genów, m iędzy innymi enzymu
jab łczanow ego i typu I 5 'd e jo d y n a z y jest pod k o n ­
trolą T 3. W wątrobie znaleziono przede wszystkim
TRp, który tworzy h eterodim er z RXR. Badania w y ­
kazały, że w ew n ątrzk om órk ow e trawienie receptora
RXR przez katepsynę L m oże być jed n y m z p oten ­
cjalnych m echanizm ów regulacji działania TR [99].
Stwierdzono, że T 3 je s t niezbędna dla p ra ­
widłowego rozwoju układu nerw ow ego, a ekspresja
rodzaju izoformy TR zależy od stadium rozwoju. W
okresie em brionalnym m ózgu szczura stwierdzono
w ystępowanie T R a i , podczas gdy po urodzeniu d o ­
m inującą form ą był TRPi. T 3 poprzez swoje recep to­
ry reguluje wzrost i dojrzew anie neuronów, p o w sta­
wanie synaps oraz proces m ielinizacji. N iedobór T 3
w okresie sześciu m iesięcy po urodzeniu człowieka
prowadzi do nieodw racalnych zm ian w rozwoju
um ysłow ym [ 1 0 0 ],
122
Stwierdzono, ze T 3 poprzez heterodim er TR/RX R
hamuje ekspresję genu
Ę-amyloidu, prekursora
białka APP w kom órkach neuroblastom a, które o d ­
grywa kluczow ą rolę w rozwoju choroby Alzheim era
[ 101].
Badania wskazują, że TR może tworzyć dimery
również z RAR. Wydaje się, że poprzez tego typu heterodim ery T 3 może w pływ ać na ekspresję genów
odpow iedzialnych za syntezę niektórych enzym ów
ja k wątrobowej glukokinazy [1 0 2 ], czy karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej [1 0 3 ], regulować
syntezę keratyny [1 0 4 ] czy m odulować procesy erytropoezy [1 0 5 ],
V. U w agi końcow e
W itam ina D 3, pochodne witam iny A oraz h o rm o ­
ny tarczycy m ają udział w regulacji wielu pod staw o ­
wych procesów życiowych. M imo różnic w swojej
strukturze chemicznej, ich receptory w ch o d zą w
skład hom ologicznej rodziny białek jąd ro w y ch o
charakterystycznej budowie, w iążą się z p ok re w n y ­
mi elem entami odpowiedzi w DNA i w y kazują p o ­
dobny m echanizm działania. Rodzinę heterodim erycznych receptorów jąd ro w y ch cechuje zdolność
asocjacji z receptorem kwasu 9-cA-retinowego, co
je s t niezbędnym w arunkiem ich aktywności biolo­
gicznej. Rzuca to nowe światło na znaczenie retinoidów w regulacjach procesów m etabolicznych z
udziałem witam iny D 3, horm onów tarczycy oraz
wielu innych ligandów heterodim erycznych recep to­
rów. Obecność elem entów odpowiedzi na receptory
heterodim eryczne w prom otorach wielu genów sp ra­
wia, że działanie ich ligandów jest wielokierunkowe.
Artykuł otrzymano 27 stycznia 2000 r.
Zaakceptowano do druku 31 marca 2000 r.
Piśm iennictw o
1. M a n g c l s d o r f D, E n g E S , D y c k J A , E v a n s R M
(1990) Naturę 345: 224-229
2. G l a s s C K (1994) E ndocńnol Rev 15:391-407
3. M a n g e l s d o r f D J , E v a n s R M (1995) Celi 83: 841-850
4. O ż y h a r A (1994) Post Bloch 40:230-239
5. P e m r i c k S M , L u c a s D A , G r i p p o J F (1994) Leukemia
8: 1797-1806
6. K w i a t k o w s k a D, K w i a t k o w s k a - K o r c z a k J (1999)
Post Biol Kom 26: 579-592
7. B o u r g u e t W, R u f f M, C h a m b o n P, G r o n e m e y e r
H, M o r a s D (1995) Naturę 375: 377-382
8. N c g p a l S, F r i a n t S, N a k h s h a d o r i H, C h a m b o n P
(1993) EMBO 7 12: 2349-2360
9. K u r o k a w a R, D i R e n z o J, B o e h m M, S u g e r m a n J,
G l o s s B, R o s c n f e l d M G . H e y m a n R A , G l a s s C K
(1994) Naturę 371: 528-531
10. R a s t i n j c a d F, P e r l m a n T, E v a n s R M , S i g l c r P B
(1995) Naturę 375: 203-211
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
11. L e b l a n c B P , S t u n n e n b e r g H G (1995) Genes Dev 9:
1811-1816
12. K ä s t n e r P, M a r k M, C h a m b o n P (1995) Cell 83:
859-869
13. K c i d e 1 S , L a m o u r F P , A p f e l C M (1997) J Biol Chem
272: 18267-18272
14. G u d a s L J (1994) J Biol Chem 269: 15399-15402
1 5 . K w i a t k o w s k a J (1992) Post Bioch 38: 32-36
16. M a n g i a r o t t i R, D a n o v a M, A l b e r i c i R, P e l l i c c i a r i C (1998) B r J Cancer 77:186-191
17. C o s g a y a J M , R e c i o J A , A r a n d a A (1997) Oncogene 15:
1687-1696
18. K a k i z u k a A (1997) Leukemia 3: 378-379
19. M a g r a u - P e y a E, S a l o m o n D, S a u r a t J H , M e d a P
(1997) J Histochem Cytochem 45: 1207-1210
20. L e e W K , D o h i J M , K i m Y H , W a l s h G L , C o n s o l i
V, A n d r e e f f M, D a w s o n H o n g W K , K u r i e J M
(1997) J Clin Invest 101: 1012-1019
21. H y a t t G A , D o w l i n g J E (1997) Invest Ophtalmol Vis Sci 38:
1471-1475
22. B a h o u t h S W , B e a u c h a m p M J , P a r k E A (1 998) Biochem Pharmacol 55:215-225
2 3 . G a b b i t a s B , C a n a l i s E {\9 9 1 )J C e ll Physiol 172: 253-264
24. H a n G R , D o h i D F , L e e H Y , R a j a h R, W a l s h G L ,
H o n g W K , C o h e n P, R u r i e J M (1997) J Biol Chem 272:
13711-13716
25. S a m a d T A , K r e z e l W, C h a m b o n P, B o r e l l i E
(1997) Proc N atl A cad Sci USA 94: 14349-14354
26. M a n n o n P J , K e i s e r L M (1997) J Neurochem 68: 20-25
27. B a l l o w M , X i a n g S, G r e e n b e r g S J , B r o d s k y L,
A l l e n C, R i c h G (1997) Int Arch Allergy Immunol 113:
167-169
2 8 . D i S e p i o D, M a l h o t r a M, C h a n d r a r a t n a R A , N a g p a l S (1997) J Biol Chem 272:25555-25559
29. N a p o l i t a n o M, B e l l a v i a D, M a r o d e r M, F a r i n a
M, V a c c a A , F r a t i L, G u l i n o A, S c r e p e n t i I (1997)
Thymus 24: 247-261
30. S h i m a d a T , R o s s A C , M u c c i o D D , B r o u i l c t t c
W J , S h e a l y Y F (1997) Arch Biochem Biophys 344: 220-227
3 1 . L o H W , A l i - O s m a n F (1997) J Biol Chem 111: 32743-32749
32. D e c a u x J F , J u a n e s M, B o s s a r d P, G i r a r d J (1997)
Mol Cell Endocrinol 130: 61-67
33. P a r k E A , S o n g S, O l i v e M, R o c s l c r W J (1997) Bio­
chem J 322: 343-349
34. R o d c r K H , W o l f S S , S c h w e i z e r M (1991)Biochem Soc
Trans 25: 157S
35. W i d s c h w e n d t e r M , B e r g e r J , D a x e n b i c h l e r G,
M u 11 c r - H o 1z n c r E, W i d s c h w c n d t e r A, M a y r A,
M a r t h C, Z c i m c t A G (1997) Cane Res 57: 3158-3161
36. M e G r e g o r F, W a g n e r E, F e l i x D, S o u t a r D, P a r ­
k i n s o n K, H a r r i s o n P R (1997) Cancer Res 57: 3886-3889
37. L i C , W a n Y J (1998) Cancer Lett 124:205-211
38. S h o n d y Z, R e i c h e r t U, E r n a r d o n J M , M i c h e l S,
O t h R, A n c i a n P, A j z n c r E, F e s u s L (1997) Mol Phar­
macol 51: 972-982
39. G u e r i n E, L u d w i g M G , B a s s e t P, A n g l a r d P (1997)
J Biol Chem 212: 11088-11095
40. D c L u c a H F , Z i e r o l d C (1998) Nutr Rev 56: S4-10
41. M i y a m o t o K, K e s t e r s o n R A , Y a m a m o t o H , T a k e t a n i Y, N i s h i w a k i E, T a t s u m i S, I n o u e Y, M o r i t a
K, T a k c d a E, P i k e J W (1997) Mol Endocrinol 11:
1 165-1179
42. Z a n c l l o S B , C o l l i n s E D , M a r i n i s s e n M J , N o r ­
m a n A W , B o l a n d R L (1997) Norm M etab Res 29: 231 -236
4 3 . B a r s o n y J, R e n y i I, M c K o y W (1997) J Biol Chem 272:
5774-5782
44. J u r u t k a P W , H s i e h J C , R e m u s L S , W h i t f i e l d
GK, T h o m p s o n PD, H a u s s i e r CA, B l a n c o JC,
O z a t o K, H a u s s i e r M R (1997) J Biol Chem 272:
14592-14599
45. M a s u y a m a
H , Brownfield
CM,
Arnaud R,
M a c - D o n a l d P N (1997) M ol Endocrinol 11: 1507-1517
POSTĘPY BIOCHEM II 40(2), 2000
46. B l a n c o J C G , W a n g I - M , T s a i S Y , T s a i M - J ,
O ' M a l l e y WB, J u r u t k a PW, H a u s s i e r MR, O z a t o
K (1995) Proc Natl A cad Sci USA 92: 1535-1539
47. H s i e h J - C , S h i m i z u Y, M i n o s h i r n a S, S h i m i z u N,
H a u s s i e r C A , J u r u t k a P W , H a u s s i e r M R (1998) J
Cell Biochem 70: 94-109
48. H s i e h J - C , J u r u t k a P W , N a k a j i m a S, G a l l i g a n
M A , H a u s s i e r C A , S h i m i z u Y, S h i m i z u N, W h i t ­
f i e l d G K , H a u s s i e r M R (1993) J Biol Chem 268: 15118
-15126
49. T h o m p s o n P D , J u r u t k a P W , H a u s s i e r C A , W h i t ­
f i e l d G K , H a u s s i e r M R (1998) J Biol Chem 273:
8483-8491
50. O z o n o K, L i a o J, K e r n e r S A , S c o t t R A , P i k e J W
(1990) J Biol Chem 265: 21881-21888
5 1 . N o d a M, V o g e l R L , C r a i g A M , P r a h l J, D c L u c a
H F , D e n h a r d t D T (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:
9995-9999
52. R a v a 1- P a n d y a M , F r e e d m a n L P , Li H, C h r i s t a k o s S (1998) M ol Endocrinol 12: 1367- 1379
53. S a t r a n J B , B u t l e r W T , F a r a c h - C a r s o n M C (1998)J
Biol Chem 273: 29935-29941
54. F e r n a n d e z - M a r t i n J L , K u r i a n S, F a r m e r P, N a n e s M S ( 1998) M ol Cell Endocrinol 141: 65-72
55. S n e d d o n W B , B a r r y EL, C o u t e r m a r s h BA, Ge s e k F A , L i u F, F r i e d m a n P A (1998) Cell Physiol Biochem
8: 261-277
56. T a k e t a n i Y, S c g a w a H, C h i k a m o r i M, M o r i t a K,
T a n a k a K, K i d o S, Y a m a m o t o H, I e m o r i Y, T a t ­
s u m i S, T s u g a w a N , O k a n o T , K o b a y a s h i T, M i y ­
a m o t o K, T a k e d a E (1998) J Biol Chem 273: 14575-14581
57. S o r e n s e n S, S o l v s t e n H, P o l i t i Y, K r a g b a l l e K
(1997) Skin Pharmacol 10: 144-152
58. S e g a e r t S, G a r m y n M , D e g r e c f H, B o u i l l o n R (
1997) J Invest Dermacol 109: 46-54
59. G r i n e r R D , Q i n F, J u n g E, S u e - L i n g C h K , C r a f o r d K B , M a n n - B l a k e n e y R, B o l l a g R J , B o l l a g
W B (1999) J Biol Chem 274: 4663-4670
60. N a r v a e z C J , W e l s h J (1997) Endocrinology 138:4690-4698
61. B 1u 11 S E , A l l e g r e t t o E A , P i k e J W , W e i g e l N L
(1997) Endocrinology 138: 1491- 1497
62. T o n g W M , B i s e s G, S h e i n i n Y, E l l i n g e r A, G c n s c r D, P o t z i R, W r b a F, W e n z l I, R o k a R, N e u h o l d N , P c t c r l i k M , C r o s s H S (1998) Int J Cancer 75:
467-472
6 3 . A l o n s o M, S e g u r a C, D i e g u e z C, P c r e z - F e r n a n d c z R (1998) Biochem Biophys Res Commun 247: 882-887
64. V e e n s t r a T D , F a h n e s t o c k M, K u m a r R (1998) Bio­
chemistry 37: 5988-5994
65. M u s i o l I M , F e l d m a n D (1997) Endocrinology 138: 12-18
66. C o r n e t A, B a u d c t C, N e v c u I, B a r o n - V a n E v e r c o o r e n A, B r a c h e t - N a v e t i n a n P (1998) J Neurosci Res
53: 742-746
67. K a n g S, Li X Y , D u e l l E A , V o o r h e e s J J (1 9 9 7 )7
Invest Dermatol 108: 513-518
68. Q u e l o I, M a c h u c a I, J u r d i c P (1998) 7 Biol Chem 273:
10638-10646
69. K o l i n o M, T a k a h a s i S, O i d a K, S u z u k i J, T a i n a i
T , Y a m a m o t o T , N a k a i T (1997) Atherosclerosis 133:
45-49
70. C h e n S, W u J, H s i e h J C , W h i t f i e l d G K , J u r u t k a
P W , H a u s s i e r M R , G a r d n e r D G (1998) Hypertension
31: 1338-1342
71. H a r a n t H , A n d r e w P J , R e d d y G S , F o g l a r E, L i n d 1e y I J (1997) Eur 7 Biochem 250: 63-71
72. E v a n s R M (1988) Science 240: 889-895
73. L a z a r M A ( 1993) Endocrinol Rev 14: 184-193
74. L i n k K, P a r k i n s o n C, M c P h i e P, C h e n g S (1991)
Mol Endocrinol 5: 485-492
75. W a g n e r R L , A p r i e t t i J W , M c G r a t h M E , W e s t
B L , B a x t e r J D , F l e t t e r i e k RJ (1995) Nature 378:
690-697
76. L e e Y , M a h d a v i V (1 9 9 3 ) 7 Biol Chem 268: 2021-2028
http://rcin.org.pl
123
77. Z h u X - G , M c P h i c P, L i n K - H , C h e n g S - Y (1997) J
Biol Chem 272: 9048- 9054
78. Z h u X - G , H a n o v e r A, H a g e r G L , C h e n g S - Y (1998)
J B io l Chem 273: 27058-27063
79. C h e n g S - Y (1995) J Biom ed Sci 2: 77-89
80. O p p e n h e i m e r J H , S c h w a r t z H J , S t r a i t K A (1994)
Eur J Endocrinol 130: 15-24
8 1 . Y e n P M , S u g a w a r a A, C h i n W (\992) J Biol Chem 267:
23248-23252
82 Y e n P M , D a r l i n g D S , C a r t e r R L , F o r g i o n e M,
U m e d a P K , C h i n W W (1992) J B io l Chem 267: 3565-3568
83. R o s e n E D , B e n i g h o f E G , K o e n i g R J (1993) J Biol
Chem 268: 11534-11541
84. W o l f f e A P (1997) Nature 387: 16-17
8 5 . N a g y L, K a o H - Y , C h a k r a v a r t i D, L i n R J , H a s s i g
C A , A y e r D E , S c h r e i b e r S L , E v a n s R M (1997) Cell
89: 373-380
86. H e i z e l T, L a v i n s k i R M , M u l l e n T M , S ö d e r s t r ö m
M, L a h e r t y C D , T o r c h i a J , Y a n g W - M , B r a r d G,
N g o S D , D a v i e J R , S e t o E, E i s e n m a n R N , R o s e
D W , G l a s s C K , R o s e n f e l d M G (1997)N ature387:43-48
87. C h e n J D , E v a n s R M (1995) Nature 377: 454-457
88. S t r a i t K A , S c h w a r t z H L , P e r e z - C a s t i l l o A,
O p p e n h e i m e r J H (1990) J Biol Chem 265: 10514-10521
89. S h i Y B (1994) Trends Endocrinol Metab 5: 14-20
90. P u z i a n o w s k a - K u z n i c k a M , D a m j a n o v s k i S, S h i
Y B (1997) M oll Cell Biol 17: 4738-4749
91. K o e n i g RJ , B r e n t G A , W a r n e R L , L a r s e n PR,
M o o r e D D (1987) Proc Natl A cad Sci USA 84: 5670-5674
92. C a r r F E , B u r n s i d e J , C h i n W W (1989) Mol Endocrinol'S:
709-716
124
93. F a r s e t t i A, M i t s u h a s h i T, D e s v c r g n c B, R o b ­
b i n s J, N i k o d e m
V M (1991) J Biol Chem 266:
23226-23232
94. I z u m o S, M a h d a v i V (1988) Nature 334: 539-542
9 5 . P e t t y K J , D e s v e r g n e B, M i t s u h a s h i T, N i k o d e m
V M (1990) J B io l Chem 265: 7395-7400
96. D i s e l a C, G l i n c u r C, B u g g e T, S a p J , S t c n g l G,
D o d g s o n J, S t u n n b e r g H, B e u g H, Z e n k e M
(1991) Gen & Dev 5: 2033-2047
97. B a n i a h m a d A, S t e i n e r C, K o h n e A C , R e n k a w i t z
R (1990) Cell 61: 505-514
98. L e z o u a l c ' h F, H a s s a n A H , G i r a u d P , L o e f f e r J P ,
L e e S L D o m e n e i x B A (1992) M ol Endocrinol 6:
1797-1804
99. N a g a y a T, M u r a t a Y, Y a m a g u s h i S, N o m u r a Y,
O h i m o r i S, F u j i e d a M, K a t u n u m a N, Y e n P M ,
C h i n W W , S e o H (1998) J Biol Chem 273: 33166-33173
100. D e n v e r R J , O u e l l e t L, F u r l i n g D, K o b a y a s h i A,
F u j i i - K u r i y a m a Y, P u y m i r a t J (1999) J Biol Chem
274: 23128-23134
101. B e 11 a n d i a B, L a t a s a M J , V i l l a A , P a s c u a l A
(1 9 9 8 )J 5 /o / Chem 273: 3036- 30371
102. D e c a u x J F , J u a n e s M , B o s s a r d P, G i r a r d J (1997)
M ol Cell Endocrinol 130: 61-67
103. P a r k E A , S o n g S, O l i v e M, R o e s l e r W J (1997) Blo­
chem J S22: 343-349
104. R a d o j a N, D i a z D V , M i n a r s T J , F r e e d b e r g J M ,
B l u m e n b e r g M, T o m i c - C a n i c M (1997) J Invest D er­
matol 109: 566-572
105. P e r i n M C B l a n c h e t J P , M o u c h i r o u d G (1997) Hematol Cell Ther 39: 19-26
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 20 00
Heterodimeryczne receptory jądrowe. II. Regulacja
przemiany kwasów tłuszczowych i steroidów
Heterodimeric nuclear receptors. II. Fatty acid and
steroid metabolism regulation
JANINA KWIATKOWSKA-KORCZAK1, DANUTA KWIATKOWSKA2
Spis treści:
Contents:
I.
II.
III.
Wstęp
Receptory sieroce
PPAR, receptory aktywowane przez czynniki proli­
feracji peroksysomów
IV. LXR, wątrobowy receptor X
V.
FXR, receptor farnezoidów X
VI. PXR, receptor pregnanu X
VII. Receptory o konstytutywnej aktywności
VIII. Uwagi końcowe
I.
Introduction
II.
Orphan receptors
III. PPAR, peroxisome proliferator-activated receptors
IV. LXR, liver X receptor
V.
FXR, farnesoid X receptor
VI. PXR, pregnane X receptor
VII. Constitutive receptors
VIII. Final remarks
Wykaz stosowanych skrótów: BABP — białko wiążące kwa­
sy żółciowe; CAR — konstytutywny receptor androstanu; CYP
— cytochrom P450; DR — proste powtórzenie oligonukleotydu
w HRE; FATP — błonowe białko transportujące kwasy
tłuszczowe; FXR — receptor farnezoidów X; 8-HETE — kwas
8-hydroksyejkozatetraenowy; 15-HETE — kwas 15-hydroksycikozatetraenowy; HNF-4-wątrobowy receptorjądrowy-4; HRE
— element odpowiedzi hormonalnej, region DNA wiążący re­
ceptor; LBD — domena receptora wiążąca ligand, domena E;
PPAR —- receptor aktywowany przez czynniki proliferacji pe­
roksysomów; P G C -1— koaktywator PPARy; PXR — receptor
pregnanu X; RXR — receptor kwasu 9-m -retinow ego.
rodziny heterodim erycznych czynników transkryp-
I. W stęp
ważnie jest ich od jed n eg o do pięciu, zgodnie z
regułą 1-5. Obie sekw encje A G G C T A są ułożone
jako proste powtórzenie, DR (direct repeat), lub palindrom owo, IR ( inverted repeat). Każde półmiejsce
łączy się z m onom erem receptora. [1-5]. N ajw cze­
śniej opisano i najlepiej poznano heterodimeryczne
receptory retinoidów, w itam iny D 3 i horm onów tar­
czycy. Opisano je w I części tego artykułu.
Z czasem poznano znacznie więcej przecstaw icieli tej rodziny. Jak się okazało, co najmniej kilka z
nich uczestniczy w regulacji przem iany lipidów.
Nie ma potrzeby przekonyw ać czytelnika, jak
istotne znaczenie dla funkcjonow ania organizm u ma
właściwa regulacja przem iany lipidów. W szelkie jej
zaburzenia upośledzają wiele procesów życiowych.
Rola horm onów przysadki, glukagonu, a zw łaszcza
insuliny w tej regulacji jest dobrze znana, choć i tu
stale odkrywa się nowe fakty. Obecnie okazuje się,
że przemiana lipidów jest regulow ana także przez ligandy receptorów jądro w y ch, które kontrolują tran­
skrypcję genów wielu białek transportow ych oraz
enzymów tego m etabolizm u. Receptory te należą do
'Prof. dr hab., 2dr hab. Zakład Biochemii Lekarskiej AM,
ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
cyjnych. Cechuje je h om ologia strukturalna, zdol­
ność tworzenia dimeru z RXR, receptorem kwasu
9-cA-retinowego (retin o id X receptor) oraz po w in o­
w actwo do wspólnego HRE, regionu rozpoznania w
DNA, (horm one responsive elem ent). W przypadku
heterodim erycznych receptorów , występujących u
ssaków, region ten stanow ią dwie sekwencje
A G G CTA , zwane półm iejscam i, oddzielone od sie­
bie o kilka nukleotydów. Liczba tych ostatnich sta­
nowi o swoistości w iązania receptora z HRE. Prze­
II. R eceptory sieroce
Białka zlokalizow ane w jądrze kom órkowym ,
pełniące funkcję czynników transkrypcyjnych, któ­
rych ligandów na razie nie znamy, nazywam y recep­
http://rcin.org.pl
125
torami sierocymi. M ają one zdolność aktywacji lub
represji transkrypcji genów i/lub w iązania znanych
HRE w regulatorow ych regionach DNA. D otych­
czas opisano ponad 80 takich białek, z tego 40 — w
tkankach ludzkich. P ow stała k oncepcja „odwrotnej
endokrynologii” , która, inaczej niż klasyczna, k o ń ­
czy się, a nie zaczyna odnalezieniem horm onu, lub
innego Uganda, w iążącego się ze znanym receptorem
[3]. W przypadku receptorów heterodim erycznych,
dodatkow ym kryterium rozpo znaw czy m jest zdo l­
rem jądrow ym , nazw anym PPAR, który tworzy dimer z R XR i rozpoznaje HRE typu DR-1[6],
PPAR występuje w postaci trzech izoform:
PPARa, PPARX i PPARp/s.
Form y te różnią się lokalizacją, pow inow actw em
do niektórych ligandów oraz odpow iedziam i ko m ór­
kowymi. PPARa w ystępuje głównie w wątrobie, a
także w nerkach i m ięśniach, PPARXw adipocytach,
jelitach i m onocytach, PPARp / 6 — we wszystkich
tkankach, ale najmniej jest go w wątrobie.
ność asocjacji z RXR, który je s t stałym partnerem w
tych dimerach, oraz w iązania się z charakterystycz­
nym regionem D N A zgodnie z reg ułą 1-5 [4, 5],
W szystkie dotychczas opisane heterodim eryczne
receptory sieroce spełniają oba kryteria. W miarę p o ­
znawania ich ligandów okazało się, że podobnie jak
w przypadku znanych ju ż receptorów witam in i h o r­
Naturalnym i Ugandami wszystkich form PPAR są
kwasy tłuszczowe, zw łaszcza nienasycone, ja k ole­
inowy, linolenowy i arachidonowy. Stałe ich w iąza­
nia (80-100 nm) m ieszczą się w zakresie fizjologicz­
nych stężeń tych kwasów. D om eny E w PPARa i
m onów , Ugandy te są w ysoce zróżnicow ane pod
względem budow y chemicznej. Są to przeważnie
substancje lipofilne. Są wśród nich zarówno
dużych cząsteczek. Duże p ow inow actw o w zględem
PPAR ma także roślinny kwas fitanowy [7]. Oprócz
kw asów tłuszczowych, poszczególne form y PPAR
w iążą też selektywnie pew ne Ugandy. PPA Ra wiąże
w ew nątrzkom órkow e metabolity, ja k i hormony,
prostaglandyny i egzogenne ksenobiotyki. Do grupy
heterodim erycznych receptorów zalicza się także
białka jądrow e, różniące się niektórym i w łaśc iw o ­
ściami od typow ych przedstaw icieli tej rodziny. N ie ­
które, takie ja k COUP, HN F-4 i G C N F w yk azu ją ak­
tywność transkrypcyjną nie tylko w połączeniu z
RXR, ale także jako hom odim ery, choć zazwyczaj ta
aktywność jest wtedy słabsza. Inne, jak np. CAR
(iconstitutive androstane recep to r) m ają swoiste ligandy, ale są aktywne w ich nieobecności. Są dane
wskazujące, że w tych przypadkach Ugand pełni
funkcje inhibitora ekspresji docelow ego genu [4].
Do sukcesów „odwrotnej endok ry nolo gii” zalicza
się odkrycie działania kilku receptorów sierocych,
regulujących przem ianę k w asów tłuszczow ych i ich
pochodnych oraz steroidów. Są to: PPAR (peroxiso­
me p ro life ra to r-a ctiv a ted recep to r), FXR (farnesoid
X rec ep to r), LXR {liv e rX re c e p to r ), PXR (pregnane
X receptor) i C A R (co n stitu tive androstane recep­
tor).
III. PPA R , receptory ak tyw ow ane przez
czynniki proliferacji peroksysom ów
Czynnikam i proliferacji peroksysom ów nazwano
heterogenną grupę substancji, które zw iększają licz­
bę tych organelli w kom órkach i stym ulują go spo dar­
kę lipidów, a zw łaszcza ich usuwanie z osocza. N a ­
leżą tu ksenobiotyki, tzw. fibraty (fenoksyizom aślany), obniżające poziom triglicerydów w osoczu oraz
tiazolidenodionowe
leki
przeciw cukrzycow e.
Wkrótce okazało się, że leki te w iążą się z recepto ­
126
PPARp / 5 m ają trzykrotnie większe kieszonki wiążące
Ugand, niż inne receptory, co um ożliw ia wiązanie
hydroksylow e pochodne kwasu eikozatetraenow ego
— leukotrieny 8 -HETE i 15-HETE oraz fibraty, zaś
PPARX— prostaglandynę P G J 2 i leki typu rezuliny.
Przypuszcza się, że PPAR może pełnić rolę sensora
lipidów, i że to one, a nie jakiś hipotetyczny horm on
są fizjologicznym i Ugandami tych receptorów [3, 4,
7]PPARa indukuje syntezę enzym ów przem iany li­
pidów w różnych strukturach subkom órkow ych: w
peroksysom ach — dw ufunkcyjnej oksydazy acyloCoA/tiolazy 3-ketoacylo-C oA oraz enzym ó w prz e­
miany rozgałęzionych kw asów tłuszczow ych; w mikrosom ach — cytochrom u P450-4-1 i enzym ów
co-oksydacji; w m itochondriach — karboksykinazy
fosfoenolopirogronianow ej, enzym u jabłcz an o w eg o
i dehydrogenazy acylo-C oA [ 6 , 7]. PPAR kontrolują
ekspresję genu FATP ifa tty acid tra n sp o rter pro tein ),
błonowego transportera kw asów tłuszczowych:
PPARa — w wątrobie, a PPARX— w tkance tłu szcz o ­
wej. W regulatorow ym regionie genu FATP znajduje
się elem ent odpowiedzi na PPAR [ 8 ]. PPA RU ma też
udział w kontroli po zakom órkow ego transportu lipi­
dów, zarówno triglicerydów i kw asów tłu szcz o ­
wych, jak i cholesterolu. W cześniejsze o bserw acje o
wpływie fibratów na obniżenie stężenia lipidów w
osoczu znalazły potw ierdzenie w dośw iadczeniach
na myszach pozbaw ionych genu PPARa . Poziom
cholesterolu całkowitego, H D L-cholesterolu i triglicerydów był u nich znacznie wyższy, niż u dzikiego
szczepu. U zw ierząt tych obserw ow ano też
w zm ożoną ekspresję genów apolipoprotein A - 1, A-2
i C-III [9]. W szystkie formy PPAR indukują tran ­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
skrypcję genu cyklooksygenazy-2. P rom otor tego
genu zawiera HRE typu DR-1 [10].
PPARXodgrywa rolę w różnicow aniu preadipocytów. Pojawia się ju ż we w czesnych okresach ro z w o ­
ju kom órek tłuszczowych. W prow adzo ny do fibroblastów indukuje ich różnicow anie do adipocytów.
uniem ożliw ia pow stanie aktywnego heterodimeru
P PA R /R X R [16].
IV. LX R , w ątrobow y receptor X
Stymuluje też różnicow anie m onocytów i makrofagów. W m onocytach ligandy PPARX ham u ją za jego
LXR w ystępuje w dwóch formach: L X R a i LXRp.
Obydwie znaleziono w wątrobie , a LXRp — ponadto
w innych tkankach, a zw łaszcza w mózgu. N atural­
pośrednictw em syntezę cytokin, uczestniczących w
procesach zapalnych [11]. PPA RXm a silny w pływ na
przem ianę lipidów: leki typu rezuliny, które w iążą
się z nim w ybiórczo, p o w odu ją obniżenie zawartości
nymi ligandami LXR są oksosterole: 24,25-epoksycholesterol oraz 24-hydroksycholesterol. Ten p ierw ­
szy obficie występuje w wątrobie i przypuszczalnie
jest głów nym aktyw atorem L X R a . Wysokie stężenie
i transportu lipidów w osoczu, co pośrednio w pływ a
też na stężenie glukozy [12]. PPA RX występuje w
dwu podtypach, 1 i 2. A ktyw atory podtypu-1 p o b u ­
dzają syntezę podtypu-2, a także białka C /E B P a, k tó ­
24-hydroksycholesterolu w m ózgu sugeruje, że jest
on fizjologicznym ligandem LXRp [17].
Stwierdzono, że w hepatocytach HRE dimeru
re reguluje różnicow anie kom órek. Obserw ow ano,
że pociąga to za sobą ham ow anie cyklu k o m ó rk o w e­
go i wzrostu kilku linii kom órek praw idłow ych i n o ­
wotworow ych [13].
Ostatnie badania przyniosły inform acje o o d kry­
ciu swoistego koaktyw atora PPA RX, PGC-1 (PPAR
co a c tiv a to r-l). R eceptor aktyw ow any przez ligand
łączy się z PGC-1. N astępuje zm iana konformacji
koaktywatora, um ożliw iająca jego interakcję z w ie­
loskładnikowym kom pleksem białkowym . K o m ­
pleks ten asocjuje ze składnikam i układu polimerazy II i inicjuje transkrypcję docelow ego genu [14].
Najmniej w iadom o dotychczas o działaniu
PPARp/5, znanego też pod n az w ą PPAR 5 lub N U C -1 .
Forma ta jest silnie aktyw ow ana przez kwasy
tłuszczowe o długim łańcuchu. Stwierdzono, że eks­
presja genu tej formy receptora zachodzi bardzo ak ­
tywnie w początkow ym stadium różnicow ania ad i­
pocytów. A ktywacja PPAR 5 nie w ystarcza jed n ak dla
indukcji późniejszych i końcow ych etapów tego pro ­
cesu, w których niezbędny jest udział PPA RX. PPARS
indukuje transkrypcję genu PPARX, a więc sprzyja
przebiegowi dalszych faz różnicowania. Stymuluje
też ekspresję genu FATP oraz białka wiążącego lipi­
dy w adipocytach.
Wszystkie trzy formy PPAR u czestniczą w p roce­
sie indukcji proliferacji peroksysom ów i enzym ów
P-oksydacji w brązowej tkance tłuszczowej w czasie
jej aklimatyzacji do obniżonej tem peratury [15].
Synteza PPAR jest regulow ana horm onalnie. Glukokortykoidy indukują ekspresję genów PPAR, zaś
insulina i horm on w zrostu—- ham u ją ją. Horm ony
płciowe też m odulują działanie PPAR, gdyż u samic
szczurów odpow iedź kom órkow a na aktywatory
PPAR jest znacznie słabsza, niż u samców. N e g aty w ­
ny wpływ horm onów tarczycy na efekty PPAR m o ­
żna tłumaczyć konkurencją o wiązanie RXR, co
POSTĘPY BIOCHEMII 46(2), 2000
LX R /R X R znajduje się w prom otorze genu hydroksylazy 7 a-ch olesterolo w ej (CYP7A). Enzym ten
katalizuje pierwszy, ograniczający etap szlaku synte­
zy kw asów żółciowych. M ożna sądzić, że aktywacja
tego enzym u przez oksysterol jest częścią m echani­
zmu, zw iększającego w ydalanie cholesterolu [3, 18],
W iadomo, że oksysterole h am ują też syntezę chole­
sterolu, gdyż są represoram i genu reduktazy
H M G -C oA , przy czym działają skuteczniej niż cho­
lesterol. Ich udział w syntezie kw asów żółciowych i
wydalaniu cholesterolu sugeruje, że związki te
pełnią centralną rolę w hom eostazie cholesterolu w
organizmie.
Fizjologiczna rola LXR w tkankach pozawątrobowych, ani jeg o geny docelow e nie s ą n a razie znane.
V. FX R , receptor farnezoidów X
FXR znajduje się w wątrobie, nerkach, jelitach i
nadnerczach ssaków. Wydaje się, że nazwa tego re­
ceptora nie oddaje jeg o roli. N azw ano go tak, gdy o d ­
kryto, że może w iązać farnezoidy w tkankach myszy.
Okazało się jed nak , że u innych zwierząt FXR nie ma
pow inow actw a do farnezoidów, a i u myszy wym aga
wysokich, niefizjologicznych stężeń tych związków.
Naturalnym i aktywatoram i u zwierząt i ludzi okazały
się kwasy deoksyżółciowe. Szczególnie aktywny
jest kwas chenodeoksycholowy. Deoksycholan oraz
litocholan w iążą się z FXR i działają w słabszym
stopniu, natom iast kwas cholow y jest całkowicie p o ­
zbawiony aktywności [19]. Stwierdzono, że w iąza­
nie liganda indukuje zm ianę konformacji receptora,
jego asocjację z RXR oraz w ydatne zwiększenie p o ­
w inow actw a do koaktyw atorów transkrypcji, m.in.
białka SRC-1 [20], Dim er F X R /R X R wiąże się z
HRE typu IR-1 (inverted r e p e a t-1, —>n<—). Reguluje
ekspresję dwu genów, odgryw ających w ażną rolę w
przem ianie kw asów żółciowych. Stwierdzono, że
http://rcin.org.pl
127
FXR aktywuje ekspresję genu białka przenoszącego
kwasy żółciowe z jelit do wątroby, BABP {bile acid
b inding p r o te in ), ham uje zaś gen hydroksylazy
7 a-cholesterolow ej (C Y P7A ). N iesprzężone kwasy
żółciowe aktyw ują F X R we w szystkich tkankach,
natom iast sprzężone z glicyna lub t a u r y n ą — tylko w
tych, w których zachodzi synteza B A B P [21].
Tak oto przem iana k w a só w żółciow ych jest reg u­
lowana przez co najm niej dwa receptory jądrow e:
LXR, aktyw ow any przez oksysteroidy pobudza syn ­
tezę poprzez indukcję C Y P 7A , zaś FXR, ak tyw ow a­
ny przez kwasy deoksyżółciow e, ham uje ten proces
na drodze sprzężenia zw rotnego, jedn ocześn ie zaś
pobudza transport jelitow o-w ątrobow y.
VI. PX R , receptor p regnanu X
Odkrycie PX R rzuciło światło na m echanizm y in­
dukcji cytochrom ów P 450 przez nieswoiste ksenobiotyki. Okazało się, że wiele zw iązków chem icz­
nych łączy się z PXR, aktyw ując pow stanie jeg o dimeru z R X R i asocjację z HRE, m ieszczącym się w
prom otorze genu hydroksylazy C Y P3A 4, a w rezul­
tacie — ekspresję tego genu. H ydroksylaza C YP3A4
katalizuje utlenienie i inaktyw ację co najmniej
połowy znanych ksenobiotyków, indukujących syn­
tezę tego enzymu, w tym antybiotyków, leków przeciwgrzybiczych, glukokortykoidów , inhibitorów reduktazy H M G -C oA i innych. P X R w ystępuje w tkan­
kach, w których zachodzi synteza hydroksylazy
CYP3A4, tzn. w w ątrobie i jelitach [22],
Aktywatoram i PXR okazały się też endogenne
steroidy: pregnany, estrogeny, kortykosteroidy i ich
metabolity. S zczególną ak tyw n ością odznacza się
pochodna progesteronu, 5|3-pregnano-3,20-dion.
W szystkie steroidy w iąż ą sie z PXR w stężeniach
nieco wyższych niż fizjologiczne. Być m oże PX R i
indukowana z jego udziałem hydroksylaza CYP3A 4
biorą udział w katabolizm ie steroidów i usuw aniu ich
nadmiaru [3].
VII. R eceptory o konstytutyw nej aktyw ności
Wykryto istnienie grupy receptorów sierocych,
które okazują aktyw ność tran saktyw acy jną w n ie­
obecności ligandów. N a le żą do nich mało dotychczas
poznane COUP, HNF4, M B67 i inne. N iektóre z nich
m ogą tworzyć zarów no heterodim ery z RXR, ja k i
homodimery. Na przykład H N F 4 {hepatocyte n u cle­
ar fa c to r-4 ) wiąże się w postaci hom odim eru z HRE
typu DR-1 i w ykazuje silne działanie transaktyw acyjne. Grupa receptorów C O U P -1, C OUP-2 i
COUP-3, (znanych też po n a z w ą EAR2, EAR3 i
128
ARP1) działa jak o dom inujący represor podstaw o­
wego poziom u transkrypcji, a także transaktywacji
genów, indukowanej przez RAR, V D R i TR. W yka­
zano to w dośw iadczeniach z użyciem transfekowanych kom órek, w których gen lucyferazy sprzęgano z
prom otorem , zaw ierającym HRE dla tych recepto­
rów. CO U P m ają silne p ow inow actw o do RXR, więc
niektórzy autorzy przypuszczają, że ham owanie
transaktyw acji w yw oływ anej przez heterodimery
polega na konkurencji o m iejsce w iążące w R X R [4],
Z tkanek m yszy izolowano CAR, konstytutyw ny
receptor androstanów. W wyniku alternatywnego
składania m ysiego genu m car p ow stają dwie formy:
CAR1 (CARp) je s t aktywny, zaś C A R 2, pozbaw iony
C-końcowej dom eny nie w ykazuje aktyw ności transaktywacyjnej. CAR1 je s t spokrew niony z ludzkim
M B 67(hC A R ). CAR1 wiąże się z R X R i jak o hetero­
dim er rozpoznaje HRE typu DR-5 [23],
CARp w ystępuje w znacznych ilościach w w ątro­
bie. P oszukiw anie jego naturalnych ligandów dopro­
wadziło do odkrycia, że wiąże się on w ybiórczo z androstanolem i androstenolem . A ndrostan, dihydroandrosteron i testosteron są całkow icie po zbaw ione ak ­
tywności, w ykazu ją j ą bow iem jedyn ie 3 a -h y d ro k sy
pochodne androstanu, zredukow ane w pozycji 5.
Przyłączenie liganda nie obniża zdolności dim eryzacji receptora z RXR, ani wiązania dim eru z HRE, n a­
tomiast ham uje transaktyw ację, w y k a zy w an ą przez
wolny heterodimer. W przypadku innych znanych re­
ceptorów jąd row ych, przyłączenie liganda pow oduje
zm ianę konformacji regionu AF-2, um ożliw iając in­
terakcję receptora z koaktyw atoram i transkrypcji.
Autorzy postulują, że w C A R region ten przybiera
akty w ną konform ację w nieobecności liganda, zaś
przyłączenie tego ostatniego pow oduje utratę p o w i­
now actw a do koaktywatora. Jak się w ięc wydaje, z a ­
daniem liganda je s t ham ow anie konstytutyw nej
transaktyw acji genów docelow ych przez dim er
C A R /R X R [24]. Nie je s t w ykluczone, że taki m ech a­
nizm działania ma też m iejsce w przypadku innych
receptorów konstytutyw nych, jed n ak nieznajom ość
ich ligandów pozostaw ia taki w niosek w sferze d o ­
mysłów.
Ostatnio odkryto je d e n z genów regulow anych
przez CARp. Koduje on h ydroksylazę steroidow ą
CYP2B, uczestniczącą w hom eostazie horm onów
steroidowych. H am ow anie jej syntezy przez p o c h o d ­
ne androstanu m oże stanowić je d en z m echanizm ów
regulacji przem iany tych ho rm onów [1 ]. C A R ak ty ­
wuje też prom otor genu receptora kw asu retinowego,
RARp2. Jak wiadom o, g łów nym induktorem R A R
jest kwas retinowy. Być może rola C A R polega na
utrzym yw aniu p odstaw ow ego poziom u ekspresji
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
genu jedn ego z typów RAR, niezależnie od obecno­
ści RA w kom órce [23],
V III. U w agi końcow e
O dkrycie ligandów opisanej grupy heterodimerycznych receptorów jąd ro w y ch (już nie) sierocych,
pozw ala na lepsze zrozum ienie regulacji przem iany
lipidów. Odbyw a się ona na poziom ie transkrypcji
genów wielu en zym ów i innych białek, uczest­
niczących w m etabolizm ie k w asów tłuszczowych,
triglicerydów i steroidów. A ktyw atoram i opisanych
receptorów s ą m .in . endogenne substraty i m etab oli­
ty, co um ożliw ia regulację typu sprzężenia zw ro tne­
go, zaś ligandy m o g ą pełnić funkcję czujników m eta­
bolicznych.
O tw ierają się now e perspektyw y leczenia za b u ­
rzeń przem iany lipidów. Szczeg óln ą uw agę badaczy
przyciąga ostatnio PPAR, ze względu na to, że jego
ligandam i są leki. U czestniczy on w różnicow aniu
adipocytów i innych kom órek oraz w procesach za­
palnych. Zapew ne niedługo PPAR będzie wym agać
osobnego omówienia.
W yjaśniają się też m echanizm y regulacji hydroksylaz, związanych z cytochrom em p450, w tym także
enzym ów indukow anych przez ksenobiotyki.
N ależy oczekiwać, że odkrycie ligandów innych
heterodim erycznych receptorów sierocych p rzyn ie­
sie równie interesujące informacje.
Artykuł otrzymano 27 stycznia 2000 r.
Zaakceptowano do druku 13 marca 2000 r.
Piśm iennictw o
1. M a n g c l s d o r f
D J , E v a n s R M (1995) Celi 83:
841-850
2. K a s t n e r P , M a r k M , C h a m b ó n P (1995) Ccii 83: 859-869
3. K l i e v e r S A , L e h m a n n J M , W i l l s o n T M (1999)Scien­
ce 284: 757-760
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
4. M a n g e l s d o r f D J , O n g E S , D y c k J A , E v a n s R M
(1990) Nature 345: 224-229.
5. K w i a t k o w s k a D, K w i a t k o w s k a - K o r c z a k J (1999)
Post B iolK om 26: 579-592
6. C o s t c t P, L e g e n d r e C h , M o r e J , E d g a r A, G a l t i e r
P (1998) J Biol Chem 273: 29577-29585
7. E l l i n g h a u s P, W o l f r u m B I , A s s m a n G, S p e n e r F ,
S e e d o r f U (1999) J Biol Chem 274: 2766-2772
8. F r o h n e r t B I , H u i T Y , B e r n l o h r D A (1999) J Biol
Chem 274: 3970-3977
9. P e t e r s J M , H e n n u y e r N, S t a e l s B, F r u c h a r t J - C ,
F i e v e t C, G o n z a l e s F J , A u w e r x J (1997) J Biol Chem
272: 27307-27312
10. M e a d e E A , M c I n t y r e T M , Z i m m e r m a n G A , P r e ­
s c o t t S M (1999 ) J Biol Chem 274: 8328-8334
1 1 . J i a n g C H , T i n g A T , S e e d B (1998) Nature 391: 82-86
12. L e h m a n n J M , M o o r e L B , S m i t h - O l i v e r T A , W i l ­
k i n s o n W O , W i l l s o n T M , K l i e v e r S A (1995) J Biol
Chem 270: 12953-12956
13. H a n s e n J B , P e t e r s e n R K , L a r s e n B M , B a r t k o v a
J, A l s n e r J, K r i s t i a n s e n K (1999) J Biol Chem 274:
2386-2393
14. P u i g s e r v e r P, A d e l m a n t G, W u Z, F a n M, X u J,
O ’ M a l l e y B, S p i e g e l m e n B M (1999) Science 286:
1368-1371
1 5 . G u a r d i o l a - D i a z H M , R e h n m a r k S, U s u d a N , A 1breksten
T,
Feltkamp
D,
Gustafsson
JA,
A l c x s o n E H (1999) J Biol Chem 274: 23368-23377
16. Z h o u Y - C h , W a x m a n D J (1999) J Biol Chem 274:
2672-2681
1 7 . T e b o u l M, E n m a r k E, Li O, W i l k s t r o m A C , P e l t o - H u i k k o M, G u s t a f s s o n J A (1995) Proc Natl Acad Sei
USA 92: 2096-2100
18 . L e h m a n n J M , K l i e v e r S A , M o o r e L B , S m i t h - O ­
l i v e r T A , O l i v e r B B , Su J - L , S u n d s e t h SS, W i n e gar DA, B l a n c h a r d DE, S p e n c e r TA, W i l l s o n
T M (1997) J B io l Chem 272: 3137-3140
19. P a r k s D J , B l a n c h a r d S G , B l e d s o e R K , C h a n d r a
G, C o n s l e r T G , K l i e v e r S A , S t i r n m e l J B , W i l l ­
son TM, Z a v a c k i AM, Mo o r e DD, L e h m a n n JM
(1999) Science 284: 1365-1368
20. M a k i s h i m a M, O k a m o t o A Y , R e p a J J , T u H, L e ­
a r n e d R M , L u k A, H u l l M V , L u s t i g K D , M a n ­
g e l s d o r f D J , S h a n B (1999) Science 284: 1362-1365
21. G u s t a f s s o n J - A (1999) Science 284: 1285-1286
2 2 . M a u r e l P (1996) w : J o a n n i d e s C (red) Cytochromes P450.
M etabolie and Toxicological Aspects. CRC Press, Boca Raton str
241-270
23. C h o i H - S , C h u n g M, T z a m e l i I, S i m h a D, L e e
Y K , S e o l W, M o o r e D D (1997) J Biol Chem 272:
23565-23571
24. F o r m a n B M , T z a m e l i I, C h o i H - S , C h e n J, S i m h a
D, S e o l W, E v a n s R M , M o o r e D D (1998) Nature 395:
612-615
http://rcin.org.pl
129
Geny syntaz tlenku azotu: struktura, regulacja ekspresji,
produkty białkowe
Genes of nitric oxide synthases: structure, regulation of
expression, protein products
NATALIA DEREBECKA1, MARCIN
TRZECIAK3
HOŁYSZ2, WIESŁAW
H.
Spis treści:
Contents:
I. Wstęp
II. Struktura genów syntaz tlenku azotu
II-I. Regiony regulatorowe genów N os
I I - l- l. N o s i
II-1-2. Nos2
II-1-3 .N o s3
III. Modyfikacje transkryptów genów Nos
U l- l.N o s l
U l-2.N os2
III-3. Nos3
IV. Produkty białkowe genów Nos
V. Uwagi końcowe
I. Introduction
II. Structure of nitric oxide synthase genes
II-l. Regulatory regions of Nos genes
I I -l-l. N o sl
II-1-2. Nos2
II-1-3. Nos3
III. Modifications of Nos gene transcripts
III-1. A to /
111-2. Nos 2
U l-3. Nos3
IV. Protein products of Nos genes
V. Concluding remarks
Stosowane skróty: BH4 — tetrahydrobiopteryna; CaM — kalmodulina; m.cz. — masa cząsteczkowa; kD — 1000 daltonów;
kpz — 1000 par zasad; NOS 1 — neuronalna syntaza tlenku azo­
tu; NOS2 — indukowalna syntaza tlenku azotu; NOS3 — endotelialna syntaza tlenku azotu; nt — nukleotydy; pz — pary za­
sad; poz. — pozycja; M — zasada A lub C; N — dowolna zasa­
da; R — zasada A lub G; S — zasada C lub G; W — zasada A lub
T; Y — zasada T lub C. 3 ’UTR — region 3 ’ transkryptu nie ule­
gający translacji, 5 ’UTR — region 5 ’ transkryptu nie ulegający
translacji.
azotu (NO) i cytrulina (R y c .l) [3-11]. Reakcje te są
I. W stęp
Tlenek azotu je s t nietrw ałym gazem , o okresie
półtrwania (ti/2) rzędu kilku sekund. M a on charakter
wolnego rodnika, reaguje więc szybko z cząsteczka­
mi zawierającym i niesparow any elektron [1 ,2 ]. T le­
nek azotu powstaje w w yniku dwóch reakcji, w któ­
rych reszta guanidynow a L-argininy ulega pięcioelektronow em u utlenieniu. Produktam i są tlenek
'Studentka (magistrantka), 2student (magistrant), 3prof. dr hab.,
Katedra i Zakład Chemii Fizjologicznej, Akademia Medyczna
im. Karola Marcinkowskiego, ul. Święcickiego 6, 60-781 Po­
znań
130
katalizow ane przez syntazę tlenku azotu (NO S) [12,
13]. Do tej pory zidentyfikow ano trzy izoformy ludz­
kiej NOS: n e u r o n a ln ą (N O S l), ind uk o w aln ą(N O S 2 )
i endotelialną (NOS3). W szystkie izoformy zaw ie­
rają żelazo hem ow e oraz dom eny wiążące FAD,
FM N, tetrahydrobiopterynę (B H 4), kalm odulinę
(CaM ) i N A D PH [ 3 , 7 , 8 , 11, 13-17], Mimo to h o m o ­
logía sekwencji am inokw asów trzech izoform nie
przekracza 60% [7, 18, 19]. We wszystkich izoform ach stwierdza się m iejsca potencjalnej fosforylacji
przez kinazy białkow e [19, 2 0 ],
W 1980 r. F u r c h g o t t i Z a w a d z k i p ro ­
wadząc badania nad w pływ em acetylocholiny na na­
czynia krwionośne, odkryli nieznany dotąd czynnik
uw alniany pod w pływ em acetylocholiny przez k o ­
mórki śródbłonka, nazwany śródbłonkow ym czynn i­
kiem rozkurczającym (en d o th eliu m -d erived relaxing
fa c to r , ED R F ) [21]. W 1987 r. I g n a r r o wykazał, iż
EDRF to tlenek azotu [22, 23]. W tym sam ym roku
potwierdził to M o n e a d a [24], Zanim poznano fi­
zjologiczną rolę NO w organizmie, w iadom o ju ż
było dzięki pracom M u r a d a , że je s t on uw alniany
z nitrogliceryny i innych azotanów. W ykazano, że
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
NO odpow iada za ich efekty farm akologiczne, które
okazały się zależne od aktywacji cytosolowej cyklazy guanylanow ej katalizującej reakcję przem iany
Celem pracy jest om ów ienie i przedyskutowanie
najnowszych badań pośw ięconych strukturze i transkrypcji genów syntaz tlenku azotu, ze szczególnym
NH2
C =
NH2
NH2+
C
|
NH
|
NADPH NADP+
+ H3N — C — H
N+— OH
NOS
C=
j
>
(CH2)3
+H3N —
c
O
NH
|
COO"
L - arginina
=
H
NH
+ 02
(CH2)3
nh2
— H
COO'
N - hydroksy - L - arginina
NOS
NO
+
|
(CH2)3
+ H3N — C — H
COO'
L - cytrulina
Ryc. 1. Przebieg reakcji biosyntezy tlenku azotu
GTP w cykliczny GM P (cGM P) [25-27], W 1998 r.
F u r c h g o t t o w i , I g n a r r o oraz M u r a d o w i
przyznano N agrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i
m edycyny za odkrycie roli tlenku azotu jako
cząsteczki sygnałowej w organizm ie [1, 28]. Tlenek
azotu odgrywa rolę cząsteczki sygnałowej w
układzie krążenia, ośrodkow ym i obw odow ym
układzie nerw ow ym oraz w układzie im m u nologicz­
nym [ 1 , 3 ,5 , 29, 30], N iepraw idłow ości jeg o syntezy
m ogą w yw oływ ać m iażdżycę tętnic, chorobę nied o­
krw ienną serca, nadciśnienie tętnicze, choroby
układu nerw ow ego i now otw ory oraz pozostają w
zw iązku z infekcjami bakteryjnym i, wirusowym i,
cukrzycą, patologią ciąży i in. [3, 5, 31].
W układzie krążenia NO obniża napięcie mięśniówki gładkiej ścian naczyń krw ionośnych i u trzy­
muje prawidłow e ciśnienie krwi. Za stałe uwalnianie
NO odpowiedzialne jest oddziaływ anie przepły­
wającej krwi na śródbłonek i aktyw acja kanałów K+
(tzw. sh ear stress) [5, 32, 33], W spółdziałając z prostacykliną PGI2, uw alnianą z endotelium [9, 34], NO
zapobiega rozwojowi blaszki m iażdżycowej ha­
mując agregację płytek krwi oraz uwalnianie z nich
trom boksanu, serotoniny, czynnika aktywującego
płytki (PAF) i czynnika wzrostu pochodzenia płytko­
w ego (PDGF) [1, 3, 4, 25, 35-37],
W polskim piśm iennictw ie pojawiły się pu blika­
cje traktujące o roli NO w organizm ie [1, 3, 5, 29],
jed n ak w żadnej z nich nie znaleźliśm y szerszych in­
formacji na tem at struktury genów syntaz tlenku azo­
tu i regulacji ich ekspresji.
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
uw zględnieniem N os3. W pracy pom inięto szcze­
gółowe rozw ażania dotyczące transkrypcji genów
N o s i i N os2 oraz m echanizm u działania NO w p o ­
szczególnych tkankach, a także efektów biologicz­
nych zw iązanych z jeg o pow staw aniem , ponieważ
kwestie te zostały om ów ione we wcześniejszych
opracowaniach.
11. Struktura genów syntaz tlenku azotu
Znana jest struktura cD NA i genów trzech izoform ludzkiej syntazy tlenku azotu (Tab. 1). Geny te
m ają zbliżoną liczbę eksonów: gen N o s i -29, a geny
N os2 i N os3 po 26 eksonów. W ielkość genu N o si w y ­
nosi ok. 160 kpz, a eksony m ają długość od 59 do
2150 pz [38], Gen N os2 obejm uje ok. 37 kpz, a w iel­
kość eksonów wynosi od 50 do 586 pz [39]. Gen
N o s3 ma wielkość około 21 kpz, a eksony m ają
długość od 6 8 do 580 pz [19,40] (Tab. 3). Lokalizacji
genów Nos dokonano dzięki zastosow aniu metody
FISH, w której komórki hybrydow e, człowieka i gry­
zonia poddano hybrydyzacji z sondą znakow aną flu­
orescencyjnie. Stwierdzono, że gen każdej z izoform
zlokalizow any jest na innym chromosom ie: N o s i na
12, N os2 na 17, a N os3 na 7 [6 , 7, 41].
II-L Regiony regulatorowe genów Nos
II-l-l. Nosi
Po stronie 5 ’ genu N o s i znaleziono sekwencję
TATA (TATA-box), u m iejsco w io ną w poz. -28 [38],
http://rcin.org.pl
131
Do sekwencji tej przyłącza się czynnik TBP (TA-
prom otorze genu stwierdza się także m iejsce wiąza­
nia czynnika A P 1 oraz siedem miejsc w iązania czyn­
nika AP2. Prom otor tego genu zawiera również se­
TA-box b in d in g p ro te in ), o masie cząsteczkowej ok.
30 kD, który tworzy, wraz z sekw encją TATA , podTabela 1.
Geny syntaz tlenku azotu
Izoforma
nos 1
nos 2
nos 3
12q24,2
17qcen-ql2
7q35-36
29
26
26
Długość eksonów
59-2150 pz
51-586 pz
67-579 pz
Długość intronów
25 - 0,3 kpz
6 - 0,1 kpz
4 - 0 , 1 kpz
160 kpz
37 kpz
21 kpz
Lokalizacja na chromosomie
Liczba eksonów
W ielkość genu
stawę kom pleksu inicjującego transkrypcję. Spośród
innych czynników, m ających w prom otorze genu
N o s i swoje m iejsca w iązania m ożna wymienić:
CREB (cA M P response elem ent binding p ro te in ) w
poz. + 6 6 , czynnik N F kB (dwie identyczne sek w e n ­
cje w poz. -316 i -501), czynnik jąd ro w y 1 (NF1), w
poz. -1090, białka Ets w poz. -1116 i -1500,
TEF-1/M C B F w p o z . -263 iN R F -1 {nuclear resp ira ­
tory fa c to r ) w poz. -742. C zynnik transkrypcyjny
NFkB, składa się z dw óch podjednostek (65 kD i 50
kD), po odłączeniu ufosforylow anego przez kinazę
białkow ą C inhibitora IkB, którym jest pirolidynoditiokarbaminian (p yrrolidinedithio carbam ate), prze­
chodzi on do jąd ra kom órk ow ego , wiąże się z pro­
motorem, a także z sekw encjam i znajdującym i się w
obrębie w zm acniacza transkrypcji (en h a n cer) [42],
Prom otor genu N o s i zaw iera także dwie odwrócone
sekwencje C A A T (ATTG) w poz. -106 i -112 [38].
II-1-2. N os2
Prom otor genu N os2 zaw iera kasetę TATA um iej­
scow ioną w poz. -30 [39,43]. Kaseta TATA i sek w e n ­
cje zgodne dla elem entów odpow iedzi na interferon
gam m a (yIRE) znajdują się w poz. -975 i -900 [38,
39, 43- 47]. W fragm encie o długości 425pz po stro­
nie 5 ’ genu znajdują się m iejsce w iązania czynnika
NFkB [7, 38, 39, 42, 43, 45, 47, 48] i m iejsce w iąza­
nia aktywatora A odp ow iedzialnego za tkankow o-specyficzną ekspresję w w ątrobie [39, 43] oraz
kwencje rozpoznaw ane przez wiele innych czynni­
ków, np. lipopolisacharyd (LPS) [7, 39, 44, 45, 47,
51, 52],
II-1-3. A t o i
Prom otor genu N os3 nie zawiera kasety TATA, co
je s t charakterystyczne dla genów ulegających kon­
stytutywnej ekspresji [19, 40, 53-55]. Prom otory g e­
nów, pozbaw ione sekwencji TATA, obok głównego
miejsca, w y kazują istnienie wielu drugorzędnych
miejsc startu transkrypcji [19, 56], T ranskrypcja tych
genów w ym aga krótkiej sekwencji bogatej w pary
GC, która jest miejscem wiązania czynnika tran­
skrypcji Spl [19, 47, 52-55, 57]. Czynnik S p l, p o ­
dobnie jak Sp2, Sp3 i Sp4 należy do rodziny czynni­
ków transkrypcyjnych zaw ierających m otyw palców
cynkowych. Czynnik ten w ykorzystyw any je s t przez
polim erazę II RNA i w spółpracuje z innymi czynni­
kami transkrypcji [19, 53, 56, 57]. Dowiedziono, że
jest on niezbędny do konstytutyw nej ekspresji genu
N os3, który w regionie regulatorow ym zaw iera dwa
miejsca wiązania Spl w poz. -104 i -1327 [19, 53]. Z
prom otorem genu N os3 łączy się także czynnik Sp3,
nie stwierdzono natom iast w iązania czynników Sp2 i
Sp4 [19, 53]. W bezpośrednim sąsiedztw ie m iejsca
palindrom ow y elem ent odpow iedzi na T N F a [39,
43, 49], Dowiedziono, że czynnik ten uczestniczy ta­
kże w ekspresji genu N os2, indukowanej przez interleukinę ip ( I L - ip ) [42, 46, 49, 50]. M utacje w m iej­
Spl (-104), w poz. -108, znajduje się sekw encja roz­
poznaw ana przez tkankow o-specyficzne czynniki
transkrypcji należące do rodziny GATA, posiadające
struktury palców cynkow ych [19, 53, 57-59]. Region
regulatorowy genu N os3 zawiera też cztery inne
przypuszczalne m iejsca GATA w poz.: -230, -555,
-610 i -1136 [19, 53, 57-59]. Podobnie ja k prom otory
innych genów, ulegających ekspresji ko n sty tu ty w ­
scu wiązania aktyw atora A oraz w regionie
wiążącym czynnik N F k B po w o d u ją obniżenie ak­
tywności transkrypcyjnej prom otora N os2 [50]. W
nej, prom otor genu N o s3 , w pozycji -290, zawiera
kasetę CAAT, z którą w iążą się czynniki transkrypcji
NF1 i NF3 [52]. Czynnik NF1, który wiąże się także
132
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
w poz. -947 i -1211, jest aktywny w formie ufosforylowanej i jego działanie w yw ołuje ok. 50-krotne
zw iększenie poziom u transkrypcji genu N os3 [19,
60], Działanie NF1 je s t zw iązany z odpo w ied zią k o ­
genu. M iejsce wiążące (-136), zawiera m otyw
R R R C W W G Y Y Y [19, 72]. Sądzi się, że wiązanie
p53 m oże mieć zw iązek z zah am ow aniem przez NO
proliferacji kom órek i zapobieganiem replikacji
mórek na czynnik w zrostu TGF-[3 [19, 60, 61]. D o ­
w iedziono, że kasety GC i C A A T w p ły w a ją na ak ­
tywność transkryp cyjn ą także wtedy, gdy znajdują
się na nici matrycowej [10]. Taki przypadek ma m iej­
sce w regionie regulatorow ym genu N os3, w którym
oprócz kasety C A A T i sekwencji GC występują: od­
uszkodzonego DNA.
w rócona sekwencja C C A A T (A T TG G ) w poz. -631
oraz kaseta GC w poz. -1327 [19]. Prom otor genu
Transkrypcja genu N o s i zachodzi w okresie ro z­
woju układu nerw ow ego oraz ulega indukcji w w y n i­
N os3 zawiera także sekw encję T G A C G T C A , zw aną
CRE (cA M P response elem ent), w iążącą białka
CREB i C R E M (cA M P response elem ent m od u la ­
tor), które m o g ą być fosforylow ane przez kinazę
białkow ą A (PKA). Białka te są aktyw ne w formie
hom odim erów i zaw ierają strukturę zam ka leucynowego (leucine zip p er) [19, 62]. W prom otorze genu
N os3 zlokalizow ano także dwa m iejsca ro z po znaw a­
ne przez czynnik A P I (sekw encja T G A S T C A w p o ­
ku uszkodzenia układu nerw ow ego [33]. Istnieje co
najmniej 8 różnych prom otorów inicjujących tran­
skrypcję, z których każdy w innym stopniu ulega
tkankow o specyficznej ekspresji [7]. Wykryto sześć
różnych izoform transkryptu genu N o s i powstałych
w w yniku alternatyw nego składania [73]. Około 5%
transkryptów wykazuje brak dw óch eksonów k o ­
zycji -661 i -1530) i dwa m iejsca w iązania czynnika
AP2 (sekwencja C C C C C M N S S S w pozycji -191 i
-1162) [19, 63, 64]. C zynniki A P I i AP2 (activator
p ro tein ) w iążą się z prom otoram i i sekwencjam i
w zm acniającym i transkrypcję [52], są one pro duk ta­
mi protoonkogenów c-fos i c-jun, zaw ierają struktury
zam ków leucynow ych i w y stępują w formie heterodimerów. Czynnik A P I odgryw a rolę w indukcji
transkrypcji przez onkogenne estry forbolu i reaguje
także na zm ianę stężenia cA M P w kom órce [19, 52,
63, 65]]. P rom otor genu N os3 zawiera również, w
poz. -985, sekw encję G A G A C C , elem ent o dpo w ie­
dzi na sh ea r stress [7, 32, 33, 48, 52, 65, 6 6 ], M otyw
ten zw iązany je s t z aktyw acją transkrypcji genu N os3
w yw ołaną naporem krwi na śródbłonek naczyń
krw ionośnych i aktyw acją kanałów potasowych. D o ­
wiedziono bowiem , że antagonista transportu jon ów
K+ hamuje indukcję genu N o s3 w y w o ła n ą przez sh e ­
ar stress [32], Proces ten jest niezależny od kinazy
białkowej C (PKC), poniew aż jej selektyw ny inhibi­
tor nie hamuje indukcji genu N o s3 wywołanej przez
shea r stress [32],
W prom otorze genu N os3 w poz. -1383, stw ier­
dzono także dwie, sąsiadujące ze sobą sekwencje
G TG SG G TG , stanowiące negatyw ny elem ent o dp o­
wiedzi na steroidy [19, 6 6 , 67]. P rom otor genu N os3
może także wiązać jo n y metali ciężkich, np. Co (se­
kwencja TG C R C Y C w poz. -899), które h am ują eks­
presję genu [19, 6 8 , 69].
Z prom otorem genu N os3 wiąże się również
białko p53. Istnieją dowody, że p53 może aktywow ać
[19,70] lub ham ow ać [19, 71] transkrypcję tego
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
III.
M od yfikacje tran skryptów genów Nos
III-I. N o si
dujących am inokw asy w m iejscu wiązania CaM, co
pow oduje utratę w łaściw ości katalitycznych białka
[52]. A lternatyw ny sp licin g pozw ala na tworzenie
białek o różnych w łaściw ościach i różnej strukturze,
np. izoform a N O S1-P zachow uje pełną aktywność
enzym atyczną, lecz traci d om enę odpow iedzialną za
oddziaływ anie białko-białko, kon ieczną do kierow a­
nia jej do błony synaptycznej [73]. Zaburzenia skła­
dania w wyniku których następuje utrata eksonu 2 ,
m ogą w yw oływ ać objawy kliniczne zagrażające ży ­
ciu [73], Ciekawe przypadki alternatywnego składa­
nia odkryto w gonadzie męskiej [73]. Ekson 1 lub
jego w ersja 1 [3 łączą się z eksonem 2 , z kolei struktu­
ra ekson 1 -ekson 2 lub ekson l^ -e k so n 2 przyłącza
się do eksonu 4, lub też ekson 1 m oże łączyć się b ez­
pośrednio z eksonem 4. Translacja takiego m RNA
zaczyna się w eksonie 5.
W gonadzie męskiej zidentyfikow ano również
m R N A , w którym ekson 2 uległ insercji między eksony 3 i 4 co pow odow ało, że translacja zaczynała się
w eksonie 2. Insercja eksonu 2 powoduje także p rze­
sunięcie ramki odczytu i w prow adza przedwczesny
kodon stop (TGA). W śród form „splicingow ych”
niespecyficznych tkankowo, zaobserw ow ano delecje eksonów 9 i 10 [38, 47] lub delecję tylko eksonu
10 [38]. Jeżeli wycięciu ulegn ą eksony 9 i 10, obej­
m ujące 315 nukleotydów kodujących aminokwasy
znajdujące się w sąsiedztwie m iejsca wiązania CaM,
powstałe białko, o m. cz. 149 kD, jest zbudow ane z
1329 am inokwasów . Delecja eksonu 10 powoduje
ubytek 175 nukleotydów i prow adzi do przesunięcia
ramki odczytu i w prow adzenia przedw czesnego kodonu stop. Powstałe białko, o m. cz. 62 kD, składa się
zaledwie z 560 am inokw asów [38].
http://rcin.org.pl
133
III-2. N os2
stwierdza się również w m onocytach i makrofagach,
a także w płytkach krwi [1, 57, 79-82], Chociaż eks­
Ekspresję genu N os2 indu kują endotoksyny b ak ­
teryjne np. LPS i cytokiny: interferon-y (INF-y),
my. Pojawia się tzw. stan refrakcji na LPS, w tym sta­
nie kolejne dawki endotoksyny nie p o w odu ją d alsze­
go zw iększenia aktyw ności N O S [51]. Indukcję
presja genu N os3 jest głównie konstytutyw na, to w
pew nych w arunkach może być regulow ana jego tran­
skrypcja i stabilność m R N A [83]. Ekspresję genu
w zm agają estrogeny oraz sh ea r stress, a także
T G F -p i [1, 32, 84]. N atom iast T G F - a zmniejsza
ilość produktu białkow ego genu, pow odując destabi­
lizację m R N A (okres półtrwania maleje wtedy z 48
do 3 godz.) [19, 52, 85-87],
A lternatyw ny sp licin g m oże mieć udział w potranskrypcyjnej regulacji produkcji NO.
N os2 w yw o łują ponadto kwas pikolinowy, a także
ozon, prom ieniow anie UV oraz infekcje bakteryjne
[47]. Ekspresja NOS m oże być także ham ow ana
Produkt transkrypcji genu N o s3 na końcu 3 ’ nie
zawiera typowego dla wielu genów sygnału poliadenylacji. M iejsce poliadenylacji znajduje się 16 nu-
przez im m unom odulatory na poziom ie transkrypcji
lub potranskrypcyjnie. [52], W regulacji potranskrypcyjnej uczestniczy IFN-y, który m oże stabilizo­
kleotydów w kierunku 3 ’ za sekw encją ACTAAA,
przypuszczalnym sygnałem poliadenylacji [19],
Transkrypt zawiera ponadto dwie sekwencje
A U U U A , które ja k w iadom o destabilizują m R NA i
są obecne w kilku labilnych transkryptach innych g e­
nów endotelialnych [19, 8 8 ]. Jednak pom im o stwier­
dzenia tych sekwencji transkrypt jest stabilny (okres
półtrwania wynosi ok. 24 godz.) [19, 8 8 ]. Nie w iado­
I L - lp ,TNF-ot i IL - 6 [43, 45, 50, 52, 74-77], Po p o da­
niu LPS następuje indukcja m R N A dla NOS 2,
wzrost aktywności syntazy i akum ulacja cytruliny w
hepatocytach. Jednak po 12 godzinach aktywność
enzymu oraz akum ulacja cytruliny w racają do n o r­
wać m RNA, podczas gdy TGF-|3 destabilizuje
m R N A i zm niejsza w ydajność jeg o translacji [52],
Nie jest wykluczone, że ekspresja genu N os2 może
zachodzić konstytutyw nie. O bserw uje się taką eks­
presję w niektórych tkankach, np. w siatkówce oka,
móżdżku, mięśniach szkieletow ych i nerce [47].
Stwierdzono w ystępow anie dw óch izoform transkryptu w siatkówce (4,5 i 4,2 kz ), natom iast po j e d ­
nej w m óżdżku (4,5 kz) i w m ięśniu szkieletowym
(4,2 kz) [78].
Ludzki transkrypt genu N os2 ma długi 5 ’-UTR,
zawierający osiem otw artych ram ek odczytu {ORF),
poprzedzających kodon start (AU G) i częściowo
nakładających się na siebie [43]. Znaleziono cztery
miejsca, w których zachodzi alternatyw ny splicing,
w wyniku którego m o g ą pow staw ać różne formy
m R NA różniące się sek w e n cją 5 ’-UTR [76]. Nie
wykryto natom iast alternatyw nego składania, w
3 ’-UTR [43],
Stężenie m R N A N os2 jest regulow ane na pozio ­
mie transkrypcji i potranskrypcyjnie, poprzez regu­
lację stabilności m RNA. Zw iększenie stężenia izo­
form transkryptu genu N os2 przez cytokiny może
tłumaczyć ich rolę w utrzym yw aniu lub w zw iększa­
niu aktywności N OS2 podczas infekcji lub o dp ow ie­
dzi zapalnej [76]. A ltern aty w ny sp licin g może
mo dokładnie jak ie czynniki zewnętrzne m o g ą desta­
bilizować ten m R NA. Stw ierdzono co prawda, że
TNFoc obniża stężenie m R N A dla NOS3, efekt ten
jest jed nak k on sek w en cją nie tylko destabilizacji
m R N A lecz także represji transkrypcji genu N o s3
[19, 85-87],
Wiadomo, że poziom ekspresji genu N os3 jest
ściśle zw iązany ze wzrostem i rozw ojem komórek.
W kom órkach proliferujących stężenie m R N A N os3
jest czterokrotnie wyższe w porównaniu do komórek
nie dzielących się. Co ciekawe, w obydwu przypad­
kach nie ma różnicy w poziom ie transkrypcji genu
N os3, natom iast okres półtrw ania transkryptów N os3
jest trzykrotnie dłuższy w kom órkach prolife­
rujących. Przypuszczalnie w regulacji stabilności
m R N A w ażną rolę odgryw a sekwencja 43 nt w
3 ’UTR, do której przyłącza się białko o m. cz. 51 kD.
Stwierdzono, że delecja tej sekwencji zw iększa sta­
bilność m RNA dla NOS3. Zauw ażono również, że w
kom órkach nieproliferujących białko o m. cz. 51 kD
jest znacznie silniej zw iązane z transkryptem genu
służyć jako potranskrypcyjny regulator ekspresji i
stanowić ochronę przez cytotoksycznym działaniem
nadmiaru NO, szczególnie w tkankach zróżn ico w a­
nych np. tkance nerwowej.
N os3, co tłum aczy m niejszą jeg o stabilność w tych
kom órkach [89].
III-3. Nos3
Sekwencja am inokw asów ludzkiego białka NOS3
wykazuje 94% hom ologii z tym sam ym enzym em u
bydła, a ok. 60% hom ologii z ludzką syntazą N O S I
[7, 18, 19, 87]. Skład am inokw asow y N-końca od­
Gen N os 3 ulega transkrypcji głównie w
śródbłonku naczyń krw ionośnych, ale ekspresję
134
IV. Produkty białkow e genów Nos
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
różnią j ą od innych syntaz. NOS3 jest bogata w prolinę i zawiera sekwencje docelow e dla acylotransferaz
przeprow adzających m irystylację i palmitylację. Ta
syntaza jest zakotw iczona w błonie, podczas gdy p o ­
zostałe syntazy znajdu ją się w cytoplazm ie [ 8 , 19,
52, 85-87]. Syntazy endotelialna (NO S3) i neuronalna (NOS 1) są z a le ż n e od kom pleksu C a 2 +/kalm odulina, natom iast syntaza indukow alna (NO S2) jest n ie­
zależna od C a2+ i kalm oduliny [90-93]. W szystkie
trzy syntazy są hom odim eram i zawierającym i: hem,
FAD, FM N i B H 4 [7, 8 ]. N -końcow y fragment
cząsteczki enzym u zajmuje dom ena oksygenazow a
(oxy), a fragm ent C -końcow y stanowi dom ena reduktazowa (red) [90], Struktury dom en i wielkości
poszczególnych izoform podano w tabeli 2. Dom ena
oksygenazow a m a zdolność przyłączania L -argini­
ny, zawiera także m iejsca wiązania hemu i B H 4 oraz
ma m ożliwość tworzenia kom pleksu żelazo-CO
[94], D om ena reduktazow a posiada zdolność re du k­
cji cytochrom u c, zależnej od N A D PH . Zaw iera
miejsca wiązania N A D PH , FAD i FMN. Pomiędzy
domenami zlokalizow ane jest m iejsce wiązania
kom pleksu C a2+/kalm odulina [90, 95, 96]. Kom pleks
C a2+/kalm odulina ułatwia przeniesienie elektronów
zm ieszaniu obu dom en w stosunku m olowym
red:oxy (2:1), a rekonstytuow ana NOS2 wykazuje
m aksym alną aktywność gdy je d n a dom ena redukta­
zow a przypada na kilka dom en oksygenazowych
[90]. A ktyw ność NOS3 je s t około dziesięć razy
m niejsza niż aktywność N O S I [90], Na aktywność
N O S wpływają: czynniki regulujące stabilność
białka (TGF-fł destabilizuje białko i m RNA), chelatory kationów (EDTA), fosforylacja reszt serynowych, dostępność argininy i jej analogów (przy n ie­
doborze argininy i nadm iarze N A D PH zamiast NO
pow staje ponadtlenek lub wodorotlenek), dostęp­
ność tlenu i B H 4 oraz obecność NO (NO hamuje
N O S) [4, 52, 69, 90].
V. U w agi końcow e
Znane są: struktura, lokalizacja, regulacja ekspre­
sji genów, alternatyw ny sp licin g transkryptów oraz
struktura i właściw ości produktów białkowych
w szystkich trzech izoform syntaz tlenku azotu (Ryc.
2 ).
Nie w iadom o jednak, czy obserw ow ane różnice w
sekwencji cD N A dotyczące pojedynczych nukleoty­
Tabela 2.
Produkty białkowe genów syntaz tlenku azotu
NOS 1
NOS 2
NOS 3
Masa cząsteczkowa (kD)
161,000
131,000
136,000
Liczba aminokwasów
1434
1153
1203
Domeny
Izoforma
C-końcowa , zawiera miejsca wiązania : FMN , FAD i NADPH
Reduktazowa
Oksygenazowa
Regulacja aktywności
N-końcowa , zawiera miejsca wiązania : L-argininy , hemu i BH4
Ca2+/CaM
niezależna od Ca2+/CaM
cytoplazma
Występowanie w komórkach
Główne miejsce działania
układ nerwowy
układ odpornościowy
Ca2+/CaM
związana z błonami
układ krążenia
z dom eny reduktazowej na dom enę oksygenazow ą
(w obecności C a2+/CaM aktywność dom eny redukta­
dów [57] dow o d z ą istnienia innych alleli genów Nos,
czy też są one w ynikiem np. m utacji punktowych lub
zowej jest dziesięciokrotnie większa niż aktywność
tej dom eny przy braku C a 2 +/C aM ) [90, 97]. W y k o ­
rzystując system ekspresyjny baculovirus można
otrzymać oddzielnie obie domeny, które po rekonstytucji dają pełną aktywność enzym atyczną NOS3
[90,94], Domena oksygenazowa zawiera ok. 0,3
mola BH 4 na mol domeny, podczas gdy dom ena re­
redagow ania m RNA. Wydaje się też interesujące w y ­
jaśnienie czy allele ludzkiego genu N os3 są polimorficzne, gdyż polim orfizm genetyczny mógłby stano­
wić czynnik ryzyka niektórych chorób, lub też
m ógłby uspraw iedliw iać m n iejszą podatność róż­
nych osobników na szkodliwe działanie czynników
środowiska [19]. Polim orfizm odkryto w intronach 4
duktazowa zawiera po 0,7 m ola FAD i FM N na mol
tej dom eny [90], W układach rekonstytuow anych
m aksym alną aktywność NOS3 otrzym uje się po
i 13 genu N os3 [19, 54, 98, 99]. Nie wyjaśniono j e d ­
nak czy w pływ a on na sp licin g i czy ma związek z
chorobami układu krążenia. Ze względu na w ażną
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
http://rcin.org.pl
135
Ryc. 2. Schemat struktury genów, mRNA i produktów białkowych genów syntaz tlenku azotu. Zachowano proporcją wielkości eksonów i intronów ge­
nów Nos oraz eksonów mRNA. Cyframi oznaczono kolejne eksony. W schemacie produktów białkowych zachowano przybliżone proporcje
wielkości i lokalizacji miejsc wiążących: hem, tetrahydrobiopteryną (BH4), kalmoduliną (CaM), FMN, FAD, NADPH. Miejsca mirystylacji
NOS3 zaznaczono strzałkami.
rolę NO w m etabolizm ie różnych kom órek nale­
żałoby oczekiwać, że m utacje genów N os będą
Najczęściej o pisyw aną m utacją genu N os3 jest
transwersja G 894T w eksonie 7. W jej w yniku w
wyw oływ ały objawy chorobowe.
Po stronie 5 ’ genu N os3 w ykryto trzy mutacje:
T786C, A 922G oraz T1468A. Tylko pierw sza z nich
powoduje zm niejszenie aktywności prom otora, n ato ­
miast druga i trzecia nie w y w ie rają w pływ u na ek s­
presję genu. Przypuszcza się, że nosiciele tranzycji
T786C m o g ą mieć predyspozycję do skurczu naczyń
w ieńcow ych (coronary spasm ) [ 1 0 0 ].
cząsteczce białka następuje zamiana glutam iny na
asparaginę w pozycji 298 (E 2 98->D ) [101-106],
Opinie na temat zw iązku tej mutacji z zaw ałem m ię ­
śnia sercowego oraz chorobą naczyń w ieńcow ych są
rozbieżne. N iektórzy badacze w yklu czają istnienie
związku w ystępow ania tej mutacji z chorobami
układu krążenia [101, 102, 104], inni u w ażają j ą za
wysoki czynnik ryzyka [106]. Poszukuje się także
136
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Tabela 3.
Wielkości eksonów i intronów genów syntaz tlenku azotu
ckson
wielkość
n os 3
nos 2
nos 1
intron
wielkość
(kpz)
ekson
(pz)
wielkość
(pz)
intron
wielkość
(kpz)
ekson
wielkość
(pz)
intron
wielkość
(kpz)
l
266
1
> 25
1
191
1
1,5
1
180
1
1,2
2
1145
2
> 25
2
183
2
1
2
112
2
1,4
3
127
3
20
3
85
3
0,7
3
149
3
0,2
4
129
4
2
4
124
4
1
4
163
4
1,4
5
146
5
1,8
5
148
5
6
5
92
5
0,09
6
163
6
0,8
6
163
6
0,8
6
142
6
0,3
7
92
7
0,8
7
91
7
0,9
7
140
7
0,1
8
142
8
12
8
143
8
0,1
8
175
8
1,1
9
140
9
2,7
9
140
9
1,7
9
102
9
0,6
10
175
10
4
10
175
10
0,1
10
195
10
0,1
ll
102
11
2,3
11
101
11
4
11
74
11
0,2
12
195
12
1,4
12
278
12
0,65
12
145
12
0,2
13
86
13
3,3
13
145
13
1,25
13
105
13
4,1
14
145
14
1,3
14
105
14
1,4
14
68
14
0,4
15
105
15
0,7
15
50
15
0,4
15
117
15
0,07
16
59
16
5
16
175
16
1,2
16
175
16
1,6
17
117
17
6
17
133
17
1,6
17
133
17
0,1
18
175
18
4
18
79
18
0,8
18
79
18
0,1
19
139
19
0,6
19
182
19
1,5
19
188
19
0,5
20
79
20
8
20
164
20
1
20
173
20
0,3
21
194
21
6
21
207
21
1,7
21
211
21
0,09
22
170
22
1,1
22
89
22
0,42
22
88
22
1,4
23
211
23
0,7
23
122
23
0,6
23
122
23
0,76
24
88
24
1,5
24
149
24
1
24
149
24
0,3
25
122
25
2
25
194
25
1,4
25
195
25
0,09
26
149
26
0,3
26
586
26
580
27
195
27
2
28
119
28
2,8
29
2150
zw iązku transwersji G894T z pow ikłaniam i naczy­
niowym i w ystępującym i przy cukrzycy typu drug ie­
go [105]. Zauw ażono też, że h om ozygoty TT oraz
heterozygoty GT w yk azu ją o wiele silniejszą o d po ­
wiedź na stym ulację a - a d re n e rg ic z n ą (fenylefryną)
niż hom ozygoty GG [103]. W genie N os3 opisano ta­
kże transw ersję G1917T, która jed n ak nie pozostaje
w bezpośrednim zw iązku z schorzeniam i układu
krążenia [98].
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Artykuł otrzymano 15 kwietnia 1999 r.
Zaakceptowano do druku 6 marca 2000 r.
Piśm iennictw o
1. W ó j c i k C, G o ł ą b J (1999) Post Biol Kom 26: 219-229
2. F u k u t o J M (1995) Adv Pharmacol 34: 1-15
3. G r y g l e w s k i R J , R y t l e w s k i K, Z d e b s k i Z, K o s t k a - T r ą b k a E (1998) II Kongres Polskiego Towarzystwa M edy­
cyny Perinatalnej Katowice 10-12.1X.1998, Tlenek azotu w
położnictwie: 143-152
http://rcin.org.pl
137
4. I g n a r r o L J (1996) Kidney Int Suppl 55: 2-5
5. D e m b i ń s k a - K i e ć A (1995) w: K o n a r s k a L {red) M ole­
kularne sygnały przekazywania sygnałów w kom órce, str. 177-189
6. W a n g Y , M a r s d c n P A (1995) Adv Pharmacol 34: 71-90
7. F o r s t e r m a n n U, K l e i n e r t H ( 1995) Naunyn Schmiede­
bergs Arch Pharmacol 352: 351-364
8. H a t t o r i R, S a s c K, E i z a w a H, K o s u g a K, A o y a m a
T, I n o u e R, S a s a y a m a S, K a w a i C, Y u i Y, M i y a h a r a K (1994) Int J Cardiol 47: 71-75
9. G r y g l e w s k i R J (1989)JC ardiovascP harm acol 14: 124-128
10. S t r y e r L (1997) Biochem ia, PWN W arszawa str. 781, 910
11. M a s t e r s B S , M c M i l l a n K, S h e t a E A , N i s h i m u r a
J S , R o m a n L J , M a r t a s e k P (\9 9 6 )F A S E B J 10: 552-558
12. S c h m i d t H H H W , N a u H, W i t t f o h t W (1988) Eur J
Pharmacol 1 54:213-216
13. P a l m e r R M , A s t h o n D S , M o n c a d a S (1988) Nature
Lond 333: 664-666
14. M o n c a d a S, K n o w l e s R G (1994) Biochem J 298: 24915. H i b b s J B , T a i n t o r R R , V a v r i n Z (1987) Science 235:
473-476
16. M a y e r B, H e m m e n s B (1997) TB iochem Sei 22: 477-481
17. Wu G, M orris SM (1998) Biochem J 336: 1-17
18. Mar s den PA, S c h a p p e r t KT, C h e n HS, F l o w e r s
M, S u n d e l l C L , W i l c o x J N , L a m a s S, M i c h e l T
(1994) Biochem Biophys Res Commun 200: 802-807
1 9 . Ma r s d e n PA, H e n g H H Q , S c h e r e r SW, S t e w a r t
RJ, Ha l l A V , Shi X M , T s u i L C, S c h a p p e r t KT
(1993) J Biol Chem 268: 17478-17488
20. B r e d t D S , F e r r i s C D , S n y d e r S H (1991) J Biol Chem
267: 10976-10981
2 1 . F u r c h g o t t R F , Z a w a d z k i J V (1980) Nature Lond 288:
373-376
22. I g n a r r o L J , B y r n s R E , B u g a G M , W o o d K S (1987)
Circul Res 61:866-879
23. I g n a r r o LJ i w s p . (1987) Proc N atlA ca d S ci 84: 9265-9269
24. P a l m e r R M , F e r r i g e A G , M o n c a d a S (1987) Nature
Lond 327: 524-526
2 5 . M u r a d F, A r n o l d W, M i t t a l C K , K a t s u k i S (1977)
Proc Natl A cad Sei 74: 3203-3207
26. M u r a d F, A r n o l d W , K a t s u k i S (1977) J Cyc Nucl Res 3:
239-247
27. M u r a d F, A r n o l d W, M i t t a l C K , I c h i h a r a K,
B r a u g h l e r M, E l - Z a y a t M (1978) M olecular biology and
pharm acology o f cyclic nucleotides: 33-42
28. G i b b s W W , N e r n e c k S, S t i x G (1999) Świat Nauki 90:
8-11
29. G r y g l e w s k i R J , K o s t k a - T r ą b k a E, Z d e b s k i Z
(1998) Tlenek azotu w medycynie. Problemy Perinatologii Klinicz­
nej cz. II., str. 48-58
30. D a v s o n V L , D a v s o n T M (1996) Neurochem Int 29: 97-110
3 1 . N o i! G , T s c h u d i M , N a v a E, L u s c h e r T F (1997) Int J
Microcirc Clin Exp 17: 273-279
32. U e m a t s u M, O h a r a Y, N a v a s J P , N i s h i d a K, M u r ­
p h y TJ , A l e x a n d e r R W , N e r m R M , H a r r i s o n DG
(1995) Am J Physiol 269: 1371-1378
33. B u s s e R, F l e m i n g I (1998) J Vase Res 35: 73-84
3 4 . R a d o m s k i M W , P a l m e r R M J , M o n c a d a S ( 1987)
Brit J Pharmacol 92: 639-646
35. G r y g l e w s k i RJ (1993)Semin ThrombHemostas 19: 158-166
36. G r y g l e w s k i RJ i w s p . (1993) J Physiol Pharmacol 44:
313-318
37. B a l l i g a n d J L , C a n n o n P J (1997) Arterioscler Thromb
Vase Biol 17: 1846-1858
38. H a l l A V , A n t o n i o u H, W a n g Y, C h e u n g A H , A r ­
b u s A M , O l s o n S L , Lu W C , K a u C L , M a r s d e n PA
(1994) J B i o l Chem 269: 33082-33090
39 . Ch a r t r a i n NA, G e l l e r DA, Ko t y PP, Si t r i n NF,
N u s s l e r AK, H o f f m a n EP, Bi l l a r TR, H u t c h i n ­
s o n N I , M u d g e t t J S (1994) J Biol Chem 269: 6765-6772
40. N a d a u d S, B o n n a r d e a u x A, L a t h r o p M , S o u b r i e r
F (1994) Biochem Biophys Res Commun 198: 1027-1033
4 1 . X u W, C h a r l e s I G , M o n c a d a S, G o r m a n P, S h e e r
D, L i u L, E m s o n P (1994) Genomics 21: 419-422
138
42. N u n o k a w a Y , O i k a w a S , T a n a k a S (1996)
Biochem Biophys Res Commun 223: 347-352
43. C h u S C , W u H P , B a n k s T C , E i s s a N T , M o s s J
(1995) J Biol Chem 270: 10625-10630
44. R c i l i n g N, U l m e r A J , D u c h r o w M, E r n s t M, F l a d
H D , H a u t s c h i l d t S (1994) Eur J Immunol 24: 1941-1944
45. Z h a n g X, L a u b a c h V E , A l l e y E W , E d w a r d s K A ,
S h e r m a n P A , R u s s e l l S W , M u r p h y WJ (1996) J Leukoc Biol 59: 575-585
46. S p i t s i n S V , K o p r o w s k i H, M i c h a e l s F H (1996) Mol
M ed 2: 226-235
47. N a d a u d S, S o u b r i e r F (1995) C R Seances Soc Biol Eil 189:
1025-1038
48. N u n o k a w a Y, I s h i d a N, T a n a k a S (1994) Genomics 19:
350-357
49. T a y l o r B S , d e V e r a M E , G a n s t e r R W , W a n g Q,
S h a p i r o RA, M o r r i s S M, B i l l a r TR, G e l l e r DA
(1998) J Biol Chem 273: 15148-15156
50. S a k i t a n i K, N i s h i z a w a M, I n o u e K, M a s u Y,
O k u m u r a T , I t o S (1998) Genes Cells 3: 321-330
51. C h a n g C C , M c C o r m i c k C C , L i n A W , D i e t e r RR,
S u n g Y J (1996) Am J Physiol 271: 539-548
52. N a t h a n C, X i e Q W (1994) J Biol Chem 269: 13725-13728
53. K a r a n t z o u l i s - F e g a r a s F, A n t o n i o u H, L a i S L M ,
K u l k a m i G, D ’ A b r c o C , W o n g G K T , M i l l e r T L ,
C h a n Y, A t k i n s J, W a n g Y, M a r s d e n P A (1999) J
Biol Chem 274: 3076-3093
54. M i y a h a r a K, K a w a m o t o T, S a s e K, Y u i Y, T o d a
K, Y a n g L X , H a t t o r i R, A o y a m a T, Y a m a m o t o Y,
D o i Y (1994) Eur J Biochem 223: 719-726
55. H a r r i s o n D G , V c n e m a R C , A r n a l J F , I n o u e N,
O h a r a Y, S a y c g h H, M u r p h y TJ (1995) Agents Actions
Suppl 45: 107-117
56. S h a r p P A (1992) Cell 68: 819-821
57. Z h a n g R, M i n W, S e s s a W C (1995) J Biol Chem 270:
15320-15326
58. O r k i n S H (1990) Cell 63: 665-672
59. Y a m a m o t o M, H o L J , L e o n a r d M W , B e u g H, O r ­
ki n S H , E n g e l J D (1990) Genes Dev 4: 1650-1662
60. R o s c n f c l d P J , K e l l y T J { m b ) J Biol Chem 261: 13981408
6 1 . R o s s i P, K a r s c n t y G, R o b e r t s A B , R o c h e N S ,
S p o r n M B , d c C r o m b r u g g h e B (1988) Cell 5 2:405-414
62. C o m b M, M c r m o d N , H y m a n S E , P c a r l b c r g J,
R o s s M E G o o d m a n H M (1988) EMBO J 7: 3793-3805
6 3 . A n g e l P, I m a g a w a M, C h i u R, S t e i n B, I m b r a R J ,
R a h m s d o r f H J , J o n a t C, H e r r l i c h P, K a r i n M
(1987) Cell 49: 729-739
64. I m a g a w a M, C h i u R, K a r i n M (1987) Cell 51: 251-260
65. H y m a n S E , C o m b M, P c a r l b c r g J, G o o d m a n H M
(1989) Mol Cell Biol 9: 321-324
66. L u s c h e r T F , B a r t o n M, W i g h t E, E s p i n o s a E,
Y a n g Z (1996) Schweiz M ed Wochenschr 126: 1748-1755
67. O s b o r n e T F , G i l G, G o l d s t e i n J L , B r o w n M S
(1988) J Biol Chem 263: 3380-3387
68. S t u a r t G W , S e a r l e P F , P a l m i t e r R D (1985) Nature
Lond 317: 828-831
69. P h e 1a n M W , F a l l e r D V (1996) Cell Physiol 167: 469-476
70. K e r n S E , P i e t e n p o l J A , T h i a g a l i n g a m S, S e y m o ­
u r A, K i n z l e r K W , V o g e l s t e i n B (1992) Science 256:
827-830
7 1 . S a n t h a n a m U, R a y A, S e h g a l P B (1991) Proc Natl A cad
Sei 88: 7605-7609
72. V o g e l s t e i n B, K i n z l e r K W (1992) Cell ID: 523-526
73. B r e n m a n J E , X i a H, C h a o D S , B l a c k S M , B r e d t
D S (1997) Dev Neurosci 19: 224-231
74. G e l l e r D A , B i l l a r T R (1998) Cancer Metastasis R ev 17:
7-23
75. M c M i c k i n g J , X i e Q W , N a t h a n C (1997) Annu R ev Im ­
munol 15: 323-350
76. E i s s a N T , S t r a u s s A J , H a g g e r t y C M , C h o o E K ,
C h u S C , M o s s J (1996) J Biol Chem 271:27184-27187
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
7 7 . W a n g Y, M a r s d e n P A (1995) Curr Opin Nephrol Hypertens
4: 12-22
78. P a r k C S , P a r k R, K r i s h n a G (1996) Life Sei 59: 219-225
79. O ’ D o n c l l T J , H u a n g P L , D a w s o n T D , D i n e r m a n
J L , S n y d e r S H , K a n d e l E R , F i s h m a n M C (1994)
Science 265: 542-546
80. T r a c e y W R , P o l l o c k J S , M u r a d F, N a k a n e M,
F o r s t e r m a n n U (1994) Am J Physiol 266: 22-28
81. S h a u 1 P W , N o r t h A J , W u L C , W e l l s L B , B r a n n o n
T S , L a u K S , M i c h e l T, M a r g r a f L R , S t a r R A
(1994) J Clin Invest 94: 2231-2236
82. R e i l i n g N , U l m e r A J , D u c h r o w M, E r n s t M, F l a d
H, H a u s c h i l d t S (1994) Eur J Immunol 24: 1941-1944
83. F o r s t e r m a n n U, B o i s s e l J P , K l e i n e r t H (1998)
FASEB 12: 773-90
84. W e i n e r C P i w s p . (1994) Proc Natl Acad Sei 91: 5212-5216
85. L a m a s S, M a r s d e n P A , Li G K , T e m p s t P, M i c h e l
T (1992) Proc Natl Acad Sei 89: 6348-6352
86. N i s h i d a K, H a r r i s o n D G , N a v a s J P , F i s h e r A A ,
D o c k e r y S P , U e m a t s u M, N e r e m R M , A l e x a n ­
d e r R W , M u r p h y T J (1992) J Clin Invest 90: 2092-2096
87. M a r s d e n P A , S c h a p p e r t K T , C h e n H S , F l o w e r s
M, S u n d e l l C L , W i l c o x J N , L a m a s S, M i c h e l T
(1992) FEBS 307: 287-293
88. S h a w G, K a m e n R (1986) Cell 46: 659-667
89. S e a r l e s C D , M i w a Y , H a r r i s o n D G , R a m a s a m y S
(1999)
Circ Res 85: 588-95
90 C h e n P F , T s a i A L , B e r k a V, W u K K (1996) J Biol
Chem 271: 14631-14635
9 1 . B r e d t D S , S n y d e r S H (1990) Proc Natl Acad Sei 87:
682-685
92. P o l l o c k J S , F o r s t e r m a n n U, M i t c h e l l J A , W a r ­
ner TD, Ha r a l d HH, S c h m i d t H H H W , N a k a n e
M, M u r a d F (1991) Proc Natl A cad Sei 88: 10480-10484
93. S t u e h r D J , K w o n N S , N a t h a n C F , G r i f f i t h O W ,
F e l d m a n P L , W i s e m a n J (1991) J Biol Chem 266:
6259-6263
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
94. C h e n P F , T s a i A L , B e r k a V, W u K K (1998) J Biol
Chem 273: 34164-34170
95. B r c d t D S , H w a n g P M , G l a t t C E , L o w e n s t e i n C,
R e e d R R , S n y d e r S H (1991) Nature Lond 351: 714-718
96. X i e Q, C h o H J , C a l a y c a y J , M u m f o r d R A , Ś w i d e ­
r e k K M , L e e T D , D i n g A, T r o s o T, N a t h a n C F
(\992) Science 256: 225-228
97. A b u - S o u d H M , S t u e h r D J (1993) Proc Natl A cad Sei 90:
10769-10772
98. H i b i K, I s h i g a m i T , T a m u r a K, M i z u s h i m a S,
N y u i N , F u j i t a T , O c h i a i H, K o s u g e M, W a t a n a b e Y, Y o s h i i Y, K i h a r a M, K i m u r a K, I s h i i M,
U m e m u r a S (1998) Hypertension 32: 521-526
99. N a k a g a m i H, I k e d a U, M a e d a Y, Y a m a m o t o K,
H o j o Y, K a r i o K, K u r o k i S, S h i m a d a K (1999) J
Thromb Thrombolysis 8:191-195
100. N a k a y a m a M , Y a s u e H, Y o s h i m u r a M, S h i m a s a k i Y, K u g i y a m a K, O g a w a H, M o t o y a m a T,
S a i t o Y, O g a w a Y, M i y a m o t a Y, N a k a o K (1999)
Circulation 99: 2864-70
1 0 1 . C a i H, W i l c k e n D E , W a n g X L ( 1999) J Mol Med 77:
511-4
102. L i a o Y L , S a k u K, O u J, J i m i S, Z h a n g B, S h i r a i
K, A r a k a w a K (1999) A ngiology 50: 671-6
103. P h i l i p I, P l a n t e f e v e G, V u i l l a u m i e r - B a r r o t S,
V i c a u t E, L e M a r i e C, H e n r i o n D, P o i r i e r O,
L e v y B I , D e s m o n t s J M , D u r a n d G, B e n e s s i a n o
J (1999) Circulation 99: 3096-8
104. L i y o u N, S i m o n s L, F r i e d l a n d e r Y, S i m o n s J,
M c C a l l u m J , O ’ S h a u g h n e s s y K, D a v i s D, J o h n ­
s o n A (1998) Clin Genet 54: 528-529
105. C a i H, W a n g X, C o l a g i u r i S, W i l c k e n D E (1998)
Diabetes Care 21: 2195-2196
106. H i n g o r a n i A D , L i a n g C F , F a t i b e n e J , L y o n A,
M o n t e i t h S, P a r s o n s A, H a y d o c k S, H o p p e r R V ,
S t e p h e n s N G , O ’ S h a u g h n e s s y K M , B r o e n MJ
(1999) Circulation 100: 1515-1520
http://rcin.org.pl
139
Grupa kinaz białkowych CKI
The group of protein kinases CKI
IWONA WOJDA*
Spis treści:
Contens:
I.
II.
III.
IV.
I. Introduction
II. General characteristic of protein kinase CKI
III. Protein kinase CKI — “the team player”
IV. Participation of CKI in DNA repair
V. Substrate specificity of CKI
VI. Regulation of protein kinase CKI activity
VII.Concluding remarks
Wstęp
Ogólna charakterystyka kinazy białkowej CKI
Kinaza białkowa CKI — „gracz zespołowy”
Udział kinazy białkowej CKI w procesach naprawy
DNA
V. Specyficzność substratowa CKI
VI. Regulacja aktywności kinazy białkowej CKI
VII.Uwagi końcowe
Wykaz stosowanych skrótów: CKI — kinaza białkowa CKI (CK
— skrót od nazwy zwyczajowej — ang. casein kinase ); cAMP
— cykliczny adenozyno-3 ’5 ’-monofosforan, CREM — czynnik
transkrypcyjny (ang. cAMP responsive elem ent modulator)',
ATP — adenozyno-5’-trifosforan, mRNA — informacyjny
RNA; BSA — albumina surowicy wołu; elF — eukariotyczny
czynnik inicjacyjny translacji; A(Ala) -— alanina; D(Asp) —
kwas asparaginowy; E(Glu) -— kwas glutaminowy; G(Gly) —
glicyna; L(Leu) — leucyna; R(Arg) — arginina; N(Asn) —
asparagina; p — reszta kwasu fosforowego; S(Ser) — seryna,
T(Tre) — treoniona; V (Val) — walina; X — dowolny amino­
kwas; Y(Tyr) — tyrozyna. Oznaczenia poszczególnych form
CKI są zawarte w Tabelach: 1 i 2.
I. W stęp
Odw racalna fosforylacja je s t je d n y m z najbar­
dziej rozpow szechnionych rodzajów m odyfikacji
białek w przyrodzie. W kom órkach eukariotycznych
około 30% białek to substraty dla kinaz białkowych.
Przyłączanie i odłączanie reszty fosforanowej re g u ­
luje aktywność en zy m atyczną wielu białek, ich loka­
lizację subko m órk ow ą czy też zdolność do tworzenia
większych kompleksów. U Eukaryota najbardziej
istotne znaczenie regulacyjne ma fosforylacja białek
w resztach serynowych, treoninow ych oraz tyrozynowych, katalizow ana przez kinazy białkowe serynowo/ treoninowe oraz tyrozynow e.
*Dr, Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Mikrobiologii i
Biotechnologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet
Marii Curie-Skłodowskiej, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin
140
Pierwszy dowód na istnienie fosfobiałek pochodzi
ju ż z roku 1883, kiedy t o H a m m a r s t e n wykazał,
że białkow y składnik m leka — kazeina zawiera
znaczne ilości fosforanu [1], Prawie w iek później k a­
zeina zaczęła być stosow ana jak o substrat do badania
aktywności kinaz białkow ych in vitro. Doprowadziło
to do wykrycia dwóch klas fosfotransferaz, nazw a­
nych następnie: kinaza kazeinow a 1 (CKI) oraz kina­
za kazeinowa 2 (CKII), według kolejności ich elucji
z DEAE celulozy [ 2 , 3 , 4 — praca przeglądowa]. N a­
zwa „kinazy kazeinow e” stosow ana była w literatu­
rze przez długie lata. Była to nazwa przyjęta zw ycza­
jow o, jed n ak nie w pełni uzasadniona i przez to
myląca, bowiem nie należy kojarzyć CKI i CKII z en ­
zymami m odyfikującym i kazeinę in vivo w gru­
czołach m lecznych ssaków. Kazeina była i jest j e d y ­
nie białkiem rutynowo stosow anym ja k o egzogenny
substrat przy oznaczaniu aktywności enzy m aty cz­
nych kinaz in vitro. Obecnie, nie stosuje się ju ż n a­
zwy „kinazy kazein ow e” , a CKI i CKII, nazywa się
odpowiednio „kinaza białkow a C K I” oraz „kinaza
białkowa C K II” . Należy tu podkreślić, że pom imo, iż
enzym y te m ają p o d ob ną nazwę, są one strukturalnie
i funkcjonalnie odm iennym i fosfotransferazami.
Przedstawione poniżej dwie prace przeglądow e
pt: „G rupa kinaz białkow ych C K I” oraz „Kinaza
białkowa C K II” są prób ą pod sum ow ania obecnego
stanu wiedzy o pierw szych, odkrytych prawie pięć­
dziesiąt lat temu, kinazach białkow ych, z uw z g lę d­
nieniem olbrzym iego postępu w badaniach, jaki d o ­
konał się w ciągu ostatnich dziesięciu lat.
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
II. O gólna ch arakterystyka kinazy białkow ej
CKI
geny, natom iast u drożdży rozszczepkow ych Schizosaccharom yces p o m b e w ykazano obecność 5 genów
Kinaza białkow a CKI należy do kinaz seryno-
kodujących różne formy tego enzymu. Poszczególne
formy CKI, zarówno u ssaków ja k i u drożdży m ają
w o/treoninowych, niezależnych od cyklicznych n u ­
róż n ą wielkość, ró ż n ą lokalizację subkom órkow ą
kleotydów. Obecność CKI w ykazano we wszystkich
zbadanych do tej pory organizm ach eukariotycz­
nych. Enzym ten w ystępuje w kom órce w formie
wolnej w cytoplazmie, w formie związanej z błon a­
mi, a także w jądrze i m itochondriach [5, 6 ]. Kinaza
białkowa CKI izolowana je st zawsze w formie ak­
tywnego m onom eru o masie cząsteczkowej w grani­
cach 25 k D a -6 5 k D a. CKI fosforyluje in vitro białka
oraz p ełnią różne funkcje w kom órce. Przedstawione
poniżej tabele są pró b ą up orządkow ania obecnego
stanu wiedzy odnośnie w ystępow ania kinazy białko ­
cytoszkieletu takie ja k m iozyna, ankyrina, troponina, spektryna; polim erazy R N A I i II; czynniki ini­
cjacyjne translacji: eIF4B, eIF4E, eIF5; syntetazy
am inoacylo-tRNA ; duży antygen T w irusa SV40; re­
ceptor insuliny; podjednostkę regu lato row ą fosfata­
zy I (inhibitor 2); syntazę glikogenu, białko p53,
białka rybosom ow e i inne [6-9]. Tylko w nielicznych
przypadkach fosforylacja danego białka została p o ­
twierdzona in vivo i wydaje się być skorelow ana z
jego funkcją. Wykazano na przykład, że fosforylacja
fosfatazy I pow oduje ham ow anie aktywności enzy­
mu [10]. Zdolność białka C RE M do wiązania się z
DNA je s t znacznie w iększa po fosforylacyjnej m o ­
dyfikacji przez CKI. A ktyw ność syntazy glikogenu
jest silnie ham ow ana po fosforylacji przez kinazę za­
leżną od cAMP, a następnie przez CKI [11]. N a to ­
miast białko p53 po fosforylacyjnej modyfikacji
przez CKI jest aktywowane. Zależność pom iędzy
fosforylacjąbiałka przez CKI a jeg o fun k c ją w y k az ano również w przypadku dużego antygenu T wirusa
SV40. Fosforylacja tego białka pow oduje zah am o ­
wanie inicjacji replikacji w irusow ego DNA [12, 13].
III. K inaza białkow a CKI — „gracz
zesp ołow y”
tycznych.
M nogość form kinazy białkowej CKI potęguje
fakt, że w wyniku alternatyw nego składania genów
m o g ą pow staw ać dodatkow e warianty CKI. Tak jest
w przypadku C K Ia , której liczba wariantów sięga
ośmiu i CKIy3, występującej w dwóch alternatyw ­
nych formach [ 8 ]. Zw iększa to do 16 ilość form k in a­
zy białkowej CKI u ssaków.
W szystkie poznane formy kinazy CKI posiadają
koniec am inow y składający się z 9-76 am inok w a­
sów, ściśle zachow any obszar katalityczny zaw ie­
rający około 300 am inokw asów oraz koniec k arbo­
ksylowy, którego długość je s t różna w p oszczegól­
nych enzym ach i waha się w granicach od 24 do 200
aminokwasów. N iektóre formy CKI u drożdży
(Y c k lp , Yck2p, Yck3p, C k i l, Cki2) w końcu k ar­
boksylow ym posiadają m iejsce ulegające prenylacji.
M odyfikacja ta um ożliw ia przyłączenie tych enzy­
m ów do błony kom órkow ej. W przeciwieństwie do
drożdży, żadna z CKI znaleziona u ssaków nie ulega
prenylacji [ 8 , 32],
W szystkie formy kinazy białkowej CKI w swoich
dom enach katalitycznych w yk azu ją bardzo wysoki
stopień identyczności. Zaw sze wynosi on powyżej
50% podczas gdy w stosunku do innych kinaz nie
przekracza 20%. Rycina 1 przedstaw ia filogenetycz­
ne pokrew ieństw o poszczególnych form kinazy
Badania biochem iczne nad kinazą CKI, ja k w cze­
śniej wspom niano, trw ają ju ż od kilkudziesięciu lat.
Niejednokrotnie doniesienia z poszczególnych labo­
ratoriów odnośnie właściw ości tego enzym u bywały
różne. Dotyczyło to m iędzy innymi m asy cząstecz­
kowej CKI, lokalizacji subkom órkowej czy też nie­
których właściwości biochem icznych enzymu. D o­
piero na początku lat dziew ięćdziesiątych w literatu­
rze zaczęły pojawiać się wyniki badań genety cz­
nych, wskazujące na obecność wielu form CKI k o do ­
wanych przez niezależne geny.
U ssaków w ykazano obecność 7 genów k o ­
dujących
różne
formy
CKI.
W
drożdżach
pączkujących Saccharom yces cerevisiae istnieją 4
POSTĘPY BIOCHEMII 46(2), 2000
wej CKI u ssaków (Tabela 1) oraz drożdży (Tabe­
la 2). M ożna przypuszczać, że badania najbliższych
lat przyn iosą odpow iedzi na wiele pytań odnośnie
w ystępow ania i funkcji CKI w kom órkach eukario­
białkowej CKI.
Kinaza białkowa CKI z pow odu w ystępowania w
wielu formach określana je s t w literaturze jako
„gracz zesp ołow y” . Spotyka się również stw ierdze­
nie, że kom órki eukariotyczne posiadają nadm iar g e­
nów kodujących CKI. Istotnie, spośród mnogości
form CKI m ożna w yróżnić enzym y mające tę sam ą
lokalizację su bko m ó rk o w ą oraz pełniące podobne
funkcje w komórce. W ykazano, że u S. cerevisiae
H R R 25 i YCK3 tw orzą n iezbędną dla przeżywalności
komórki parę genów, których produkty białkowe zlo­
kalizowane są w jąd rze kom órk ow y m i biorą udział
w procesach napraw y DNA. Delecja każdego z tych
genów powoduje jed y n ie zm iany fenotypowe, p o d ­
http://rcin.org.pl
141
czas gdy delecja obydw u jest letalna [23, 27]. U Schizo saccharom yces p o m b e parę enzy m ó w o podobnej
funkcji stanow ią H h p l i Hhp2. U ssaków natomiast
udział w naprawie D N A biorą: CKI5, C K Is oraz
C K Ia . W ykazano, że ekspresja ssaczych form CKI,
odpowiedzialnych za procesy n apraw y DNA w k o ­
mórkach S. cerevisiae defektyw ych w genie H RR25,
um ożliwia kom órkom
widłowego fenotypu.
drożdży
odzyskanie
p ra­
IV. U dział kinazy białkow ej CKI w procesach
napraw y D N A
W cyklu kom órkow ym organizm ów eukariotycz­
nych wyróżnić m ożna 3 punkty kontrolne, które w
przypadku uszkodzenia DNA op óźniają podział k o ­
mórki. Punkty te znajdują się w fazie Gi, S oraz na
granicy faz G 2 /M. W tym czasie urucham iane zostają
m echanizm y um ożliw iające napraw ę DNA. Induko­
Tabela 1.
Formy CKI zidentyfikowane u ssaków.
Forma CKI
M asa cząsteczkowa
białka
C K Ia
35 kDa
(z grasicy wołu)
CKip
39 kDa
Lokalizacja w komórce
Lokalizacja zależna od fazy
cyklu komórkowego: w inter­
fazie — struktury pęcherzyko­
we; w czasie mitozy —
włókna
wrzeciona
po­
działowego;
jądro
?
Proces komórkowy w którym
dany enzym uczestniczy/ funkcja
Segregacja chromosomów w czasie
podziału; kontrola cyklu kom órko­
wego;
dojrzewanie mRNA
?
43 kDa
Funkcja nie poznana.W iadomo, że
ekspresja CKIy, i CKIy3 u S. cerevisiae powoduje częściową supresję
mutacji AYCK.
(z jąder szczura)
?
[14,
16,
18]
15,
17,
[8, 17]
(z mózgu wołu)
CKIy,
Literatura
[8,
19]
17,
Sugeruje się, że CKly2 może brać
udział w przekazywaniu sygnałów
zewnątrzkomórkowych.
CKIy:
45 kDa
?
( z jąder szczura)
c k i Y3
50 kDa
?
( z jąder szczura)
CKI5
49 kDa
Jądro komórkowe
Metabolizm DNA, głównie napra­
wa DNA
Jądro komórkowe
Metabolizm DNA
(z jąder szczura)
CKIe
47 kDa
(z łożyska ludzkiego)
Kolejną parę genów kodujących kinazy CKI o p o ­
dobnej funkcji stanowią: YCK1 i YCK2 u S. cerevisiae [25]. Inną sytuację obserw uje się u drożdży S.
p o m b e , u których c k il i cki2 nie stano w ią pary ge­
nów, a ich produkty białkow e w y d a ją się spełniać
różne funkcje w kom órce [30]. U drożdży nie znale­
ziono form CKI o dpow iadających ssaczym
C K Ia i C K ip. P raw dopodobnie enzym y
udział w procesach charakterystycznych dla
złożonych organizm ów eukariotycznych.
formom
te biorą
bardziej
D oty ch­
czas, dwie spośród form kinazy białkowej CKI tj.
C kil i CKI5 zostały otrzym ane w formie krystalicz­
nej [33, 34]. Strukturę d om eny katalitycznej C kil z
S. p o m b e przedstaw ia rycina 2.
142
[20, 21]
[22]
wana jest wówczas ekspresja genów za ang ażo w a­
nych w ten proces. Są to m iędzy innymi: geny k o ­
dujące dużą (RN R2) oraz małe (RNR1 i RN R3) podjednostki reduktazy rybonukleotydow ej, gen ko­
dujący białko odpow iedzialne za napraw ę rekombin a c y jn ą D N A (R A D 5 4 ), polim erazę 1 DNA (PO L1),
ligazę DNA (C D C 9) [23],
Zauw ażono, że drożdże S. cerevisiae z dysrupcją
genu H RR25 są nadw rażliw e na działanie niektórych
czynników pow odujących uszkodzenie DNA takich
jak: prom ieniow anie X, działanie endonukleazy czy
działanie M MS (ang. m ethyl m ethanesulfonate) oraz
prom ieniow anie y. M utanty te są niezdolne do induk­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
cji transkrypcji genów RN R2 i RNR3 po zadziałaniu
HU (hydroksyuracyl) na komórki drożdżow e [35].
Okazało się, że kinaza Hrr25p fosforyluje in vitro
białko Swió. Białko to w połączeniu z białkiem Swi4
tworzy czynnik transkrypcyjny SBF. H o i w sp ółp ra­
cownicy sugerują [23], że fosforylacja białka Swió
wielkiej grupy kinaz “kw asotroficzny ch” tj. rozpo­
znających akceptorowy am inokw as w otoczeniu
am inokw asów o charakterze kwaśnym . Za klasyczną
sekw encję rozpoznaw aną przez OKI jako miejsce
fosforylacji uważa się m otyw E -X -X -S /T lub
Sp/T p/Y p-X -X - S/T [ 8 , 36]. Okazało się jednak, że
Tabela 2.
Formy CKI zidentyfikowane u drożdży.
Gen
Białko
Masa cząsteczkowa
białka
Lokalizacja w komórce
Proces komórkowy w którym
dany enzym uczestniczy/ funkcja
Literatura
Saccharomyces cerevisiae
M orfologia pączków; cytokincza;
transport pęcherzykowy; halotolerancja; metabolizm heksoz.
[23-26]
Jądro komórkowe
Prawidłowy wzrost drożdży, po­
działy komórek, naprawa DNA,
sporulacja
[27]
Jądro komórkowe; błona ko­
mórkowa
Metabolizm DNA.
[28]
YCK1
Y ck lp
62 kDa
Błona komórkowa; cytosol
YCK2
Yck2p
62 kDa
Błona komórkowa; cytosol
HRR25
Hrr25p
58 kDa
YCK3
Yck3p
60 kDa
Schizosaccharomyces potnbe
hh pl
H hpl
Około
Jądro komórkowe
Naprawa DNA
[29]
42kDa-46kDa
hhp2
Hhp2
ckil
Ckil
55 kDa
Cytosol; błona komórkowa
?
[30]
cki2
Cki2
55 kDa
Cytosol
Morfologia komórki
[30]
cki3
Cki3
7
Prawdopodobnie cytosol
Prawdopodobny udział w adaptacji
drożdży do warunków głodowych
[31]
przez kinazę Hrr25p um ożliw ia indukcję genów za­
leżnych od czynnika SBF odpow iedzialnych za n a ­
prawę uszkodzeń DNA spow odow anych działaniem
HU. Być może fosforylacja białka Swió um ożliwia
przedostanie się jego do jąd ra w odpowiedzi na
uszkodzenie DNA. Wykazano również, że nadekspresja
białka Swi4 pow oduje odzyskanie p ra­
widłowego fenotypu drożdży S. cerevisiae z dysrupcjąge n u //A /? 2 5 , co sugeruje istnienie równoległego,
niezależnego od kinazy Hrr25p m echanizm u regula­
cji aktywności czynnika SBF [23],
V. Specyficzność substratow a CKI
Struktura pierw szorzędow a kinazy białkowej CKI
pozwoliła sklasyfikować ten enzym w grupie kinaz
serynowo/treoninowych. CKI należy rów nież do n ie­
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
obecność fosfoseryny czy fosfotreoniny, a nawet
fosfotyrozyny w pozycji - 3 w stosunku do miejsca
przyjm ującego resztę fosforanow ą jest korzystniej­
sza niż obecność kwasu asparaginow ego czy gluta­
m inowego w tej samej pozycji. W ynika z tego, że
wiele białek może stać się substratem dla kinazy
białkowej CKI dopiero po uprzednim ufosforylowaniu przez inny enzym. Istotnie, wykazano, że fosfo­
rylacja syntazy glikogenu z mięśni królika przez ki­
nazę zależną od cA M P powoduje, że białko to jest
w ówczas intensywniej fosforylow ane przez CKI.
Syntaza glikogenu posiada 3 charakterystyczne dla
kinazy A miejsca fosforylacji. Są to: Ser7, Ser 6 9 7 oraz
Ser 7 1 0 [11]. Fosforylacja przez kinazę zależną od
cAM P seryny w pozycji 7 sprawia, że S er 10 może być
fosforylowana przez kinazę CKI. Ponadto w yk aza­
no, że defosforylacja kazeiny powoduje, że białko to
http://rcin.org.pl
143
staje się znacznie słabszym substratem dla CKI [37,
38],
Obecność ufosforylowanej seryny czy treoniny w
ekspresji w kom órkach E. coli i w ykazano, że są one
rozpoznaw ane przez przeciwciała skierow ane prze­
ciw fosfotyrozynie. W ykazano także, że formy CKI z
pozycji - 3 nie jest jed n ak niezbędna, jeśli w pobliżu
znajdują się am inokw asy o charakterze kwaśnym.
Tak jest w przypadku a kazeiny, gdzie kinaza CKI
drożdży S. p o m b e u legają autofosforylacji in vitro w
resztach tyrozynow ych, a co więcej, kinazy Hhpl
oraz Hhp2 fosforylują tyrozynę w peptydzie poli
E 4 Yi . Zaobserw ow ano także, że defosforylacja Hhp 1
i Hhp2 przez fosfatazę serynow o/treoninow ą nie ma
w iększego w pływu na aktywność tych enzymów,
podczas gdy defosforylacja tyrozyny pociąga za sobą
2-3 krotny spadek ich aktywności w stosunku do sub­
stratów takich ja k kazeina czy peptyd E 4 Y]. Sugeruje
to, że obecność fosfotyrozyny może pozytyw nie re­
gulować aktywność wyżej w ym ienionych form CKI
fosforyluje S er 1 3 5 w sekwencji: Sp-E-E-N-S. Ufosforylowana uprzednio seryna znajduje się tu w pozycji
--------------- Ycklp
•--------------- Yck2p
-------------------------------- Yck3p
r--------------------- Cki1
[35].
Wyniki pow yższych badań są zgodne z w cze­
Cki2
------------------------------ CKlyl
----------- CKla
---------- CKip
------ CKIS
---------C K |e
--------------------- Hhp1
---------------------------- Hhp2
----------------------------------- Hrr25p
Ryc. 1. Filogenetyczne pokrewieństwo wśród kinaz CKI [8], Na uwagą
zasługuje fakt, że ssaczc formy CKIy są najbardziej spokrew­
nione z drożdżowymi YCK i Cki. Z kolei CKI5 i CKIe wyka­
zują największą homologią z H hpl, Hhp2 oraz Hrr25p. Jak
wspomniano w tekście C K la i C K ip nie m ają swoich odpo­
wiedników wśród drożdżowych form CKI.
- 4 , natomiast obecność dwóch reszt kwasu glutam i­
nowego w pozycjach - 2 i - 3 praw dopodobnie p o w o ­
duje nagrom adzenie ujem nie naładow anych reszt co
jest wystarczające dla rozpoznania S e r 1 3 5 jako ak cep ­
tora reszty fosforanowej. P od o b n ą sytuację o bserw u ­
je się w przypadku fosforylacji inhibitora 2 (fosfata­
zy 1 ), u którego po stronie am inowej od m iejsca fo s­
forylacji brak jest w ogóle fosfoseryny, a Ser 8 6 jest
fosforylowana w sekwencji D -D -D -D -A -Y -S. Tak
więc w tym przypadku obecność czterech reszt k w a ­
su asparaginowego um ożliw ia rozpoznanie Ser
jako akceptora reszty fosforanowej [15],
W ostatnim czasie w literaturze naukowej p o ja­
wiło się kilka prac w skazujących, że niektóre formy
CKI m ają zdolność do przyłączania reszt fosforano­
wych również do tyrozyny. Wykazano, że kinaza
Hrr25p z drożdży S. cerevisiae oraz H h p l, Hhp2 i
C kil z drożdży S. p o m b e są enzym am i o tzw. p o ­
dwójnej specyficzności. K a żdą z tych kinaz poddano
144
śniejszą obserwacją, że kinaza CKI z ludzkich ery­
trocytów może również fosforylować reszty tyrozynowe. O czyszczona CKI z cytoplazm y ludzkich ery­
trocytów fosforyluje peptyd poli E 2 Yi, a ponadto angiotensynę II, alkilow aną BSA oraz ankyrinę w resz­
tach tyrozynow ych [39].
Tak więc niektóre formy kinazy CKI pow iększają
listę kinaz o podwójnej specyficzności.
W śród drożdżow ych kinaz o podwójnej specy­
ficzności znajdują się m iędzy innymi: kinazy M c k l,
S p k l, Fus3, K s s l, Ste7 drożdży S. cerevisiae oraz ki­
nazy B y rl, Byr2 drożdży S. p o m b e [40, 41].
VI. R egulacja aktyw ności kinazy białkow ej
CKI
Jednym z testów sprawdzających właściwości
biochem iczne kinaz jest badanie wrażliwości tych
enzym ów na działanie heparyny. Polisacharyd ten
jest silnym inhibitorem kinazy białkowej CKII [ó] i
w niektórych przypadkach aktyw atorem podjednostki katalitycznej kinazy zależnej od cA M P [42, 43].
Ponadto heparyna aktywuje kinazę zależn ą od dwuniciowego RNA (PKR) [44, 45], w pływ a również na
aktywność niektórych kinaz tyrozynow ych [46, 47],
Okazuje się, że w pływ heparyny na aktyw ność CKI
jest zróżnicow any i zależy zarówno od formy enzy ­
mu, ja k również od rodzaju substratu [48, 49].
Okazało się, że heparyna stym uluje fosforylację
syntetycznego, specyficznego dla CKI peptydu D4
(D D D D V A SLPG LR R R)
przez
rek om binacyjn ą
CKIS. Stym ulację obserwuje się rów nież po defosforylacji CKIS przez podjednostkę katalityczną fosfa­
tazy pierwszej (CS1). Jeśli naty w n ą formę CKIS p o ­
zbawi się końcow ych 1 1 0 am inokwasów , enzym sta­
je się wówczas niewrażliwy na działanie heparyny.
C iekaw ym wydaje się również fakt, że forma C K l a
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
2. Struktura Ill-rzędowa
domeny katalitycznej
Ckil z Sch. pom be w
kompleksie z MgATP
[34], Domena katali­
tyczna składa się z
dwóch płatów: N-koniec cząsteczki tworzy
mniejszy płat, w któ­
rym dominuje struktu­
ra p. Obszar ten jest
miejscem wiązania trifosfonuklcotydu. Wię­
kszy płat o strukturze
a-helisy zawiera se­
kwencje uczestniczące
w przenoszeniu reszty
fosforanowej. Szczeli­
na, znajdująca się m ię­
dzy obydwoma płata­
mi wchodzi w interakcjc z białkowym substratem. Obydwa płaty
połączone są tzw. re­
gionem zawiasu (pętla
L-78), który decyduje
o konformacji szczeli­
ny. NLS — sygnał lo­
kalizacji
jądrowej
(ang. nuclear localiza­
tion signal); KHD —
ang. kinesin homology
domain (pętla L-9D); L
— pętla (ang. loop).
a.2, aL , a3, y3-2 —
tzw. wstawki, domeny
występujące w niektó­
rych wariantach CKI.
P 0 4 - oznacza miejsce
rozpoznające i wiążące
resztę fosforanową w
białku substratowym
m ająca bardzo krótki C -koniec nie jest aktyw ow ana
w ow ana przez działanie fosfatazy oraz przez ograni­
przez heparynę, a naw et je s t w niew ielkim stopniu
ham owana [2 0 ].
Badania prow adzone przez grupę kierow aną przez
R o a c h wykazały, że koniec karboksylow y CKI o d ­
czo ną proteolizę.
Powyższe obserwacje dowodzą, że ufosforylowany koniec C kinazy białkowej CKI pełni funkcję in­
hibitora aktywności CKI. Pełna aktywacja enzymu
m ożliwa jest przez:
— proteolityczne usunięcie C -końca
— defosforylację enzymu
grywa istotną rolę w regulacji aktywności tego enzy­
mu [19]. Istnieją dowody, że fosforylacja am in o k w a­
sów w C-końcu jest p rz y czy ną autoinhibicji enzymu.
Heparyna oddziałuje z C -końcem CKI5, co p o w o d u ­
je zmiany konformacji kinazy naśladujące defosforylację [7]. Nie w iadom o jed n ak czy in vivo fosfory­
lacja enzymu w C- końcu je s t w ynikiem autofosforylacji czy też efektem działania innej kinazy białk o ­
wej.
Podobne wyniki
gi el s ką i wsp.
wierająca C -koniec
wielom a m iejscam i
zostały uzyskane przez C e ­
[50]. O kazało się, że CKIe za­
o długości 123 am inokw asów z
fosforylacji je st rów nież akty­
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
— zw iązanie heparyny (i przypuszczalnie innych polianionów)
Przedstawiony poniżej schem at (Ryc. 3) wyjaśnia
rolę C -końca w regulacji aktywności kinazy CKI.
Wykazano, że koniec karboksylow y kinazy
białkowej CKI bierze również udział w rozpoznaw a­
niu substratu oraz jest odpow iedzialny za lokalizację
su bko m ó rkow ą enzymu. K inazy Y c k lp , Yck2p, Yck3p i C kil są prenylow ane właśnie w C-końcu, co
http://rcin.org.pl
145
nieaktyw na CKI
aktyw na CKI
um ożliwia „z akotw iczenie” enzym u w błonie k o ­
mórkowej.
Praw dopodobnie istnieją jes z c z e inne m ech ani­
zmy regulujące aktyw ność poszczególnych form
CKI. Wykazano, że aktyw ność C K I a je s t ham ow ana
przez fosfoinozytolodifosforan (P IP 2) [51]. Ponadto,
lokalizacja subkom órkow a poszczególnych form
CKI jest czynnikiem ograniczającym dostępność
niektórych substratów do enzymu.
VII. U w agi końcow e
Wyniki badań prow adzon ych od wielu lat w y k a ­
zują, że kinaza białkow a CKI je s t enzym em w ielo­
funkcyjnym, zaangażow anym w wiele procesów k o ­
mórkowych. Lata dziew ięćdziesiąte są wyjątkowo
obfite w doniesienia, dotyczące odkrycia kolejnych
genów kodujących poszczególne formy CKI, zaró w ­
no u drożdży, jak i w yższych organizm ów eukario­
tycznych. Biorąc pod uw ag ę olbrzym ie tempo badań
dotyczących funkcji tego enzym u w kom órce, okre­
ślenie specyficznego udziału poszczególnych form
kinazy CKI w tak istotnych procesach ja k naprawa
DNA, czy podziały kom ó rko w e w ydaje się ju ż być
jedynie kw estią czasu.
Podziękowanie
Bardzo dziękuję Pani Profesor Teresie Jakubow icz
za cenne uwagi i sugestie w trakcie p rzy g o to w y w a­
nia niniejszej pracy.
Artykuł otrzymano 4 listopada 1999 r.
Zaakceptowano do druku 2 marca 2000 r.
146
Ryc. 3. Regulacja aktywności kinazy CKI przez koniec
karboksylowy enzymu. Ufosforylowany C-koniec
blokuje dostęp białek do miejsca wiązania substratu. Pełna aktywacja CKI odbywa się przez proteo­
lityczne
odcięcie C-końcowcgo
fragmentu
cząsteczki lub przez jego defosforylację [50] —
zmodyfikowane.
P iśm iennictw o
1. H a m m a r s t e n O (1883) Z Physiol Chem 7: 227-273
2. B u r n e t t G , K e n n e d y E P (1954) J Biol Chem 211:
969-972
3. H a t h a w a y G M , T r a u g h J A (1979) J Biol Chem
254: 762-768
4. D o b r o w o l s k a G ( 1 989) Postępy Biochemii 35: 231 -244
5. G r a n k o w s k i N, I s s i n g e r O G (1990) Biochem Biophys
Res Commun 167: 471-476
6. T u a z o n P T , T r a u g h J A (1991) Adv Second M essenger Pho
sphoprotein Res 23: 123-164
7. G r a v e s P R , R o a c h P J (1995) J B io lC h em 270: 21689-21694
8. G r o s s S D , A n d e r s o n R A (1998; Cell Signal 19: 699-711
9. W o j d a I, C y t r y ń s k a M, J a k u b o w i c z T (1 9 9 6 )JB a sic
M icrobiol 36: 363-369
10. A g o s t i n i s P, V a n d e n d e e J R . , G o r i s J, M c g g i o F,
P i n n a L A , M a r l c v e d e W (1987) FEBS Lett 224: 385-390
11. F l o t o w H, R o a c h P J (1989) J Biol Chem 264: 9126-9128
12. C e g i e l s k a A, V i r s h u p D M (1993) Mol Cell Biol 13:
1202-1211
13. C e g i e l s k a A, M o a r c f i I, F a n n i n g E, V i r s h u p D M
(1994) J Virol 68: 269-275
14. B r o c k m a n J L , G r o s s S D , S u s s m a n M R , A n d e r ­
s o n R A (1992; P roc Natl A cad Sci USA 89: 9454-9458
15. F l o t o w H, G r a v e s P R , W a n g A, F i o ł C J , R o e s k e
R W , R o a c h P (1990) J Biol Chem 265: 14264-14269
16. G r o s s S D , S i m e r l y C, S c h a t t e n G, A n d e r s o n R A
(1997; J Celi Sci 110: 3083-3090
17. R o w l e s J , S l a u g h t e r C, M o o m a w C, H s u J , C o b b
M H (1991) Proc Natl A cad Sci USA 88:9548-9552
18. G r o s s S D , L o i j e n s J C , A n d e r s o n R A (1999) J Celi Sci
112: 2647-1645
19. Z h a i L, G r a v e s P R , R o b i n s o n L C , I t a l i a n o M,
C u l b e r t s o n M R . , R o w l e s J, C o b b M H , D c P a o l i - R o a c h A A , R o a c h P J (1995) J Biol Chem 270:
12717-12724
20. G r a v e s P R , H a a s D W , H a g e d o r n C H , D e P a o l i - R o a c h A A , R o a c h P J (1993) J Biol Chem 268:
6394-6401
2 1 . K u s u d a J, H i d a r i N , H i r a i M, H a s h i m o t o K (1996)
Genomics 32, 140-143
22. F i s h K J , C e g i e l s k a A, G e t m a n M E , L a n d e s G M ,
V i r s h u p D M (1995) J B iol Chem 270: 14875-14883
2 3 . H o Y, M a s o n S, K o b a y a s h i R, H o c k s t r a M, A n ­
d r e w s B (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 581-586
24. P a n e k H R , S t e p p J D , E n g l e H M , M a r k s K M , T a n
P K , L e m m o n S K , R o b i n s o n L C (1997) EM BO J 16:
4194-4204
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
25. Robinson LC, Hubboard EJA, Graves PR, DcPaoli-Roach AA, Ro­
ach PJ, Kung C, Haas DW, Hagedorn CH, Goebl M, Culbertson
MR, Carlson M (1992) Proc Natl Acad Sei USA 89: 28-32
26. R o b i n s o n L C , M e n o l d M M , G a r r e t t S, C u l b e r t ­
s o n M R (1993) Mol Cell Biol 13: 2870-2881
27. D c M a g g i o A J , L i n d b e r g R A , H u n t e r T , H o e k s t r a
M F (1992) Proc Natl Acad Sei USA 89: 7008-7012
2 8 . W a n g X, H o e k s t r a M F , D c M a g g i o A J , D h i l l o n
N, V a n c u r a A , K u r e t J, J o h n s t o n G C , S i n g e r R A
(1996) Mol Cell Biol 16: 5375-5385
29. K e a r n e y P H , E b e r t M, K u r e t J (1994) Biochem Biophys
Res Commun 203: 231-236
30. W a n g P - C , V a n c u r a A, D e s a i A, C a r m e l G, K u r e t
J (1994) J Biol Chem 269: 12014-12023
31. K i t a m u r a K , Y a m a s h i t a I (1998) Gene 214: 131-137
32. V a n c u r a A, S e s s l e r A, L e i c h u s B, K u r e t J (1994) J
Biol Chem 269: 19271-19278
33. L o n g e n e c k e r K L , R o a c h P J , H u r l e y T D (1996)J M o l
Biol 257, 618-631
34. X u R , C a r m e l G, S w e e t R M , K u r e t J , C h e n g X
(1995) EM BO J 14, 1015-1023
3 5 . H o e k s t r a M F , D h i l l o n N , C a r m e l G, D e M a g g i o
A J , L i n d b e r g R A , H u n t e r T , K u r e t J (1994) M ol Biol
Cell 5: 877-886
36. K e m p B E , P e a r s o n R B (1990) TIBS 15: 342-346
37. M e g g io F , D o n e l l a D A , P i n n a L A (1979) FEBS Lett
106, 76-80
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
38. T u a z o n P T , B i n g h a m E W , T r a u g h J A (\919) Ear J
Biochem 94: 497-504
39. L u P - W , T a o M (1986) Biochem Biophys Res Commun 139:
855-860
40. N e i m a n A M , S t e v e n s o n B J , X u H - P , S p r a g u e
C F , J r H e r s k o w i t z 1, W i g i e r M, M a r c u s S (1993)
M ol Biol Cell 4: 107-120
4 1 . Z h o u Z, G a r t n e r A, C a d e R, A m m e r c r G, E r r e d c
B (1993) M ol Cell Biol 13: 2069-2080
42. C h a i n D, K o r c - G r o d z i c k i B, K r e i z m a n T, S h a l t i e l S (1990) FEBS Lett 269: 221-225
4 3 . M e g g i o F, D o n e l l a - D e a n a A, P i n n a L A (1983) Bio­
chem Int 6: 427-432
44. G e o r g e C X, T h o m i s D C , M c C o r m a c k S J , S v a h n
C M , S a m u e l C E (1996) Virology’ 221: 180-188
45. P a t e l R C , S t a n t o n P, S e n G C (1994) J Biol Chem 269:
18593-18598
46. G a o G, G o I d f o r d M (1995) EM BO J 14: 2183-2190
47. P u k a c L A , C a r t e r J E , O t t l i n g e r M E , K a r n o v s k y
M J (1997) J Cell Physiol 172: 69-78
48. W o j d a I, F r a j n t M, J a k u b o w i c z T (1997) J Basic
M icrobiol 37: 371-377
49. W o j d a I, C y t r y ń s k a M, F r a j n t M, J a k u b o w i c z T
(1999) Acta Biochim Polon 46: 211-215
50. C e g i e l s k a A, G i e t z e n K F , R i v e r s A, V i r s h u p D M
(1998) J Biol Chem 273: 1357-1364
51. B r o c k m a n J L , A n d e r s o n R A (1991) J Biol Chem 266:
2508-2512
http://rcin.org.pl
147
Kinaza białkowa CKII
Protein kinase CKII
IWONA WOJDA*
Spis treści:
Contens:
I.
II.
III.
IV.
I.
II.
III.
IV.
Ogólna charakterystyka
Struktura podjednostkowa i regulacja aktywności
Funkcja CKII w komórce
Podsumowanie
Wykaz stosowanych skrótów: CKII — kinaza białkowa CKII
(CK — skrót od nazwy zwyczajowej, ang. casein kinase ); ATP
— adenozyno-5’- trifosforan; GTP — guanozyno-5’-trifosforan; PKA — kinaza zależna od cAMP, mRNA — informacyjny
RNA; elF — eukariotyczny czynnik inicjacyjny translacji; D —
kwas asparaginowy; E — kwas glutaminowy; p — reszta kwasu
fosforowego; S (Ser) ■
— seryna, T (Tre) — treoniona; X — do­
wolny aminokwas; Y — (Tyr) tyrozyna.
I. O gólna ch arakterystyka
Kinaza białkow a CKII je st je d n ą z kinaz serynowo/treoninowych, niezależnych od cyklicznych nukleotydów.
General characteristics
Subunit structure and regulation of activity
Function of CKII in the cell
Summary
roku, do 99 białek [4], Obecnie lista p rz ypu szczal­
nych substratów tego enzym u zawiera około 2 0 0
białek, wśród których znajdują się kluczow e enzymy
niektórych szlaków m etabolicznych (syntaza gliko­
genu, dekarboksylaza ornityny); receptory (receptor
insuliny, receptor 1GF-II); białka uczestniczące w
przekazyw aniu sygnałów w kom órce (podjednostka
Rn PKA, kalm odulina, inhibitor-2 fosfataz); czynni­
ki transkrypcyjne (c-Myc, c-M yb); białka supresorowe now otw orów (p53); enzym y jąd row e (polim eraza
I i II RNA, topoizom eraza DNA I i II); czynniki
translacji (eIF3, eIF5) oraz białka cytoszkieletu (klatryna, spektryna) [ 8 ]. Dosyć niezw ykłą cech ą kinazy
Badania genetyczne wykazały, że CKII jest nie­
zbędna dla przeżyw alności kom órek Saccharom yces
cerevisiae, [1], Schizosaccharom yces po m b e [2],
D ictyostelium discoideum [3], A ktyw ność CKII ha­
m owana jest in vitro przez polianiony takie jak: kwas
poliglutaminowy, kwas poliasparaginowy, a przede
wszystkim heparynę, stym ulow ana zaś przez poliaminy takie ja k sperm ina oraz zasadow e białka takie
jak polilizyna czy protam ina. Enzym ten je st nie­
wrażliwy na działanie staurosporyny, zw iązku h a­
mującego aktyw ność wielu kinaz białkowych. CKII
wykorzystuje zarówno ATP ja k i G TP jak o źródła
reszt fosforanowych [4-7].
wać się am inokwas o charakterze kw aśnym lub
uprzednio ufosforylow ana seryna, treonina lub ty ro ­
zyna. Jednak w iększa liczba kwaśnych am in o k w a ­
sów wokół m iejsca fosforylacji zw iększa jej w y d a j­
Lista białek fosforylow anych przez CKII wzrasta
bardzo szybko. W roku 1980 znane były jed ynie
ność [4, 6 , 7, 13].
Ostatnio w literaturze pojawiły się doniesienia, że
3 substraty, do roku 1990 liczba znanych białek fos­
forylow anych przez CKII w zrosła do 35, a do 1993
CKII uważana dotąd za klasyczną kinazę serynow o/treoninową, podobnie jak CKI może rów nież fosforylować reszty tyrozynow e. W ykazano, że CKII z
drożdży Yarrowia lipolytica, w obecności jo n ó w
M g++ulega autofosforylacji w resztach serynow ych i
treoninowych. W obecności jo n ó w M n++ autofosforylacja w resztach serynow ych i treonino w y ch je s t
znacznie mniejsza, wzrasta natom iast poziom auto-
*Dr, Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Mikrobiologii i
Biotechnologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet
Marii Curie-Skłodowskiej, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin
148
CKII jest jej zdolność do tw orzenia stabilnych k o m ­
pleksów z wielom a substratam i [9, 10]. W iadom o,
że CKII z S. cerevisiae tworzy kom pleks z topoizom e ra z ą ll [11] oraz białkiem Srp40 [12], F izjolo gicz­
na rola takich kom pleksów nie jest jeszcze poznana.
Kinaza białkowa CKII rozpoznaje resztę seryn ow ą czy treoninow ą w fosforylow anym białku w
sekwencji S /T -X -X -D /E/Sp/Tp/Y p. W pozycji +3 w
stosunku do fosforylow anego m iejsca musi znajdo ­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
fosforylacji enzym u w resztach tyrozynow ych [14].
Podobne wyniki uzyskano używając kazeiny jako
substratu. Tak więc obecność jo n ó w M n++zmienia
CKII w kinazę b iałk ow ą o podwójnej specyficzno­
w y m ag ają kontaktu z obydw iem a podjednostkami
ści.
Kolejne doniesienie o zdolności CKII do fosfory­
lacji białek w resztach tyrozynow ych pochodzi z g ru ­
py kierowanej przez M a r t i n (University o f C ali­
podjednostek katalitycznych.
Na podstawie pow yższych informacji zapropono­
wano model budow y h oloenzym u kinazy CKII
przedstawiony na rycinie 1 , w edług którego p o djed­
fornia, Berkeley) Wykazano, że jąd ro w e białko Fpr3
(ang. im m u n o p h ilin) drożdży Saccharom yces cerevi­
nostki P znajdują się w ew nątrz tetrameru, tworząc
siae jest fosforylowane w reszcie tyrozynowej
(Tyr184) przez oczy szczon ą CKII z drożdży oraz rekom bin acy jn ąC K II ludzką i z D rosophila m elanogaster. Fosforylacja T y r 1 8 4 w ym aga obecności fosfose-
regulatorowym i do prawidłowej asocjacji lub, że di­
meryzacja podjednostek regulatorowych powoduje
zmiany konform acyjne ułatwiające przyłączenie
tzw. rdzeń, natom iast podjednostki katalityczne zlo­
kalizowane są na zewnątrz. Wykazano, że za interak­
cje P~P oraz p - a odpow iedzialny jest fragment
C -końcow y podjednostki regulatorowej CKII (za­
kreślony trapez) [23].
ryny lub kw aśnego am inokw asu w pozycji +2 [15].
Zdolność CKII do fosforylacji białek w resztach
tyrozynow ych m oże mieć istotne znaczenie w k o ­
m órkach drożdży, u których jak w iadom o nie ma ty ­
powych kinaz tyrozynow ych.
^ pozytywna i negatywna
regulacja aktywności
podjednostki katalitycznej
*/ stymulacja aktywności
przez polikationy
yn tworzenie kompleksów
z innymi białkami
II. Struktura podjednostkow a i regulacja ak­
tyw ności
Obecność kinazy CKII stwierdzono we w szy st­
kich zbadanych dotąd organizm ach eukariotycz­
nych. W znacznej większości z nich enzym ten
składa się z dwóch podjednostek katalitycznych ( a
lub a ’), o masie od 35kDa do 44kD a (u S.cerevisiae
są one kodowane przez geny CKA1 i CKA2) oraz
dwóch podjednostek regulatorow ych ([3) o masie od
24kDa do 29kDa. U Saccharom yces cerevisiae w y ­
kazano obecność dwóch różnych podjednostek regu ­
latorowych tj. p i P ’, kodow anych przez niezależne
geny (CKB1 i CKB2). Obecność dwóch różnych p o d ­
jednostek regulatorowych w ykazano także u A rabidopsis thaliana i Candida albicans [16, 17, 18].
Podjednostki p pełnią jak wcześniej w spom niano
funkcję regulatorową. Z w iększają odporność en zy­
mu na denaturację i w większości przypadków sty­
m ulują aktywność katalityczną podjednostek a.
Badania nad strukturą czw artorzędo w ą CKII pro ­
wadzone były w kilku laboratoriach, z w y ko rzy sta­
niem systemu dw uhybrydow ego [19-21], Wykazały
one, że podjednostki P w cho dzą we w zajem ne inte­
rakcje, jak również w interakcje z podjednostkam i a ,
podczas gdy podjednostki katalityczne o d d ziału jąjedynie z podjednostkam i P (nie zaobserw ow ano o d ­
działywań typu a - a ) . Ponadto badania wykazały, że
dimery podjednostek p łatwiej w iążą podjednostki
katalityczne niż ich formy m onom eryczne [22], S po ­
strzeżenie to nasuwa wniosek, że dim eryzacja p o d ­
jednostek p poprzedza przyłączenie podjednostek
katalitycznych. Może to oznaczać, że podjednostki a
POSTĘPY BIOCHEMII 46(2), 2000
y/ aktywność katalityczna
y/ rozpoznawanie miejsca
fosforylacji
hamowanie aktywności
enzymu przez polianiony
Ryc. 1. Struktura podjednostkowa kinazy CKII, [6]-zmodyfikowane.
Doświadczenia z użyciem syntetycznych frag­
m entów podjednostki p wykazały, że fragment
C -końcow y polipeptydu P stym uluje aktywność ka­
talityczną podjednostki a oraz stabilizuje enzym
(pozytyw na kontrola), natom iast N-koniec pełni
funkcję inhibitora (negatyw na regulacja) [22, 24,
25], '
Tak więc podjednostka regulatorow a kinazy CKII
pełni p odw ójn ą funkcję. Z jednej strony zwiększa
ona aktywność podjednostki katalitycznej, z drugiej
zaś może również działać ham ująco na jej ak tyw ­
ność. Hamujące działanie podjednostki P j e d najbar­
dziej widoczne w odniesieniu do takich substratów
jak kalm odulina czy dekarboksylaza ornityny, któ­
rych fosforylacja jest całkow icie ham owana w o bec­
ności podjednostki p. H oloenzym CKII może jed nak
fosforylować powyższe substraty w obecności białek
o charakterze zasadow ym takich jak: protamina, histon czy polilizyna [26, 27]. Na uwagę zasługuje
fakt, że spermina, która jak w iadom o stymuluje ak­
tywność kinazy CKII, może ham ować fosforylację
kalm oduliny w obecności białek zasadowych [28],
http://rcin.org.pl
149
Powyższe wnioski dotyczące roli podjednostki (3 w
regulacji aktywności enzym u, zdają się być p otw ier­
dzone przez wyniki badań z użyciem peptydowych
substratów CKII. W ykazano, że poziom fosforylacji
peptydu jest w y pa d k o w ą po zytyw nego i n eg aty w n e­
go działania podjednostek p na podjednostki a . W
mutantach substytucyjnych, u których sekwencja
am inokw asów w N -końcu podjednostki P kinazy
CKII została zm ieniona zaobserw ow ano hyperaktywację podjednostki a przez p odjednostkę P, ja k ró w ­
nież brak ham ującego w pływ u podjednostki p na fosforylację kalm oduliny przez h oloenzym CKII [27].
Aktywność kinazy CKII jest, ja k wcześniej w s p o ­
mniano, stym ulow ana przez poliaminy, szczególnie
sperminę oraz zasadow e polipeptydy, np. polilizynę.
Stymulacja aktywności CKII przez poliam iny jest
najbardziej w idoczna w odniesieniu do takich sub­
stratów ja k kazeina czy czynnik transkrypcyjny
MyoD i m a m iejsce jed y n ie w obecności podjednost­
ki P przy niskim stężeniu jo n ó w M g ++.
Nieznany jest jeszcze m echanizm regulacji a k ­
tywności CKII przez polikationy, niemniej jed n ak w
literaturze pojaw iają się próby jeg o wyjaśnienia. Na
rycinie 2 przedstaw iony je s t model stymulacji ak­
tywności kinazy CKII przez sperm inę zap rop ono w a­
ny przez L e r o y i w s p .
[ 2 9 ,3 0 ].
centrum katalityczne
nostki p, znajdującym i się w części N-końcowej polipeptydu. Taka „zam kn ięta” konform acja holo enzy­
mu, stabilna przy Im M stężeniu jo n ó w M g ++, ograni­
cza dostęp substratów do centrum katalitycznego en­
zymu. Spermina, jak twierdzi L e r o y przyłącza się
do m iejsca w iążącego poliam iny znajdującego się
ja k wcześniej w spom niano w N -k o ń c u podjednostki
regulatorowej. P ow oduje to odsłonięcie centrum ka­
talitycznego enzymu. CKII przybiera konform ację
„otw artą” i centrum katalityczne staje się bardziej
dostępne dla substratu.
W ostatnich latach wzrosła liczba poznanych
białek zdolnych do interakcji z po djedno stk ą p k ina­
zy CKII. Przypuszcza się, że niektóre z tych białek
dzięki obecności w strukturze pierw szorzędowej
szeregu am inokw asów o charakterze zasadow ym
m o g ą „naślad ow ać” działanie polilizyny. M a to
m iejsce w przypadku fosforylacji białka Mdm2
przez CKII. Białko M dm2 je s t inhibitorem białka
p53. Fosforylacja M dm 2, podobnie jak fosforylacja
kalm oduliny jest ham ow ana przez podjednostkę re ­
gulatorow ą CKII. Wykazano, że fosforylacja białka
Mdm2 przez kinazę CKII jest stym ulow ana przez k o ­
niec C białka p53, naśladujący działanie polilizyny
[31].
U drożdży S. p o m b e dysrupcja genu kodującego
podjednostkę P CKII pow oduje znaczny spadek a k ­
tywności CKII. W tym przypadku aktywność p o d ­
jednostki katalitycznej CKII jest bardzo niska i podjedn ostka P jest niezbędna do uzyskania dostatecznej
dla praw idłow ego funkcjonow ania kom órek akty w ­
ności enzymu. Warto tu zaznaczyć, że u S. p o m b e se­
kwencja kwaśnych am inokw asów w N -końcu p o d ­
jednostki p, odpow iedzialnych za ham ow anie ak ­
tywności podjednostki katalitycznej nie jest tak d o ­
brze zachowana. Sugeruje to, że u tego gatunku d ro ­
żdży funkcją podjednostek P jest jed y n ie stym ulacja
aktywności podjednostek katalitycznych [cyt za 6 ],
Z literatury wiadom o, że u niektórych organi­
zm ów takich jak Zea m ays czy D ictyostelium istnieją
m onom eryczne formy CKII, odpow iadające podjednostce a [32, 33].
Dotychczas brak jest przekonyw ujących d o w o ­
dów dotyczących regulacji aktywności CKII przez
fosforylację. Podjednostką p jest fosforylow ana
przez podjednostkę katalityczną CKII w N -końcu
(Ser 2 i / lub Ser3) [34], Wykazano, że autofosforyla-
Ryc. 2. Model stymulacji aktywności kinazy CKII przez sperminę wg
L e r o y i w s p . [30]- zmodyfikowane, objaśnienia w tekście.
Struktura holoenzym u CKII je s t stabilizowana
przez oddziaływ ania elektrostatyczne pom iędzy d o ­
datnio naładow anym i resztam i w centrum katalitycz­
nym podjednostki a , a ujem nym i ładunkam i podjed150
cja CKII pow oduje niewielki spadek aktyw ności en ­
zym u [35] ja k również, że aktyw ność CKII in vitro
jest większa w obecności fosfataz, które p ra w d o p o ­
dobnie utrzym ują enzym w formie zdefosforylow anej [36]. Z drugiej strony na przełom ie lat o siem dzie­
siątych i dziew ięćdziesiątych pojaw iały się prace s u ­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
gerujące, że fosforylacja CKII je s t skorelow ana ze
wzrostem aktywności tego enzym u w odpowiedzi
komórki na czynniki w zrostow e, surow icę czy h o r­
mony [cyt. za 37].
Wykazano, że holoenzym y CKII w w arunkach in
vitro m ają zdolność do tw orzenia oligo- i polimerów.
Przy w ysokim stężeniu soli (0,5 M), CKII występuje
w postaci p rotom erów o średnicy około 18 nm, o dp o­
W dalszym ciągu jed n ak pozostaje do wyjaśnienia
czy wyżej w spom niane struktury CKII w ystępują in
vivo , a jeżeli tak, to ja k a je s t ich fizjologiczna funk­
cja.
P om im o ogromnej ilości badań nad regulacją ak ­
tywności CKII, specyficzne inhibitory tego enzymu
nie są dokładnie poznane. Pow szechnie znany jest
w pływ heparyny na aktyw ność CKII. Podjęto ró w ­
dwóch podjednostek katalitycznych ( 0 .2 0 2 )- PrzY n iż­
szym stężeniu soli, rzędu 0,2 M NaCl, protom ery
CKII aso c ju ją z e sobą tw orząc struktury pierścienio­
we o średnicy około 36 nm. W skład pojedynczego
nież próby chemicznej syntezy inhibitorów CKII.
W iększość z nich to pochodne benzim idazolu takie
jak: 5,6-DiCl-RB (5,6-dichloro-l-0-D -rybofuranozyl b enzym idazolow y-D R B ), 5,6-DiBr-RB (5,6d ib ro m o -1-0-D-rybofuranozyl
benzym idazolow y)
czy 4-C1-DRB (4,5,6-trichloro-l-0-D -rybofuranozyl
pierścienia w c h o d z ą 4 protom ery enzym u [ ( a 20 2)4]Jeśli stężenie soli zostanie obniżone do 0,1 M NaCl
kinaza CKII w ystępuje ja k o m ieszanina proto-, oli­
go- i polimerów. Poza wyżej w spom nianym i struktu­
benzym idazolow y) i inne [40, 41],
P ow yższe inform acje wskazują, że dalsze badania
nad m echanizm em regulacji aktywności CKII, a w
szczególności nad poszukiw aniem specyficznych in­
rami pojaw iają się dodatkow o tzw. cienkie i grube filamenty. Filam enty cienkie p ow stają pra w d o p o d o b ­
nie poprzez liniow ą asocjację protom erów CKII
[ ( a 2(32)n]• M ają one długość od 1 do 5 pm. Filamenty
grube są krótsze i pow stają dzięki liniowej asocjacji
struktur pierścieniow ych CKII [ ( ( a 20 2)4)n] [38]. P o ­
szczególne formy w jak ich kinaza CKII m oże w y stę­
pować w zależności od siły jonow ej środowiska
przedstawia rycina 3.
hibitorów tego enzym u m o g ą w przyszłości mieć
istotne znaczenie w terapii wielu chorób, szczegól­
nie chorób now otw orow ych.
wiadających pojed yń czy m holoenzym om składa­
jącym się z dwóch podjednostek regulatorow ych i
P ro to m e r
S tru k tu ra
C ie n k i f ila m e n t
G r u b y f ila m e n t
p ie rś c ie n io w a
(a2p2)4
(a;p2)„
((a2p2)2)„
Ryc. 3. Struktura czwartorzędowa kinazy białkowej CKII [38] — zmo­
dyfikowane.
Badania in vitro wykazały, że w optym alnych w a ­
runkach katalizy, tj. przy w ysycającym stężeniu sub­
stratów i kofaktorów kinaza białkow a CKII p rzy bie­
ra formę struktur pierścieniow ych. Takie kofaktory
jak jony M g++ czy bardzo niskie stężenia sperminy
stabilizują struktury pierścieniow e, nie dopuszczając
do utworzenia nieaktyw nych protom erów czy filamentów. Wysokie, ham ujące aktyw ność enzym u stę­
żenia soli, po w odują dysocjację aktyw nych struktur
pierścieniowych do protomerów. Powyższe o bser­
wacje sugerują ścisłą korelację pom iędzy k on fo rm a­
cją enzymu, a jego aktyw no ścią i w ydają się potwiedzać sugestie o allosterycznej regulacji aktywności
CKII [cyt. za 39],
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
III. Funkcja C K II w kom órce
Fizjologiczna rola kinazy CKII w kom órce nie jest
jeszcze dokładnie poznana. M nogość potencjalnych
substratów wskazuje, że kinaza ta jest enzym em w ie­
lofunkcyjnym, zaangażow anym w wiele procesów
kom órkowych. A ktyw ność kinazy białkowej CKII
jest bardzo duża w kom órkach szybkodzielących się
zarówno prawidłow ych jak i po transformacji n o w o ­
tworowej. Z aobserw ow ano rów nież wzrost aktyw ­
ności CKII w odpowiedzi na stym ulację kom órek
mitogenami.
Wyniki prow adzonych od wielu lat badań nad rolą
CKII u Saccharom yces cerevisiae pozwoliły w y o d ­
rębnić cztery główne procesy, w które enzym ten jest
zaangażowany. Są to: regulacja ekspresji genów,
cykl komórkowy, polarność kom órki oraz h om eosta­
za [cyt. za 4],
Wykazano, że aktywność kinazy CKII jest istotna
w transkrypcji genów zależnych od polimerazy III
zarówno iv vivo jak i in vitro. W ekstraktach drożdży
S. cerevisiae u których zinaktyw ow ano gen CKA2,
kodujący podjednostkę a ’ kinazy CKII (ang. gene d i­
sruption) wykazano znacznie niższy poziom tran­
skrypcji genów dla tRNA i 5S rR N A w porównaniu z
ekstraktami z kom órek kontrolnych. Prawidłowy p o ­
ziom transkrypcji tych genów uzyskano po dodaniu
do ekstraktu kinazy CKII oczyszczonej z drożdży
S. cerevisiae [4].
Kinaza białkowa CKII reguluje również ekspresję
flokulin, białek zew n ątrzkom órkow ych wiążących
http://rcin.org.pl
151
się do glikoprotein ściany kom órkow ej S. cerevisiae
[cyt. za 4].
Wyniki prow adzonych badań nad udziałem CKII
[48]. W ykazano również, że nadekspresja p odjed­
nostki a u myszy transgenicznych prowadzi do leu­
kemii [49], Ponadto CKII je s t enzymem fosfory-
w regulacji cyklu kom órko w ego u drożdży w y k a­
zały, że enzym ten je s t niezbędny w fazie G| oraz w
fazie G 2 lub/i M [42],
lującym wiele białek kodow anych przez genom
rusów takich ja k HIV (białka VPU i Rev), VSV,
tom egalowirus, co sugeruje, że CKII kom órek
spodarza jest zaangażow ana w przebieg infekcji
rusowej [ 8 ],
W kom órkach ssaków, m ikroiniekcja przeciwciał
skierow anych przeciw podjednostce [3 CKII p o w o ­
duje zaham ow anie cyklu kom órkow ego w kilku
m iejscach fazy Gi tj. G 0/G i, we wczesnej fazie Gi
oraz w Gi/S [43].
Nie w iadom o jedn ak, które białka niezbędne do
przejścia kom órki przez fazę Gi cyklu kom órkow ego
są fizjologicznym i substratam i CKII. Wykazano, że
u wyższych Eukaryota enzym ten in vitro fosforyluje
Ser39 w białku Cdc2. Warto zaznaczyć, że kinaza
Cdc2 jest również fosfory low ana in vivo w tej samej
pozycji w fazie Gi cyklu kom ó rko w eg o [44],
P rzypuszcza się że w fazie G 2/M fizjologicznym
substratem CKII je s t topo izo m eraza II. Enzym ten
jest niezbędny do p raw idłow ego przebiegu k o nden ­
sacji chrom atyny w m etafazie oraz do rozdziału sio­
strzanych chrom atyd w anafazie [42]. Wykazano, że
u S. cerevisiae fosforylacja topoizom erazy II przez
CKII in vitro znacznie stym uluje aktyw ność enzymu.
w i­
cygo­
w i­
IV. P odsum ow anie
Historia badań nad k in a z ą b ia łk o w ą C K II liczy już
sobie kilkadziesiąt lat. W iadom o, że jest to enzym
wielofunkcyjny, m odyfikujący wiele białek, które
biorą udział w takich procesach jak: nowotworzenie,
kontrola ekspresji genów, cykl kom órkow y czy apoptoza.
CKII jest w większości przypadków białkiem oligom erycznym składającym się z podjednostek kata­
litycznych i regulatorow ych, które asocjują ze sobą
tworząc natywny holoenzym . Podjednostki regulato­
rowe m odulują aktyw ność podjednostek katalitycz­
nych, decydują o lokalizacji subkom órkowej en z y ­
mu oraz um o żliw iają tworzenie kom pleksu w różny­
mi białkami.
Jednocześnie udow odniono, że topoizom eraza II,
która jest fosforylow ana in vivo, ulega hyperfosforylacji podczas mitozy [45].
Kinaza białkow a CKII bierze rów nież udział w
utrzym aniu polarności kom órki. Poniew aż mutanty
S. cerevisiae C K A lXs (ang. tem perature sensitive) w
tem peraturze restrykcyjnej w y k a zu ją nieco inny fe­
notyp niż mutanty C K A 2ts niektórzy uczeni sugerują
W ostatnich latach wzrasta liczba dowodów, że
poszczególne podjednostki CKII m og ą istnieć w k o ­
mórce niezależnie od siebie [cyt. za 50]. Jaka jest
rola poszczególnych polipeptydów a i ß w komórce
pozostaje do wyjaśnienia.
funkcjonalną specjalizację podjednostek a i a ’ u
tego gatunku drożdży [46, 47].
Wykazano, że u Saccharom yces cerevisiae kinaza
CKII odgryw a istotną rolę w regulacji odporności
komórki na wysokie stężenie soli. Kom órki drożdży
u których zinaktyw ow ano gen kodujący podjednostkę p charakteryzow ały się w rażliw o ścią na wysokie
stężenie N a + i Li+ [16]. Przypuszcza się, że CKII fos­
foryluje, a tym sam ym aktyw uje białko(a) o d p ow ie­
dzialne za indukcję genu E N A l w odpow iedzi k o ­
mórki na wysokie stężenie soli. M ożliw e jest ró w ­
nież, że enzym ten inaktywuje inhibitor ekspresji ge­
nów E N A. Białka k odow ane przez geny E N A 1-4
tw orzą tzw. „p o m p ę” sodową, od pow iadającą za
transport jo n ó w N a+ na zew nątrz kom órki i są indu­
kowane w odpow iedzi na w ysokie stężenie soli [4].
Wykazano, że aktyw ność/ilość kinazy białkowej
Serdecznie dziękuję Pani P rofesor Teresie Jak u b o ­
wicz za cenne uwagi i rady w czasie p rzygo tow yw a­
nia niniejszego artykułu.
CKII je s t znacznie w iększa w k om órkach n o w o tw o ­
rowych, np. w 50% n ow otw oró w nerek zaobserw o­
wano nadm iar podjednostki regulatorowej CKII
152
Podziękowanie
Artykuł otrzymano 4 listopada 1999 r.
Zaakceptowano do druku 2 marca 2000 r.
Piśm iennictw o
1. P a d m a n a b h a R , C h e n - W u J L P , H a n n a
D E , G l o v e r C V C (1990) M ol Celi Biol 10: 4089-4099
2. S n e l l V, N u r s e P (1994) EMBO J 13: 2066-2074
3. K i k k a w a U, M a n n S K O , F i r t e l R A , H u n t e r T
(1992) M ol Celi Biol 12: 571 1-5723
4. G l o v e r C V C (1998) Prog Nuc A cid Res 59: 95-133
5. P i n n a L A (1990) Biochim Biophys Acta 1054: 267-284
6. P i n n a L A , M e g g i o F ( l 997) Prog Cell Cycle Res 3: 77-97
7. T u a z o n P T , T r a u g h J A (1991) Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 23: 123-164
8. P i n n a L A (1997) Int J Biochem Cell Biol 29:551-554
9. L i D , D o b r o w o l s k a G, K r e b s E G (1996) J Biol Chem
271: 15662-15668
10. M i y a t a Y, Y a h a r a I (1995) Biochemistry 34: 8123-8129
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
11. C a r d e n a s M E . , W a l t e r R, H a n n a D, C a s s e r S M
(1993) J Cell Sci 104: 533-543
12. M e i e r U T (1996) J B iol Chem 271: 19376
13. K e m p B E , P e a r s o n R B (1990) TIBS 15: 342-346
14. C h a r d o t T , S h e n H , M e u n i e r J C (1995) C R A cad Sci
(Paris) 318: 937-942
15. W i l s o n L K , D h i l l o n N, T h o r n e r J, M a r t i n G S
(1997) J Biol Chem 272: 12961-12967
16. B i d w a i A P , R e e d J C , G l o v e r C V C (1995) J Biol Chem
270: 10395-10404
17. C o l l i n g e M A , W a l k e r J C (1994) Plant M ol Biol 25:
649-658
18. W a l z K , P a r d o P S , P a s s e r o n S (1997) Arch Biochem
Biophys 340: 347-354
19. B o l d y r e f f B , I s s i n g e r O G (\991) FEBS Lett 403: 197-199
20. G i e t z D , G r a h a m K C , L i t c h w i e l d D W (1995 ) J Biol
Chem 270: 13017-13021
2 1 . K u s k M , B e n d i x e n C , D u n o M, W e r t e r g a a r d O,
T h o m s e n B (1995) J M ol Biol 253: 703-711
22. M a r i n O , M e g g i o F , S a r n o S , P i n n a L A (1997) Bio­
chemistry 36: 7192-7198
23. L i t c h e f i e l d D W , S l o m s k i E , L e w e n z a S , N a r v e y
M , B o s e D G , G i e t z R D (1996) Biochem Cell Biol 74:
541-547
24. S a r n o S , V a g l i o P , M a r i n O , I s s i n g e r O G , R u f f a t o K , P i n n a L A (1 9 9 7 ) Biochemistry 36: 11717-11724
2 5 . S a r n o S, V a g l i o P, M a r i n O, M e g g i o F, I s s i n g e r
O G , P i n n a L A (1 9 9 7 ) Eur J Biochem 2 4 8 :2 9 0 -2 9 5
26. M e g g i o F , B o l d y r e f f B , M a r i n O , M a r c h i o r i F ,
P e r i c h J W , I s s i n g e r O G , P i n n a L A ( \992) Eur J Bio­
chem 205: 939-945
27. M e g g i o F , B o l d y r e f f B , I s s i n g e r O G , P i n n a L A
(1994) Biochem istry 33: 43 3 6-4342
28. S a r n o S , M a r i n O , M e g g i o F , P i n n a L A (1993) Bio­
chem Biophys Res Commun 194: 83-90
29. L e r o y D , S c h m i d N , B e h r J P , F i l h o l O , P a r e s S ,
G a r i n J, B o u r g a r i t J J , C h a m b a z E M , C o c h e t C
(1995) J Biol Chem 270: 17400-17406
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
30. L e r o y D, H c r i c h e J K , F i l h o l O, C h a m b a z E M ,
C o c h e t C (1997) J Biol Chem 272:20820-20827
3 1 . G u e r r a B, G ö t z C, W a g n e r P, M o n t e n a r h M, I s ­
s i n g e r O G (1997) Oncogene 14: 2683-2688
32. D o b r o w o l s k a G, M e g g i o F, S z c z e g i e l n i a k J, M u ­
s z y ń s k a G, P i n n a L A (1992) Eur J Biochem 204: 299-303
3 3 . 0 s p i n a B , N u n e z A, F e r n a n d e z - R c n a r t M (1992)
Mol Cell Biochem 118: 49-60
34. M e g g i o F, P i n n a L A (1984) Eur J Biochem 145: 593-599
35. L i n W J , S h e u G T , T r a u g h J A (1994) Biochemistry 33:
6998-7004
3 6 . A g o s t i n i s P, G o r i s J, P i n n a L A , M a r l e v e d e W
(1992) Biochem J 248: 785-789
37. L i t c h f i e 1d D W , D o b r o w o l s k a G, K r e b s E G (1994)
Cell M ol Biol Res 40: 373-381
3 8 . V a l e r o E, D c B o n i s S, F i l h o l O, W a d e R H , L a n g o w s k i J, C h a m b a z E M , C o c h e t C (1995) J Biol Chem
270, 8345-8352
39. V a l e r o E, C h a m b a z E M , C o c h e t C (1997) Biochem
Biophys Res Commun 232: 178-182
40. S h u g a r D (1995) Acta Biochim Polon 42: 405-418
4 L S h u g a r D (1995) Pharmacol Ther 82: 315 - 335
42. H a n n a D E , R e t h i n a s w a m y A, G l o v e r C V C (1995) J
Biol Chem 270: 25905-25914
4 3 . P e p p e r k o k R, L o r e n z P, A n s o r g e W, P y e r i n W
(1994) J Biol Chem 269: 6986-6991
44. R u s s o G L , V a n d e n b e r g M T , Y u I J , B a e Y S , F r a n z a B R , J r . M a r s h a k D R (1992) J Biol Chem 267,
20317-20325
4 5 . C a r d e n a s M , D a n g Q, G l o v e r C V C , G a s s e r S M
(1992) EM BO J 11: 1785-1796
46. B o d e n b a c h L, F a u s s J , R o b i t z k i A, K r e h a n A,
L o r e n z P, L o z e m a n F J , P y e r i n W (1994) Eur J Bioch
220: 263-273
47. R e t h i n a s w a m y A, B i r n b a u m M J , G l o v e r C V C
(1998) J B i o l Chem 273: 5869-5877
48. I s s i n g e r O G (1993) Pharmacol Ther 59: 1-30
49. S e i d i n D C , L e d e r P (1995) Science 267: 8 9 4 - 897
5 0 . G u e r r a B, I s s i n g e r O G (1999)Electrophoresis20:391 -408
http://rcin.org.pl
153
Dehydrogenaza
NADH
kompleksu
I łańcucha
oddechowego. Podstawowe podjednostki kodowane
przez genom jądrowy
Complex I NADH-dehydrogenase of the respiratory
chain. The basic subunits encoded by a nuclear genome
DOROTA PIĘKNA*
Spis treści:
Contents:
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
Wstęp
Minimalny kompleks I
Kompleks I organizmów wyższych
Przestrzenny model kompleksu I
Kompleks I roślin
Podjednostka PSST - potencjalne miejsce wiązania cen­
trum N2
VII. Podsumowanie
I. Introduction
II. Minimal complex I
III. Complex I of higher organisms
IV. Three-dimensional structure of complex I
V. Plant complex I
VI. PSST subunit - the potential binding site for N2 cluster
VII.Concluding remarks
Wykaz stosowanych skrótów: N A D H — d in u k le o ty d n ik o ty -
dwóch system ów błonow ych tj. błony wewnętrznej i
zewnętrznej, spow odow ała pojaw ienie się dwóch
przedziałów: matriks m itochondrialnej i przestrzeni
m iędzybłonowej. Tym sam ym w m itochondriach
utworzone zostały odpow iednie warunki do p rzeb ie­
gu różnych procesów zw iązanych z uzyskiw aniem
energii w postaci ATP.
Fosforylacja oksydacyjna zachodząca przy u d zia­
le łańcucha oddechow ego to końcow y szlak o gó ln e­
go procesu zm ierzającego do uzyskania energii z
prostych zw iązków organicznych.
n a m id o a d e n in o w y (p o sta ć z re d u k o w a n a ); N A D P H — fo sfo ra n
d in u k le o ty d u n ik o ty n a m id o a d e n in o w e g o (p o sta ć z re d u k o w a ­
na); FM N — m o n o n u k le o ty d fla w in o w y (p o sta ć u tle n io n a);
FA D — d in u k le o ty d fla w in o a d e n in o w y (p o sta ć u tle n io n a); ATP
— a d e n o z y n o trifo sfo ra n ; N D — n a z w a p o d je d n o s te k k o m p le k ­
su I z w ierz ąt i g rz y b ó w k o d o w a n y c h p rz e z g e n o m m ito c h o n d rialny; n a d — m ito c h o n d ria ln e g e n y p o d je d n o s te k N A D k o m ­
p lek su I ro ślin ; N A D — n a z w a p o d je d n o s te k k o m p le k su I ro ślin
k o d o w a n y ch p rz e z g e n o m m ito c h o n d ria ln y ; n u o — g e n y p o d ­
je d n o s te k k o m p le k su I E .c o li\ N u o — n a z w a p o d je d n o s te k k o m ­
p lek su I E. coli', N U O — n a z w a p o d je d n o s te k k o m p le k su I N.
crassa\ ndh — c h lo ro p la s to w e g e n y p o d je d n o s te k d e h y d ro g e ­
nazy N A D (P )H ; N D H — n a zw a p o d je d n o s te k c h lo ro p la sto w e j
d e h y d ro g e n a z y NA D(P)F1; Ę H jT D P — (a n g .) ( tr ijlu o r o m e th y l)
d ia zirin y lp y rid a b e n ; S D S /P A G E — e le k tro fo re z a w żelu p o liak ry la m id o w y m z SD S; E P R — e le k tro n o w y re z o n a n s p a ra m a ­
g n e ty c zn y (sp in o w y ); E m — p o te n c ja ł w y ra ż a n y w m V
I. W stęp
M itochondria określa się jak o siłownie komórki,
gdyż zachod zą w nich procesy prow adzące do w y ­
tworzenia energii. Obecność w m itochondriach
*M gr, Z ak ład B iolo g ii M o le k u la rn ej R o ślin , In sty tu t B iologii
M o le k u la rn ej i B io te c h n o lo g ii, U A M , ul. M ię d z y c h o d z k a 5,
60-371 P oznań
154
Sekwencję nośników elektronów w łańcuchu mitochondrialnym ustalono w znacznej mierze w latach
sześćdziesiątych dzięki zastosow aniu elektrody tle­
nowej i technik spektroskopow ych. W skład łań cu ­
cha oddechow ego rozm ieszczonego w wewnętrznej
błonie mitochondrialnej, w ch od zą cztery kom pleksy
enzym atyczne znane jako oksydoreduktaza N A D H ubichinon (kom pleks I, E.C. 1.6.99.3), ok sy d o re d u k ­
taza
bursztynian-ubichinon
(kom pleks
II,
E.C. 1.3.99.1),
oksydoreduktaza
ubichinol-cytochrom c (kompleks III, E.C. 1.10.2.2.) i oksydaza cytochrom u c (kom pleks IV, E.C. 1.9.9.1.). Pod sta­
w ow ą funkcją łańcucha oddechow ego jest prz en o ­
szenie elektronów od pary N A D 7 N A D H do pary
0 2/2 H 20 . Drugą w ażn ą funkcją jest translokacja p ro ­
tonów w poprzek błony z matriks m itochondrialnej
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
do przestrzeni m iędzybłonow ej. Przy udziale trzech
pomp protonow ych w ytw arzany je s t gradient proto­
nowy, który dostarcza energii do syntezy ATP.
Elektrony z kom pleksu I są przenoszone poprzez
zreduk ow an ą form ę ubichinonu do kom pleksu III i
następnie do kom pleksu IV. N a pulę ubichinonu
A
elektrony przenoszone są j e d n ą drogą: z N AD H na
tlen. D odatkow e cztery dehydrogenazy NAD (P)H są
zlokalizow ane w wewnętrznej błonie mitochondrialn e j; dwie są skierow ane w stronę m atriks a pozostałe
dwie w stronę cytozolu (Ryc. 1). Fakt w ystępowania
u roślin kilku dehydrogenaz utrudnia niewątpliwie
Przestrzeń międzybłonowa
2H
Przestrzeń międzybłonowa
2H
Matriks
Ryc. 1. A. Droga transportu elektronów w łańcuchu oddechowym. B. Schemat rozgałęzienia łańcucha oddechowego roślin. Dehydrogenaza NAD(P)H
niewrażliwa na rotenon skierowana w stronę matriks - N D wew, dehydrogenaza NAD(P)H niewrażliwa na rotenon skierowana w stronę prze­
strzeni międzybłonowej - N D zcw, ubichinon — UQ, oksydaza alternatywna - Oks.alt, cytochrom c - Cyt. c. W g R a s m u s s o n i w s p . [10]
(zmieniono).
elektrony dostarczane są rów nież z F A D H 2 przy
udziale dehydrogenazy bursztynianow ej (k o m ­
badanie transportu elektronów w łańcuchu o ddecho­
pleks II). Kom pleks II, w przeciw ieństw ie do p o zo ­
stałych kom pleksów, nie je s t po m p ą protonową.
Transport elektronów w łańcuchu odd ech ow y m jest
wym.
Donorem elektronów dla pierw szego ogniwa
łańcucha oddechow ego - dehydrogenazy N AD H są
cząsteczki N A D H zaw ierające pary elektronów o
m ożliwy dzięki różnicy potencjałów m iędzy N A D H
a 0 2, która wynosi 1,1 V.
W przeciw ieństw ie do innych eukariontów mitochondrialny łańcuch oddechow y roślin jest o wiele
bardziej rozbudowany. Oprócz podstaw ow ych skład­
ników łańcucha oddechow ego, u roślin w ystępują
w ysokim potencjale energetycznym . D ehydrogena­
za N A D H - kom pleks I je s t najw iększym wielopodjedn o stk o w y m kom pleksem enzym atycznym , w o b ­
rębie którego istnieje szereg centrów oksydoredukcyjnych ja k FM N i centra Fe-S, poprzez które p rz e­
noszone są elektrony z N A D H na kolejny akceptor -
dodatkowo cztery niewrażliwe na rotenon deh ydro­
genazy N A D (P )H i alternatyw na oksydaza. Żaden z
dodatkowych składników roślinnego łańcucha od d e­
chow ego nie p om puje protonów w poprzek błony [ 1,
2]. U roślin istnieje więc kilka dróg, którym i może
być transportow any elektron, podczas gdy u ssaków
ubichinon i następnie do kom pleksó w III i IV.
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
II. M inim alny kom pleks I
O ksydoreduktaza N A D H -u bichin on zwana dalej
dehy dro gen azą N A D H jest najbardziej skom pliko­
http://rcin.org.pl
155
wanym i najmniej poznan ym enzym em wśród k o m ­
pleksów m itochondrialnego łańcucha oddechowego.
Dzięki badaniom przeprow adzo nym z organizm am i
bakteryjnymi, m ożliw e było lepsze poznanie k o m ­
pleksu I w yższych organizm ów . Szczególnie inten­
sywnie prow adzone są badania kom pleksu I z N eurospora crassa i kom pleksu I w yizolow anego z mitochondriów serca wołu (Bos ta u ru s) [3, 4], Z dec y d o ­
wanie słabiej poznano dehy dro gen azę N A D H w ra ­
żliwą na rotenon roślin. Istnieją je d n a k pew ne cechy
Podjednostki NuoA, H, J, K, L, M, N są ho m ologicz­
ne z podjednostkam i kodow anym i przez genom m i­
tego w ielopodjednostkow ego kom pleksu enz y m a­
tycznego, które są w spólne dla w szystkich królestw
(bakterie, grzyby, rośliny, zw ierzęta). Te cechy to:
w ystępow anie 14 p o d staw ow ych podjednostek, k tó ­
re tw orzą „m inim aln y” aktyw ny kom pleks, w yraźna
hom ologia podjednostek „m in im a ln eg o ” kom pleksu
między gatunkam i różnych królestw, obecność grup
związanych z przebiegiem procesów oksydoredukcyjnych (FM N i centra Fe-S) (Tab. 1).
III. K om pleks I organizm ów w yższych
T abela.l.
Geny podstawowych podjednostek kompleksu I występujące w geno­
mie jądrowym, mitochondrialnym i chloroplastowym u roślin. U roślin
dwie podjednostki są kodowane przez genom mitochondrialny (Mit.),
podczas gdy u ssaków podjednostki te są kodowane przez genom jądro­
wy (Jąd.). Z 14 podjednostek „m inim alnego” kompleksu bakterii (geny
nuo u E. coli) 11 jest homologicznych do podjednostek występujących u
roślin w chloroplastach (Chl.:geny ndh). Dla podjednostki (24kDa)
Arabidopsis thaliana masę cząsteczkową określono na podstawie
cDNA. W g R a s m u s s o n i w s p . [10] (zmieniono).
Rośliny wyższe
Ją d .
M it.
Chi.
Ssaki
Mit.
E. coli
Ją d .
nad 1
ndh A
ndl
nuo H
nad 2
ndh B
nd2
nuo N
nad 3
ndh C
nd3
nuo A
nad 4
ndh D
nd4
nuo M
nad 4L
ndh E
nd4L
nuo K
nad 5
ndh F
nd5
nuo L
nad 6
ndh G
ndó
nad 7
ndh H
49kD
ndh I
TYKY
nuo I
ndh J
30kD
nuo C
28.5kD
nad 9
nuo D
PSST
nuo B
(24kD)
24kD
nuo E
55kD
51kD
nuo F
76kD
75kD
nuo G
22kD
ndh K
nuo J
U bakterii znane jest loeus chrom osom alne obej­
mujące 14 genów, które są hom ologiczne do po d jed ­
nostek m itochondrialnego kom pleksu I. Locus ten
nazwano nuo od pierw szych liter: N AD F\\ubiquinone oxidoreductase a poszczególne podjednostki o d ­
powiednio — NuoA, NuoB, itd. aż do NuoN [5].
156
tochondrialny ssaków, natom iast N uoB, C, D, E, F,
G, I są hom ologiczne z podjednostkam i kodow anym i
przez genom jądrow y. W obrębie bakteryjnego k o m ­
pleksu I (dehydrogenaza N AD H 1) znajdują się
wszystkie te podjednostki, w których określono w y ­
stępowanie miejsc w iążących N A D H , FM N i centra
Fe-S [5,6].
Kom pleks I izolowany z m itochondriów serca
wołu ma ciężar cząsteczkow y około 907 kDa i zbu­
dowany jest z co najmniej 43 różnych podjednostek
[7, 8]. W obrębie kom pleksu w ystępuje grupa prostetyczna FMN, dwa centra dw unuklearne [2Fe-2S]:
N l a i N l b , oraz cztery centra tetranuklearne
[4Fe-4S] oznaczone jak o N2, N3, N4, N5 [8].
Siedem podjednostek dehydrogenazy N A D H o
charakterze hydrofobow ym je st kodow anych przez
genom m itochondrialny [9]. Ich lokalizacja ograni­
cza się do części błonowej kom pleksu. W obrębie
tych podjednostek w ystępu ją liczne helisy transbłonowe, które zakotw iczają kom pleks w w e w n ętrz­
nej błonie mitochondrialnej. U zw ierząt i grzybów
podjednostki, których geny są zlokalizow ane w g e­
nom ie
m itochondrialnym
są
nazyw ane
ND
(N D 1-N D 6 i N D 4L) [4, 9]. U roślin natom iast p o d ­
jednostki te nazwano N A D (NA D 1-NA D6 i NAD 4L)
[10]. W genom ie m itochondrialnym roślin znajdują
się dodatkowo geny dwóch podjednostek, które u
zwierząt i u grzybów są zlokalizow ane w genom ie
jądrow ym . Są to podjednostki o wielkości 49kD a i
30kDa. N azw ano je odpow iednio N A D 7 i NA D 9
[11-13]. U M archanda polym w rpha gen nad7 jest
jednak zlokalizow any w jądrze. W obrębie genom u
m itochondrialnego pozostała kopia tego genu w p o ­
staci pseudogenu [14, 15].
Pozostałe
36
podjednostek
dehydrogenazy
N A D H ssaków jest kodow anych przez genom j ą d r o ­
wy. Biosynteza tych podjednostek odbyw a się w cytoplazmie, gdzie pow stają jak o prekursory za o p a­
trzone w sekwencję sygnalną um ieszczoną na N-końcu białka. Sekwencja sygnalna um ożliw ia dotarcie
prekursorów białkowych do m itochondriów i zanim
białko przyjm ie ostateczną dojrzałą formę, sekw en­
cja ta musi zostać usunięta. Odcięcie presekwencji
odbywa się w trakcie lub tuż po transporcie przez
błony, przy udziale peptydazy MPP (m itochon d ria l
P rocessing p e p tid a se ) [16], Białka kodowane przez
genom jądrow y m ają charakter hydrofilowy, nie p o ­
siadają transbłonow ych helis i nie są związane z
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
błoną m itochondrialną. W śród tych podjednostek są
także te, które zaw ierają grupy odpow iedzialne za
przebieg procesów oksydoredukcyjnych.
Podjednostki kom pleksu I z m itochondriów serca
wołu o m asach cząsteczkow ych 75kDa, 51kDa i
24kDa zaw ierają następujące grupy zw iązane z p ro ­
cesami oksydoredukcyjnym i: p odjednostka o masie
75kDa - 4Fe-S, 2Fe-2S, po djednostka o masie
51kDa — 4Fe-4S, FM N a p odjednostka 24kD a —
2Fe-2S. P odjednostka 51kD a posiada dodatkowo
miejsce w iązania N A D H [3].
Z innych podjednostek kom pleksu I na uw agę
zasłu gująpo djedno stki oznaczone jak o TYKY, PSST
i PGIV, w których zidentyfikow ano m otyw y cyste­
rnowe, m ogące tworzyć ligand z centrum Fe-S. P rzy­
należność poszczególnych centrów Fe-S do określo­
nych polipeptydów nie została dokładnie w y jaśn io­
na. Jak w ynika z tabeli 2 rozm ieszczenie grup prostetycznych w ramach poszczególnych podjednostek
sugerow ane przez A l b r a c h t i w s p . oraz O h n i s h i [6, 8] jest w yraźnie różne.
Białka żelazow o-siarkow e w y k a zu ją charaktery­
styczne w idm a elektronow ego rezonansu param a­
gnetycznego (EPR) co um ożliw ia identyfikację ce n ­
trów Fe-S. Sądzi się, że kom pleks I m oże zawierać co
najmniej osiem centrów Fe-S [6, 8], Z tej ilości
dokładnie scharakteryzow ano centra NI a, N l b , N2,
N3 i N4. Na podstaw ie wartości potencjału (E m)
określono najbardziej p raw d o p o d o b n ą drogę p rz e­
pływu elektronów: N A D H —> FM N -> N I —» N4 —»
N3 -» N2 —» UQ. Określono rów nież stechiom etrię
translokacji protonów dla kom pleksu I, która wynosi
4 H +/2e' [17].
W śród pozostałych podjednostek ko m pleksu I
Bos taurus kodow anych przez genom jąd ro w y są
białka, których grupa a am inow a jest m odyfikow ana
potranslacyjnie. Do nich należy co najmniej 10 p od­
jedn ostek tj: B 8(8 kDa), B9(9 kDa), B i2 (12 kDa), B 13
(13 kDa), B 14 (14 kDa), B 15 (15 kDa), B 17 (17 kDa),
B 1 8 (18 kDa), B 2 2 (22 kDa) i SDAP. I tak np. grupa
końcow a a - N podjednostek B 8, B )3, B ]4, B 15, B n , B 22
jest acetylowana a koniec a - N podjednostki B 18 ma
przy łączoną grupę m irystylową. P rzypuszcza się, że
grupa m irystylow ą m oże pom agać zakotw iczać podjedno stk ę w błonie [3].
Potranslacyjne przyłączenie kwasu p an to ten o w e­
go do podjednostki SDAP jest ciek aw ą m odyfikacją,
gdyż białko to wykazuje w łaściw ości białka n ośn i­
kowego acyli (acyl ca rrier p ro te in ) [18].
Ze względu na bardzo dużą m asę cząsteczkową,
kom pleks I m itochondriów serca wołu poddaw ano
obróbce w celu uzyskania m niejszych fragmentów,
które dalej szczegółowo analizowano.
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Traktow anie izolow anego enzym u jonam i chaotropowym i prow adzi do uzyskania trzech frakcji
oznaczonych odpowiednio: FP, IP i HP.
Frakcja flaw oproteinow a - FP (flavoprotein) za­
wiera podjednostki o masach: 51 kDa, 24 kDa i
10 kDa. W obrębie frakcji białek żelazowo-siarkow ych - IP (iron-protein) w y stęp ują podjednostki
m ające charakter hydrofilowy. Są to podjednostki o
masach: 75 kDa, 49 kDa, 30 kDa, 18 kDa, 15 kDa,
13 kDa, T Y K Y i PSST. Trzecia frakcja zwana frakcją
białek hy drofobow ych - HP (hydrophobic pro tein )
nie jest złożona w yłącznie z podjednostek o charak ­
terze hydrofobow ym , gdyż w ystęp u ją tu również
białka o charakterze h ydrofilow ym [3].
K om pleks I z m itochondriów serca wołu m ożna
także rozszczepić przy użyciu detergentów na dwa
subkompleksy, które nazw ano odpow iednio l a i 10.
Według F i n e l i w s p . [19] subkom pleks l a za­
wiera 23 podjednostki, które w większości m ają ch a­
rakter hydrofilowy. W obrębie tego subkom pleksu
w y stępują podjednostki frakcji IP i FP, oraz po d jed ­
nostki takie jak: ND2, M LR Q , B9, M W FE i 49kDa
m ające charakter h ydrofobow y [3].
Subkom pleks 10 deh ydrogenazy N A D H B. taurus
je st słabiej poznany. Według F i n e 1 i w s p . [19]
subkom pleks ten zb udow any jest z 17 podjednostek i
ma m asę 266 kDa. W iadom o również, że z pośród
siedmiu podjednostek kod ow anych przez genom mitochondrialny dwie a m ianow icie N D 4 i ND5 w ystę­
pują na pew no w subkom pleksie 10. Cały subk om ­
pleks ma charakter hydro fo bow y i stanowi 75% d o ­
m eny błonowej, której m asę cząsteczkow ą oszaco­
w ano na 370kD a [3, 20] (Ryc. 2).
F i n e l i w s p . oraz F e a r n l e y i w s p . [21,
22] wyodrębnili rów nież subkom pleks złożony z 15
podjednostek o charakterze hydrofilowym ze
wszystkim i m iejscam i oksydoredukcyjnym i jakie
znajdują się w subkom pleksie l a . Subkompleks ten
nazwano W i stwierdzono, że stanowi on pew ną czę­
ść subkom pleksu l a .
Kom pleks I N eurospora crassa jest złożony z
dwóch subkom pleksów. S ubkom pleks skierowany w
stronę matriks, tzw. ram ię peryferyjne, złożony jest z
13 podjednostek ko dow anych przez genom jądrowy,
wśród których są podjednostki o masach 30, 38 i
49 kDa. Subkom pleks osadzony w błonie mitochondrialnej, tzw. ram ię hydrofobow e, zbudow any jest z
podjednostek ko dow anych przez genom m itochondrialny i z pozostałych podjednostek kodow anych
przez genom ją d ro w y [23]. W śród grzybów istnieją
mutanty, u których brak niektórych podjednostek
kom pleksu I. M utant u którego brak kodowanej
jąd row o podjednostki 4 9kD a (odpow iednik N A D 7 u
http://rcin.org.pl
157
roślin) wykazuje zaburzenia w składaniu części p e ­
ryferyjnej kom pleksu. N atom iast brak podjednostki
21kDa kodowanej przez genom jąd ro w y prowadzi
do zaburzeń w procesie składania części h ydro fo b o ­
wej kompleksu. Tego typu defekty p ro w adzą nie ty l­
ko do zaburzeń w procesie składania kom pleksu, ale
również po w o dują obniżenie aktyw ności e n z y m a­
tycznej [24].
się, że subkom pleks 1(3 stanowi dom enę błonową, n a­
tomiast subkom pleks l a obejm uje dom enę peryfe­
ryjną zw róconą w stronę matriks, część łączącą do­
menę peryferyjną i b łonow ą oraz m ałą część dom eny
błonowej [20].
V. K om pleks I roślin
Strukturę przestrzenną deh ydrogenazy N A D H b a ­
Analiza wyników dotycząca aktywności i trans­
portu elektronów w obrębie roślinnego kom pleksu 1
była częściowo ułatwiona dzięki porów naniom z
kom pleksem I Bos taurus i N eurospora crassa.
dano przy w ykorzystaniu m ikro sko pu elektron ow e­
go jedynie w przypadku N eurospora crassa i B os
taurus [20, 25-27].
M itochondrialny kom pleks I izolowano d oty ch ­
czas z Vicia fa b a [28], Beta vulgaris [29] i Solatium
tuberosum [30] oraz z Triticum aestivum [31 ]. U Beta
Model przestrzenny ko m pleksu I N. crassa m a
kształt litery L. R am ię hydrofob ow e je s t u m ieszc zo ­
ne w błonie i tworzy do m enę błonow ą, natom iast ra ­
m ię hydrofilowe odgina się w stronę m atriks mitochondrium i stanowi do m enę peryferyjną. Poniew aż
vulgaris wielkość kom pleksu I oszacow ano na około
700 kDa. Wynik ten uzyskano na podstaw ie filtracji
żelowej i analizy w natyw nym żelu poliakrylam idowym PAGE {polyacrylam ide g el electrophoresis).
Kom pleks I Beta vulgaris rozdzielono w den a tu ­
rującym żelu SDS-PAGE i stwierdzono w y stęp o w a­
nie około 30 podjednostek. Kilka podjednostek zi­
dentyfikowano w wyniku reakcji z przeciwciałam i
skierowanym i przeciw ko odpow iednim polipepty-
IV. P rzestrzenny m odel kom pleksu I
podjednostki kom pleksu I N. crassa w y k a zu ją w y ra ­
źną hom ologię z pod jednostkam i dehydrogenazy
N A D H innych organizmów, zakłada się, że struktura
tego kom pleksu jest taka sam a u innych organizmów.
NADH
NAD
*
Przestrzeń
międzybłonowa
Ryc. 2. Model kompleksu I Bos taurus.
Rozmieszczenie najważniejszych
podjednostek
na
podstawie
składu subkomplcksów l a i ip
oraz frakcji IP, FP i HP. Wg W a l ­
k e r [3] (zmieniono).
P rzestrzenną strukturę dehyd rog enazy N AD H b a ­
dom dehydrogenazy N A D H N. crassa [29], U Vicia
dano również dla kom pleksu I izolow anego z mitochondriów serca wolu [20]. M odel tego w ielopodjednostkowego enzym u ma rów nież kształt litery L.
Kompleks enzym atyczny ssaka m a wyraźnie p rze­
fa b a i Solanum tuberosum podjednostki identyfiko­
wano też za po m ocą poznania sekwencji N -końca
polipeptydów [28, 30]. Z sum ow anie mas c z ąstecz­
kowych 32 rozdzielonych podjednostek kom pleksu 1
S. tuberosum dawało wartość 891 kDa, podczas gdy
analiza w natywnym niebieskim żelu (blue n a tive
g el) białek błon m itochondrialnych S. tuberosum w y ­
kazała, że kom pleks I ma wielkość około 1000 kDa
w ężony rejon łączący dom enę b ło n o w ą z d om eną p e ­
ryferyjną. D om ena zw rócona w stronę matriks jest
większa u ssaka niż u N. crassa. P raw dopodobnie
wynika to z wielkości całego kom pleksu. U Bos ta u ­
rus kom pleks I zbudow any je s t z co najmniej 43 p o d ­
jed no stek a u N eurospora crassa z co najmniej 36
podjednostek [3, 4, 7].
Wielkość kom pleksu I B. taurus oszacow ano na
około 890 kDa, z czego 370 kDa przypada na dom enę
błonow ą a 520 kDa na do m en ę peryferyjną. Sądzi
158
[30, 32], W kom pleksie I Triticum aestivum w y stę p u ­
je co najmniej 30 podjednostek, z czego dw anaście
zidentyfikow ano w wyniku reakcji z przeciw ciałam i
[31].
L i n T s e - I i wsp. [33] badając widm a EPR
kompleksu I S. tuberosum potwierdzili w nim o b e c ­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
ność centrów N l b , N2, N3 i N4. Wartości poten­
cjałów dla tych grup oksydo red uk cyjn ych zgadzają
się z obecnie przyjętym m odelem transportu elektro­
nów w obrębie kom pleksu I [34], Wśród podjednostek dehydrogenazy N A D H kodow anych przez g e­
nom jąd ro w y roślin najbardziej intensywnie badano
geny białek o m asach 76 kDa, 55 kDa, 28.5 kDa,
22 kDa [35-38]. W ynikało to częściow o z faktu, że
geny tych podjednostek w y k a zu ją w y ra źn ą hom ologię z odpow iednim i genami po djednostek kom p lek ­
su I innych organizm ów, oraz że podjednostki te z a ­
wierają charakterystyczne m otywy. G r o h m a n n i
wsp. [36] potwierdzili obecność m iejsca wiązania
N A D H i FMN oraz centrum N3 w podjednostce 55
kDa ziemniaka. Okazało się również, że ko n serw a­
tywne m otyw y cysteinowe w ystępujące w sekwencji
podjednostek 75 kDa, T Y K Y i P SST kom pleksu I B.
taurus, w ystępują także odpow iednio w podjednostkach 76 kDa, 28.5 kDa i 22 kD a S. tuberosum [35, 37,
38]. W ykorzystując bazę danych EST u A ra b id o p sis
thaliana odkryto jeszc ze je d n ą po djednostkę o masie
24 kDa [10].
Jądrow e geny podjednostek kom pleksu I ch arak ­
teryzują się obecnością m ałych spliceosom alnych intronów zaw ierających dużą ilość par A+T. Stw ier­
dzono np. że geny podjednostki 22 kD a-PS S T A. tha­
liana i 55 kDaH. thaliana oraz S. tuberosum są p rze­
rwane jed n y m intronem [36, 38]. Ciekawe, że w g e­
nie białka o masie 55 kDa intron je s t zlokalizow any
zaraz za pierw szym kodonem (ATG). S c h m i d t B 1 e e k i wsp. [37] stwierdzili, że gen białka żelazow o-siarkow ego o masie 28.5 k D a /F thaliana i S. tu ­
berosum jest przerw any naw et siedm iom a intronami
a wielkość intronów waha się od 60 do 1700 nukleotydów.
Badano również ekspresję genów podjednostek
kom pleksu I kodow anych przez genom jądrowy.
W iadom o już, że ekspresja genów podjednostek
łańcucha oddechow ego kodow anych przez jąd ro jest
6-10 krotnie w yższa w organach kw iatow ych niż w
liściach i korzeniach a regulacja tych procesów jest
tkankow o-specyficzna [36]. Ciekawe, że p o d w y ż ­
szoną ekspresję na poziom ie RNA w organach k w ia­
towych zaobserw ow ano rów nież dla takich białek
ja k białko Fe-S Rieske (podjednostka kom pleksu
III), czy też podjednostka Fip ATP-azy (p od jedn ost­
ka kom pleksu V) [39, 40]. A nalogiczne wyniki
otrzym ano analizując ekspresję podjednostek 76
mie RNA dotyczyła pylnika i pyłku kwiatowego
[41].
Geny kom pleksu I roślin zlokalizow ane w g eno ­
mie m itochondrialnym d oty czą genów oznaczonych
jako n a d l - n a d ó , nad4L oraz dodatkowo nad7 i
nad9. Te dodatkow e geny k odują polipeptydy h o m o ­
logiczne z białkami o m asie 49 kDa i 30 kDa ssaków,
o których wiadom o, że ich geny są kodowane przez
genom jądrowy.
Ponieważ b udow a genów podjednostek kodo w a­
nych przez genom m itochondrialny jest przedm io­
tem równolegle prezentowanej pracy, w niniejszym
opracow aniu b ędą one pominięte.
W sumie u roślin zidentyfikow ano dotychczas 14
podjednostek kom pleksu I. Jest to ilość, która tworzy
tzw. „m in im alny ” kom pleks u zwierząt i bakterii.
Należy podkreślić, że w genom ie chloroplastowym
znaleziono 11 genów hom ologicznych z tymi czter­
nastom a podstaw ow ym i podjednostkam i ko m plek­
su I [42], Te chloroplastow e geny k o d ująpod jed nostki, które w ch odzą w skład kom pleksu enzym atycz­
nego — N A D (P )H :plastochinon oksydoreduktaza
(Tab. 1). Sugeruje się, że funkcją chloroplastowego
kom pleksu je s t transport elektronów sprzężony z
translokacją protonów [43]. Ze względu na w yraźną
hom ologię m iędzy podjednostkam i chloroplastow e­
go i m itochondrialnego kom pleksu przypuszcza się,
że N A D (P )H :plastochinon oksydoreduktaza ma p o ­
dobną budow ę do m itochondrialnej dehydrogenazy
NAD H.
VI. P odjednostka PSST -p o te n c ja ln e m iejsce
w iązania centrum N2
Po raz pierw szy podjednostka PSST została scha­
rakteryzow ana u gatunku Bos taurus [44, 45]. Nazwa
PSST powstała od pierw szych czterech am in okw a­
sów dojrzałego białka. Obecnie znane są sekwencje
cD N A genu PSST takich gatunków jak Bos taurus
[45], A rabidopsis thaliana [38], Solanum tuberosum
[38], B rassica olerácea [46] oraz L upinus luteus
[47]. Znana jest także sekw encja cD NA ludzkiego
genu PSST [48]. W internetowej bazie danych EST
znajdują się sekwencje hom ologiczne z cDNA genu
PSST z takich gatunków jak L ycopersicon esculentum - pom idor (A I489436), G ossypium hirsutum .baw ełna
(A I731321),
Zea
m ays
-
kukurydza
kDa, 55 kDa A. thaliana i S. tuberosum oraz 28.5
kD a-T Y K Y S. tuberosum i 22 kD a-PS S T A. thaliana
(AI964559), Avena sativa - owies (AI978363). C ie­
kawe, że gen PSST odkryto również w genomie m i­
tochondrialnym np. u P aram ecium tetraurelia [49,
oraz S. tuberosum [35-38]. U A. thaliana badania
ekspresji przeprow adzono analizując różne części
kwiatu. Okazało się, że w ysoka ekspresja na p o zio ­
50], a także u bakterii np. u P aracoccus denitrificans
[51]. Ciężar cząsteczkow y podjednostki PSST został
oszacow any na około 22kDa. H om ologiem chloro­
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
http://rcin.org.pl
159
plastowym PSST
jest podjednostka N D H -K . Gen
nej w rejonie N -końca m ałych podjednostek hydro-
ndh-K znajduje się w obrębie genom u c h lo ro p la sto ­
wego i koduje białko w chodzące w skład ko m p lek su
N A D (P )H :plastochinon oksydoreduktaza. Gen ndhK (wcześniej określany jak o p sb G) poznano u kilku
gatunków roślinnych: G lycine m ax [52], N ico tia n a
genaz NiFe [60, 61]. Struktura krystaliczna hydrogenazy NiFe z D. gigas [62] ujawniła zaangażow anie
reszty Cys w stabilizacji ligandu — centrum Fe-S.
Ponieważ m otyw w ystępujący w PSST i innych ho­
mologicznych podjednostkach m a jak o pierw szy
am inokwas Leu lub Thr, obecność centrum Fe-S
tabacum [53], O ryza sativa [54], Zea m ays [55], Triticum aestivum [56], L up in u s luteus [57], P isum s a ­
tivum [58] a także u w ątrob ow ców M a rch a n tía p o ly m orpha [59].
Białko PSST kodow ane przez genom ją d ro w y p o ­
wstaje jako prekursor. Presekw encja podjednostki
um ożliwia dotarcie prekursora do błony m itochon drialnej i jego translokację. U sunięcie sekw encji s y ­
gnalnej um ożliwia uform ow anie dojrzałego białka
PSST.
Badania ekspresji na poziom ie R NA podjednostki
PSST przeprow adzono u A. thaliana [38], S. tu b ero ­
sum [38] i B. olerácea [46] oraz u człow ieka [48].
m oże mieć miejsce. Badania EPR nie w ykazały j e d ­
noznacznie, że PSST jest białkiem żelazow o-siarkowym; istnieje je d n a k wiele danych, które w sk az y ­
wałyby na obecność takiego centrum. Na przykład
S c h u l e r i w s p . [63], w ykorzystując inhibitor
[3H]TDP w badaniach prow adzonych z izolow anym
kom pleksem I bakterii P aracoccus denitrifica n s i
Therm us therm ophilus, wykazali udział podjedn ost­
ki PSST w procesie transportu elektronu na drodze
pom iędzy N2 a p ulą ubichinonu. Stosując z n a k o w a­
ny radioaktyw nie inhibitor [3H]TDP w niskim stęże­
niu, S c h u l e r i w s p . uzyskali zablokow anie
Tabela 2.
Rozmieszczenie grup FMN i centrów Fc-S, oraz liczba podjednostek kodowanych przez jądro w „m inimalnym ” kompleksie I Bos taurus. Wg O h n i s h i [6] (zmieniono).
Podjednostki
Kompleksu I
Model wg A 1b r a c h t [8]
Grupy prostctyczne
Model wg O h n i s h i [6]
Liczba podj.
Grupy prostctyczne
Liczba podj.
75kDa
l(N la), 2 (N4)
1
l(N lb), 1(N4), 1(N5)
51kDa
2 (FMN), 2 (N3)
2
l(FMN), 1(N3)
1
24kDa
l(N lb)
1
l(N la)
1
49kDa
brak
1
brak
1
30kDa
brak
1
brak
1
TYKY
2 (N2)
1
2 [4Fe-4S]
1
PSST
brak lub 1[4Fe-4S]
1
1(N2)
1
Całkowita liczba
2FMN i 8 lub 9 centrów Fe-S
1
1FMN i 8 centrów Fe-S
grup prostetycznych
Stwierdzono, że u roślin najw yższa ekspresja w y s tę ­
w korzeniu. Jak w ykazano u A. thaliana w yso ka e k s ­
presja w kwiatach dotyczy szczególnie p y lnika i
transportu elektronów w obrębie kom pleksu I. Gdy
podjednostki kom pleksu I rozdzielono elektroforetycznie w w arunkach SD S/PA G E i zm ierzono p o je­
dynczy sygnał uzyskany dla białka okazało się, że
pyłku kwiatowego [41]. U człow ieka bardzo w ysoki
ma ono wielkość około 23kDa. W wyniku sekwen-
poziom ekspresji występuje przede w szystkim w ta ­
kich organach ja k serce i wątroba. Poziom ekspresji
cjonow ania fragm entu podjednostki 23kDa, białko
to zostało zidentyfikow ane jak o PSST.
C entrum Fe-S N2, jed y n e ze znanych centrów nie
jest wyraźnie przypisane do określonej podjednostki.
Jako potencjalne m iejsca w skazuje się na po djed­
nostki TY K Y i PSST. N2 uznano za je d e n z istotniej­
puje w organach kw iatow ych, natom iast n ajm niejsza
tej podjednostki niew ątpliw ie wiąże się z d u żą a k ­
tyw nością kom pleksu I, a więc i łańcucha o d d e c h o ­
wego w organach, w których potrzeba dużo energii i
tlenu.
PSST w obrębie sekwencji białkowej zaw iera m o ­
tyw L/TxC C x61G xC xx xG x24-2 5 GCPP. Jest on p o d o b ­
ny do konserwatywnej sekwencji C x x C x nGxC xxxG xmGCPP (gdzie n = 61 -106, m = 24-61) obec160
szych centrów Fe-S w kom pleksie I. Wartość Em dla
tego centrum je s t najwyższa. Próby w ykazania, w
obrębie której dom eny kom pleksu I je s t zlo kalizow a­
ne centrum N2, nie doprow adziły do jed n o zna czne go
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
wyniku. Przyjęto, że N2 nie je s t zlokalizow ane w
podjednostce błonowej, ale je s t zw iązane z białkiem
leżącym na granicy dom eny błonowej i peryferyjnej
[19, 64, 65]. Jak w ynika z badań w ykonanych n a s u b frakcjach kom pleksu I E. c o li, centrum N2 zlokalizo ­
wane jest w części sąsiadującej z regionem amfipatycznym [6]. Do tej subfrakcji n ależ ą podjednostki
NuoB [PSST], N uoC D i N u o l [TYKY]. Ze względu
na obecność m otyw u cysteinow ego w budow ie w z ię­
to pod uw agę dwie podjednostki: NuoB i N uol. A n a ­
lizując m otyw cysteinow y w ystępujący w NuoB
[C63 C 64x x E 67 -C i 2 9 -C i 5 8P] brano pod uw agę m o żli­
wość tworzenia przez po djednostkę NuoB „mix-ligandu” , poprzez który centrum N2 byłoby związane
z podjednostką. Chociaż m oty w zaw iera cztery k o n ­
serwatywne cysteiny, dwie: C 63,C64 sąsiadują z sobą,
a więc tylko je d n a z nich bierze udział w stabilizacji
ligandu i w związku z tym tylko trzy reszty cysterno­
we, dosyć znacznie oddalone od siebie, m o g ą tw o ­
rzyć w łaściw e wiązanie. Poniew aż reszta C y si 5 8
sąsiaduje z resztą P ro i59, sugeruje się, że ew entualne
centrum Fe-S jest tetranuklearne [4Fe-4S] [66]. Z n a ­
nych jest kilka centrów [4Fe-4S] zw iązanych z p o d ­
jed n o stk ą poprzez system „m ix -ligan dów ” . „Mix-lig andy” są tworzone przez reszty Cys i inne am ino ­
kwasy np. Asp. U P a racoccus fu r io su s centrum
[4Fe-4S] jest związane z białkiem poprzez trzy re sz­
ty Cys (C) i je d n ą resztę Asp (D) [motyw:
C xDxxCC]. Takie centrum m ożna identyfikow ać za
po m ocą EPR w temp. poniżej 15K [67]. P oniew aż w
motywie cysternowym podjednostki PSST istnieje
konserw atyw na reszta Glu (E) w pozycji 67
[C 6 3C 64x x E 67 -C i 2 9 -C i 5 8P] przypuszcza się, że ró w ­
nież PSST może tworzyć centrum Fe-S w postaci li­
gandu. Pom iar EPR w temp. poniżej 1OK daw ał słaby
sygnał, który w skazyw ałby na obecność centrum
[4Fe-4S] [66], W ynik ten nie jest je d n ak w y star­
czająco przekonyw ujący by uznać, że w p o djed nost­
m iast obecność podjednostki hom ologicznej do
T Y K Y w części peryferyjnej kom pleksu I, wykazana
przez S o u s a i w s p . [ 6 8 ], przem aw ia za tym, że to
podjednostką PSST a nie TY K Y wiąże centrum N2.
V II. P od su m ow an ie
Intensyw ne badania kom pleksu I różnych organi­
zmów, w istotny sposób przyczyniły się do w yjaśn ie­
nia m echanizm u sprzężenia transportu elektronów z
tran slo k ac ją protonów w poprzek błony. N ie do koń ­
ca je s t ja s n y sens obecności tak w ielu podjednostek
w k om pleksie I w yższych organizmów, skoro tylko
część z nich jest niezbędna do utw orzenia „m in im al­
n e g o ” aktywnego kom pleksu enzym atycznego. De­
h y d rog enaza N A D H organizm ów w y ższych jest
zło żo n a z co najmniej 43 podjednostek to jest z około
trzy razy większej ilości niż u bakterii. M ożliwe, że
w y stępow an ie większej liczby pod jedn ostek w tym
ko m pleksie wiąże się rów nież z d odatkow ym i funk­
cjami, których nie znamy. Być m oże część dod atko ­
w ych podjednostek jest zaangażow ana w proces p o ­
p ra w neg o składania w kom pleks podjednostek p o ­
chod zen ia jąd row eg o i m itochondrialnego. Możliwe
rów nież, że część podjednostek je s t niezbędna do
u trzy m a n ia właściwej struktury przestrzennej k o m ­
pleksu i do w łaściw ego um iejscow ienia w błonie w e ­
wnętrznej.
B adania dotyczące m itochondrialnego kom pleksu
I m a ją również znaczenie użytkowe, gdyż po jaw ie­
nie się defektów w kom pleksie I w iąże się m iędzy in­
nymi z rozwojem chorób m itochondrialnych [70,
71].
Podziękow ania
A u to rka niniejszej pracy składa serdeczne podzięk o­
w an ia Pani P rofesor dr hab. Halinie A ugustyniak za
ce PSST na pewno w ystępuje centrum N2.
Ostatnio poznano sekwencje cD N A genu w y izo ­
lowanego z biblioteki N. crassa, którego sekwencja
cenne uwagi i pom oc przy pisaniu tego artykułu. Pra­
ca została zrealizow ana w ramach grantu KBN nr
6P 04B 0181B .
jest hom ologiczna z PSST [68]. P odjednostkę tą n a ­
zw ano NUO -19,3 i nie je s t ona izolow ana ani z do­
m eną błonow ą ani z peryferyjną. O becność tej p o d ­
Artykuł otrzymano 13 grudnia 1999 r.
Zaakceptowano do druku 28 lutego 2000 r.
jednostki jest m onitorow ana je d y n ie wtedy, gdy obie
dom eny są połączone. N U O -19,3 m ożna w y ekstra­
hować z błony m itochondrialnej przy w ysokim pH,
co znaczy, że nie je s t to podjednostką błonowa.
W a n g i w s p . [69] uważają, że niestabilność h o ­
m ologicznego z PSST białka NUO -19,3 przy roz­
dzielaniu dwóch dom en kom pleksu I, m ogła by
tłum aczyć brak również centrum N2 w izolowanej
dom enie peryferyjnej kom pleksu I N. crassa. N a to ­
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
P iśm ien nictw o
1. M 0 11 e r I M , R a s m u s s o n A G, F r c d l u n d K M (1993)
J Bioenerg Biotnembr 25: 377-384.
2. S o o l e K L, M e n z R I (1995) J Bioenerg Biom em br 27:
397-406
3. W a l k e r J E (1992) Quart Rev Biophys 25: 253-324
4. V i d c i ra A (1998) Biochim Biophys Acta 1364: 89-100
5. W c i d n c r U, G e i c r S, P t o c k A, F r i e d r i c h T, L c i f
H , W e i s s H (1993) J M ol Biol 233: 109-122
http://rcin.org.pl
161
6. O h n i s h i T (1998) Biochim Biophys Acta 1364: 186-206.
7. B u c h a n a n S K, W a l k e r J E (1996) B iochem J 318: 343-349
8. A l b r a c h t S P J , M a r i e t t e A, P h d c J o n g ( \991) Bio­
chim Biophys Acta 1318: 92-106
9. F e a r n l e y 1 M, W a l k e r J E (1992) Biochim Biophys Acta
1140: 105-134
10. R a s m u s s o n A G, H e i s e r V , Z a b a l e t a E, B r e n n i c ­
k e A, G r o h m a n n L (1998) Biochim Biophys Acta 1364:
101-111
11. G a b l e r L, H e r z U, L i d d e l l A , L e a v e r C J , S c ­
h r ö d e r W, B r e n n i c k e A , G r o h m a n n L (1994) M ol Gen
Genet 244: 33-40
12. G r o h m a n n L, T h i e c k O, H e r z U, S c h r ö d e r W,
B r e n n i c k e A (1994) Nucl Acids Res 22: 3304-331 1.
1 3 . U n s e l d M , M a r i e n f e l d J , B r a n d t P, B r e n n i c k e A
(1997) Nat Genet 15: 57-61
14. K o b a y a s h i Y, K n o o p V , F u k u z a w a H , B r e n n i c k e
A , O h y a m a K (1997) M ol Gen Genet 256: 589-592
15. O d a K , Y a m a t o K, O h t a E, N a k a m u r a Y, T a k e m u r a M, N o z a t o N , A k a s h i K, K a n e g a e T , O g u r a Y,
K o h c h i T , O h y a m a K (1992) J M ol Biol 223: 1-7
16. G l a s e r E, S j ö l i n g S, T a n u d j i M, W h e l a n J (1998)
Plant M ol B iol 38: 311-338
17. W e i s s H, F r i e d r i c h T (1991) J Bioenerg Biom em br 23:
743-771
18. R u n s w i c k M J, F e a r n l e y I M , S k e h e l J M , W a l k e r
J E (1991) FEBS Lett 286:121-124
19. F i n e l M, S k e h e l J M , A l b r a c h t S P J , F e a r n l e y I
M, W a l k e r J E (1992) Biochemistry 31: 11425-11434
20. G r i g o r i e f f N (1998) J M ol Biol 277: 1033-1046
2 1 . F i n e l M , M a j a n d e r A S, T y y n e l a J, D c j o n g A M
P, A l b r a c h t S P J , W i k s t r o m M (1994) Eur J Biochem
226: 237-242
22. F e a r n l e y I M, S k e h e l J M , W a l k e r J E (1994) Biochem
Soc Trans 22: 551-555
2 3 . F r i e d r i c h T, H o f h a u s G, I s e W, N e h l s
U,
S c h m i t z B, W e i s s H (1989) Eur J Biochem 180: 173-180
24. G u t i e r r e s S, C o m b e t t e s B, D e P a e p e R, M i r a n d e
M, L c l a n d a i s C, V e d e l F, C h c t r i t P ( 1999) Eur J Bio­
chem 261: 361-370
2 5 . L e o n a r d K, H a i k c r H, W e i s s H (1987) J M ol B iol 194:
277-286
26. H o fh a u s G , W e i s s H, L e o n a r d K (1991) J M ol Biol 221:
1027-1043
27. G u e n e b a u t V, V i n c e n t e l l i R, M i l l s D, W e i s s H,
L e o n a r d K R (1997) J M ol Biol 265: 409-418
28. L e t e r m e S , B o u t r y M (1993) Plant Physiol 102: 435-443
29. R a s m u s s o n A G, M e n d e l - H a r t v i g J, M ö l l e r I M,
W i s k i c h J T (1994) Physiol Plant 90: 607-615
30. H e r z U, S c h r ö d e r W, L i d d e l l A, L e a v e r C J,
B r e n n i c k e A, G r o h m a n n L (1994) J Biol Chem 269:
2263-2269
3 1 . C o m b e t t e s B, G r i e n e n b e r g e r J M (1999) Biochimie 81:
645-653
3 2 . J ä n s c h L, K r u f t V, S c h m i t z U K , B r a u n H - P (1996)
Plant J 9: 357-368
33. L in T s e - I , S l e d V D, O h n i s h i T, B r e n n i c k e A,
G r o h m a n n L (1995) Eur J Biochem 230: 1032-1036
34. B r a n d t U (1997) Biochim Biophys Acta 1318: 79-91
35. R a s m u s s o n A G, H e i s e r V, I r r g a n g K D, B r e n n i c ­
k e A, G r o h m a n n L (1998) Plant Cell Physiol 39: 373-381
36. G r o h m a n n L, R a s m u s s o n A G, H e i s e r V, T h i e c k
O, B r e n n i c k e A (1996) Plant J 10: 793-803
37. S c h m i d t - B l e e k K , H e i s e r V, T h i e c k O, B r e n n i c ­
k e A, G r o h m a n n L (1997) M ol Gen Genet 253: 448-454
38. H e i s e r V, B r e n n i c k e A, G r o h m a n n L (1996) Plant
M ol Biol 31: 1195-1204
39. H u a n g J , S t r u c k F , M a t z i n g e r D F. L e v i n g s I I I C
S (1994) Plant Cell 6: 439-448
40. S m a r t C J , M o n c g e r F, L e a v e r C J (1994) Plant Cell 6:
811-825
41. Z a b a 1c t a E , H e i s e r V, G r o h m a n n L, B r e n n i c k e A
(1998) Plant J 15: 49-59
162
42. S u g i u r a M (1992) Plant M ol Biol 19: 149-168
43. S c h e r e r S (1990) TIBS 15:458-462
44. M a s i u R, W a k a b a y a s h i S, M a t s u b a r a H, H a t e f i
Y (1991) J Biochem 110: 575-582
4 5 . A r i z m e n d i J M, R u n s w i c k M J, S k e h e l J M , W a l ­
k e r J E (1992) FEBS Lett 301: 237-242
46. P o g s o n B J, D o w n s C G, D a v i e s K M, M o r r i s S C,
B u c h a n a n - W o l l a s t o n V (1995) Plant Physiol 108:
859-860
47. P i q k n a D , S i k o r s k i M, A u g u s t y n i a k H (1999) Streszczenia X X X V Zjazd PTBioch, Olsztyn
48. H y s l o p S J, D u n c a n A M V, P i t k ä n e n S, R o b i n ­
s o n B H (1996) Genomics 37: 375-380
49. P r i t c h a r d A E, V e n u t i S E, G h a l a m b o r M A, S a ­
b l e C L, C u m m i n g s D J (1989) Gene 78: 121-134
50. P r i t c h a r d A E, S e i l h a m e r J J , M a h a l i n g a m R , S a ­
b l e C L, V e n u t i S E, C u m m i n g s D J (1990) Nucleic
Acids Res 18: 173-180
5 1 . X u X, M a t s u n o - Y a g i A , Y a g i T (1992) Biochemistry 31:
6925-6932
52. W h e l a n J , Y o u n g S, D a y D A (1992) Plant M ol Biol 20:
887-895
5 3 . S h i n o z a k i K, O h m e M, T a n a k a M , W a k a s u g i T,
H a y a s h i d a N, M a t s u b a y a s h i T, Z a i t a N, C h u n w o n g s e J, O b o k a t a J , Y a m a g u c h i - S h i n o z a k i K,
O h t o C, T o r a z a w a K, M e n g B Y, S u g i t a M , D e n o
H, K a m o g a s h i r a T, Y a m a d a K, K u s u d a J , T a k a i w a F, K a t o A , T o h d o h N , S h i m a d a H, S u g i u r a M
(1986) EMBO J 5: 2043-2049
54. H i r a t s u k a J , S h i m a d a H, W h i t t i e r R , I s h i b a s h i
T , S a k a m o t o M, M o r i M, K o n d o C , H o n j i Y, S u n
C R, M e n g B Y, Li Y Q, K a n n o A, N i s h i z a w a Y,
H i r a i A, S h i n o z a k i K, S u g i u r a M ( \9&9) M ol Gen Ge­
net 211: 185-194
55. S t e i n m ü l l e r K, L e y A C, S t e i n m e t z A A, S a y r e R
T, B o g o r a d L (1989) M ol Gen Genet 216: 60-69
56. N i x o n P J , G o u n a r i s K, C o o m b e r S A, H u n t e r C
N, D y e r T A, B a r b e r J (1989) J Biol Chem 264:
14129-14135
57. O c z k o w s k i M, P a s z k i e w i c z J, P i a t y s z e k M , A u ­
g u s t y n i a k H (1997) Plant Sci 127: 171-177
58. E l o r t z a F, A s t u r i a s J A , A r i z m e n d i J M (1 9 9 9 )Plant
Cell Physiol 40: 149-154
59. O h y a m a K, F u k u z a w a H, K o h c h i T , S h i r a i H,
S a n o T , S a n o S, U m c s o n o K, S h i k i Y , T a k c u c h i
M, C h a n g Z, A o t a S, I n o k u c h i H, O z e k i H (1986)
Nature 322: 571-574
60. A l b r a c h t S P J (1993) Biochim Biophys Acta 1144: 22 1-224
6 1 . A l b r a c h t S P J (1994) Biochim Biophys Acta 1188: 167-207
62. V o l b e d a A, C h a r o n M - H , P i r a s C , H a t c h i k i a n E
C, F r e y M, F o n t e c i l l a - C a m p s J C (1995) Nature 373:
580-587
63. S c h u l e r F, Y a n o T, Di B e r n a r d o S, Y a g i T, Y a n ­
k o v s k a y a V, S i n g e r T P, C a s i d a J E (1999) Proc Natl
Acad Sci USA 96: 4149-4153
64. F e c k e W, S l e d V D, O h n i s h i T, W e i s s H (1 994)E u rJ
Biochem 220: 551-558
65. Y a g i T, Y a n o T , Di B e r n a r d o S, M a t s u n o - Y a g i A
(1998) Biochim Biophys Acta 1364: 125-133
66. O h n i s h i T, S l e d V D, Y a n o T, Y a g i T , B u r b a c v D
S, V i n o g r a d o v A D (1998) Biochim Biophys Acta 1365:
301-308
67. P a r k J B, F a n C L, H o f f m a n B M , A d a m s M W
(1991) J B io l Chem 266: 19351-19356
68. S o u s a R, B a r q u e r a B, D u a r t e M, F i n e l M, V i d c i r a A (1999) Biochim Biophys Acta 1411: 142-146
69. W a n g D C, M c i n h a r d t S W, S a c k m a n n U, W e i s s
H, O h n i s h i T (1991) Eur J Biochem 197:257-264
70. W a 11 a c e D C (1989) Trends Genet 5; 9-13
7 1 . B e n t l a g e H A C M, J a n s s e n A J M, C h o m y n A , A t t a r d i G, W a l k e r J E, S c h ä g g e r I I , S c n g e r s R C A,
T r i j b c l s F J M (1995) Biochim Biophys Acta 1234: 63-73
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Mitochondrialne geny podjednostek dehydrogenazy
NADH
kompleksu
I
łańcucha
oddechowego.
Redagowanie ich transkryptów
Mitochondrial genes of complex I NADH dehydrogenase
of the respiratory chain subunits. The editing of their
transcripts
MICHAŁ RUREK*
Spis treści:
Contents:
I. Wstęp
II. Geny podjednostek dehydrogenazy NADH
III. Organizacja, budowa i ekspresja genów nd i nad
III-I. Geny nd zwierząt
III-2. Geny nd grzybów
III-3.Geny nad roślin
IV. Redagowanie transkryptów genów mitochondrialnych
IV-1. Redagowanie transkryptów genów nd pierwotnia­
ków
IV-2. Redagowanie transkryptów genów nad roślin
V. Uwagi końcowe
I. Introduction
II. Genes of NADH dehydrogenase subunits
III. Organisation, structure and expression of nd and nad
genes
III-l. Animal nd genes
HI-2. Fungal nd genes
III-3. Plant nad genes
IV. Editing of mitochondrial genes transcripts
IV-1. Editing of nd transcripts of protozoans
IV-2. Editing of nad transcripts of plants
V. Conclusion remarks
Wykaz stosowanych skrótów: atp — geny podjednostek syntazy ATP (ATPazy); ccb206 — gen podjednostki transportera
hemu; CMS — cecha cytoplazmatycznej męskiej sterylności;
cob — gen białka apocytochromu b; cox — mitochondrialne
geny podjednostek oksydazy cytochromowej; et DNA — chlo­
roplastowy DNA; gRNA — g u id e RNA; FMN — mononukleotyd flawinowy; mat-r — sekwencja kodująca białko podobne
do maturazy; mt DNA — mitochondrialny DNA; n a d — mito­
chondrialne geny podjednostek NAD kompleksu I roślin; nd —
mitochondrialne geny podjednostek ND kompleksu I zwierząt i
grzybów; ndh — chloroplastowe geny podjednostek dehydroge­
nazy NAD(P)H; rp l — geny białek dużej podjednostki mitorybosomów; rps — geny białek małej podjednostki mitorybosomów; PSST — jądrow a podjednostka kompleksu I zawierająca
motyw: Pro-Ser-Ser-Thr; TR/c-erbA — receptor kodowany
przez protoonkogen c-erbA wiążący hormony tarczycy; TYKY
— jądrowa podjednostka kompleksu I zawierająca motyw:
Thr-Tyr-Lys-Tyr.
I. W stęp
*Mgr, Zakład Biologii Molekularnej Roślin, Instytut Biologii
Molekularnej i Biotechnologii UAM, ul. Międzychodzka 5,
60-371 Poznań
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
K om pleks I, fosforylująca dehydrogenaza N AD H
(oksydoreduktaza N A D H — ubichinon, E.C.
1.6.99.3) je s t w yjątkow o złożonym i najmniej p o ­
znanym enzym em wśród białek wchodzących w
skład m itochondrialnego łańcucha oddechowego.
Z nana je s t n atom iast podstaw o w a funkcja kom p lek ­
su I. Przenosi on elektrony z N A D H na ubichinon p o ­
przez szereg centrów redoks obejm ujących grupę
prostety czn ą F M N i centra żelazow o — siarkowe,
oraz po m p uje protony z m atriks, tworząc siłę proton o m o to ry cz n ą n iezbęd ną do syntezy ATP [1], K om ­
pleks I w yizolow ano dotychczas m.in. z m itochondriów wołu (B os taurus) [2], grzyba N eurospora
crassa [2 ], a spośród roślin w yższych — z buraka
{Beta v u lg a ris) [3], wyki {V iciafa b a ) [4], ziem niaka
{Solanum tuberosum ) [5] i pszenicy {Triticum
a estivum ) [ 6 ]. Stwierdzono, że enzym ten wykazuje
pew ne cechy w spólne dla wszystkich organizm ów
żywych. N a le ży do nich głów nie obecność centrów
redoks oraz p odjednostek w iążących N A D H i ubi-
http://rcin.org.pl
163
chinon [7]. W skład deh ydrogenazy N A D H zwierząt,
grzybów i roślin w chodzi od 30 do 43 podjednostek
białkowych [ 8 ], podczas gdy u bakterii m inim alny
kompleks I składa się z 14 podjednostek [2, 4, 5].
Kilka podjednostek je st ko dow anych przez genom
m itochondrialny, a pozostałe przez genom jądrow y.
C ałkow itą m asę cz ąsteczk ow ą kom pleksu I różnych
organizm ów eukariotycznych oszacow ano na około
wotniaki. W śród pierw otniaków wyjątek stanowi
Plasm odium fa lcip a ru m , który nie zawiera w mt
DNA żadnych genów podjednostek ND [15], Z kolei
genom m itochondrialny pantofelka (P a ram eciu m )
posiada oprócz w ym ienionych wyżej genów, dodat­
kowe geny kodujące trzy podjednostki, które u ssa­
700 do 1000 kDa. Dla p o rów nania m asę cząstecz­
ko w ą m inim alnego kom pleksu I bakterii, który
składa się z 14 podjedno stek o szacow ano na 525 kDa
ndhK. chloroplastowej dehydrogenazy N A D (P)H , co
dowodzi w spółdziałania funkcyjnego tych dwóch
enzym ów [16]. N atom iast u C rithidia fa sc ic u la ta i
L eishm ania tarentolae w tzw. dużych kółkach (ang.
m a xicircles) mt D N A w ystęp ują zarówno geny p o d ­
jedn o stek ND1, ND 4 i ND5 jak i gen kodujący p o d ­
[9].
W niniejszym artykule zostan ą sch arak teryzo w a­
ne geny podjednostek k om plek su I kodow ane przez
m itochondrialny D N A zw ierząt, grzybów i roślin
oraz ich ekspresja. U czestniczą one w w ielu rearanżacjach genom u m itochondrialnego, które w efekcie
końcow ym p ro w a d zą czasam i do mutacji letalnych
albo objaw ów chorob ow y ch organizm u. Szczególny
nacisk zostanie położony na opis potranskrypcyjnych zmian sekwencji ich m R N A , czyli proces reda­
gowania (ang. ecliting), który zachodzi ze szczególną
intensyw nością w m itochondriach. Na łam ach „ P o ­
stępów B ioch em ii” , ja k i w innych czasopism ach
polskojęzycznych ukazało się w ostatnim dziesięcio­
leciu kilka prac po św ięco nych procesow i re dagow a­
nia [10-14], Pojawienie się now ych danych, szcze­
gólnie dotyczących redagow ania m itochondrialnych
podjednostek kom pleksu I skłania do ich p rzed sta­
wienia w niniejszym artykule.
II. G eny p od jednostek deh yd rogen azy N A D H
Fakt, że geny p odjednostek dehydrogenazy
NAD H wrażliwej na rotenon (kom pleks I), zwanej
dalej dehydrogenazą N A D H , są kodow ane zarówno
przez genom m itochondrialny, ja k i jąd ro w y wynika
jak się sądzi stąd, że w trakcie ewolucji większość
genów kodujących podjednostki
dehydrogenazy
NADH uległa przeniesieniu z m itochondriów do
jąd ra kom órkow ego i została zintegrow ana z j ą d r o ­
wym DNA. Spow odow ało to zm ianę hydrofobow ości poszczególnych podjednostek.
Ilość podjednostek dehydrogenazy N AD H k o d o ­
wanych przez genom m itochondrialny w ykazuje
pewne zróżnicowanie. U ssaków genom m ito cho n­
drialny koduje 7 podjednostek dehydrogenazy
NADH, nazyw anych odpow iednio: ND1, ND2,
ND3, ND4, N D 4L, ND5, N D 6 . W szystkie one w y ­
stępują w części błonowej kom pleksu I [2], Taką
sam ą ilość i usytuow anie stw ierdzono w innych gru ­
pach zwierząt, jak: ptaki, płazy, ryby, owady, płazińce, obleńce, skorupiaki, m ięczaki, jam o ch ło n y i p ier­
164
ków są kodow ane przez genom jądrow y. Genom m i­
tochondrialny pantofelka koduje też podjednostkę
jedn o stk ę 49 kDa, która je s t zw ykle kodow ana przez
genom jąd ro w y [17]. T rypanosom y p o siad ają p o n ad to geny podjednostek N D 8 i ND9, które u ssaków z a ­
warte są w jąd ro w y m D N A [18, 19]. W mt D N A in­
nych pierw otniaków liczba podjednostek je s t ró w ­
nież zw iększona i u am eby obejm uje aż 1 0 genów
podjednostek dehydrogenazy N A D H [20],
Poznanie pełnej sekwencji genom u m itoch on ­
drialnego grzyba H ansenidci w ingei pozw oliło
stwierdzić, że podobnie jak w mt DNA uprzednio
zbadanych gatunków Podosporci anserina i N eurospora crassa [15, 21-24] oraz ssaków występuje
7 genów nd. G enów nd nie znaleziono natom iast w
genom ie m itochondrialnym drożdży pączkujących
Saccharom yces.
U roślin geny podjednostek dehydrogenazy
N A D H zlokalizow ane w mt DNA przyjęto nazywać
nad, a odpow iadające im podjednostki — NAD.
Ilość zidentyfikow anych m itochondrialnych genów
podjednostek dehydrogenazy N A D H roślin w y ż ­
szych wynosi 9. Taka ilość została również p o tw ier­
dzona u rzodkiew nika pospolitego, jedynej rośliny
nasiennej, u której poznano budow ę mt DNA [15],
Należy podkreślić, że geny występujące u roślin
oznaczone jak o n a d l i n a d 9 u ssaków i grzybów są
zlokalizow ane w genom ie jądro w ym . U niektórych
glonów, na przykład u brunatnicy C hondrus crispus
stwierdzono jed n ak brak tych 2 genów. Zielenica
C hlam ydom onas reinhardtii nie zawiera natom iast
genów n a d 3 i nad4L [15]. Z kolei, u porostnicy w ie ­
lokształtnej (M archanda p o ly m o rp h a ), której pełna
sekwencja genom u m itochondrialnego jest także
znana, okazało się, że gen n a d l jest zlokalizow any w
jąd rze kom órkow ym , natom iast w mt DNA pozostał
pseudogen n a d l [25],
Jak wynika z przedstaw ionych danych, liczba
podjednostek kodow anych przez genom m ito ch on­
drialny jest nieznaczna, a zatem większość p o d jed ­
nostek jest kodow ana przez genom jądrowy.
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
III. O rganizacja, budow a i ekspresja genów
nd i nad
III-l. G eny nd zw ierząt
Sześć genów kodujących podjednostki nd
zwierząt tkankow ych znajduje się na nici H mt DNA
i jest transkrybow anych w postaci pojedynczej, policistronowej cząsteczki m R N A . Gen ndó występuje
na nici L i wchodzi w skład drugiej policistronowej
cząsteczki m RNA. Ilość, j a k rów nież liczba kopii g e­
nów nd zw ierząt podlega p ew ny m fluktuacjom . O k a ­
zało się na przykład, że zarów no gen nd4, ja k i nd4L
ludzkich m itochondriów posiad ają kopię w jąd rze
[26]. Z aobserw ow ano również, że w jednej z linii k o ­
m órek now o tw o row ych człow ieka nastąpiła delecja
genów nd3 i nd4L w mt D N A [27], natom iast w linii
kom órkowej A9 m yszy dehydrogenaza N A D H nie
posiada podjednostki N A D 6 , co spow odow ało p ra ­
wie całkowite zaham ow anie aktywności tego en z y ­
mu [28].
Organizacja, budow a oraz obraz ekspresji genów
nd w y k a zu ją zróżnicow anie w p oszczególnych g ru ­
pach zwierząt [29]. Na przykład u kręg ow ców geny
nd3 i ndó nie p o siadają typow ego ko donu „start” . Z
kolei gen nd3 posiada kodon „stop” je d y n ie u gryzo­
ni i waleni [30-31], a w genie nd4 nie w ystępuje k o ­
don „stop“ u żadnego z p oznanych gatunków ssaków
i jest on kreow any przez p o tran skrypcyjn ą poliadenylację [30-32]. U obleńców niektóre geny nd wykorz y s tu ją ja k o kodon „start” tryplet TTG a nietypow e
kodony „stop” w ystępu ją w genach n d l , nd2, nd3 i
nd5 [33], U ow adów organizacja genów n d l , nd4,
nd4L i ndó jest p odobna [34], ale czasam i w ystęp ują
różnice w budowie; na przykład u B oophilus m icrop lu s [35] 3 ’ końcow y rejon genu ndl je s t 5 razy p o ­
wtórzony. Organizacja genów nd w przypadku chito ­
nów znacznie odbiega od reszty m ięczakó w i obej­
m uje rozległe rearanżacje [36], natom iast organiza­
cja genów nd am eby przypom ina układ od p o w ied ­
nich genów nuo eubakterii, gdyż geny ułożone są n a ­
stępująco: nd3-nd9-nd7, nd6-nd5, nd4-nd2; niektóre
z tych genów zacho dzą na siebie [20], U innych pier­
w otniaków, ja k trypanosom y geny n d l , nd4, nd5,
nd7, n d 8 , nd9 są zawarte w tzw. „dużych kółkach ”
(ang. m a xicircles) genom u m itochondrialnego [18].
Różnice w budow ie genów nd d otyczą w y s tę p o w a ­
nia insercji i delecji, co ma m iejsce u skorupiaków w
genach n d l , nd2, nd3 i nd5 [37], lub w ystępow ania
intronu; intron zidentyfikow ano na przykład w genie
nd5 jam o ch ło n a M etridium sen ile [38]. Z akłada się,
że podobnie ja k w przypadku innych genów mito-
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
chondrialnych, w ystępujące pom iędzy genami nd
geny tR NA b iorą udział w dojrzew aniu m RNA.
N a ekspresję genów nd zw ierząt w p ły w a wiele
czynników. Stw ierdzono na przykład, że akum ulacja
m R N A podjednostki ND2 w zarodkach królika zale­
ży od zm ian natlenienia kultur blastocystów [39], Z
kolei w m ózgu i sercu szczura ekspresja m R N A p o d ­
jednostki ND3 je s t regulow ana przez horm ony tar­
czycy, gdyż kodujący j ą gen posiada sekw encję
w iążącą się specyficznie z receptorem TR/c-erbA.
N iedobór tych horm onów m oże zatem obniżać p o ­
ziom transkryptu nd3 [40]. K o d a m a i w s p . [41]
donieśli, że w starzejących się ludzkich fibroblastach
linii M RC-5 następuje zw iększenie akumulacji
m R N A nd4 i nd4L. Sugerują oni, że ekspresja p o d ­
jedno stek N D 4 i N D 4 L je s t re gulo w ana przez m e ­
chanizm zależny od starzenia się kom órek. Badając
ekspresję genów nd2, nd4 i nd5 we w szystkich sta­
diach oogenezy D rosophila m e la n o g a ster T o u r mente
i w s p . [42] nie stwierdzili jedn ak
znaczących różnic.
B adania białkow ych produktów genó w nd o bej­
m ow ały identyfikację o dpow iednich podjednostek
oraz analizę fizykochem iczną. P odjednostki k o m ­
pleksu I kodow ane przez mt D N A w ołu identyfiko­
wano stosując zarów no przeciw ciała [2, 43], jak i za
po m o cą określenia ich sekwencji am inokw asow ej.
W nielicznych przypadkach poznano strukturę II —
rzędow ą łańcucha po lipeptydow ego podjednostek
ND. Y a g i [44] na przykład określił, że podjednostka ND2 zawiera 8 helis transbłonow ych i posiada
m asę 30 kDa, a podjednostki ND4 i N D 5 zaw ierają
odpow iednio 14 i 15 helis transbło now ych . W ym ie­
nione fragm enty hydrofobow e charaktery zują się
szczególnie dużą ilością kon serw aty w ny ch reszt
am inokw asow ych. N atom iast M o u m i w s p . [29]
w przedstaw ionym m odelu białka N D 6 postulują
w ystępow anie u ssaków i innych kręgow ców 5 helis
transbłonowych, oraz zró żn ico w a ną długość sek­
wencji łączącej dom eny IV i V. S ugerują oni także
większe podobieństw o sekwencji am inokw asow ej
tej podjednostki pom iędzy ptakam i i rybami, niż p o ­
m iędzy ptakam i i ssakami. W przyp adk u analizy za­
burzeń chorobow ych za które odpow iedzialne są
m iędzy innymi zm iany w m t DNA , podjednostki ND
identyfikowano stosując przeciw ciała [45].
M asa cząsteczkow a podjednostek N D mieści się
w granicach od 10 do 67 kDa. U człow ieka produkty
m itochondrialnych genów nd w y k a zu ją odpow ied­
nio następujące m asy cząsteczkow e: 35.7, 39, 13.2,
51.6, 67, 18.7 oraz 10.7 kD a [46]. U w aża się, że u
zwierząt żadna z tych podjednostek nie je st związana
http://rcin.org.pl
165
z centrami żelazow o — siarkow ym i. Postuluje się
jednak, że podjednostka ND1 wołu o wielkości 33
kDa może uczestniczyć w w iązaniu ubichinonu [2],
III-2. Geny nd grzybów
U grzybów do n ajw iększych genów nd należy gen
n d l. U P o dospora anserina stwierdzono, że gen n d l
posiada 4 introny klasy I., które zaw ierają liczne
otwarte ramki odczytu. O kazało się że istnieje
zw iązek pom iędzy w ystępo w aniem tych ramek o d ­
czytu u 23 szczepów P o d o sp o ra , a obecnością wielu
substytucji nukleotydow ych w sąsiadujących ze sobą
eksonach [47]. C u m m i n g s i w s p . [22] stw ier­
dzili także, że intron genu nd4 P odospora anserina
zawiera sekw encję tzw. dodekapeptydu, która jest
częścią otwartej ramki odczytu kodującej białko maturazy. Wykryli oni rów nież [24], że gen nd4L p osia­
da kopię w ystępu jącą w intronie grupy I tego genu, a
rozm ieszczony bezpośrednio za genem nd4L, gen
nd5 zawiera 2 introny różnego typu; pierw szy z nich
należy do grupy IC a drugi do grupy II.
C echą ch arakterystyczną intronów klasy IC o b ec­
nych w m itochondrialnych genach nd grzybów jest
pew ne zróżnicow anie w budowie, polegające na
obecności dodatkow ych układów helikalnych w
strukturze II-rzędowej genów n d l i nd3; takich d o ­
datkowych układów helikalnych nie stwierdza się w
intronie genu nd4 [22],
Geny nd4L i nd5 N. crassa które zachod zą na sie­
bie i ulegają kotranskrypcji do m R N A o wielkości
ok. 3200 zasad też zaw ierają introny. Introny tych g e­
nów są szczególnie stabilne po ich wycięciu z
cząsteczki pre-m R N A [21]. N e 1 s o n i w s p . [21]
stwierdzili, że zaw ierają one rów nież otwarte ramki
odczytu, w obrębie których zn ajd ują się sekwencje
powtórzone i k onserw atyw ny m otyw dodekapeptydowy.
Okazało się także, iż w mt DNA N. crassa w y stę­
puje zarówno „n aty w n y” gen n d 2 , jak i jego zduplikowane fragmenty, połączone ze sobą sekw encją palin d ro m o w ą o wielkości 37 pz. Obraz ekspresji genu
n d 2 różni się od jego niepełnych kopii: transkrypty
zawierające gen nd2 m ają wielkość 2.6, 3 i 5 kpz, a
transkrypty zduplikow anych fragm entów genu —
2.05 oraz 2.3 kpz [23].
P odjednostkom ND przypisuje się czasami inne
funkcje. O brazują to m iędzy innymi wyniki uzyska­
ne przez H o g u e i w s p . [48]. A utorzy ci w y izo lo ­
wali
cD NA
sztucznego
białka
fuzyjnego
składającego się z centralnej i C końcowej części
podjednostki ND4 człowieka, oraz N końcowej cz ę­
ści białka GAL 10 S accharom yces ce revisia e, i wyka166
zali jeg o obecność w błonie kom órkow ej drożdży.
Sugerują oni, że podjednostka ND 4 posiadająca
praw dopodobnie 1 2 helis transbłonow ych może
funkcjonow ać jak o transporter lub tw orzyć kanał w
wewnętrznej błonie m itochondrialnej drożdży.
III-3. Geny nad roślin
Roślinna dehydrogenaza N A D H w yk azu je w ię ­
kszą m asę cząsteczko w ą niż odpow iedni enzym
zwierząt i grzybów. C ech ą ch a rakterystyczną enzy­
mu roślinnego je s t m ożliw ość czasow ego i prze­
strzennego rozdzielenia części: hydrofilow ej (peryferycznej) i hydrofobowej kom pleksu I [49]. W cz ę­
ści hydrofobowej w y stępują podjednostki NAD1 do
N A D 6 oraz N A D 4L, a podjednostki N A D 7 i NAD9
znajdują się w części peryferycznej enzym u (Rys. 1).
NADH
*•
w ew nętrzna błona
m itochondrialna
NAD
«
FMN, N1b,
N3,
24,5 1 ,5 5
76 kDa
PSST, TYKY,
na d 7 . n a d 9
\
część peryferyczna
Matriks
część błonowa
n a d l, nad2, nad3,
nad4, nad4L, nad5, nad6
_____________
jj| |
Przestrzeń
międzybłonowa
Rys. 1. Rozmieszczenie podjednostek dehydrogenazy NADH — ubichinon wrażliwej na rotenon (kompleks I) w wewnętrznej
błonie mitochondrialnej roślin. Podjednostki kodowane przez
genom mitochondrialny oznaczono kursywą. NI doN 3 — cen­
tra żelazowo — siarkowe o znanej lokalizacji; FMN — rnononukleotyd flawinowy; (na podstawie [1 5 1 ]- zmodyfikowano)
Kodujące je geny nad cha rakteryzują się ogólnie w y ­
soką zacho w aw czością sekwencji u różnych gatun­
ków roślin. Wyjątek jak dotychczas stanowi budowa
genu n a d l buraka cukrow ego [50]. O kazało się, że
pierw sze 400 nukleotydów eksonu 4 genu n a d l p o ­
siada odm ienną niż u innych roślin sekw encję nukleotydową. Z kolei sekwencje flankujące geny nad ró ż­
nią się składem nukleotydow ym nawet u blisko sp o ­
krewnionych gatunków [51-53].
W iększość genów n ad roślin posiada od 1 do 5 in­
tronów kl. II, kodujących niekiedy białka maturaz.
Odległości pom iędzy intronami w genach nad m ogą
sięgać nawet 300 kpz [54],
Chociaż wiele m itochondrialnych genów roślin
ulega niezależnej od siebie ekspresji, niektóre se­
kwencje kodujące ulegają kotranskrypcji. Tran­
skrypty genów nad m ogą być również m onocistronowe lub policistronowe, kiedy ulegają kotranskrypcji
z innymi genami. Składanie transkryptów genów nad
roślin jest wyjątkowo skom plikow ane, gdyż może
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
się odbyw ać nie tylko w układzie cis, ale również
trans. M o r a w a l a - P a t e l l i w s p . [55] uw a­
żają, że w a ż n ą rolę w składaniu eksonów transkryptów genów na d w układzie trans odgryw a dom ena IV
intronów. H a o u a z i n e i w s p . [56] p roponują
dwa m odele dojrzew ania i obróbki kotranskryptu
nad 1 — nad6 pszenicy. W pierw szym modelu
zakładają, że gen nad6 w trakcie tego procesu o d ­
działuje w łaśnie z d o m e n ą IV intronu ro zd zie­
lającego eksony IV i V nad 1; w drugim natomiast,
który autorzy faworyzują, nie przew id u ją takiego o d ­
działywania. Inni autorzy [57] sądzą, że na od p o ­
wiedni p rzebieg procesu składania w układzie trans
m ają w p ływ m iędzy innymi duplikacje eksonów.
D otychczas nie znaleziono je d n a k żadnych reguł
w skazujących na korelację pom iędzy liczbą ek so ­
nów a typem składania. N iektóre geny nad, np. nad 1,
2 i 5 p o siad ają z w ięk szo ną liczbę eksonów i składa­
nie transkry ptów tych genów zachodzi zarów no w
systemie cis, ja k i trans. P oczątek i koniec tran skryp­
tu niektórych genów n ad obejm uje czasam i kilka
miejsc. H a o u a z i n e i w s p . [58] wykryli na
przykład, że u pszenicy na 3 ’ końcu transkryptu nad6
są 3 m iejsca za kończenia transkrypcji, a 5 ’ koniec
tego m R N A je s t położony 375 nu kleotydów przed
kodonem „ A U G ” nad6.
N ieo becno ść niektórych podjednostek N A D p o ­
woduje, że fizjologiczne funkcje dehydrogenazy
N A D H u leg ają znacznem u ograniczeniu. W 1995 r.
P 1 a i w s p . [59] badając m utanta CM S N icotiana
sylve stris stwierdzili brak podjednostki N A D 7 w w y ­
niku delecji w mt DNA tej rośliny. Delecja spo w o d o ­
wała rów nież utratę 2 dalszych podjednostek i ogra­
niczenie aktyw ności dehydrogenazy N A D H . Z kolei
G u t i e r r e s i w s p . [60] pracując z m utantem
CM S II N. sylve stris stwierdzili utratę podjednostki
NAD 1. Jest to pierw szy zbadany roślinny m utant nie
zaw ierający tej podjednostki. Autorzy sugerują, że
za m utację tą od pow iedzialna je s t translacja tran­
skryptu genu n a d 1 ; w m itochondriach m utanta nie
stw ierdzono obecności dojrzałych m R N A nad 1. O b ­
niżenie aktyw ności dehydrogenazy N A D H o 90%
w ynika praw do pod obn ie z faktu, że podjednostka
NAD1 posiada m iejsce w iążące ubichinon. Ostatnio
D u b y i w s p . [61] pracując z m utantam i C hlam ydom onas reinhardtii stwierdzili m iędzy innymi, że
brak genu nad4 i 3 ’ końca genu n a d 5 też powoduje
obniżenie aktyw ności enzym atycznej dehyd ro g en a­
zy N A D H . Z nany od daw na m utant NC S 2, w y k a­
zujący c zęścio w ą delecję genu nad4 rów nież posiada
ob n iżo n ą
aktyw ność
deh ydrogenazy
N AD H.
W szystkie te m utanty nie są letalne, gdyż zaw ierają
genom y dzikie i zm utow ane, a ponadto przepływ
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
elektronów w ramach łańcucha oddecho w ego ko m ­
pensują dehydrogenazy N A D H n iew rażliw e na rotenon.
Sekwencje genów nd i n ad podobnie ja k inne se­
kwencje mt D N A są w yko rzy sty w ane w badaniach
filogenetycznych [62-64],
Ponieważ ilość inform acji na tem at bu dow y i ek s­
presji roślinnych genów nad je st zn aczn a i różnorod­
na, w tabeli 1 przedstaw iono najbardziej istotne dane
dotyczące charakterystyki tych genów.
IV. R ed agow anie tran skryptów genów m itochondrialnych
R edagow anie (ang. ed itin g ) — proces, który m o ­
dyfikuje inform ację genetyczną z a w artą w transkrypcie poprzez w ym ianę, p rzyłączenie lub u sunię­
cie nukleotydów — w ystępuje u wielu grup eukariontów [65-67]. Z m iany takie za obserw ow ano w
m R N A , tR N A i rR N A dotychczas tylko u eukariontów. N ajczęściej redagow ane są sekw encje kodujące,
a w m niejszym stopniu sekw encje je oskrzydlające i
introny. R edagow anie opisano początko w o u p ier­
wotniaków, jako proces p row adzący do delecji lub
insercji urydyn. Obecnie w iadom o, że redagow anie
m oże obejm ow ać również nukleotydy takie, jak: A,
G, C i praw dopodobnie I [ 6 8 ] oraz, że zam iana C-U
zachodzi poprzez deam inację C, a zam ian a U-C przez transam inację [ 6 8 , 69]. W i l l i a m s i w s p .
[70] sądzą, że na proces redagow ania nie ma wpływ u
struktura II-rzędowa. N iektórzy autorzy opierając
się na fakcie, że chloroplastow e sekw encje prz en o ­
szone do m itochondrium i odwrotnie nie są redago­
wane, sugerują odrębny m echanizm redagow ania dla
każdej z tych organelli [71 ], inni natom iast [6 8 ] u w a ­
żają, że m echanizm redagow ania w chloroplastach i
m itochondriach chociaż nie je s t identyczny, bo w y ­
maga pew nych specyficznych dla danych organelli
czynników, w ykazuje jed n ak pew ne podobieństwa.
R edagow anie w m itochondriach roślin okrytozalążkow ych odkryto w 1989 r., a w dw a lata później
— w chloroplastach tych roślin [72-73]. P odobień­
stwo system ów redagow ania RNA m itochondriów i
chloroplastów wynika z tego, że w trakcie tego pro ­
cesu następuje głównie zam iana C-U i proces ten nie
wykazuje polarności [71], ty m czasem podczas re da­
gowania jąd row y ch m R N A zw ierząt i człow ieka z a ­
chodzi również deam inacja adenozyny [14]. W transkryptach genów chloroplastow ych je s t znacznie
mniej miejsc redagow ania, niż w m itochondriach, co
ma zw iązek przypuszczalnie z szy bszą ew olu cją plastomu [74]. K a r c h e r i w s p . [74] postulują p e ­
wien w pływ plastydow ego aparatu translacji na p ro ­
http://rcin.org.pl
167
jąd ro w y i im portow ane do organelli. N ie wiadomo,
czy podobna sytuacja dotyczy m itochondriów .
R edagow anie występuje zarówno w normalnych,
ja k i chim erycznych transkryptach, ale zaobserw o ­
cesy redagowania, gdyż p od w yższo na tem peratura i
zaham ow anie syntezy białka ham uje proces re d ag o ­
wania. M a i e r i w s p . [ 6 8 ] sugerują jednak, że
wszystkie białkow e składniki konieczne do re d a g o ­
wania w plastydach, są k odow ane przez genom
wano, że ulega ono ograniczeniu w roślinach z feno-
Tabela 1
N iektóre cechy roślinnych genów nad
N azw a
genu
B adany
m ateriał
nad\
Z ielenice
P orostnica
P szenica
Bób
W iesiołek
1
1
1
1
1
—
4
4
4
trans, cis
cis
trans, cis
Z iem niak
T ytoń
1
1
1
4
cis
S łonecznik
1
4
trans, cis
Petunia
1
4
trans,cis
R zodkiew nik
Porostnica
1
1
1
cis
1.5-9.6
Pszenica
Rzepak
B urak
W iesiołek
R zodkiew nik
1
1
1
1
1
4
4
4
4
trans, cis
trans, cis
trans, cis
trans, cis
1.7-4.9
1.4-1.7
1.5-5.3
nad.3
Ponad 20 gat.
roślin
1 lub 2
Tylko 1 u
porostnicy
U porost­
nicy cis
nad4
Z ielenice
1;
1
cis
1.25-1.4
Porostnica
1
1
cis
3-5.4
Pszenica
K ukurydza
1
1
3
3
cis
cis
1.8-2.5
2-3.4
Ryż
1
3
Sałata
R zodkiew nik
Soja
Rzepak
1
1
1
1
1
3
>1
>1
cis
cis
1.6-3.2
nadl
168
Ilość kopii
Ilość
intronów
Typ
składania
eksonów
W ielkość
transkryptów
(kpz)
—
2-3.5
2.5-3.8
1.4-7.0
Uwagi
[119]
[152]
[94, 95] sekw . m at-r
[120] sekw .m at-r
[121, 92] kotranskr. z
r p s 13 i c o x I
[95] sekw. m at-r
[122, 60] rearanżacja
eksonu 1 - nieaktyw ny
kom pl. I
[123]
[124] korelacja z CM S
[15]
W ielkość
transkryptów u
roślin
nasiennych:
0.9-3.2
http://rcin.org.pl
2.2
[125] kotranskrypcja z
nad4 i nadS
[55]
[126]
[50]
[120, 127]
[97] 2 kodony start
[51-53, 75, 99, 100101, 103-105, 122,
128-131]
K otranskrypcja zw ykle
z rps 12, u w iesiołka z
rp l5, u ryżu z rps3 i
ccb206; u petunii i
ziem niaka korelacja z
CM S;
2 kopie u N. sylvestris:
jed n o ulega kotranskr.
z eksonem I nad 1
[132] K otranskrypcja z
cob
[125] kotranskrypcja z
n a d l i nad5
[106-107]
[133] korelacja z CM S
[134] intron 1 w iąkszy
od odpow . intronu
pszenicy i zaw. sekw.
Pow tórzoną
[108]
[15]
[135]
[64] korelacja z CM S
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
nadAL
G lony
Porostnica
R zodkiew nik
nad5
Z ielenice
W ątrobow ce
1;
1
1
1
1 lub 2
Paprotniki
1
W iele gat.
roślin
nasiennych
1 lub 2
nad6
ponad 20 gat.
roślin
1 lub 2
nadl
G lony
Porostnica ,
1
2
Pszenica,
ziem niak,
tytoń
Pszenica,
Ryż
nad9
[136-137] nieobecny u
Ch. R einhardtii
2
0
2
1
cis
0.8-4.4
cis, trans
0.3-4.4
2 do 4
0.3-4.5
1.2-2.9;
-
-
2
cis
9.6 i 16;
1
1
1
4
4
4
cis
cis
cis
1.7;
1;
1
-
1
1
1
typow ą cech ą C M S [75]. R ed agow ania transkryptów
organellowych nie wykryto dotychczas u porostnic
(.M a rch a n tiid a e) i glonów [ 6 6 , 76]. U niektórych
m szaków (glew iki) w ystępuje w znacznym odsetku
proces odw rotnego redagowania: zam iana U-C [ 6 6 ,
69]. M a i e r i w s p . [ 6 8 ] szacują, że w m itochondriach roślinnych 8 6 % w szystkich przypadków reda­
gowania zm ienia kodony am inokw asów . Pozostałe
zmiany, tzw. redagow anie „ciche” — nie z m ie­
niające am inok w asów —- z niejasnych pow odów
nadal utrzym uje się ewolucyjnie. S h i e l d s i w s p .
[77] zwrócili rów nież uw agę na fakt, że 24 % miejsc
redagow ania C-U w pew nych gatunkach je s t „preredagow anych” tzn. w ykazuje obecność w sekwencji
genomowej T. A utorzy ci sądzą, że zam iana genom owych C w T m oże się przyczyniać do p rz y sp ie szo ­
nej ewolucji genów. U w ażają oni jedn ak, że red ag o ­
wanie w yw iera m ałą presję selekcyjną w p rzypadku
większości zm ieniany ch miejsc w czasie ewolucji.
Redagow anie w m itochondriach może przyw racać
także w ystępow anie ko nserw atyw nych a m in o k w a­
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
"
--
—
0.9-1.8
0.69-3.0
-
"
Burak,
Z iem niak,
R zodkiew nik
2.1-9.6
_
1
0.9-1.8
[131]
[109]
[138]
[66, 125] porostnica:
kotranskrypcja n a d l i
nadA
[139] najm niejszy
intron gr. II roślin
[110, 134, 140-147]
kotranskrypcja:
w iesiołek z genam i
rR N A , jabłoń z atp9
[56, 58, 1 1 1, 131, 148149]
8 znanych sekw encji;
kotranskrypcja:
pszenica z eksonem IV
n a d l, kukurydza z atpó
[59]
[25] jed n a kopia w
jąd rze; w
m itochondriach
pseudogen ulegający
transkrypcji
[113]
[112]
[59] delecja 2 eksonów
w CM S
[115]
[118] kotranskrypcja z
ndhK , n d h J z ct DN A
[150]
[116]
H U ........................... ..........
sów, kreow ać kodony „start” lub „stop” , albo oba
jedn ocześn ie [78].
Częściow o redagow ane transkrypty, będące p ro ­
duktami przejściow ym i dojrzew ania RNA, w y stę­
p ują w m itochondriach niem al wszystkich zbada­
nych gatunków roślin. Ilość częściow o zred ago w a­
nych m R N A zależy od stopnia dojrzałości transkryp­
tów [6 8 ]. Mniej redagow ane są cząsteczki, które są
przeznaczone do procesu składania R N A (ang. sp li­
cing), natom iast cząsteczki które uległy temu pro c e­
sowi są redagow ane w w iększym stopniu. L u i
w s p . [79] wykazali, że częściow o redagowane
m R N A m o g ą ulegać translacji, a odpow iednie białko
może się akum ulow ać na poziom ie w ykryw alnym
m etodam i im m unologicznym i. Prowadzi to do p o ­
w stania polim orfizm u białek. A utorzy sądzą jednak,
że zjawisko translacji takich m R N A może być specy­
ficzne dla określonych gatunków roślin. W m ito ­
chondriach roślin selekcja redag ow an ych C jest w y ­
soce specyficzna i jak sąd zą M u 11 i g a n i w s p .
[80] oraz K u b o i K a d o w a k i [71] zależy ona
http://rcin.org.pl
169
między innymi od sekwencji rejonu flankującego re­
dagow any nukleotyd od strony 5 ’.
Jednym z zagadnień zw iązanych z redagow aniem
jest wyjaśnienie, w jaki sposób dochodzi do o d ­
działywania R N A — białko. Zakładając udział w re­
dagow aniu cząsteczek gR N A (ang. g uide RNA), k tó ­
re m o gą być obecne w m itochondriach w bardzo
m ałym stężeniu, fakt znacznej liczby miejsc red ag o ­
wania skłania do przypuszczenia, że nie każde z nich
jest rozpoznaw ane przez odrębne białka [70]. P ro­
blem udziału czyn nikó w białkow ych w redagow aniu
będzie m ógł być lepiej poznany gdy będzie p rzep ro­
wadzona odpow iednia analiza in vitro. Próby o p ra­
cowania takiego „system u” podjęli Y u i w s p . [81]
dla grochu w przypadku redagow ania typu C-U, n a ­
tomiast B l a n c i w s p . [82] opisali podobny eks­
peryment z zasto sow aniem ekstraktu z m itochondriów zarodków pszenicy. P ostulują oni, że białkowy
kom pleks redagujący (edytosom ) składałby się z deam inazy cytozyny, białek wiążących się z RNA oraz
białek stabilizujących cały układ (Rys. 2). Na po d sta­
wie p rzeprow adzonych dośw iadczeń autorzy su g e­
rują, że edytosom zawiera n ie je d n o , ale kilka białek
niezbędnych do pojaw ienia się aktywności reda­
gującej. F a i v r e - N i t s c h k e i w s p . [83] scha­
rakteryzowali du żą rodzinę genów deam inaz cyto zy­
ny w ystępujących w m itochondriach rzodkiewnika.
W ykazują one wysoki stopień hom ologii z ich b ak te­
ryjnymi odpow iednikam i, a sześć z siedm iu pozna­
nych białek posiada typow y m otyw am inokw asow y
charakterystyczny dla m iejsca aktyw nego deaminaz.
B r e n n i c k e i w s p . [67] sądzą jednak, że w ięk­
szość procesów redagow ania o bejm ująca zarówno
jądrow e, jak i organellow e tran skrypty jest stosunko­
wo m łodych ew olucyjnie i p ow stała raczej niezale­
żnie od siebie. Fakt w ystępo w an ia redagow ania transkryptów m itochondrialnych u m szak ó w przem awia
także za tym, że redagow anie u roślin sięga czasów
pojawienia się roślin lądow ych i że proces ten w p e ­
wien sposób przyspieszył ew olu cję roślin telomowych [76],
IV-1. Redagowanie transkryptów genów nd
pierwotniaków
Proces redagow ania transkryptó w nd pierw otnia­
ków, w szczególności nd7 i n d 8 trypanosom , zach o­
dzi zarówno poprzez tw orzenie kodonów „start” i
„stop” , ja k również poprzez ad dycje nukleotydów w
obrębie cząsteczek RNA [84-85]. R edagow anie tran­
skryptów genów nd trypanosom zależy od wielu
czynników. W przypadku tran skryptó w ndl Trypanosom a brucei i C rithidia fa s c ic u la ta okazało się, że
nie ulegają one redagow aniu w obszarze kodującym,
a jed ynie w obrębie ogona poli(A ) [ 8 6 ], Z kolei u
wolno żyjącego pierw otniaka B odo sa lta n s, tran­
skrypty nd5 są redagow ane w rejonie kodującym
[87]. S o u z a i w s p . [18] badając redagowanie
transkryptów genu nd7 stwierdzili, że poziom red a­
gowania nie zmieniał się w cyklu życiow ym T. b ru ­
c e i, ale pula nieredagow anych transkryptów była
wyższa u osobników żyjących we krwi. W 1992 r. zi­
dentyfikowano geny gR N A redag ujące transkrypty
genów nd7 i n d 8 i wykryto, że zależn a od okresu ro z­
woju regulacja tego procesu nie je s t zw iązana z aktu­
alną ilością gRNA [ 8 8 ]. B 1 u m i S i m p s o n [89]
zainteresowali się początkow ym etapem red ago w a­
nia transkryptów genu nd7. D ążąc do poznania za an ­
liiałka sta b iliz u ją c e e d y to s o m
gażowania gRNA w tym procesie autorzy zastoso ­
wali chim eryczną cząsteczkę za w iera ją cą syntetycz­
ny preredagow any m R N A i gR N A dla kryptogenu
nd7 L eishm ania tarentolae, oraz ekstrakt z mitochondriów. W wyniku tych badań stwierdzili, że preredagow ana część nie w pływ a na redagow anie w in­
nych miejscach cząsteczki. H e r m a n n i w s p .
[90] rozwinęli dalej te badania i skonstruowali trój­
Rys. 2. Schemat kompleksu edytującego (edytosomu) w mitochon­
driach roślin; (na podstawie [82] - zmodyfikowano)
Uważa się, że wiele przypadków redagowania
mogło się w ykształcić niezależnie od siebie.
Zakładając, że proces redagow ania jest bardzo stary
ewolucyjnie, postuluje się [69], że mógł on za ch o ­
dzić ju ż u prokariotycznych przodków organelli.
170
wym iarow y model układu: gR N A — transkrypt genu
nd7. Pozwoliło im to stwierdzić, że gRNA znajduje
się wewnątrz rybonukleinow ego kom pleksu o d p o ­
wiedzialnego za redagowanie.
Generalnie uważa się, że re dagow anie transkryp­
tów genów nd trypanosom zachodzi niezależnie od
innych procesów dojrzew ania m R N A [91].
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
IV-2. Redagow anie transkryptów genów nad roślin
Prawie w szystkie m R N A m itochondriów ro ślin­
nych ulegają redagow aniu, w tym rów nież transkrypty genów nad. Jak pokazano w tabeli 2, ilość miejsc
redagowania w transkryptach genów nad jest dość
znaczna.
R edagow anie polega najczęściej na zamianie
C-U. Niektóre z opisanych przyp adk ów odwrotnej
zamiany U-C w y m a g a ją jeszc ze weryfikacji. R ed a­
gowanie prow adzi czasam i do pow staw ania kodonów „start” . W zależności od badanego m ateriału re ­
dagow anie tran skryp tów genów nad w ykazuje p e w ­
ne cechy charakterystyczne. U niektórych roślin, na
przykład u w iesiołka, re dagow aniu ulega nie tylko 4
z 5 eksonów genu n a d 1, ale i p ojedynczy intron [92].
C harakterystyczną cechą redagow ania genu nad 1
w iesiołka je s t również znaczny odsetek cytozyn u le ­
gających „c ichem u” redagow aniu. W roślinie tej ist­
nieje w yraźny zw iązek pom iędzy redagow aniem a
splicingiem. U sunięcie intronu z nad 1 w ym aga n aj­
pierw redagow ania dom eny VI intronu . N atom iast w
transkryptach n a d \ petunii usunięcie intronów nie
je s t w ym agane do przebiegu procesu redagow ania
[93]. '
W transkryptach pszenicy każdy ekson n a d lulega
redagowaniu, a szczególny nadm iar miejsc red ag o ­
w ania zawiera ekson III [94]. R edagow anie intronów
genu n a d l zachodzi też w obrębie sekwencji m at-r
pszenicy i ziem niaka i dotyczy 13-15 konwersji C-U,
które zm ien iają charakter potencjalnych domen k o ­
dow anych m aturaz [95].
R edagow anie transkryptów genu n a d l prowadzi
nie tylko do zm ian am inokwasów , ale również do
Tabela 2
O braz redagow ania transkryptów genów n ad roślin
Gen
B adany m ateriał
nad 1
P szenica
Z iem niak
W iesiołek
Petunia
P szenica
W iesiołek
R zodkiew nik
Sosna
Pszenica
nadl
nadl
nad4
nadAL
nad5
Ryż
K ukurydza
Sorgo
W iesiołek
Z eń-szeń
Petunia
Rzepak
M agnolia
S łonecznik
C zosnek
Pszenica
Sałata
Rzepa
R zodkiew nik
W ątrobow ce:
glew iki
jungerm aniow ce
M chy
W iesiołek
R zodkiew nik
L iczba m iejsc
redagow ania
Uw agi
17
[94,95] redagow anie generuje kodon „start”
[95] redagow anie sekw encji m at-r (15 m iejsc)
[121]redagow anie m at-r; redag. generuje „start”
[124]
28
23
36
36
33
27
21
5
22
19
16
15
19
10
23
16
21
23
16
36
9
37-50
2-21
1-9
nad6
Pszenica
K ukurydza
27
9
15
12
nadl
Pszenica
Z iem niak
32
3
nad9
Pszenica
Ryż
Burak zw yczajny
Z iem niak
15
12
5
7
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
[55]
[96,127] w tym redagow anie intronów
[97] w tym redagow anie intronów
[100] częściow e redagow anie
[103] częściow e redagow anie; korelacja:
redagow anie - dojrzew anie m R N A
[99]
[104] częściow e redag.; kultury zaw iesinow e;
[75]
[102] częściow e redagow anie
[128] redagow anie zbliżone do w iesiołka
[105] częściow e redagow anie
[98] redagow anie różnicuje rodzaj Brassica
[51] częściow e redagow anie
[51] częściow e redagow anie
[51] częściow e redagow anie
[106] całkow ite redagow anie
[108] całkow ite redagow anie
[108] odm ienna ilość m iejsc redag. w eksonach
w porów naniu z p szenicą i sałatą
[109] częściow e redagow anie
[66] redagow anie badano w e fragm encie
transkryptu genu nadS
[110]
[110]
[58]
[111]
[113] niektóre zm iany są częściow e
[112] redagow anie I eksonu
[115]
[118]
[150]
[116]
http://rcin.org.pl
171
tzw. „cichych” konwersji. R edagow anie tych ostat­
nich wykryto u w iesiołka [96]. W intronach genu
wpływ na redagowanie; takiego w pływ u nie obser­
wuje się jed n ak w relacji redagow ania poszczegól­
nych miejsc. Z aobserw ow ano przy tym, że niektóre
m iejsca w sekwencji m R N A n a d 3 są redagow ane z
w ięk szą częstotliwością, inne natom iast z m niejszą
[98, 105], Badano również w pływ sterylnej i płodnej
cytoplazm y na obraz redagow ania transkryptów
n a d l. Jak wynika z badań p rzeprow adzonych z etiolowanym i siewkami i pylnikam i sorgo [75] nie
stwierdza się różnic w redagow aniu tych dwóch ty ­
pów cytoplazm. Poniew aż gen n a d l w większości
badanych przypadków ulega kotranskrypcji z genem
n a d l wiesiołka składanych w system ie trans stw ier­
dzono w ystępow anie 3 miejsc redagowania. P o d o b ­
nie jak w przypadku genu nad 1 stwierdzono, że re d a­
gowanie jest konieczne do praw idłow ego wycięcia
intronów [96]. Okazało się również, że 27 miejsc re ­
dagow ania wiesiołka, pszenicy i rzodkiew nika je st
wspólnych [97].
W transkryptach genu n a d l dotychczas zb a d a­
nych gatunków roślin najwięcej zm ian typu C — U
występuje w centralnym i 3 ’ ko ńcow ym rejonie
m RNA (Rys. 3). U o krytozalążkow ych, z w yjątkiem
ryżu [51, 98, 99] obraz redagow ania je s t zach o w a w ­
czy. Konwersji ulega zazwyczaj od 10-23 miejsc u
okrytozalążkowych, natom iast u nag ozalążkow ych
— sosny zw yczajnej, redagow anie m R N A n a d l
obejmuje aż 27 pozycji [100]. W yjątkow y przypadek
rps 12 badano także rejon m iędzy tymi genami. U
słonecznika rejon ten był redagow any w jednym
miejscu [51].
Badając redagow anie transkryptów genu nad4
pszenicy [106, 107], rzepy i sałaty [108] i stw ierdzo­
no, że obraz redagow ania jest podobny ale nieiden-
R o zm ieszczen ie re d a g o w a n y c h kodonóyy w tr a n s k r y p ta c i
GEM
NA1)3
II AA
MC.
SŁONECZNIK
MAGNOEI \
PETUNIA
ŻEŃ-SZEŃ
W IESIOŁEK
CEBULA
RYŻ
KUKURYDZA
SORGO
PSZENICA
SOSN A
ZW Y( Z A J N A
RO ZM IESZC ZEN IE
REDAGOW ANYCH KODONOW W TRANSKRYPTACH
GENU
NA!)9
l AA
AUG
ZIEM NIAK
BURAK
ZW YCZAJNY
RY Ż
PS Z E N I C \
stanowi rzodkiew odm iany płodnej i m ęskosterylnej
‘O g u ra’, w których m itochondrialne transkrypty
n a d l nie ulegają w ogóle redagow aniu [101]. C h a ­
rakterystyczną cechą to w arzy szącą ekspresji genu
n a d l roślin je s t w ystępow anie procesu częściowego
redagowania [51, 100, 102-105], W niektórych tran ­
skryptach pszenicy stw ierdzono w ystępow anie delecji w miejscach redagow ania lub w ich bezpośrednim
sąsiedztwie. G u a 1 b e r t o i w s p . [103] sugerują ,
że delecje te są konsekw encją procesu redagowania.
Jak w ykazały szczegółowe badania przeprow adzone
na siewkach i kulturach zaw iesinow ych kukurydzy
[104] stopień redagow ania m R N A n a d l zm ienia się
w zależności od w arunków hodowli kultur zaw iesi­
nowych i od wieku siewek. W i l s o n i H a n s o n
[105] analizując stopień redagow ania 4 różnych g e ­
notypów petunii zauważyli, że genom jąd ro w y ma
172
Rys. 3. Przykładowe rozmieszczenie
miejsc redagowania w transkryp­
tach genów nad na przykładzie
n adl i nad9. Gwiazdkami (*)
oznaczono pozycje redagowa­
nych kodonów na całej długości
odpowiedniego mRNA.
tyczny. U pszenicy redagow anie występuje głównie
w I i IV eksonie. Sugeruje się, że to nierów nom ierne
rozm ieszczenie miejsc redagow ania ma związek z
bu dow ą podjednostki NA D 4 i z ew olucyjnym i p ro ­
cesami „tasow ania” eksonów. W porównaniu z o b ra­
zem redagow ania innych transkryptów nad proces
podw ójnego redagow ania kodonów m R N A nad4
występuje rzadko [ 106, 108]. U pszenicy okazało się
również, że redagow anie połączenia eksonów II i III
m R N A zapewnia ciągłość ramki odczytu [107],
Redagow anie stwierdzono rów nież w transkryp­
tach nad4L . Transkrypty podjednostki N AD 4L
rzodkiew nika ulegają redagow aniu, które zm ienia
charakter 9 kodonów. Okazało się jednak, że spośród
dziesięciu analizow anych klonów cD N A nad4L tego
gatunku, cztery z nich były identyczne i całkowicie
redagowane, pozostałe zaw ierały od jedn ego do kil­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
ku pozycji nieredagow anych. Badając to zagadnienie
B r a n d t i w s p . [109] nie znaleźli przyczyn częś­
ciowego redagow ania tego transkryptu.
Redagow anie genu nad5 badano zarów no u roślin
nasiennych, ja k i mszaków. W przypadku tych ostat­
nich są to je d y n e inform acje na ten temat. Badając
centralny rejon genu nad5 S t e i n h a u s e r i w s p .
[ 6 6 ] nie wykryli jed n ak re dagow ania u w ą tro b o w ­
ców M archantiidae. Zanalizow ano także 30 prz ed ­
stawicieli mchów. Stw ierdzono u nich typowe re d a­
gowanie typu C-U pow odujące głów nie zam ian ę kodonów serynow ych i argininow ych w kodon y fenyloalaninowe, leucynow e, cysteinow e i tryptofanow e.
Okazało się również, że u g lew ików redagow anie
m R NA nad5 m oże zm ieniać aż 6 % kodonów także w
wyniku zam iany U-C, co p ow oduje przekształcenie
w ew nętrznych k odonów „stop” w kodony glutam i­
nowe i argininow e [6 6 ]. Transkrypty nad5 u glew i­
ków w poró w naniu z innymi roślinam i okazały się
najczęściej redagow anym i transkryptam i nad. Z k o ­
lei u roślin okrytozalążkow ych, ja k w iesiołek i rz o d ­
kiewnik, które ja k o jed y n e były dotychczas poddane
badaniom w szystkie eksony u leg ają redagow aniu z
wyjątkiem eksonu V. U w iesiołka red ago w aniu u le­
gają też introny rozdzielające eksony I i II oraz IV i V
[ 110].
Badając redagow anie transkryptów genu n a d 6
pszenicy H a o u a z i n e i w s p . [58] wykryli p e w ­
ne cechy charakterystyczne dla m R N A tej rośliny.
Okazało się, że redagow anie 2 kodonów pszenicy
jest typu „cich ego ” , a w 4 dalszych zm ianie p od le­
gają 2 pozycje w kodonie. M iejsca redagow ania tran­
skryptów nad6 kukurydzy o d po w iada ją znanym p o ­
zycjom w pszenicy, ale z kolei u ku kurydzy wykryto
znaczny odsetek częściowo redagow anych m R NA
[ 111].
Jak w ynika z dotychczasow ych badań, zm iany to­
w arzyszące redagow aniu transkryptów nad6 pszeni­
cy i kukurydzy o bejm ują zarów no konw ersje k o d o ­
nów prolinowych, serynow ych i histyd yno w ych o d ­
powiednio w kodony fenyloalaninow e, leucynow e i
tyrozynow e, jak rów nież zm iany „ciche” w kodonach leucynowych.
Ilość miejsc redagow ania w transkryptach genu
n a d l wyraźnie zależy od badanego m ateriału. R eda­
gowaniu w 1 eksonie transkryptu genu n a d l ziem nia­
ka p o d le g a ją 3 kodony [112]. W m R N A n a d l p szeni­
cy natom iast redagow anie pow oduje aż 32 konw ersje
C-U w 4 z 5 eksonów. 27 z tych 32 zm ian dotyczy re­
dagow ania zm ieniającego sens kodonów. B o n e n i
w s p . [113] szacują, że w śród pozostałych zmian
„cichych” niektóre są częściowo redagowane. B a­
dając w pływ okresu rozwoju na redagow anie introPOSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
nów n a d l pszenicy stwierdzono, że chociaż redago­
w anie intronów genu n a d l pszenicy może wpływać
na w ydajność procesów dojrzew ania m R NA nie jest
to jed n ak proces niezbędny do zachodzenia dojrze­
w ania [114],
R edagow anie badano rów nież w transkryptach
genu nad9. D otychczasow e dane dotyczą 4 gatun­
ków roślin nasiennych. Okazało się, że u roślin jednoliściennych, szczególnie u pszenicy, w porów na­
niu z roślinami dw uliściennym i więcej miejsc reda­
gow ania transkryptów nad9 w ystępuje bliżej końca
3 ’ (Rys. 3). Ciekawe, że w szystkie dotychczas ziden­
tyfikow ane zm iany „ciche” w transkryptach genu
n a d 9 w ystępują w yłącznie u pszenicy i dotyczą
głównie k odonów serynow ych i leucynowych. Pozo­
stałe zm iany C-U po w o d u ją konw ersje kodonów se­
rynow ych i prolinow ych w kodony fenyloalaninowe
i leucynow e [115]. Najwięcej uwagi poświęcono re­
dagow aniu transkryptów nad9 ziem niaka, gdzie w y ­
stępują częściowo i w pełni redagow ane transkrypty.
R edagow anie transkryptów nad9 ziem niaka było b a­
dane w 2 laboratoriach [116-117]. G r o h m a n n i
w s p . [116] opierając się na w ynikach sekwencjonow ania peptydów uważają, że tylko peptydy p odjed­
nostki N A D 9 odpow iadające w pełni zredagow anym
transkryptom są obecne w dehydrogenazie NADH.
C zęściow o redagow ane m R N A nad9 m ogą nie u le­
gać translacji w wyniku pretranslacyjnej selekcji lub
powstałe z nich białko m oże ulegać szybkiej proteolizie. L u i H a n s o n [117] na podstawie swoich
w yników uzyskanych z zastosow aniem inhibitorów
translacji uważają, że częściow o redagow ane trans­
krypty m o g ą ulegać translacji, ale do ich wykrycia
w ym agane są czulsze m etody im munologiczne. W
zw iązku z tym u w ażają oni, że nie musi istnieć spec­
ja ln y m echanizm selekcji na m itorybosom ach. A n a ­
lizując m iejsca redagow ania m R N A nad9 roślin jednoliściennych i dw uliściennych, ja k również wydedukow ane sekwencje białka podjednostki NAD 9
stwierdzono [118], że rośliny dwuliścienne (burak i
ziem niak) zaw ierają mniej miejsc redagowania, ale
wszystkie one o d po w iadają m iejscom w ystępującym
u jednoliściennych.
V. U w agi końcow e
Dane przedstaw ione w artykule wskazują, ze or­
ganizacja, budow a i ekspresja genów nd i nad w y k a­
zuje zróżnicow anie w poszczególnych grupach orga­
nizmów. Zróżnicow anie to dotyczy przede w szyst­
kim obrazu ekspresji, natom iast więcej cech zach o­
w aw czych w ramach p oszczególnych genów nd i nad
w ystępuje w budow ie genów i ich liczbie kopii.
http://rcin.org.pl
173
C zynnikiem , który m oże w pływ ać na zró żnicow a­
nie ekspresji m itochondrialnych genów p o djedno ­
stek dehydrogenazy N A D H kom pleksu I łańcucha
oddechowego je s t m iedzy innym i redagowanie.
Redagow anie, które w ystępuje najczęściej w transkryptach m itochondrialnych, a rzadziej w chloro ­
plastowych i jąd row ych, w dw óch pierw szych p rz y ­
padkach w ykazuje pew ne cechy wspólne, jak: w y stę­
powanie zam iany C-U, preferencja drugiej pozycji
kodonu w redagow aniu, preferencja konwersji p e w ­
nych kodonów oraz redagow anie głównie sekwencji
mRNA.
Do grupy najczęściej redagow anych transkryptów
genów m itochondrialnych n ależ ą m R N A genów nad.
Stopień redagow ania transkryptów genów nad m oże
się zm ieniać w zależności od gatunku rośliny, ro dza­
ju tkanki, stadium rozw oju i w aru nkó w hodowli ro­
ślin. Proces ten w ydaje się być skorelow any z dojrze­
waniem transkryptów i zachodzi nie tylko w sek w en­
cjach eksonów, ale rów nież intronów.
Chociaż uważa się, że częściow o zredagow ane
transkrypty n a d m o g ą ulegać translacji, co gen ero ­
wałoby pew ien polim orfizm polipeptydów NAD , to
ze względu na m ałą ilość danych, zagadnienie to w y ­
maga dalszych badań.
Podziękowanie
Praca finansow ana z projektu badaw czego nr 6
P 0 4 B 018 13 Kom itetu Badań Naukowych.
Prof. dr hab. Halinie A ugustyniak dziękuję za sty m u ­
lację i sugestie podczas przyg otow yw ania niniejsze­
go artykułu.
Artykuł otrzymano 13 grudnia 1999 r.
Zaakceptowano do druku 28 lutego 2000 r.
Piśm iennictw o
1. H e i s e r V , B r c n n i c k c A , G r o h m a n n L
(1996) Plant M ul Biol 31: 1195-1204
2. W a 1 k e r J E (1992) Quater Rev Biophys 25: 254-324
3. R a s m u s s o n A G , M c n d e l - H a r t v i g J , M o l i e r I M,
W i s k i c h J T (1994) Physiol Plant 90: 607-615
4. L a t c r m c S, B o u t r y M (1993) Plant Physiol 102: 435-443
5. H e r z V, S c h r o e d e r W, L i d d c l A, L e a v e r C J ,
B r c n n i c k c A , G r o h m a n n L (1994) J Biol Chem 269:
2263-2269
6. C o m b e 11 e s B , G r i e n e n b c r g e r JM (1999) Biochimie 81:
645-653
7. S c h m i d t - B l e e k K, H e i s e r V, T h i c c k O, B r c n n i c ­
k e A, G r o h m a n n L (1997) M ol Biol Genet 253: 448-454
8. W e i s s H, F r i e d r i c h T, H o f h a u s G, P r e i s D (1991)
Eur J Biochem 197: 563-576
9. W e i d n e r U, G e i e r S, P t o e k A, F r i e d r i c h T, L e i f
H , W e i s s H (1993) J Mol B iol 233: 109-122
10. S z y m a ń s k i M , B a r c i s z e w s k i J (1990) Post Biochem 36:
2-4
174
1 1 . Ż c k a n o w s k i C (1992) Post Bioch 38: 156-163
12. Ż c k a n o w s k i C (1994) Biotechnologia 1: 109-120
13. R u r c k M (1994) Post Bioch Kom 21: 391-394
14. K o s t y r k o A, T r z e c i a k W (1998) Post Bioch 44: 94-101
15. U n s e l d M, M a r i e n f e l d J R , B r a n d t P, B r c n n i c k c
A (1997) Nat Genet 15: 57-61
16. P r i t c h a r d A E , S e i l h a m e r J J , M a h a l i n g a m R, S a ­
b i e C L , V e n u t i S E , C u m m i n g s DJ (1990) Nuci Acids
Res 18: 173-180
17. S i m p s o n L, N e c k c l m a n N, D e L a C r u z V F , S i m p ­
s o n A M , F e a g i n J E , J a s m e r D P , S t u a r t K (1 9 8 7 )./
Biol Chem 262: 6182-6196
18. S o u z a A E , S h u H H , R e a d L K , M y l e r P J , S t u a r t
K D (1993) M ol Celi Biol 13: 6832-6840
19. M a s l o v D A , N a w a t h c a n P, S c h c e l J (1999) Mol Bio­
chem Parasitol 99: 207-221
20. B u r g e r G, P l a n t e 1, L o n e r g a n K M , G r a y M W
(1995) J M o l Biol 245: 522-537
21. N e l s o n M A , M a c i n o G (1987) M ol Gen Genet 206:
307-317
22. C u m m i n g s D J , D o m e n i c o J M (1988) J M ol Biol 204:
815-839
2 3 . A g s t e r i b b e E, H a r t o g M , d e V r i e s H (1989) Curr Ge­
net 15: 57-62
24. C u m m i n g s D J , M i c h e l F, D o m e n i c o J M , M c N a l ­
l y K L (1990) J M o l Biol 212: 269-286
25. T a k e m u r a M, N o z a t o N, O d a K, K o a a y a s h i Y,
F u k u z a w a H, O h y a m a K (1995) Mol Gen Genet 247:
565-570
26. K a m i n u r a N, I s h i i S, L i a n d o n g M, S h a y J W (1989)
J Mol Biol 210: 703-707
27. S a v r e - T r a i n I, P i ą t y s z e k M A , S h a y J W (1992) Hum
M ol Genet 1: 203-204
28. B a i Y , A t t a r d i G (1998) EM BO J 17: 4848-4858
29. M o u r n T , W i l l a s s e n N P , J o h a n s e n S ( i 994) Curr Ge­
net 25: 554-557
30. X u X , J a n k ę A, A r n a s o n U (1996) Mol Biol Evol 13:
1167-1173
3 1 . A r n a s o n U, G u l l b c r g A, W i d e g r e n B (1991) J Mol
Evol 33: 556-568
32. A r n a s o n U, J o h n s s o n E (1992) J Mol Evol 34: 493-505
33. O k i m o t o R , M a c f a r l a i n c J L , C l a r y DC1, W o 1s t c n h o l m e D R (1992) Genet 130: 471-498
34. R i p p c R M , G c l l i s s e n G (1994) Curr Gene: 25: 135-141
3 5 . C a m p b e l l N J , B a r k e r S C (1999) Mol Biol Evol 16:
732-740
36. B o o r c J L , B r o w n W M (1994) Genet 138: 423-443
37. B a t u e c a s B, G a r e s s c R, C a l i ej a M, V a l v c r d c J R ,
M a r c o R (1988) Nuci Acids Res 16: 6515-6529
38. B c a g 1c y C T , O k a d a N A , W o 1s t c n h o 1ni e D R (1996)
Proc NatI Acad Sci USA 93: 5619-5623
39. K o e r b c r S, S a n t o s A N , T e t e u s F, K u c i e n h o f f A,
F i s c h e r B (1998) M ol Reprod Dev 49: 394-399
40. I g 1e s i a s T , C a n b i n J , Z a b a 11 o s A , B e : n a 1 J , M u ­
n o z A (1995) Biochem Biophys Res Com 210: 995-1000
41. K o d a m a S, Y a m a d a H, A n n a b L, B a r r e t t J C (1995)
Exp Cell Res 219: 82-96
42. T o u r m c n t c S, S a v r e - T r a i n 1, B e r t h i c r F , R e n a u d
M (1990) Cell Differ Dev 31: 137-149
43. G i b b G M , R a g a n C I (1990) J Biochem 265: 903-906
44. Y a g i T ( 1993) Biochem Mol Biol Int 30: 253-26
45. Benl lagc H A C M , J a n s s e n AJ M, Cho n y n A , A t ­
t a r d i G, W a l k e r J E , S c h a e g g e r H , S e n g e r s R C A ,
T r i j b e 1s F J M ( i 995) Biochim Biophys Acta 1234: 63-73
46. R a g a n CI (1987) Curr Top Bioenerg 15: 1-36
47. S e l l c m C H , d ’ A u b e n t o n - C a r a f a Y, R o s s i g n o l
M , B e 1c o u r L (1996) Genet 143: 777-788
48. H o g u e D L , E l l i s o n M J , V i c k e r s M , C a s s C E (1997)
Biochem Biophys Res Com 238: 81 1-816
49. S o o 1e K L , M e n z RI (1995) J Bioenerg Biomembr 21:
397-406
50. X u c Y , D a v i e s D R , T h o m a s C M (1990) doi Gen Genet
221: 195-198
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 40(2), 2000
51. P c r o t t a G, R e g i n a T M R , C c c i L R , Q u a g l i a r i e l l o
C (1996) M ol Gen Genet 251: 326-337
52. R u r e k M, O c z k o w s k i M, A u g u s t y n i a k H (1998)^c/a
Biochim Polon 45: 695-699
5 3 . K a n a z a w a A, T o z u k a A, K a t o S, N i k a m i T , A b c
J, S h i m a m o t o Y (1998) Curr Genet 33: 188-198
54. J a ń s k a H, W o ł o s z y ń s k a M (1997) Acta Biochim Polon 2:
239-250
55. M o r a w a 1a - P a t e 11 V , G u a l b e r t o J M , L a m a t t i n a
L, G r i e n e n b e r g e r J M , B o n n a r d G (1998) M ol Gen Ge­
net 258: 503-511
56. H a o u a z i n e N , T a k v o r i a n A, J u b i e r M F , M i c h e l
F, L c j c u n c B (1993) Curr Genet 24: 533-588
5 7 . W i s s i n g e r B, B r e n n i c k c A, S c h u s t e r W (1992)
Trends Genet 8: 322-340
58. H a o u a z i n e N. d e S o u z a A P , J u b i e r M F , L a n c e l i n
D, D e l c h e r E , L e j e u n e B (1992) Plant M ol Biol 20:
395-404
59. P 1a M , M a t h i e u C, D e P a e p e R, C h e t r i t P, V e d e l
F (1995) M ol Gen Genet 248: 79-88
60. G u t i e r r e s S, C o m b e t t e s B, D e P a e p e R, M i r a n d ę
M, L e l a n d a i s C, V e d e l F, C h e t r i t P (1999) Eur J Bio­
chem 261: 361-370
61. D u b y F, M a t a g u e R F (1999) Plant Celi 11: 115-126
62. Z a r d o y a R, M e y e r A (1996) M ol Biol Evol 13: 933-942
63. P e s o l e G, C e c i L R , G i s s i C , S a c c o n e C , Q u a g l i a ­
r i e l l o C (1996) J M ol Evol 43: 447-452
64. Y a n g Y W , L a i K N , T a i P Y , Li W H (1999) J M ol Evol
48: 596-604
65. B e n n e R (1996) Curr Opin Genet Dev 6: 221-231
66. S t e i n h ä u s e r S, B e c k e r t S, C a p e s i u s I, M a ł e k O,
K n o o p V (1999) J M ol Evol 48: 303-312
67. B r e n n i c k c A, M a r c h f e l d e r A, B i n d e r S (1999)
EEMS Microbiol Rev 23: 297-316
68. M a i e r R M , Z e i t z P, K o e s s e l H , B o n n a r d G, G u a l ­
b e r t o J M , G r i e n e n b e r g e r J M (1996) Plant M ol Biol 32:
343-365
69. G r a y M W (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 8157-8159
70. W i l l i a m s M A , K u t c h e r B M , M u l l i g a n R M (1998)
Plant Mol Biol 36: 229-237
71. K u b o N , K a d o w a k i K (1997) FEBS Lett 413: 40-44
72. G u a l b e r t o J M , L a m a t t i n a L, B o n n a r d G, W e i l
J H , G r i e n e n b e r g e r J M (1989) Nature(Lond) 341 : 660-662
73. H o c h B, M a i e r R M , A p p e l K , I g l o i G L , K o e s s e l H
(1991) Nature(Lond) 353: 178-180
74. K a re h e r D , B o c k R (1998) Nuci Acids Res 26: 1185-1190
75. H o w a d W , K e m p k e n F (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94:
11090-11095
76. M a ł e k O, L a e t t i g K, H i e s e l R, B r e n n i c k c A,
K n o o p V (1996) EMBO J 15: 1403-1411
77. S h i e l d s D C , W o l f e K H (1997) M ol Biol Evol 14: 344-349
78. Z a n l u g o S, Q u i n o n e s V, M o e n n e A, H o l u i g u e L,
J o r d a n a X (1995) Curr Genet 27: 565-571
7 9 . L u B, W i l s o n R K , P h r e a n e r C G , M u l l i g a n R M ,
H a n s o n M R (1996) Mol Cell Biol 16: 1543-1549
80. M u l l i g a n R M , W i l l i a m s M A , S h a n a h a n M T (1999)
J H ered 90: 338-344
81. Y u W , S a n c h e z H, S c h u s t e r W (1998) M ethods 15:
63-74
82. B l a n c V, J o r d a n a V, L i t v a k S, A r a y a A (1996) Bio­
chim 78: 511-517
83. F a i v r e - N i t s c h k e E , O ’ B r i a n C , M u l l i g a n R M ,
G r i e n e n b e r g e r J M , G u a l b e r t o J M ( 1 9 9 8 ) W:
M o l i e r I M , G a r d e s t r o e m P, G l i m e l i u s K, G l a s e r
E (red) Proceedings o f the International Congress on Plant M ito­
chondria: From Gene To Function, Backhuys Publishers, Leiden,
str. 127-130
84. F e a g i n J E (1990) J Biol Chem 265: 19373-19376
85. S l o o f P, B e n n e P (1993) FEBS Lett 325: 146-151
8 6 . V a n d e r S p e k H, S p e i j e r D, A r t s G J , V a n d e n
B u r g J , S t e e g H, S l o o f P , B e n n e R (1990) EM BO J 9:
257-262
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
87.
B l o m D, d e H a a n A, v a n d e n B e r g M , S l o o f P ,
J i r k u M, L u k e s J , B e n n e R (1998) N ucl Acids Res 26:
1205-1213
88. K o s l o w s k y D J , R i l e y G R , F e a g i n J E , S t u a r t K
(1992) M ol Cell Biol 12: 2043-2049
89. B l u m B, S i m p s o n L (1992) Proc Natl A cad Sei USA 89:
11944-11948
90. H e r m a n n T, S c h m i d B, H e u m a n n N , G o r i n g e r
H U (1997) Nucl Acids Res 25: 2311-2318
91. K o s l o w s k y D J , Y a h a m p a t h G ( l 997) M ol Biochem Pa­
ras itol 90: 81-94
92. B o r n e r G V , M o r l M, W i s s i n g e r B, B r e n n i c k e
A, S c h m e l z e r C (1995) M ol Gen Genet 246: 739-744
93. S u t t o n C A , C o n k l i n P L , P r u i t t K D , H a n s o n M R
(1991) M ol Cell Biol 11: 4274-4277
94. C h a p d e l e i n e Y, B o n e n L (1991) Cell 65: 465-472
95. B c g u D, M a r c a d o A, F a r r e J C , M o e n n e A, H o l u ­
i g u e L, A r a y a A, J o r d a n a X (1998) Curr Genet 33:
420-428
96. B i n d e r S, M a r c h f e l d e r A, B r e n n i c k e A, W i s ­
s i n g e r B (1992) J Biol Chem 267: 7615-7623
97. L i p p o k B , B r e n n i c k e A, U n s e l d M ( l 996) Biol Chem
Hoppe-Seyler 377: 251-257
98. I t a n i K, H a n d a H (1998) Curr Genet 34: 318-325
99. S u z u k i T , K a z a m a S, H i r a i A, A k i h a m a T, K a ­
d o w a k i K (1991) Curr Genet 20: 331-337
100. K a r p i n s k a B , K a r p i n s k i S, H a e l l g r e n J E (1995)
Curr Genet 28: 423-428
101. R a n k i n C T , C u t r i g h t M T , M a k a r o f f C A (1996)
Curr Genet 29: 564-571
102. S c h u s t e r W, W i s s i n g e r B, U n s e l d M , B r e n n i c ­
k e A (1990) EM BO J 9: 263-269
103. G u a 1b e r t o J M , B o n n a r d G, L a m a t t i n a L, G r i e ­
n e n b e r g e r J M (1991) Plant Cell 3: 1109-1120
104. G r o s s k o p f D, M u l l i g a n R M (1996) Curr Genet 29:
556-563
105. W i l s o n R K , H a n s o n M R (1996) Curr Genet 30: 502-508
106. L a m a t t i n a L, G r i e n e n b e r g e r J M (1991) Nucl Acids
Res 19: 3275-3282
107. L a m a t t i n a L, W e i l J H , G r i e n e n b e r g e r J M (1989)
FEBS Lett 258: 79-83
108. G e i s s K T , A b b a s G M , M a k a r o f f C A (1994) Mol Gen
Genet 243: 97-105
109. B r a n d t P, S u n k e l S, U n s e l d M, B r e n n i c k e A,
K n o o p V (1992) M ol Gen Genet 236: 33-38
110. K n o o p V, S c h u s t e r W, W i s s i n g e r B, B r e n n i c k e
A (1991) EMBO 7 10: 3483-3493
111. H a o u a z i n e - T a k v o r i a n N , T a k v o r i a n A, J u b i e r
M F , L e j e u n e B (1997) Curr Genet 31: 63-69
112. G a e b l e r L, H e r z U, L i d d e l A, L e a v e r C J , S c h r o e d c r W, B r e n n i c k e A, G r o h m a n n L (1994) M ol Gen
Genet 244: 33-40
113. B o n e n L. W i l l i a m s K, B i r d S, W o o d C (1994) M ol
Gen Genet 244: 81-89
114. C a r i l l o C, B o n e n L (1997) Nucl Acids Res 25: 403-409
115. L a m a 11 i n a L , G o n z a l e s D, G u a l b e r t o J, G r i e ­
n e n b e r g e r J M (1993) Eur J Biochem 217: 831-838
116. G r o h m a n n L, T h i e c k O, H e r z U, S c h r o e d e r W,
B r e n n i c k e A (1994) Nucl Acids Res 22: 3204-3311
117. L u B , H a n s o n M R (1996) Nucl Acids Res 24: 1369-1374
118. N i s h i w a k i S, N a k a z o n o M, T s u t s u m i N, H i r a i A
(1995) Plant Cell Physiol 36: 1 135-1 138
119. B o e r P H , G r a y M W (1988) EM BO J 7: 3501-3508
120. W a h l e i t h n e r J A , M a c f a r l a i n e J L , W o l s t e n h o l m e D R (1990) Proc Natl A cad Sei USA 87: 548-552
121. W i s s i n g e r B, S c h u s t e r W, B r e n n i c k e A (1991) Cell
65: 473-482
122. L e l a n d a i s C , G u t i e r r e s S, M a t h i e u C , V e d e l F,
R e m a c l e C, M a r e c h a l - D r o u a r d L, B r e n n i c k e A,
B i n d e r S, C h e t r i t P (1996) Nucl Acids Res 24: 4798-4804
123. S p a s s o v a M, M o n e g e r F , L e a v e r C J , P e t r o v P,
A t a n a s s o v A, N i j k a m p H J , H i l l e J (1994) Plant Mol
Biol 26: 1819-1831
http://rcin.org.pl
175
124. C o n k l i n P L , W i l s o n R K , H a n s o n M R (1991) Genes
Dev 5: 1407-1415
125. N o z a t o N , O d a K, Y a m a t o K, O h t a E, T a k c m u r a
M, A k a s h i K, F u k u z a w a H, O h y a m a K (1993) Mol
Gen Genet 237: 343-350
1 2 6 . H a n d a H, M i z o b u c h i - F u k u o k a R, P i n y a r a t W
(1997) Curr Genet 31: 336-342
127. L i p p o k B , B r e n n i c k e A, W i s s i n g e r B (1994) Mol
Gen Genet 243: 39-46
128. K im K S , S c h u s t e r W, B r e n n i c k e A, C h o i K T
(1991) Plant Physiol 97: 1602-1603
129. S c h u s t e r W (1993) M ol Gen Genet 240: 445-449
130. N a k a z o n o M, I t a d a n i H, W a k a s u g i T , T s u t s u m i
N, S u g i u r a M, H i r a i A (1995) Curr Genet 33: 188-198
131. Y a m a t o K, N o z a t o N , O d a K, O h t a E, T a k e m u r a
M, A k a s h i K, O h y a m a K (1993) Curr Genet 23: 526-531
132. P r a t j e E, V a h r e n h o l z C, B u h l e r S, M i c h a e l i s G
(1989) Curr Genet 16: 61-64
133. M a r i e n f e l d J R , N e w t o n K J (1994) Plant Physiol 104:
301-302
134. I t a d a n i H, W a k a s u g i T, S u g i t a M , S u g i u r a M,
N a k a z o n o M , H i r a i A (1994) Plant Cell Physiol 35:
1239-1244
135. W i n t z H , C h e n H C , P i l l a y D T N (1989) Curr Genet 15:
155-160
136. L e b l a n c C, B o y e n C, R i c h a r d O, B o n n a r d G,
G r i e n e n b e r g e r J M , K l o a r e g B (1995) J M ol Biol 250:
484-495
176
137. W o l f f G, P l a n t e 1, L a n g B F , K u c k U , B u r g e r G
(1994) J Mol Biol 237: 75-86
138. K r o y m a n n J, Z c t s c h e K (1998) J M ol Evol 47: 4 3 1-440
139. M a l e k O, K n o o p V (1998) RNA 4: 1599-1609
140. K n o o p V, B r e n n i c k e A (1991) Curr Genet 20: 423-425
141. E c k e W, S c h m i t z U, M i c h a e l i s G (1990) Curr Genet
18: 133-139
142. W i s s i n g e r B, H i e s e l R, S c h u s t e r W , B r e n n i c k e
A (1988) M ol Gen Genet 212: 56-65
143. K a t o S, S h i m a m o t o Y, M i k a m i T (1995) Physiol Plant
93: 572-575
144. P e r e i r a d e S o u z a A , J u b i e r M F , L e j e u n e B (1992)
Curr Genet 22: 75-82
145. C h e t r i t P, R i o s R, D e P a e p e R, V i t a r t V, G u t i e r ­
r e s S, V e d e l F (1992) Curr Genet 21: 131-137
146. P e r e i r a d e S o u z a A, J u b i e r M F , D e l c h e r E, L a n c e l i n D, L e j e u n e B (1991) Plant Cell 3: 1363-1378
147. L ’ H o m m c Y, S t a h l R J , L i Q X , H a m e e d A,
B r o w n G G (1997) Curr Genet 31: 325-335
148. N u g e n t J M , P a l m e r J D (1993) Curr Genet 23:148-153
149. N a k a z o n o M, I t o Y , T s u t s u m i N, H i r a i A (1996)
Curr Genet 29: 412-416
150. K u b o T, M i k a m i T , K i n o s h i t a T (1993) M ol Gen Ge­
net 241: 479-482
151. B r e n n i c k e A , K l e i n M , B i n d e r S, K n o o p V,
G r o h m a n n L, M a l e k O, M a r c h f e l d e r A, M a r i e n f e l d J, U n s o l d M (1996) Naturwissenschaften 83: 339-346
152. O h y a m a K (1996) Biosci Biotech Biochern 60: 16-24
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Antyportery Na+/H+ w komórkach ssaczych
Mammalian Na+/H+ exchangers
ANNA KICIŃSKA*
Spis treści:
Contents:
I. Wstęp
II. Ogólna charakterystyka antyporterów Na+/H+
II-l. Rodzina genów kodujących antyportery Na+/H+
(NHE)
II-2. Struktura antyporterów Na+/H + oraz ich lokaliza­
cja
II-3. Podstawowe właściwości biochemiczne i farmako­
logiczne antyporterów Na+/H+
III. Regulacja aktywności antyporterów Na+/H+
III-l. Fosforylacja
III-2. Oddziaływanie z innymi białkami
IV. Funkcja antyporterów Na /H+
IV-1. Antyportery N a+/H+ błony cytoplazmatycznej
IV-1.1. Regulacja wewnątrzkomórkowego pH
IV-1.2. Regulacja objętości komórki
IV-1.3. Transport w komórkach nabłonkowych
IV-2. Antyporter Na+/H+ wewnętrznej błony mitochondrialnej
V. Uwagi końcowe
I. Introduction
II. Basic properties of the Na+/H + exchangers.
II-1. N H E gene family
II-2. Structure, tissue and subcellular distribution of
Na+/H+ exchangers
II-3. Basic biochemical and pharmacological proper­
ties.
III. Regulation of NHE activity.
III-l. Phosphorylation
III-2. Interaction with other proteins
IV. Functional role of Na+/H+exchangers
IV-1. Plasma membrane Na+/H+exchangers
IV-1.1. Regulation of intracellular pH
IV-1.2. Regulation of cell volume
IV-1.3. Transepithelial transport
IV-2. Mitochondrial Na+/H+exchanger
V. Concluding remarks
Wykaz skrótów: CaM — kalmodulina; CHP- (ang. calcineurin
B homolog protein) białko homologiczne z kalcyneuryną B;
ER-retikulum endoplazmatyczne; FGF — fibroblastowy czyn­
nik wzrostu; [H+]w- wewnątrzkomórkowe stężenie H+; [H+]zzewnątrzkomórkowe stężenie H+; HOE694- (3-metylosulfonylo, 4-piperydynobenzoilo) metasulfonian guanidyny; IP3Rreceptor IP3; KD- stała dysocjacji; MAPK — (ang. mitogen ac­
tivated protein kinase) kinaza aktywowana przez mitogen;
MEK- (ang. mitogen/extracellular signaling kinase) kinaza ki­
nazy MAP-Erk; [Na+]w- wewnątrzkomórkowe stężenie Na+;
[Na+]z— zewnątrzkomórkowe stężenie Na+; NHE — antyporter
Na+/H +; NHERF- (ang. N a+/H + exchanger regulatory factor)
białko regulujące aktywność antyportera NHE3; PKA —
białkowa kinaza A; pH j — wewnątrzkomórkowe pH; PKC —
białkowa kinaza C; PTH — parathormon; pz — par zasad; SH3
— region 3 homologii src.
I. W stęp
*Mgr, Pracownia Wewnątrzkomórkowych Kanałów Jonowych,
Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul.
Pasteura 3, 02-093 Warszawa, e-mail anias@nencki.gov.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
A ntyportery N a +/H + (NH E — ang. sodium /proton
exchangers) usu w ają z w nętrza komórki jon y H + z
je d n o cz esn y m pobieraniem jo n ó w N a+. W ym iana
N a +/H + chroni kom órki przed niebezpiecznym za­
kw aszeniem środow iska w ew nątrzkom órkow ego. Z
drugiej strony, zm iany w ew nątrzk om ó rk ow eg o pH
często zapoczątk ow ują zm iany zw iązane z etapem
rozwoju, na którym znajduje się kom órka cz y je j sta­
nem funkcjonalnym . Procesy te m o g ą więc być regu­
low ane poprzez zm iany aktyw ności antyporterów
N a+/H +. W ym iana N a+/H +je s t również bardzo istot­
na dla regulacji objętości kom órki oraz resorpcji j o ­
nów N a + w ko m órkach nabło nko w ych układu p ok ar­
m ow ego i nerek. A ntyport N a +/H + najpraw do po dob ­
niej gra rów nież k luczow ą rolę w uszkodzeniach
ludzkiego m ięśnia sercow ego podczas ischemii i reperfuzji [ 1 ].
A kty w no ść antyportu N a +/H + została zaobserw o ­
w ana we w szystkich dotychczas przebadanych k o ­
m órkach eukariotycznych (kom órki grzybów [2 ],
zw ierząt [3-7] i roślin [ 8 , 9]), ja k również w k o m ó r­
http://rcin.org.pl
177
kach prokariotycznych [10]. E ukariotyczne antyportery N a +/H + w yk azu ją je d n a k niew ielkie po d o b ień ­
stwo do bakteryjnych białek NhaA i NhaB opisanych
Białka NH E1- 5 w yk a zu ją dość znaczne podo­
bieństwo pod w zględem sekwencji am inokwasowej
( - 3 4 — 60% identycznych am inokw asów ), a ich
u E scherichia coli [11]
Ponieważ białka N H E biorą udział w tak wielu
podstaw ow ych dla funkcjonow ania organizm u p ro ­
cesach, ich aktyw ność je s t bardzo ściśle regulow ana
przez różne czynniki, takie jak: hormony, czynniki
wzrostu, jo n y w apniow e oraz czynniki fizyczne takie
jak zm iany objętości kom órki [12]. W sp olaryzow a­
nych kom órkach nabło nko w ych aktyw ność antyportu N a+/H + obserwuje się zarów no w błonach bazolateralnych ja k i apikalnych. Białka N H E w ystępujące
w każdej z nich pełnią odm ienne funkcje i w yk azu ją
charakterystyczne w łaściw ości zarów no kinetyczne,
biochem iczne ja k i farm akologiczne.
przew idyw ana m asa cząsteczkow a wynosi od 81 do
93 kDa [3],
Izoform a N H E 6 będąca białkiem m itochondrial-
Do tej pory udało się scharakteryzow ać i poznać
sekwencję am ino k w aso w ą sześciu białek z rodziny
NHE (oznaczonych skrótem N H E oraz liczbą od 1 do
6 ), z których pięć (NHE1 — 5) katalizuje transport
kationów w błonach plazm aty czn ych kom ó rek ró ż­
nych typów, a jed n o je s t białkiem w ew nętrznej błony
m itochondrialnej (N H E 6 ).
II.
O gólna charak terystyk a antyporterów
N a+/H +
II-l. Rodzina genów kodujących antyportery
N a /H + (NHE)
Poszczególne izoform y antyporterów N a+/H +
(NHE 1- 6 ) kodow ane s ą p r z e z osobne geny, położone
M iejsce
w iązania
Miejsce trawienia
przez peptydazę
sygnałową
Domeny
transbłonowe
amiiorydu
dzialnych za transport jo n ó w [19]. Gen N H E6 zaw ie­
ra otw artą ram kę odczytu o długości 2 0 1 0 pz., a prze­
w idyw ana m asa cząsteczkow a białka wynosi 74 kDa
[19].
11-2. Struktura antyporterów Na+/H + oraz ich loka­
lizacja
Opierając się o badania hydrofobow ości antypor­
terów N a+/H + w ykazano, że ich cząsteczki są p o do b­
nie zbudow ane. Składają się m ianow icie z dwóch
funkcjonalnych domen, hydrofobow ej zawierającej
kilka transbłonow ych sekwencji oraz hydro filo wej
odpowiadającej za regulację ich aktywności trans­
portowej (Ryc. 1). Część N -końcow a białek NHE
składa się z 1 0 do 1 2 dom en transbłonow ych (M lM12 Ryc. 1) i katalizuje w rażliw ą na am iloryd w y ­
mianę N a+/H + [20]. P ozostałą część białek NHE sta­
nowi stosunkow o długa (ok. 300 am inokw asów )
[2 1 ], zlokalizow ana w cytoplazm ie komórki (lub w
matriks m itochondrialnej w przypadku N H E 6 ) d o ­
mena C -końcow a. D om ena C -końcow a m itochon-
Ryc. 1. Schemat budowy struktural­
nej antyporterów N a7H +.
Domena hydrofobowa skła­
dająca
się
z
domen
Domena
transbłonowych
M
l
—
M 12
hydrofobowa
oraz domena hydrofilowa z
licznymi miejscami regula­
torowymi. M6 i M7- najbar­
dziej konserwatywny frag­
ment sekwencji antyporte­
Domena
rów N a’/H +, związany z
hydrofilow a
transportem jonów, M4 i M9
— domeny prawdopodobnie
odpowiedzialne za hamowa­
nie antyporterów przez ami­
M iejsca regulatorowe
loryd.
w różnych rejonach gen om ó w ssaków [13-17]. Nie
w ystępują przypadki alternatyw nego składania (ang.
sp licin g ) pojedynczych transkryptów m R N A [3], Je­
dynie w przypadku szczurzego białka NHE2 w y iz o ­
lowano alternatywne m R N A , kodujące białko p o z b a ­
wione 116 N -końcow ych am inok w asów [18].
178
nym w ykazuje znacznie n iż s z ą h o m o lo g ię sekwencji
do pozostałych białek tej rodziny ( - 2 0 %) z tym, że
podobieństw o zostaje zachow ane w największym
stopniu w obrębie dom en transbłonow ych o dpo w ie­
drialnego białka NHE je s t krótsza i składa się z około
170 am inokw asów [19].
Dom eny C -koncow e poszczególnych białek NHE
są do siebie podobne w znacznie m niejszym stopniu
niż części hydrofobow e, zaw ierają bowiem od - 2 4
do 56% identycznych am inokwasów . W cześniejsze
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
badania w skazyw ały, iż dom eny te są zlokalizow ane
w cytoplazm ie kom órek [3]. Ostatnio jed n ak w y k a ­
zano, że część dom eny C-końcow ej białka NHE3 jest
obecna na zew nątrz kom órki [22]. Już w stępne d o ­
świadczenia pokazyw ały, że d om ena C -końcow a antyporterów N a +/H + odpow iada za regulację ich ak­
tywności transportow ej poprzez oddziaływ anie z d o ­
m eną transbłonow ą. U sunięcie cytoplazm atycznej
części białka p ow oduje zanik ich wrażliw ości na sty­
mulację h o rm o n aln ą oraz zm ienia w rażliw ość białek
NHE na w e w n ątrzko m ó rk ow e stężenie jo n ó w H +
[20]. C -końcow e fragm enty białek NE1E zaw ierają
liczne m iejsca potencjalnej fosforylacji oraz se­
kwencje od pow iedzialne za oddziaływ anie antyporterów z białkam i regulującym i ich aktyw ność [23].
Dom ena C -końcow a białka N H E 2 zaw iera dw a re ­
giony (Pro-1 i Pro-2) szczególnie bogate w prolinę,
podobne do dom en hom ologii 3 src (SH3 — ang. srchom o lo g y-3 bin d in g d o m a in s) [24]. Rejon Pro-1
wiąże in vitro dom eny SH3 różnych białek, n ato ­
miast Pro-2 oddziałuje raczej z dom enam i kinaz
białkowych. N astępnie w ykazano, że region Pro-1
jest niezbędny, aby antyporter N H E2 był zlok alizo­
w any w błonie apikalnej kom ó rek nabłonkow ych. W
kom órkach, w których zachodzi ekspresja białek
NHE2 niezaw ierających dom en y Pro-1, antyportery
w y stęp ują w błonie kom órkow ej po stronie bazolateralnej oraz w cytoplazm ie kom órek [24].
cD NA izoform N H E z błony plazm atycznej z a ­
wiera sekw encję kodującą, tzw. peptyd sygnałowy,
składający się z am inokw asów hydrofobow ych i h y ­
drofitowych, zaw ierający m iejsce potencjalnego tra­
wienia przez peptydazę s y g nałow ą (Ryc. 1) [25]. Nie
jest jeszcze jasn e, czy peptyd sygnałow y jest u su w a­
ny podczas procesu dojrzew ania białek NHE, czy
m oże stanowi integralną część dojrzałego antyportera, zak otw iczającą białko w błonie plazm atycznej.
Z kolei, na N -końcu sekwencji białka N H E 6 , przy
pom ocy program u PSORT [26], znaleziono s ek w e n ­
cję kierującą to białko do wewnętrznej błony mitochondrialnej. M itochondrialna lokalizacja N H E 6 z o ­
stała rów nież potw ierdzona w kom órkach transfekowanych białkiem fuzyjnym składającym się z białka
N H E 6 oraz fluoryzującego białka GFP (ang. green
flu o r e s c e n t p ro tein ) [19]. Z najdujące się w N - k o ń c o wej części antyporterów N a +/H + transbłonow e helisy
M 6 i M7 (Ryc. 1) stanow ią rejon najbardziej k o n ser­
w atyw ny poszczególnych izoform N H E (do 95%
identycznych am inokw asów ), co sugeruje, że je s t to
rejon bezpośrednio zaangażow any w transport jonów. F a f o u r n o u x i w s p . [27] wykazali, że w
NHE1 zastąpienie glutam inianu 262 w dom enie M7
przez izoleucynę (Glu262Ile) prowadzi do całk ow i­
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
tego zaham ow ania transportu jo n ó w przez ten anty­
porter (m ierzono pobieranie jo n ó w 2 2 N a+) [27].
Antyportery N a +/H + najpraw dopodobniej w y stę­
pu ją w błonach plazm aty czn ych w postaci homodim erów [27, 28]. D okładne m iejsca oddziaływania
m o nom eró w nie zostały je d n a k jeszcze zidentyfiko­
wane. W iadom o, że istotną, dla tego oddziaływania,
rolę gra rejon transbłonow y białek N H E oraz p ra w ­
dopodobnie pow stające pom iędzy m onom eram i
w iązania dw usiarczkow e [28].
W sekwencji antyporterów N a +/H + znaleziono k il­
ka miejsc potencjalnej glikozylacji. Białko NHE1
zaw iera am inokw asy zarów no N- (Asn75) ja k i
O -glikozylow ane [21, 24]. Z kolei NHE2 p o ­
chodzące z tkanek królika ulega wyłącznie O-glikozylacji [16], a N H E3 praw d op odo bnie nie jest wcale
glikozylow ane [29]. U sunięcie podjednostek w ę g lo ­
w o danow ych z białek NHE1 i N H E2 nie p o w o d o ­
wało jed n ak w idocznych zm ian w szybkości trans­
portu jo n ó w ani przez błony pęcherzyków lipido­
w ych, ani w transfekow anych kom órkach [16, 25,
30]. R ów nież w części N -końcow ej białka N H E 6
znaleziono m iejsce m ogące ulec N-glikozylacji
(A sn 369) [19].
m R N A izoformy NHE1 ulega ekspresji p rak tycz­
nie we w szystkich tkankach (Tabela 1) i kom órkach
Tabela 1
Lokalizacja tkankowa poszczególnych izoform antyporterów Na+/H+
Izoforma
Lokalizacja tkankowa
Bibliografia
W szystkie przebadane rodzaje ko­
mórek i tkanek, błony bazolateralne i apikalne
[3]
NHE1
Nabłonki kanalików nerkowych,
jelita i żołądka, błony bazolateralne i apikalne
[14],[15],[31]
NHE2
Nabłonki jelita, nerek (kanaliki
proksymalne), i żołądka, błony
apikalne
[14], [29], [31]
NHE3
NHE4
Żołądek, jelito >ncrki, mózg, m a­
cica, mięśnie szkieletowe
[14]
NHE5
Mózg, śledziona, jądra
[32], [33]
NHE6
Mózg, mięśnie szkieletowe, serce
[19]
ssaczych. P raw dopodobnie białko to pełni funkcje w
tak podstaw ow ych procesach ja k utrzym yw anie i re­
gulacja w e w nątrzk om órk ow ego pH oraz regulacja
objętości kom órki [3], W ykazano, że prom otor genu
NH E1 jest aktyw ow any in vitro pod wpływem wielu
czynników m itogennych, a więc że aktywność N H E 1
m oże być regulow ana w p rocesach wzrostu i różni­
http://rcin.org.pl
179
cowania się kom órek poprzez w zrost poziom u ek s­
presji białka [34],
Izoformy NHE2, 3 i 4 charakterystyczne są dla k o ­
m órek nabłonkow ych, głów nie układu p o k arm o w e­
go i nerek [2, 14, 15]. W ykazano, że izoform a NHE2
w kom órkach nabłonkow ych je s t odpow iedzialna za
utrzym yw anie i regulację w ew n ątrzk om órk ow ego
pH oraz regulację objętości kom órki [35]. S tw ier­
działach k om órkow ych [43, 44]. W iadom o na
przykład, że izoforma NHE3 jest obecna w endosomach (ang. recycling en d osom es). [45], Najnow sze
badania w ykazały również, że internalizacja białka
NHE3 zachodzi przy udziale pęcherzyków klatrynow ych [24]. Regulacja aktywności NHE3 przez parathorm on (PTH) zależy od zm ian rozm ieszczenia
białek antyportera [46]. I tak, pod w pływ em para-
dzono, że stres osm otyczny m oże regulow ać poziom
ekspresji NHE2 w kanalikach zbiorczych nerek [36].
Ostatnio zidentyfikow ano w obrębie p rom otora genu
N H E2 dwie sekwencje od pow iedzialne za tę reg u la­
thorm onu gw ałtow nie spada aktyw ność NHE3 w k a­
nalikach proksym alnych nerek szczura, co jest
zw iązane ze spadkiem ilości białka w błonach apikalnych kom órek, a nie całkowitej ilości NHE3 w
cję [37]. Białko NHE3 ulega ekspresji w kom órkach
nabłonka jelita oraz k analików prok sy m aln ych n e­
tych kom órkach. R ów nież antyporter N a+/H + z dro­
żdży, zw any N h x l , w ystępuje w pęcherzykach pre-
rek, zawsze po stronie apikalnej [29, 38]. P raw d o p o ­
dobnie NHE3 uczestniczy w absorpcji jo n ó w N a + w
tych komórkach.
Izoforma N H E 4 w najw iększych ilościach jest
syntetyzowana w kom ó rkach nabłonka żołądka oraz
kanalików zbiorczych nerek, praw d opo dob nie p o ­
zwalając na zachow anie stałej objętości kom órkom
narażonym na stały kontakt ze stężonym i roz tw o ra­
mi [14, 39].
Ekspresję białka N H E5 obserw uje się w k o m ó r­
kach mózgu, śledziony, ją d e r i m ięśni szkieletow ych
w akuolarnych, odpow iadających późnym endosom om w kom órkach zw ierzęcych. [47],
W ystępow anie na N-końcu białka N H E 6 sekw en­
cji kierującej do m itochondriów wskazuje, że białko
N H E 6 m oże być antyporterem w ew nętrznej błony
mitochondrialnej [19]. O bserw acje pokazujące, że
ekspresja tego antyportera zachodzi we wszystkich
przebadanych tkankach oraz, że jej poziom jest
szczególnie wysoki w tkankach bogatych w m ito­
[17]. N ajpraw dopodobniej, to właśnie NHE5 je s t
niew rażliw ym na am iloryd antyporterem N a +/H +,
którego aktyw ność obserw ow ano w neuronach
hippokam pa [40].
M itochondrialny antyporter N a +/H + (białko
N H E 6 ) ulega ekspresji we w szystkich badanych
tkankach z tym, że ilość m R N A je s t najw yższa w
tkankach szczególnie bogatych w m itochondria, ta ­
kich jak mózg, mięśnie szkieletow e i serce [19].
Badania z zastosow aniem przeciw ciał oraz frak­
cjonowania kom órek wykazały, że antyportery
Na+/H + nie są rów nom iernie zlokalizow ane w błonie
plazmatycznej komórek. Np. białko NHE1 grom adzi
się w okolicy lam ellipodiów w fibroblastach
rosnących w m onow arstw ie, w m iejscach, w których
dochodzi do asocjacji takich białek ja k winkulina, talina i F-aktyna [41 ]. O bserw acje te zdają się w sk az y ­
wać, że białko NHE1 m oże oddziaływ ać ze szkiele­
tem kom órkowym . Ostatnio w ykazano, że cytoszkielet aktynowy jest czynnikiem w pły w ającym na ro z­
m ieszczenie białka NHE3 w błonie plazm atycznej
[42], Substancje pow odujące depolim eryzację F-aktyny w dużym stopniu h am ow ały aktyw ność NHE3
oraz pow odow ały jeg o ak um ulację w miejscach
agregacji aktyny [42],
Na podstaw ie w yników badań funkcjonalnych
przypuszczano, że antyportery N a +/H + są obecne,
poza błoną plazm atyczną, rów nież w innych p rz e­
180
chondria, potw ierdzają te przypuszczenia [19], Do­
datkowo pokazano, że sygnał lokalizacji m ito c h o n ­
drialnej na N -końcu białka N H E 6 wystarcza, aby
białka fuzyjne N H E 6 -GFP były transportow ane do
m itochondriów transfekow anych komórek. A ntypo r­
ter N H E 6 usuwa jo n y N a+ z m atriks m itochon drial­
nej, co ma praw dopodobnie ogrom ne znaczenie dla
regulacji stężenia jo n ó w C a2+ w m itochondriach
(por. Rozdz. IV-2) [48].
II-3. Podstawowe właściwości biochem iczne i
farm akologiczne antyporterów Na+/H +
Zależność szybkości transportu N a + i H + przez
białka N HE od zew n ątrzko m órk ow ego stężenia N aT
spełnia równanie M ichaelisa-M enten. O bserw acja ta
sugeruje obecność jed n eg o m iejsca wiązania jonó w
N a + w białkach N H E [49]. P odo bną zależność obser­
wuje się rów nież w przypadku białka N H E 6 z m ito ­
chondriów [50]. Zależność szybkości transportu od
stężenia jo n ó w N a + izoformy N H E 4 ilustruje krzywa
sigm oidalna [51], Stała M ichaelisa-M enten K m dla
poszczególnych izoform wynosi 5-50 mM [52, 53],
Inne kationy jedn ow a rtościow e także w p ływ ają na
aktywność białek NHE. Li+ i H+ p odane zewnątrzkom órkow o kom petencyjnie h am u ją pobieranie N a +
[54],
Jedn ą z podstaw ow ych cech antyporterów N a+/ H f
jest ich w rażliw ość na w ew nątrzk om órk ow e stężenie
H +. Protony są allosterycznym i aktyw atoram i białek
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
NHE. A ktyw ność antyporterów gw ałtow nie rośnie,
gdy wartość w ew nątrzko m órko w ego pH spadnie p o ­
niżej określonego poziom u progow ego, pow odując
usuw ania nadm iaru jo n ó w H + z w nętrza komórki
[55]. C echa ta je s t w spólna dla wszystkich d otych ­
czas zbadanych izoform (NHE 1-3) z tym, że wartość
stężenia progowego je s t charakterystyczna dla p o ­
szczególnych antyporterów [49]. Badanie w y k o rz y ­
stujące syntezę zm utow anych antyporterów w y k a ­
zały, że rejon N -końcow y białek N H E jest o d pow ie­
dzialny za ich w rażliw ość na stężenie jo n ó w H +, p o d ­
czas gdy dom eny odpow iedzialne za wartość stęże­
nia progow ego znajdują się w cytoplazm atycznej
części białek (Ryc. 1 i 2) [20],
Z arów no dane kinetyczne, ja k i term odynam iczne
(przy stężeniach jo n ó w [Na+]z/[N a+]w = [H +]Z/[H +]W
przepływ jo n ó w przez antyport je s t niezauw ażalny
[56]) wskazują, że antyportery N a +/H + transportują
jo n y w sposób elektroneutralny (stechiom etria 1 : 1 )
[56]. R eakcja transportu jo n ó w je s t odw racalna i za­
leży od chem icznego gradientu N a + i H+ w poprzek
błony, nie w ym agając b ezpośredniego w kładu ener­
gii np. pochodzącej z hydrolizy ATR
A ktyw ność antyporterów N a +/H + je s t ham ow ana
przez m oczopędny lek, am iloryd oraz jego pochodne
[57], a także przez zw iązki benzoiloguanidynow e
(np. H O E694) [58, 59]. A ktyw n ość poszczególnych
izoform w różnym stopniu je s t ham ow ana przez te
związki, najbardziej w rażliw a je s t iz o f o r m a N H E l , a
następnie NHE2, NHE3 i N H E 4 [51, 58, 60, 61]. Z
kolei izoforma m itochondrialna, N H E 6 jest p ra k ­
tycznie niewrażliwa na am iloryd, natom iast jego
analog — benzam il ham uje N H E 6 [50, 52, 62]. Inne
substancje zawierające grupy im idazolinow e lub guanidynow e, a więc strukturalnie podobne do amilorydu lub HOE694, takie ja k cim etydyna, klonidyna i
harm alina również w różnym stopniu h am u ją ak ty w ­
ność białek NHE [60].
H am ow anie aktywności antyporterów N a +/H +
p rzez am iloryd i inne wyżej w ym ienione związki jest
częściow o odwracalne w przypadku dużego
zew nątrzkom órkow ego stężenia jo n ó w N a +. W
zw iązku z tym do niedaw na uw ażano, że m iejsca
w iązania inhibitorów są położone w bezpośrednim
sąsiedztw ie dom eny odpow iedzialnej za transport j o ­
nów. Wykazano jednak, że am inokw asy w d om enach
transbłonow ych M4 i M 9 odpow iedzialne są za w ra­
żliw ość białek N H E na am iloryd i jeg o po chodne
[63] oraz, że nie jest to rejon bezpośrednio zw iązany
z transportem jo n ó w (Ryc. 1).
W ydaje się, że ATP jest rów nież niezbędne dla
praw idłow ego
funkcjonow ania
antyporterów
N a +/H +. Obniżenie w ew n ątrzk om órk ow eg o poziom u
POSTĘPY BIOCHEMII 46(2), 2000
ATP drastycznie obniża aktyw ność N H E zarówno w
system ach natyw nych ja k i w transfekow anych k o ­
m órkach [3, 35, 64]. W ydaje się, że podłożem tych
zm ian jest zm iana w rażliw ości antyportera na stęże­
nie jo n ó w H + [3]. Początkow o przypuszczano, że
efekt ATP wiąże się ze stanem fosforylacji białek
NHE. Jednak, po niew aż brak A TP ham uje również
aktyw ność cząsteczek N H E p ozbaw ionych w szy st­
kich miejsc potencjalnej fosforylacji, przypuszcza
się, że ham ujący efekt A TP nie je st bezpośredni [65].
P raw dopodobnie istnieją d odatkow e białka wiążące
się z białkam i N H E, których w pływ na aktywność
transporterów zależy od pozio m u fosforylacji.
III. R egulacja ak tyw ności antyporterów
N a+/H +
A ktyw ność białek N H E zm ienia się pod w pływ em
wielu czynników, takich ja k hormony, czynniki
wzrostowe, zm iany w ew n ątrzk om órk ow eg o stężenia
jo n ó w w odo row ych i w ap nio w ych oraz zm iany obję­
tości kom órki [23]. R egulacja ta zachodzi poprzez
bezpośrednie zm iany poziom u fosforylacji antypor­
terów N a+/H + lub poprzez oddziaływ anie antyporte­
rów ze specyficznym i białkam i regulatorowym i
(Ryc. 2). W przypadku p ow szechnie występującej
izoformy NHE1 czynniki zew nątrzkom órkow e naj­
praw dopodobniej zw iększają pow inow actw o tego
białka do w e w nątrzk om órk ow ych jo n ó w H + [ 6 6 ],
R egulacja aktywności pełniących odm ienne funkcje
izoform epitelialnych (NH E2 i N H E 3) zachodzi p o ­
przez zm iany szybkości m aksym alnej transportu
(R m ax)
[49]. ’
III-l. Fosforylacja
Białka N H E z błon plazm atycznych zaw ierają
liczne m iejsca potencjalnej fosforylacji przez
białkow e kinazy A i C, k inazę kalm oduliny oraz k i­
nazy Ser/Thr [4]. R ów nież białko N H E 6 zawiera
w iele miejsc potencjalnej fosforylacji przez kinazy
białkowe zależne od cyklicznych nukleotydów oraz
kinazę kazeiny II [19].
Eksperym entalnie dow iedziono, że białko NHE1
je st fosforylow ane w kom órce spoczynkowej w
m niejszym stopniu niż w kom órce funkcjonalnie
zmienionej po podaniu takich substancji jak czynniki
wzrostowe, estry forbolu czy inhibitory fosfataz [3].
Poniew aż wiele z tych c zynników w yw iera w pływ na
kom órki docelow e p oprzez aktyw ację kinaz białk o­
wych, początkow o uważano, że białka N H E są b e z ­
pośrednio fosforylow ane i w ten sposób regulow ana
jest ich aktywność. O kazało się jednak, iż większość
http://rcin.org.pl
181
substancji regulujących zachow uje zdolność do re ­
gulacji aktywności zm u tow any ch białek N H E p o ­
Cząsteczka N H E2 zawiera praw dopodobnie kilka
subdom en
regulatorowych.
Np.
am inokwasy
zbawionych miejsc fosforylacji, a część wcale nie
zm ienia stopnia u fosforylow ania białek N H E [3].
W ykazano także, że kinazy M A P K (ang. m itogenactiva ted p ro tein kin a se) 4 4 kD a oraz p 9 0 rsk (Ser703)
fosfory luj ą rejon obejm ujący 178 C -końcow ych a m i­
nokw asów NHE1 jedn o cz eśn ie regulując aktyw ność
białka [67, 6 8 ]. Kinaza p 9 0 rsk najpraw dopodobniej
bierze udział w regulacji aktyw ności białka NHE1
poprzez endotelinę I w m iocytach z serca szczura
[67]. R ów nież aktyw acja antyportera NHE1
związana z aktyw acją receptora kannabinoidow ego
przebiega praw d op odo bnie z udziałem kinaz M A P K
p42/44 [69],
540-573 są odpow iedzialne za w rażliw ość NHE2 na
inhibitory fosfataz, rejon 499-540 zw iązany jest z re ­
gulacją prze FGF. W tej chwili nie w iadom o, czy
wpływ tych substancji na antyporter NHE2 ma
zw iązek ze zm ianami w poziom ie
fosforylacji
N H E2, czy raczej jest zw iązany z fosforylacją dodat­
kowych białek regulatorow ych [70].
Izoform a NHE3 je st regulow ana przez wiele
czynników pow odujących pow stanie w tórnych prze­
kaźników aktyw ujących b iałk o w ą kinazę C [71].
W ykazano, że białko NHE3 je s t bezpośrednio fosforylow ane przez PKC [72], Do zw iększenia poziom u
fosforylacji oraz znacznego zah am o w ania ak tyw no­
ści białka NHE3 dochodzi także pod w pływ em zw ię­
kszonego stężenia cA M P w kom órce [3].
III-2. O ddziaływanie z innym i białkam i
Ryc. 2. Schemat przedstawiający miejsca regulatorowe w domenach
hydrofitowych białek NHE 1, 2, 3 oraz białka wpływające na
aktywność antyporterów. F-domena odpowiadająca za wrażli­
wość białek NHE na zmiany objętości komórki ( V+: aktywacja,
V-: hamowanie); / / f-domena określająca progowe stężenie H+,
które powoduje aktywację antyportera; CaM (1, 2) CHP,
E3KARP, N H ERF — miejsca wiązania białek regulatorowych,
odpowiednio kalmoduliny (CaM), CHP, E3KARP i NHERF;
Pro-1 i Pro-2 — regiony bogate w prolinę; P - miejsca fosfory­
lacji; PKA-kinaza białkowa A; PKC-kinaza białkowa C;
MAPK 42/44kDa, p90rsk- kinazy MAP.
Także dom ena C -końcow a białka N H E2 zawiera
sekwencje odpow iedzialne za w rażliw ość tego
białka na czynniki w zrostu/kinazy białkowe [70],
Izoforma ta je s t aktyw ow ana m.in. przez surowicę,
FGF, inhibitory fosfataz i estry forbolu [70].
182
D om ena cytosolow a białka NHE1 zawiera dwie
dom eny wiążące kalm odulinę z w ysokim (K D ~ 2 0
nM ) i niskim p o w ino w actw em (KD~350nM ) [73].
Delecja pierw szego z tych rejonów (aminokwasy
636-656) pow oduje ko nstytu tyw n ą aktyw ację anty­
portera, p o do bn ą do obserw ow anej, kiedy stężenie
C a2+ w kom órce je s t stale podniesione. Sugeruje się
więc, że przy norm alnym stężeniu C a2+ przy braku
wiązania kalm oduliny przez antyporter jego ak tyw ­
ność zm niejsza się, podczas gdy przyłączenie kalm o ­
duliny do NHE1 pod w pływ em w zrostu stężenia C a 24
w kom órce prowadzi do aktywacji transportera
(Ryc. 2). Także aktywność izoform y NHE2 jest regu­
lowana przez kalmodulinę. Praw dopodobnie w o bec­
ności podw yższonego stężenia jo n ó w C a 2+ w k om ór­
ce dochodzi do zw iązania się kalm oduliny z antyporterem NHE2 oraz do zw iększenia jeg o aktywności
poprzez zw iększenie zarów no szybkości m aksym al­
nej transportu Vmax, ja k i po w in ow actw a antyportera
dla jo n ó w H+ [70]. Wykazano również, że w p ro w a­
dzenie dom eny wiążącej kalm odulinę 636-656
białka NHE1 do części cytosolowej białka NHE3 p o ­
w oduje powstanie wrażliwości na stężenie jo nów
C a2+ w tym białku [74].
R ównież białko hom ologiczne z k alcyneuryną B
(ang. CHP — calcineurin B hom olog protein ) od ­
działuje z fragm entem C -końcow ym antyportera
NHE1 [75]. Zw iązanie ufosforylow anego białka
CHP z antyporterem pow oduje jeg o inaktywację. Z
kolei defosforylacja CHP prowadzi do jego oddysocjowania oraz do aktywacji NHE1 [75],
Wykazano również wiązanie białka opiekuńczego
hsp70 z antyporterem NHE1 [76], M ożliwe, że o d ­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
działywania to ma m iejsce jed y n ie podczas biosynte­
zy NHE 1. Jednak, poniew aż w iązanie to jest o d w ra­
cane przez M gA TP , być m oże bierze ono udział w re ­
gulacji NHE1 przez ATP.
A ktyw ność antyportera NHE3 znacznie spada pod
wpływem aktywacji kinazy białkowej zależnej od
cAMP [77, 78]. Efekt ten być m oże zależy od o b ec­
ności dw óch strukturalnie po dobnych białek, z w a ­
nych N H E R F i E3KARP, które m o g ą wiązać się z
fragm entem dom eny C-końcow ej NHE3 [79], O k a­
zało się również, że dla obniżenia aktyw ności białka
NHE3 w tych w arunkach jed n o cz eśn ie konieczna
jest b ezpośrednia fosforylacja Ser 6 0 5 oraz obecność
Ser 6 3 4 w dom enie C -końcow ej N H E3 [80]. Poniew aż
oba te am inokw asy znajd ują się w rejonie, w którym
praw dopodobnie dochodzi do interakcji pom iędzy
białkami N H E R F i E 3K A R P a N H E 3, m ożna p rz y ­
puszczać, że Ser 6 3 4 jest konieczna dla tego o d ­
działywania. D odatkow o w ykazano, że zarówno
NHERF, ja k i E3K A R P w iąż ą ezrynę — białko
będące składnikiem szkieletu ko m órkow ego, które
zakotw icza P K A w błonie kom órkow ej [81]. Być
może białka N H E R F i E 3K A R P p o w o d u ją zbliżenia
PKA do dom eny C -końcowej NHE3, która następnie
ulega fosforylacji w efekcie zw iększonego stężenia
cAM P w kom órce.
O pisano
także
o d d ziały w a n ie
p om iędzy
białkiem N H E R F a re cep to re m [3-adrenergicznym
zależne od zw iązania adrenalin y lub n o rad renalin y
z recep torem [82]. N H E R F w iąże się z kilko m a
ostatnimi am in o k w asa m i receptora. Zastąpienie
ostatniego am in o k w asu recepto ra leucyny alan in ą
po w oduje zn aczne o słab ienie tego od działyw a n ia
oraz zaburza reg ulację N H E3 przez recep to r p,
jed n o c z e śn ie nie w p ływ ając na aktyw n ość cyk lazy
adenylow ej [82], Jest to bardzo ciekaw y przykład
innego niż klasyczny (p oprzez a k ty w a cję białek G i
cyklazy adeny low ej) w p ły w u p ob u d ze n ia recep tora
z P -ad renergicznego na m etab o lizm kom órki. O b ­
serw acje te m o g ą tłu m aczyć fakt, że w przypad ku
aktywacji recep tora P-adrenerg iczneg o i b e z p o ś re d ­
niej aktyw acji PKA o b serw uje się p rzeciw staw ne
efekty odp ow iedn io akty w a cję [83] i ham o w a n ie
aktyw ności N H E3 [84],
Także białka G b io rą p raw d o p o d o b n ie udział w re ­
gulacji transportu jo n ó w przez białka NHE. Pod
w pływ em białek Ha-Ras i G a 13 wzrasta aktywność
antyporterów N HE [85, 8 6 ]. Praw dopodobnie m e ­
chanizm tej aktywacji prow adzi poprzez kaskadę sy­
gnałów zw iązaną z kinazam i M A P K 42/44kD a oraz
k inazą M EK (ang. m ito g en /extra cellu la r sig n a lin g
kinase) [87, 8 8 ],
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
W kom órkach, które znajdują się w środowisku
hiperosm otycznym dochodzi do aktywacji antypor­
terów N H E1, N H E2 i N H E 4 [35], Zjawisko to nie
jest jed n ak zw iązane ze zm ianam i poziom u fosfory­
lacji białka, ani z gw ałtow nym i zm ianami stężenia
jo n ó w C a2+ [3]. P raw dopodobnie oddziaływanie
białka N H E 1 z nieznanym i białkam i regulatorowym i
jest odpow iedzialne za w rażliw ość tego antyportera
na zm iany objętości komórki.
A ktyw ność białka NHE1 w zrasta również w k o ­
m órkach hodow any ch na szalkach pokryw anych fib ro nektyn ą [89]. Jest m ożliwe, że na obserwowany
wzrost aktywności NHE1 w pływ w yw iera
od­
działywanie fibronektyny z integrynam i [90]. Integryny k otw iczą m ikrofilam enty aktynowe do błony
plazm atycznej poprzez oddziaływ anie z taliną i a - a k ty n ą o ra z białkam i szkieletu kom órkow ego. W tym
świetle interesujące jest, że NHE1 m oże zostać w y ­
izolow any w spólnie z F-aktyną, w ink uliną i taliną
[41].
IV.
F unkcja antyporterów N a+/H +
IV-1. A ntyportery N a+/H + błony cytoplazm atycznej
IV-1.1. R egulacja w ew nątrzkom órkow ego pH
Jony w odorow e są aktyw nie usuwane z kom órek
zw ierzęcych zapew niając zachow anie fizjologicznej
wartości w ew nątrzk om órk ow ego pH. Transport j o ­
nów przez antyportery N a +/H + stanowi jeden z g łó w ­
nych m echanizm ów usuw ania jo n ó w H+ z wnętrza
komórek. W kom órkach nieepitelialnych aktywność
transporterów N a +/H + je s t bardzo niska w fizjolo­
gicznym pH, jed n ak gw ałtow nie wzrasta po za k w a­
szeniu cytosolu. O czyw iście, ja k ju ż wcześniej o p i­
sano (Rozdz. II-3. i III.), w rażliw ość na stężenie j o ­
nów H+ może być m odyfikow ana poprzez np. niskie
stężenie ATP w kom órce, czynniki w zrostowe czy
stres osmotyczny. Wydaje się, że regulacja ak tyw no ­
ści antyportera N H E 1 przez pH; je s t jedn ym z cz y n ­
ników prow adzących do p ow stania niekorzystnych
zmian w m ięśniu sercow ym podczas niedokrw ienia i
reperfuzji [91]. Podczas niedokrw ienia dochodzi do
znacznego obniżenia pH cytoplazmy, aktywacji an­
typortera i w zrostu stężenia N a +. Przy jednoczesnym
niskim poziom ie ATP w kom órk ach serca, czyli za­
ham ow aniu ATPazy N a+/K + , jo n y N a+ są usuwane
przez antyporter N a+/C a 2+. W czasie niedokrw ienia i
późniejszej reperfuzji gw ałtow nie wzrasta stężenie
jo n ó w C a2+ w cytoplazm ie m iocytów, co prowadzi
http://rcin.org.pl
183
do arytmii, uszkodzeń m ięśnia sercow ego i nekrozy
kom órek [92].
IV-1.2. R egulacja objętości kom órki
Objętość kom órek zw ierzęcych je s t regulow ana
przez kontrolow any przepływ jo n ó w do i na
drialne stężenie C a2+ jest kontrolow ane przez
w spółdziałanie trzech m echanizm ów transp or­
tujących. N ale żą do nich: uniport C a2+ oraz antyporty N a+/C a 2+ i N a +/H + (białko N H E 6 ) zlokalizow ane
w wewnętrznej błonie m itochondrialnej (Ryc. 3)
Ca2*
Na+
zewnątrz kom órki. U suw anie na zew nątrz komórki
K + i Cl* zapobiega pęcznieniu, a pobieranie ze środo­
wiska zew nętrznego N a + i Cl' zm niejszaniu się o b ję­
tości kom órki [93]. W przypadku kom órek wielu ty ­
pów za pobieranie jo n ó w N a+ odpow iedzialne są a n ­
typortery N a +/H + [94]. Pod w pły w em kurczenia się
kom órek w środow isku h iperosm otycznym dochodzi
do aktywacji białek N H E, n ap ły w u jo n ó w N a+ i p o ­
nownego uzyskania przez ko m ó rk ę poprzedniej o b ­
jętości, m im o niezm ienionych w arunk ów zew nętrz­
nych [94]. N ieznany je s t dotąd dokładny m echanizm
odpow iedzialny za odbieranie przez k om órkę sy­
gnału o zmieniającej się objętości i przekazyw anie
tej informacji do białek NHE. W iadom o jedynie, że
pod w pływ em zm ian objętości kom órki wrażliwość
antyportera na stężenie H + w zrasta w pH alkalicz­
nym [95].
IV-1.3. Transport w kom órkach nabłonkow ych
A ktyw ność antyporterów N a+/H + je s t opisyw ana
dla błon plazm atycznych w szystkich kom órek
nabłonkowych, gdzie ich rola polega na regulacji
transportu jo n ó w N a+ i H + [96]. W kanalikach proksym alnych nerek białko N H E je s t niezbędne dla resorpcji jo n ó w H C 0 3\ A ntyport N a +/H + poprzez lek­
kie zakw aszenie światła kanalików nerkow ych p o ­
średnio uczestniczy także w transporcie słabych
kwasów do kom órek (związki te po uprotonow aniu
dyfundują przez błonę cytoplazm atyczną). Ostatnio
pokazano, że transport jo n ó w H + przez białko NHE3
jest istotny dla praw idłow ego transportu produktów
degradacji białek w jelicie cienkim [97]. A m in o k w a­
sy, dipeptydy i niektóre leki są transportow ane do
wnętrza kom órek nabłonka poprzez sym port z H+.
A ktyw ność białka NHE3 zapew nia optym alną ab­
sorpcję N a + i czynników odżyw czych jedn ocześn ie
utrzymując fizjologiczne p H j [97].
wewnętrzna
błona
m itochondrialna
H*
Ca2*
Na*
H+
Ryc. 3. Transport Ca2+ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną.
W zrost stężenia jonów wapniowych w cytosolu powoduje ich
pobieranie do mitochondriów poprzez uniport wapniowy. Jony
Ca2+ są następnie usuwane z mitochondriów na wym ianę z Na+
przez antyporter N a+/Ca2+. Antyporter Na+/H + usuwa Na+ do cy­
tosolu przywracając jego stężenie do wartości początkowych,
kosztem gradientu protonowego w poprzek wewnętrznej błony
mitochondrialnej wytworzonego przez pompy protonowe
łańcucha oddechowego.
[48], A ntyporter N a+/H + (białko N H E 6 ) je s t p ra w d o ­
podobnie zaw sze aktyw ny w oddychających mitochondriach i odpow iada za utrzym anie gradientu N a+
w poprzek wewnętrznej błony m itoch o n d rialn ej, k tó ­
ry pozw ala na zależny od N a+ w ypływ C a 2+. Stężenie
C a2+ w m atriks m itochondrialnej w pływ a na ak ty w ­
ność takich enzym ów , ja k d ehydrogenazy cyklu
kw asów karboksylow ych, F |F 0 ATP-aza, translokaza
nukleotydów adeninow ych [98]. Poniew aż zm iany
stężenia C a2+ w cytosolu często tow arzy szą zm ianom
w m etabolizm ie komórki, przypuszcza się, że jo n y
C a2+ m o g ą stanowić ogniwo łączące poziom p ro d u k ­
cji ATP w m itochondriach ze zm ieniającym i się p o ­
trzebami energetycznym i komórki [99]. Przyjm uje
się, że zm iany stężenia C a2+ w matriks m ito c h o n ­
drialnej od po w iad ają w ahaniom stężenia tego jo n u w
cytoplazm ie [100, 101], Taką korelację w ykazano
mierząc jedno cześnie zm iany stężenia C a 2+ w cy to ­
plazmie oraz zm iany aktywności zależnych od C a2+
dehydrogenaz m itochondrialnych (po aktywacji
szlaku zw iązanego z kanałami C a2+ ak tyw ow anym i
,4,5-trisfosforanem inozytolu w retikulum endoplazm atycznym ) [102]. Co więcej, pobieranie C a 2+
przez m itochondria reguluje stężenie tych jo n ó w w
1
IV-2. A ntyporter Na+/H + wewnętrznej błony
m itochondrialnej
pobliżu receptorów IP3R zapobiegając nadm iernem u
w ypływ ow i C a2+ z m agazynów w ER. [103]. P rzy ­
puszcza się, że aktyw ność białka N H E 6 je st n iezw y ­
Elektroobojętne antyportery kation /H + grają b a r­
dzo istotną rolę w regulacji objętości m itochondriów
oraz w utrzym yw aniu hom eostazy jo n ó w C a2+
wewnątrz komórki. W kom órkach ssaków m itochon-
kle istotna dla regulacji stężenia C a2+ w m ito c h o n ­
driach, gdyż um ożliw ia ona efektyw ny w yp ływ C a 2+
i powrót jeg o stężenia w matriks m itochondrialnej do
wartości spoczynkowych.
184
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 40(2), 2000
V. U w agi k oń cow e
P ow szechność w y stęp o w a n ia białek N a +/H + oraz
różnorodność cz y n n ik ó w w pływ ających na ich ak­
tywność sugeruje, iż g ra ją one bardzo istotną rolę w
utrzym aniu h o m eo staz y jo no w ej komórki. Takich
procesów m iano w icie j a k regulacja w e w nątrzk om ór­
kow ego pH, transport jo n ó w i m etabolitów w k o m ó r­
kach n ab łon kow yc h oraz regulacja objętości k o m ó r­
ki. Ich aktyw ność po d leg a ścisłej regulacji i zależy
od c zynników w zrostu, horm onów, w arunków osmotycznych. W ciąż j e d n a k wiele bardzo istotnych p ro ­
blem ów dotyczących antyporterów N a+/H + po zo sta­
je do rozw iązania. P oznano je d y n ie niektóre szcze­
gółowe p rocesy pro w a d ząc e do regulacji aktywności
tych białek, niew iele w iad om o o am inokw asach za­
angażow anych w w iąz an ie kationów i ich transport, a
także o istocie od działy w a n ia cytosolowej dom eny
regulatorowej b iałek N H E z odp ow iedzialn ą za
transport jo n ó w d o m e n ą hydrofobow ą.
Podziękowania
Serdecznie d zięk uję Panu dr hab. A dam ow i S zew ­
czykowi za cenne uw agi dotyczące niniejszej pracy i
pomoc.
Praca została napisana w ram ach realizacji projektu
badaw czego nr
KBN.
6
P04A 014 18 finansow anego przez
A r ty k u ł o trzym a n o 9 m arca 2000 r.
Z a a k c e p to w a n o do d ru ku 2 7 m arca 2 0 0 0 r.
Piśm iennictw o
1. F l i c g e l L , W a n g H J (1997) M ol Cell Cardiol 29:
1991-1999
2. J i a Z P , M c C u l l o u g h N , M a r t e l R, H e m m i n g s c n
S, Y o u n g P G (1992) EM BO 7 1 1 : 1631-1640
3. T s c M , L e v i n e S, Y u n C, B r a n t S, C o u n i l l o n L T ,
P o u y s s e g u r J , D o n o w i t z M (1993) J M embr Biol 135:
93-108
4. W a k a b a y a s h i S, S h i g e k a w a M, P o u y s s e g u r J
(1997) Physiol Rev 77: 51-74
5. F l i e g e l L, F r ö h l i c h O (1993) Biochem J 296: 273-285
6. A h e a r n G A , C l a y L P (1989) Am J Physiol 257: R484-493
7. M a r r a M A , P r a s a d S S , B a i l l i e D L ( l 993) M ol Gen Ge­
net 236:289-298
8. G a x i o l a R A , R a o R, S h e r m a n A, G r i s a f i P, A l p e r
S L , F i n k G R (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96: 1480-1485
9. F u k u d a A, N a k a m u r a A, T a n a k a Y (1999) Biochim
Biophys Acta 1446: 149-155
10. S c h u l d i n e r S, P a d a n E (\993) Int Rev Cytol 137C: 229-266
1 1 . P a d a n E, S c h u l d i n e r S (1994) J Exp Biol 196: 443-456
12. O r l o v v s k i J , G r i n s t e i n S (1997) J Biol Chem 272:
22373-22376
1 3 . S a r d e t C , F r a n c h i A , P o u y s s e g u r J (1989) Cell 56:
271-280
14. O r l o w s k i J , K a n d a s a m y R A , S h u l l G E (1992) J Biol
Chem 267: 9331-9339
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
15. W a n g Z , O r l o w s k i J , S h u l l G E (1993) 7 Biol Chem 268:
11925-11928
16. T s e C M , L e v i n e S A , Y u n C H , K h u r a n a S, D o n o w i t z M (1994) Biochemistry 33: 12954-12961
17. K l a n k e C A , S u Y R , C a l l e n D F , W a n g Z, M e n e t o n
P, B a i r d N, K a n d a s a m y R A , O r l o w s k i J , O t t e r u d
B E , L e p p e r t M, e t al (1995) Genomics 25: 615-622
18. C o l l i n s J F , H o n d a T , K n o b e l S, B u l u s N M , C o n a r y J , D u B o i s R, G h i s h a n F K (1993) Proc Natl Acad Sei
USA 90: 3938-3942
19. N u m a t a M , P e t r e c c a K, L a k e N , O r l o w s k i J (1998)
J Biol Chem 273: 6951-6959
20. W a k a b a y a s h i S, F a f o u r n o u x P , S a r d e t C , P o u y s ­
s e g u r J (1992) Proc Natl A cad Sei USA 89: 2424-2428
2 1 . S a r d e t C, C o u n i l l o n L, F r a n c h i A, P o u y s s e g u r J
(1990) Science 241: 723-726
22. B i e m e s d e r f e r D , D e G r a y B, A r o n s o n P S (1998) J
Biol Chem 273: 12391-12396.
23. N o e l J , P o u y s s e g u r J (1996) Am J Physiol 268: C283-296
24. C h o w C W , W o o d s i d e M, D e m a u r e x N, Y u F H ,
P l a n t P, R o t i n D, G r i n s t e i n S, O r l o w s k i J (1 999)7
Biol Chem 274: 10481-10488
2 5 . C o u n i l l o n L, P o u y s s e g u r J , R e i t h m e i e r R A (1994)
Biochemistry 33: 10463-10469
26. N a k a i K . , M. K a n e h i s a ? (1992) Genomics 14: 897-911
27. F a f o u r n o u x P, N o e l J , P o u y s s e g u r J (1994) J Biol
Chem 269: 2589-2596
28. F l i e g e l L, H a w o r t h R S , D y c k J R (1993)Biochem 7289:
101-107
29. B i e m e s d e r f e r D, P i z z o n i a J , A b u - A l f a A , E x n e r
M , R e i l l y R, I g a r a s h i P, A r o n s o n P S (1993) Am J
Physiol 265: F736-742
30. H a w o r t h R S , F r ö h l i c h O , F l i e g e l L (1993) Biochem J
289: 637-640
31. H o o g e r w e r f W A , T s a o S C , D e v u y s t O, L e v i n e
SA, Yun CH, Yi p JW, C o h e n ME , Wi l s o n PD, L a ­
z e n b y A J , T s e C M , D o n o w i t z M (1996) Am J Physiol
270: G29-41
32. A t t a p h i t a y a S, P a r k K, M e l v i n J E (1999) J Biol Chem
274: 4383-4388
33 . B a i r d N R , O r l o w s k i J, S z a b o E Z , Z a u n H C ,
S c h u l t h e i s P J , M e n o n A G , S h u l l G E (1999) J Biol
Chem 274: 4377-4382
3 4 . B e s s o n P, F e r n a n d e z - R a c h u b i n s k i F, Y a n g W,
F l i e g e l L (1998) Am J Physiol 274: C 8 3 1-839
3 5 . K a p u s A, G r i n s t e i n S, W a s a n S, K a n d a s a m y R,
O r l o w s k i J (1994) J Biol Chem 269: 23544-23552
3 6 . S o l e i m a n i M , S i n g h G, B i z a l G L , G u l l a n s S R ,
M c A t e e r J A (1994) J B iol Chem 269: 27973-27978
37. B a i L , C o l l i n s J F , M u l l e r Y L , X u H, K i e l a P R ,
G h i s h a n F K (1999) Am J Physiol 277: Rl 112-1119
3 8 . B o o k s t c i n C, D e P a o l i A M , X i e Y , N i u P, M u s c h
M W , R a o M C , C h a n g E B (1994) J Clin Invest 93: 106-113
39. B o o k s t e i n C , M u s c h M W , D e P a o l i A, X i e Y, V i 1l e r e a l M, R a o M C , C h a n g E B (1994) J Biol Chem 269:
29704-29709
40. R a l e y - S u s m a n K M , C r a g o e E J J r , S a p o l s k y R M ,
K o p i t o R R (1991) J Biol Chem 266: 2739-2745
4 1 . G r i n s t e i n S, W o o d s i d e M , W a d d e l l T K , D o w n e y
G P , O r l o w s k i J, P o u y s s e g u r J, W o n g D C , F o s k e t t J K (1993) EM BO J 12: 5209-1528
42. K u r a s h i m a K, D ’ S o u z a S, S z a s z i K, R a m j e e s i n g h R, O r l o w s k i J, G r i n s t e i n S (1 9 99)7 Biol Chem 214:
29843-29849.
43. V a n D y k e R W (1995) Am J Physiol 269: C943-954
44. H e n s l e y C B , B r a d l e y M E , M i r c h e f f A K (1990)Kid­
ney Int 37: 707-716
4 5 . D ’ S o u z a S, G a r c i a - C a b a d o A , Y u F, T e t e r K, L u ­
k á c s G, S k o r e c k i K, M o o r e H P , O r l o w s k i J,
G r i n s t e i n S (1998) J Biol Chem 273: 2035-2043
46. F a n L , W i e d e r k e h r M R , C o l l a z o R, W a n g H,
C r o w d e r L A , M o e O W (1999) J Biol Chem 214:
11289-11295
http://rcin.org.pl
185
47. N a s s R, R a o R (1998) J B io l Chem 273: 054-060
48. B e r n a r d i P (1999) Physiol Rev 79: 1127-1155
49. L e v i n e S A , M o n t r o s e M H , T s c C M , D o n o w i t z M
(1993) J B io l Chem 268: 25527-25535
50. B r i e r l e y G P , D a v i s M H , C r a g o e E J J r , J u n g D W
(1989) Biochemistry 28: 4347-4354
5 1 . B o o k s t c i n C, M u s c h M W , D e P a o l i A, X i e Y, R a ­
b e n a u K, V i l l e r e a l M, R a o M C , C h a n g E B (1996)
Am J Physiol 271: CI 629-1638
52. K a p u s A , L u k á c s G L , C r a g o e E J J r , L i g e t i E, F o ­
n y o A (1988) Biochim Biophys Acta 944:383-390
5 3 . K a p u s A, L i g e t i E, F o n y o A (1989)F E B S L e tt251:49-52
54. Y u F H , S h u l l G E , O r ł o w s k i J (1993) J Biol Chem 268:
25536-25541
55. A r o n s o n P S (1983) Am J Physiol 245: F647-659
56. G r i n s t e i n S, G o e t z J D , R o t h s t e i n A (1984) J Gen
Physiol 84: 565-584
57. K l e y m a n T R , C r a g o e E J J r (1988) J M embr Biol 105: 158. C o u n i l l o n L, S c h o l z W, L a n g H J , P o u y s s e g u r J
(1993) M ol Pharmacol 44: 1041-1045
59. O r ł o w s k i J, K a n d a s a m y R A (1996) J Biol Chem 271:
19922-19927
60. O r ł o w s k i J (1993) J Biol Chem 268: 16369-16377
6 1 . I v e s H E , Y e e V J , W a r n o c k D G (1983) J Biol Chem 258:
9710-9716
62. S a s t r a s i n h M , Y o u n g P, C r a g o e E J J r , S a s t r a s i n h S (1995) Am J Physiol 268: C1227-C1234
63. C o u n i l l o n L, N o e l J, R e i t h m e i e r R A , P o u y s s e ­
g u r J (1991) Biochemistry 36: 2951-2959
64. C a s s e l D, K a t z M , R o t m a n M (1986) J Biol Chem 261:
5460-5466
65. G o s s G G , W o o d s i d e M, W a k a b a y a s h i S, P o u y s ­
s e g u r J W a d d e l l T, D o w n e y G P , G r i n s t e i n S
(1994) J Biol Chem 269: 8741-8748
66. P a r i s S, P o u y s s e g u r J (1984) J Biol Chem 259:
10989-10994
67. M o o r A N , F l i e g e l L (1999) J Biol Chem 274:22985--22992
6 8 . W a n g H, S i l v a N L , L u c c h e s i P A , H a w o r t h R,
W a n g K, M i c h a l a k M, P e l e c h S, F l i e g e l L (1997)
Biochemistry 36: 9151-9158
69. B o u a b o u l a M, B i a n c h i n i L, M c K e n z i e F R , P o u y ­
s s e g u r J, C a s e l l a s P (1999) FEBS Lett 449: 61 -65
70. N a t h S K , K a m b a d u r R, Y u n C H , D o n o w i t z M,
T s e C M (1999) Am J Physiol 276: C873-882
7 L T s e C M , L e v i n e S, Y u n C, B r a n t S, P o u y s s e g u r
J, M o n t r o s e M H , D o n o w i t z M (1993) Proc Natl Acad Sci
USA 90: 9110-9114
72. W i e d e r k e h r M R , Z h a o H, M o e O W ( 1999) Am J Phy­
siol 276: C l205-17
7 3 . B e r t r a n d B, W a k a b a y a s h i S, I k e d a T, P o u y s s e ­
g u r J, S h i g c k a w a M (1994) J B iol Chem 269: 13703-13709
74. W a k a b a y a s h i S, I k e d a T , N o e l J, O r ł o w s k i J,
P o u y s s e g u r J , S h i g e k a w a M (1995) J Biol Chem 270:
26460-26465
75. L i n X , B a r b e r D L (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:
12631-12636.
76. S i l v a N L C L , H a w o r t h R S , S i n g h D, F l i e g e l L
(1995) Biochemistry 34: 10412-10420
77. D o n o w i t z M, W e l s h M J (1986) Anna Rev Physiol 48,
135-150.
186
78. W e i n m a n n E J , S h n o l i k a r S (1993) Annu Rev Physiol
55: 289-304
79. Y u n C H , O h S , Z i z a k M, S t e p l o c k D, T s a o S,
T s c C M , W e i n m a n E J , D o n o w i t z M (1997) Proc
Natl Acad Sci USA 94: 3010-3015.
80. K u r a s h i m a K, Y u F H , C a b a d o A G , S z a b o E Z ,
G r i n s t e i n S, O r ł o w s k i J (1997) J Biol Chem 272:
28672-28679
81. Y u n C H , L a m p r e c h t G, F o r s t e r D V , S i d o r A
(1998) J Biol Chem 273: 25856-25863
82. H a l l R A , P r e m o n t R T , C h o w C W , B l i t z e r J T ,
P i t c h e r J A , C l a i n g A, S t o f f e l R H , B a r a k L S ,
S h e n o l i k a r S, W e i n m a n E J , G r i n s t e i n S, L c f k o w i t z R J (1998) Nature (Lond) 392: 626-630
83. W e i n m a n E J , S a n s o m S C , K n i g h t T F , Sc n e k j i a n H O (\9 8 2 ) J M em br B iol 69: 107-111
84. K a h n A M , D o l s o n G M , H i s e M K , B e n n e t t S C ,
W e i n m a n EJ (1985) Am J Physiol 248: F2-8
8 5 . M a l y K, Ü b e r a l l F, L o f e r e r H, D o p p l e r W,
O b e r h u b e r H, G r o n e r B, G r u n i c k e H (1989) J
Biol Chem 264: 11839-11842
86. V o y o n o - Y a s e n e t s k a y a T , C o n k l i n B R , G i l ­
b e r t L R , H o o l e y R, B o u r n e H R , B a r b e r D L
(1994) J Biol Chem 269: 47-4724
87. P a g e s G, L e n o r m a n d P, L ’ A l l e m a i n G, C h a m b a r d J C , M e l o c h e S, P o u y s s e g u r J (1993) Proc
Natl A cad Sci USA 90: 8319-8323
88. H o o l e y R, Y u C Y , S y m o n s M, B a r b e r D L (1996)
J Biol Chem 271: 6152-6158
89. I n g b e r D E , P r u s t y D, F r a n g i o n i J V , C r a g o e
E J J R , L e c h e n e C , S c h w a r t z M A (1990) J Cell Biol
110: 1803-1810
90. S c h w a r z M A , L e c h e n e C, I n g b e r D E (1991)Proc
Natl Acad Sci USA 88: 7849-7853
9 1 . L e v i t s k y J, G u r c l l D, F r i s h m a n W H (\9 9 8 )J C lin
Pharmacol 38: 887-897.
92. X i a o X H , A l l e n D G (1999) Circ Res 85: 723-730
93. C a l a P M (1983) M ol Physiol. 4, 33-52
94. G r i n s t e i n S, R o t i n D, M a s o n M J (1989) Biochim
Biophys Acta 988: 73-97
95. G r i n s t e i n S, R o t h s t e i n A (1986) J M embr Biol 90:
1 -1 2
96. A r o n s o n P S , N e e J , S u h m M A (1982) Nature (Lond)
299: 161-163
97. T h w a i t e s D T , F o r d D, G l a n v i l l e M, S i m m o n s
N L (1999) J Clin Invest 104: 629-635
98. H a n s f o r d R G (1994) J Bioenerg Biomembr 26, 495-508
99. D e n t o n R M , M c C o r m a c k J G (1985) Am J Physiol
249: E543-554
100. M i y a t a H, S i l v e r m a n H S , S o l l o t S J , L a k a t t a
E G , S t e r n M D , H a n s f o r d R G (1991) Am J Physiol
261: HI 123-1134.
101. R i z z u t o R, B a s t i a n u t t o C, B r i n i M, M u r g i a
M, P o z z a n T (1994) J Cell B iol 126: 1183-1194
102. H a j n o c z k y G, R o b b - G a s p e r s L D , S e i t z M B ,
T h o m a s A P (1995) Cell 82: 415-424
103. H a j n o c z k y G , H a g e r R, T h o m a s A P (1999) J
Biol Chem 274: 14157-14162
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIO CH EM II 46(2), 2 0 0 0
Sekwencjonowanie genomu człowieka — dwa projekty
badawcze, dwie strategie
Sequencing of human genome — two projects, two
strategies
GRACJAN MICHLEWSKI1, WŁODZIMIERZ KRZYŻOSIAK2
Spis treści:
Contents:
I. Wstęp
II. Projekt Badawczy — Genom Człowieka (HGP)
II-l. Strategia sekwencjonowania
II-2. Postęp w sekwencjonowaniu genomu
II-3. Źródła informacji
II-4. Cele HGP na najbliższą przyszłość
III. Projekt badawczy firmy Celera Genomics
III-I.Strategia sekwencjonowania
1II-2. Postęp w sekwencjonowaniu genomu
III-3. Źródła informacji
III-4. Firma Celera Genomics w XXI wieku
IV. Podsumowanie
I. Introduction
II. Human Genome Project (HPG)
II-l. Sequencing strategy
II-2. Progress in human genome sequencing
II-3. Sources of information
II-4. HGP goals for the nearest future
III. Research project of Celera Genomics Corporation
III-l.Sequencing strategy
III-2. Progress in genome sequencing
III-3. Sources of information
III-4. Celera Genomics Corporation in XXI century
IV. Summary
Wykaz stosowanych skrótów: BAC — (ang. Bacterial A rtifi­
cial C hrom osom e ) — sztuczny chromosom bakteryjny, FISH -—
(ang. F luorescence in situ H ybridisation ) — Hybrydyzacja in
situ fluorescencyjnie wyznakowanych fragmentów DNA, HGP(ang. Hum an G enom e P roject ) — Projekt Badawczy — Genom
Człowieka, MHC — (ang. M ajor H istocom patibility Com plex)
— Główny kompleks zgodności tkankowej, NCBI — (ang. N a­
tional C enter f o r B iotechnology Inform ation) — Narodowe
Centrum Informacji Biotechnologicznej, SNPs (ang. Single
N ucleotide P olym orphism s) — polimorfizmy pojedynczych nukleotydów, STCs — (ang. Sequence-Tagged C onnectors) —
unikatowe sekwencje łączące, STSs — (ang. Sequence-Tagged
Sites) — sekwencje unikatowe, YAC — (ang. Yeast A rtificia l
Chrom osom e) — sztuczny chromosom drożdżowy.
m olekularnych podstaw funkcjonow ania organ i­
zm ów żyw ych, w tym człowieka. Obecnie jesteśm y
świadkami innego wielkiego przełomu. Jest nim bli­
skie ju ż poznanie sekwencji nukleotydowej całego
ludzkiego DNA. Kolejność zasad ustalana jest za p o ­
m ocą m etody enzym atycznego sekwencjonowania,
opracowanej przez Sangera, znanej jako sek w en cjo ­
nowanie „dideoksy” [2].
Artykuł traktuje o dwóch niezależnych projektach
badawczych, których podstaw o w ym zadaniem jest
zsekw encjonow anie genom u człowieka. Jeden z nich
rządowy, niekom ercyjny, realizow any przez szereg
ośrodków naukow ych (rozdział II). Drugi prywatny,
z założenia komercyjny, w którego realizację zaan­
gażowała się jed n a firma (rozdział III). Celem tego
artykułu je s t ukazanie różnic w podejściu do uzyski­
wania sekwencji, om ów ienie źródeł informacji, p o ­
stępu badań ja k i celów na n ajbliższą przyszłość k a ż ­
I. W stęp
Odkrycie przez J . D W a t s o n a i F . H . C
C r i c k a podwójnej helisy D N A [1] za po czątko­
wało ogrom ny postęp w biologii m olekularnej. P o ­
znanie sposobu działania tego nośnika inform acji g e ­
dego projektu z osobna.
netycznej, doprow adziło do przełom u w rozum ieniu
II. Projekt B adaw czy — G enom C złow ieka
(H G P)
'Student IV r. biotechnologii UAM, 2prof. dr hab., Instytut Che­
mii Bioorganicznej PAN, Pracownia Genetyki Nowotworów,
ul. Noskowskiego 12/14, 61-704 Poznań
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Projekt B adaw czy G enom Człowieka, p oczątko­
wo kierow any przez J a m e s a
http://rcin.org.pl
W a t s o n a , a od
187
Tabela I
Ośrodki współpracujące w ramach HGP (G-5 wyróżnione pogrubieniem i kursywą)
S k ró t
N a z w a o ś ro d k a b a d a w c z e g o
A d re s s tro n y in te rn e to w e j
AECOM
Albert Einstein College o f Medicine
paclla.med.yalc.edu
BCM
Baylor College o f M edicine
www. hgsc. bcm. tm c. edu
Beijing
Human Genome Center, Institute o f Genetics, Chinese Academy o f Science
hgc.igtp.ac.cn
CGM
Center for Genetics in Medicine (Perkin Elmer/W ashington Univ.)
www.ibc.wustl.edu
GBF
Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH
www.gbf-braunschweig.de
GS
Genoscope
www.genoscope.org
GTC
Genome Therapeutics Corporation
www.cric.com
IMB
Institute for M olecular Biotechnology, Jena Germany
genome.imb-jena.de
KICMM
Karolińska Institute, Center for M olecular Medicine
www.ki.se/cmm
LAHGC
Lita Annenberg Hazen Genome Center, Cold Spring Harbor
sciclio.cshl.org/genscq/
MPIMG
Max Planck Institute for M olecular Genetics
seq.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de
JG I
Joint Genome Institute, U.S. DOE
www.jgi.doe.gov
JST
Japan Science and Technology Corporation
www-alis.tokyo.jst.go.jp
RIKEN
RIKEN Genome Sciences Center
hgp.gsc.riken.go.jp
SC
The Sanger Centre
www. sanger. ac. uk
SDSTC
Stanford DNA Sequencing and Technology Development Center
sequence-www.stanford.edu
SHGC
Stanford Human Genome Center
www-shgc.stanford.edu
TIGR
The Institute for Genome Research
www.tigr.org
UUGC
University o f Utah Genome Center
www.genomc.utah.edu
UOAGTC
University o f Oklahoma, Advanced Genome Technology Center
www.genome.ou.edu
UTSW
University o f Texas, Southwestern Medical Center
gestec.swmed.edu
UWGC
University o f W ashington Genome Center
www.genom e.Washington.cdu/UWGC
UWMSC
University o f Washington Multimegabase Sequencing Center
chroma.m bt.washington.edu
WIBR
W hitehead Institute f o r Biomedical Research/M IT
www.genome.wi.mit.edu
WUGSC
Washington University, Genome Sequencing Center
genome. wustl. edu/gsc
1993 przez F r a n c i s a C o l l i n s a , wszedł w
ostatnich latach XX wieku w k o ń co w ą fazę zbadania
kolejności w szystkich deo ksynukleotydów , z około
3 m iliardów, które w ystęp ują w 24 nieprzerw anych
łańcuchach sekwencji DNA, jakim i są 22 ch ro m o so ­
my autosom alne i 2 ch rom oso m y płciowe. Projekt
ten, opracow any przy w spółpracy D epartam entu
Energii (DOE — D ep a rta m en t o f E n erg y) i N a ro d o ­
wych Instytutów Zdrow ia (NIH — N a tio n a l In stitu tes o f H e a lth ), zatw ierdzony został w 1990 r. przez
Kongres USA [3], Czas je g o realizacji przew idziano
na 15 lat.
W pierw szych etapach projekt b adaw czy HGP
obejm ował m.in. opracow anie map genetycznych i
fizycznych ludzkich chro m o som ów oraz u spraw nie­
nie technik sekw encjonow ania [4], Postęp w au to m a­
188
tyzacji i obniżaniu kosztów sekw encjono w an ia p o zw o ­
lił badaczom , skupionym w okół HGP, stanąć przed re­
alną szansą w cześniejszego odczytania całego genom u
człow ieka — j uż w 2003 roku [5]. Nie bez znaczenia
była i jest ścisła w spółpraca licznych ośrodków , za an ­
gażow anych w realizację HGP (Tab. 1). Pięć z nich tzw.
G5 (wyróżnione w tabeli 1), to najw iększe ośrodki b a­
dania genom ów, których zadaniem jest prz ep ro w a d ze­
nie większości prac zw iązanych z sekw encjonow aniem
ludzkiego DNA. W śród nich w yróżnić należy Centrum
Sangera m ieszczące się w C am bridge w Wielkiej B ryta­
nii, w którym określono sekw encję n u kleoty dow ą
znacznej części ludzkiego chrom osom u 22 [6]. O czek u ­
je się, że ośrodek ten „dostarczy” danych, o sekwencji
nukleotydów jednej trzeciej ludzkiego genom u [7].
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
II-l. Strategia sekw encjonow ania
w adzonych we w szystkich ośrodkach badawczych
biorących udział w HGP.
Strategią sto so w an ą przez ośrodki, zaangażow ane
w HGP je st sekw en cjon ow anie g enom u ludzkiego
„klon po k lo n ie” (ang. clo n e-b y-clo n e sequencing).
Istotą tego p odejścia je s t określanie sekwencji czę­
ściowo n akładających się na siebie fragm entów
DNA, które p o c h o d z ą z uszereg ow anych klonów
(wektor i zaw arty w nim insert — fragm ent DNA)
obejm ujących k onkretny odcinek genom u (np. chro­
m osom lub je g o część). N astępnie rozpoznane se­
kwencje łączy się w je d e n ciąg, odtw arzający se­
kw encję badan ego odcinka. O statecznym etapem b ę ­
dzie rozpoznanie sekwencji badanych fragmentów,
które odpow iednio zestaw ione reprezentow ać b ęd ą
cały genom człow ieka (Ryc. la).
Analizując dokładniej aktualnie realizow ane p o ­
dejście, zw raca uw agę fakt, iż różni się ono dość
istotnie od pierw otnie rozw ażanego. Początkow o,
bowiem, zakładano w ykorzystanie szczegółow ych
map fizycznych, pow stałych w w yniku określania
kolejności nak ładających się częściow o klonów typu
YAC, w których inserty m o g ą m ieć długość od 100
do 2 000 kpz. W dalszej kolejności inserty m iały być
subklonow ane do kosmidów, których „p ojem no ść”
wynosi od 30 do 45 kpz, a ostatecznie do w ektorów
sekw encyjnych takich ja k pUC i M13, m ogących p o ­
mieścić inserty o optym alnych w ielkościach o d p o ­
wiednio 2 lub 10 kpz i około 1 kpz. Z podejścia tego
zrezygnow ano, po przedstaw ieniu innej strategii se­
kw encjonow ania, którą zaproponow ali C r a i g
Venter, H a m i l t o n Smi t h i Leroy Hood
[8]. Ideą tego rozw iązania je s t w yelim inow anie eta­
pu m apow ania fizycznego i w ykorzystanie klonów
sztucznych ch rom osom ów bakteryjnych BAC, k tó ­
rych inserty m a ją długość 80-350 kpz [8], jak o p o d ­
stawowego źródła fragm entów D N A do sekw encjo­
nowania. Pozw oliło to zw iększyć efektywność se­
kw encjonow ania. Po pierw sze, poniew aż inserty
klonów B A C są bardziej stabilne, niż te w klonach
YAC i k osm idach [9]. C echę tę klony BAC z a w d zię­
czają czynnikow i F, zaw artem u w ich sekwencji.
Czynnik ten, w ystępujący ja k o odrębny plazm id u
E. co li, zaw iera zestaw genów kodujących białka o d ­
pow iedzialne za regulację replikacji, a także za
utrzym anie niskiej liczby kopii całego klonu. Po d ru ­
gie, klony B A C w p rzeciw ieństw ie do np. klonów
YAC, w ystępują w kolistej superhelikalnej formie.
Dzięki temu, są mniej podatne na spontaniczną fragmentację. Istotna przew aga tej nowej strategii nad
wyżej opisaną, w ynika z faktu, że jedn olity zbiór k lo ­
nów BAC um ożliw ia spraw ną k oordynację prac, pro-
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Etapy uzyskiw ania sekwencji w strategii „klon po
k lo nie” :
1. Fizyczna fragm entacja wybranej części genom u
ludzkiego (np. chrom osom u) na odcinki o w iel­
kości około 150 kpz. Najczęściej stosow aną
techniką fragm entacji je s t nebulizacja [10]. P ole­
ga ona na przepychaniu roztw oru DNA przez
szczelinę stożkow atego cylindra, za p o m o cą w y ­
tw orzonego nadciśnienia. Poprzez dobór o dpo ­
wiedniej szczeliny, m o żna tą m etodą uzyskać
fragm enty żądanej długości.
2. Losowe w klonow anie u zyskanych fragm entów
w w ektory sztucznych chrom o som ów bak teryj­
nych BAC. W iązanie insertu z wektorem za ch o­
dzi poprzez tępe końce i prow adzone jest po
uprzednim ich w y rów nan iu przy użyciu frag­
m entu K lenow a po lim erazy I DNA z E .co li lub
polim erazy D N A faga T7 [11].
3. Analiza restrykcyjna poszczególnych klonów
4.
BAC w celu spraw dzenia czy nastąpiło zw ią za­
nie w ektora z insertem i czy klon nie zawiera kil­
ku różnych fragm entów D N A zamiast jednego,
lub też całego innego klonu BAC, ja k również w
celu dokładnego określenia wielkości insertu.
Ustalenie sekwencji nukleotydow ej obu końców
insertu znajdującego się w konkretnym klonie.
U zyskane w ten sposób sekw encje łączące STC,
będące je d n y m z rodzajów etykietek sekwencji
unikatow ych STS, p o z w a la ją n a ułożenie klonów
w kontigi — czyli w ciągi nakładających się cz ę­
ściowo klonów. Do dalszych etapów badań w y ­
biera się te klony bakteryjne, których inserty
nakładają się w m in im alnym stopniu.
5. Fizyczna fragm entacja insertów i ich subklonowanie w w ektorach pU C lub M 13, używ anych do
sekw encjonow ania. Przy użyciu m etody lo sow e­
go w yboru klonów, całkow ita długość uzyskanej
sekwencji musi być kilkukrotnym ekw iw alentem
jej wyjściowej długości [10].
6 . D oprow adzenie „surowej sekw encji” , w której
jed en błąd przypada na około 1,000 zasad do se­
kwencji o wysokiej jak o ści, której je d en błąd
przypada na nie mniej niż 10,000 zasad [12],
Osiąga się to poprzez kilkukrotne powtarzanie
sekw encjonow ania konkretnego klonu BAC.
7. Uzupełnianie przerw w ciągłości sekwencji, k tó ­
rych wielkość i um iejscow ienie m ożna w y z n a­
czyć m.in. za p o m o cą m etody FISH, hy bryd yza­
cji in situ fluorescencyjnie w yznakow anych
fragm entów D N A do rozciągniętych w łókien
http://rcin.org.pl
189
Ryc. 1. Strategia sekwencjonowania ludzkiego genomu, realizowana przez Projekt Badawczy — Genom Człowieka HGP a), oraz strategia wykorzy­
stywana przez projekt badawczy firmy Cclera b). Opis niektórych symboli: pogrubiona linia w klonach — inserty; T — miejsce restrykcyjne;
c t t ,c c c ,c a a ,c a g — symboliczne przedstawienie unikatowych sekwencji łączących STC; ...GCCagGCTAACaaAAGCTTCttATTGGCCCCAA... — symboliczne przedstawienie sekwencji końcowej. ^Sekwencje klonów sztucznych chromosomów bakteryjnych BAC pozyski­
wane są: z „serwera klonów” HGP, jak również w wyniku własnych prac firmy Celcra.
190
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
ch rom atynow ych [13]. N astępnie D N A obej­
m ujący ko n k re tn ą p rzerw ę trzeba w klonow ać do
w ektorów innych niż BAC np. do kosm idów.
oznaczenie sekw encji nukleotydow ej chrom osom u
22 [6], Jest to drugi najm niejszy, autosom alny, akrocentryczny ludzki chrom osom , obejm ujący 1,6 —
Dalsze p ostępow anie przebiega ja k opisano p o ­
wyżej. Gdy D N A nie je s t stabilny w w ektorach, a
przerw y są krótkie, ich uzupełnianie prowadzi
się za p o m o c ą bezpośredniego sekw encjonow ania produktów PCR.
W iększość badań dotyczących wstępnej analizy
klonów BAC (punkty 3 i 4) dla potrzeb w szystkich
uczestników projektu w ykonują: C entrum Sekwencjonow ania G enom u, U niw ersytetu im. W aszyngto­
na W U G S C (ang. W ashington University, G enom e
Sequ en cin g C enter) oraz Instytut B adań Genom owych TIG R (ang. The In stitu te f o r G enom e R e se ­
arch) [14]. P rzekazyw anie inform acji i koordynację
działań zapew nia „serw er k lo n ó w ” , znajdujący się w
bazie danych W U G SC , do którego dostęp m ożliw y
je s t przez b azę danych N a rodo w eg o C entrum Infor­
macji B iotechnologicznej N C B I (ang. N a tio n a l C en­
ter f o r B io tech n o lo g y In fo rm a tio n ) [15]. Z aw iera on
1 ,8 % gen om ow ego D N A [17]. R am ię krótsze, o zn a­
czane sym bolem p, znajduje się powyżej centromeru, a ram ię dłuższe — q, poniżej. R am ię 22p zawiera
m apy klonów B A C (powstałe w w yniku działań opi­
sanych w punkcie 3 i 4). Istotnym etapem ko o rd y n a­
cji działań P rojektu B adaw czego G enom C złow ieka
jest rozdzielenie konkretnych zadań m iędzy p o ­
szczególne ośrodki. N a przykład, C entrum Sangera
zaangażow ane je s t w badanie sekwencji ch ro m o so ­
mów 1, 6, 9, 10, 13, 20, 22 i X, a U niw ersytet im. Wa­
szyngtona w analizę chrom o som ów 2, 3, 7, 11, 15,
18, Y [16].
II-2. Postęp w sekw encjonow aniu genomu
Dzięki zastosow aniu przedstaw ionej strategii i
w zm ożonem u wysiłkow i w szystkich ośrodków
w spółuczestniczących w HGP, tem po poznaw ania
sekwencji genom u ludzkiego znacznie się zw ię k ­
szyło. Pod koniec m arca 2000 roku łączna długość,
zdeponow anych w bazie danych G enBank, sek w e n ­
cji o wysokiej jakości i „surowej sekw encji” lud zkie­
go genom u w ynosiła od pow iednio 563 606 kpz
(17.5%) i 2 104 257 kpz (65.5%), podczas gdy w p a ź ­
dzierniku 1998 długość tej ostatniej w ynosiła ok. 180
000 kpz (5,7 %). Śledzenie postępu badań um ożliw ia
bieżące udostępnianie now o poznanej sekwencji, w
Internecie [6]. Tabela 2 przedstaw ia dane odnośnie
sekwencji p oszczególnych ludzkich chro m osom ó w z
31 marca 2000 roku [15].
Pierwszy m ilow y krok w sekw en cjon ow aniu g e­
nom u człow ieka zrobili badacze z C entrum Sangera
we w spółpracy z innymi ośrodkam i, głównie z U n i­
w ersytetem O klahom a w U SA (U O A G T C ) oraz Ja ­
pońską K o rporacją Nauki i Techniki (JST). Było to
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
serię tan dem ow ych powtórzeń, które kodują m. in.
rybo som aln e RNA. Poniew aż nie było żadnych do­
w od ów na w y stępow an ie w ram ieniu krótszym geTabela 2
Sekwencje nukleotydów poszczególnych ludzkich chromosomów, w
danych z 31 m arca 2000 roku (według NCBI).
Najdłuższy
kontig
(kpz)
C h r.
Efektyw na
w ielkość
(kpz)
Poznana
sekwencja
1
263 000
10,8
164
1005
2
255 000
10,1
111
1044
3
214000
5,7
68
746
4
203 000
6,5
101
359
5
194 000
9,4
114
739
6
183 000
26,7
318
3926
Liczba
kontigów
(% )
7
171 000
49,5
302
2094
8
155 000
5,8
43
1902
9
145 000
3,8
33
1010
10
144 000
4,8
40
469
11
144 000
6,1
65
817
12
143 000
17,7
104
1526
13
98 000
2,4
8
1416
14
93 000
36,9
116
1581
15
89 000
2,5
17
297
16
98 000
20,9
125
545
17
92 000
31,5
128
1101
18
85 000
4,8
22
349
19
67 000
24,0
147
1008
20
72 000
41,6
145
1187
21
39 000
72,4
51
7223
22
34 491
97,5
12
23051
X
164 000
41,4
340
1024
Y
35 000
22,6
31
U 04
3 180 491
17,7
2614
C ało ść
E fektyw na w ielkość chrom osom ów przedstaw ia szacow aną całko­
w itą długość ich sekw encji, p o m niejszoną o sekw encje pow ta­
rzające się takie jak: w ystępujące w krótkich ram ionach akrocentrycznych chrom osom ów 13, 14, 15, 21 i 22.
nów k odujących białka, cała uw aga badaczy skiero­
w ana została na dłuższe ram ię 22q. Z pom ocą m eto­
dy „klon po k lo n ie” zsekw en cjon ow ano 33,464 kpz z
34,491 kpz, jak ie w ystęp u ją w ram ieniu q, z do k ład ­
n o ścią jed n eg o błędu na 50 000 zasad. Brakujące
1,037 kpz to 11 przerw w ciągach sekwencji. W iel­
kość przerw m ieści się w granicach 1,9 — 150 kpz.
W dalszym etapie badań przerw y te b ędą uzu pełn ia­
ne. Jak w idać nie udało się dotąd rozpoznać całej euchro m aty ny ch ro m o som u 22. Bez wątpienia jednak,
zbadana sek w encja 12 kontigów , obejm ująca 33,4
http://rcin.org.pl
191
Mpz, która przypuszczalnie zawiera 545 genów i 134
pseudogeny, po raz pierw szy dała badaczom m ożli­
wość spojrzenia na tak złożony twór, ja k im jest ludz­
ki chromosom. Geny obecne w tym chrom osom ie za­
wierają się w granicach od lk p z (np. H M G 1L 10, któ ­
ry koduje S-transferazę tyrozylow ą) do 583 kpz
(genu L A R G E kodującego am inotransferazę acetylglukozanową). Liczba eksonów w genach, dłuższego
ramienia 22q, waha się od 1 do 54, a średnia ich w iel­
kość to 266 pz. W stępne analizy tej sekwencji, d o ­
prowadziły m.in. do zidentyfikow ania genów k o ­
dujących im m unoglobuliny lambda, S-transferazę
glutationową, apolipoproteinę.
[21-23]. Innym źródłem godnym polecenia jest stro­
na Centrum Sangera (SC) [7], om aw iająca HGP. Pod
tym adresem m ożna znaleźć równie wyczerpujące
dane dotyczące postępu badań całego genomu, p o ­
szczególnych chrom osom ów , a także opisy stosow a­
nych m etod laboratoryjnych oraz narzędzia k o m pu ­
terowe służące do analizy sekwencji ja k np. bardzo
dobrze opracow any pod w zględem użytkow ym p ro ­
gram BLAST, który służy do w yszukiw ania p od o b ­
nych sekwencji w całym genom ie lub w wybranych
jeg o częściach. M ożna tu też odnaleźć pliki danych
przedstawiające długie sekwencje DNA.
Do chwili obecnej około 35 chorób kojarzonych
jest z m utacjam i genów zlokalizow anych w tym
II-4. Cele HGP na najbliższą przyszłość
chromosom ie. Są to choroby m.in. układu o d po rno­
ściowego, choroby serca, białaczki, j a k rów nież c ho ­
roby układu nerw ow ego, takie ja k ataksja rdzeniow o -m óżdżkow a typu 10 [18] i schizofrenia. Biorąc
pod uwagę dane uzyskane podczas analizy sekwencji
22 q, p rzew idyw ana liczba genów w całym ludzkim
genom ie w ynosiłaby 61,000.
Innym w ażnym w ydarzeniem , zw iązanym z sekw encjonow aniem genom u człow ieka, było p o z n a ­
nie kompletnej sekwencji kodującej głów ny k o m ­
pleks zgodności tkankowej M H C [19], występującej
w krótkim ram ieniu chrom o so m u 6. Jest to sekw en ­
cja o długości 3,6 Mpz, zaw ierająca 244 geny, w w ię ­
kszości zw iązane z układem odpornościow ym . G ę ­
stość genów M HC je s t duża, p oznanie zatem całko ­
witej sekwencji ułatwi proces identyfikacji kon kret­
nych loci genow ych dla poszczególnych jednostek
chorobowych.
N ajw ażniejszym celem Projektu Badaw czego —
Genom C złow ieka do roku 2003 je s t poznanie całko­
13 kw ietnia br., na dwa m iesiące przed p lan o w a­
nym term inem , ukończony został etap określania se­
kwencji chrom osom ów 5, 16 i 19. Dokonali tego b a ­
dacze z trzech kalifornijskich ośrodków (Law rence
B erkeley N a tio n a l L aboratory in B erkeley; L a w ren­
ce Liverm ore N a tional L a b o ra to ry in Liverm ore; Los
A lam os N a tio n a l L a b o ra to ry in L os A lam os)
współpracujących w ram ach Połączonego Instytutu
G enom ow ego (JGI — Jo in t G enom e In stitute), pod
auspicjami Departam entu Energii USA [20].
II-3. Źródła inform acji
Szybki dostęp do inform acji o postępach HGP
um ożliwia sieć INTERNET. Najczęściej o dw ied za­
nym adresem, który każdem u zainteresow anem u p o ­
zwala dotrzeć do danych zg rom adzonych m.in. w
procesie sekw encjonow ania ludzkiego genom u, jest
strona NCBI [9]. Ze względu na sw ą popularność jest
ona często opisywana w piśm iennictw ie naukow ym
192
witej sekwencji ludzkiego genom u. P ółm etkiem p la­
now anym na czerwiec roku 2000, je s t „surowa se­
kw encja” (ang. d ra ft sequence), oznaczona z d okład­
nością 99.9%, która obejm ie 90 procent genom u
[24].
Innymi w ażnym i celami, których opis nie mieści
się w ramach tego artykułu, są:
1. kontynuacja m apow ania polim orfizm ów p oje­
dynczych nukleotydów SNP, w ystępujących w
całym genomie. Te SNP, które znajdują się w se­
kwencjach genów kodujących białka transpor­
tujące i m etabolizujące leki, stanowić będ ą p od­
stawę farm akogenom iki. Nowej dziedziny m e­
dycyny, która traktować m a każdego pacjenta in­
dywidualnie, w zależności od posiadanego przez
niego zestawu SNP;
2 . poznanie wszystkich kom pletnych sekwencji
cDNA, to je s t sekwencji przepisanych z m RNA,
a zatem poznanie ludzkiego transkryptom u;
3. sekw encjonow anie genom ów organizm ów m o ­
delowych takich ja k m ysz [25], czy D rosophila
m elanogaster. Z najom ość sekwencji ich g en o­
mów, oraz funkcji poznanych w ten sposób g e ­
nów, pozwoli na lepsze zrozum ienie znaczenia
hom ologicznych sekwencji genów u człowieka.
Podejm owanie tego ostatniego zadania w obliczu
prac prywatnej firmy, o której m ow a w kolejnym
rozdziale, w niektórych przypadkach (np. D ro­
sophila m elanogaster) ju ż jest, a w innych m oże
być spóźnione.
III. Projekt badaw czy firm y C elera G enom ics
9 maja 1998 roku J. Craig Venter firma Perkin-Elmer, i Instytut Badań G enom ow ych TIGR ogłosili
utworzenie nowej firmy [26]. Jej głów nym celem
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
miało być dokonanie w 3 lata, czyli do 2001 roku
tego, co Projekt B adaw czy — G enom Człowieka
HGP przew idyw ał początkow o na rok 2005 — p o ­
znanie sekwencji zasad w ludzkim genomie. Nazwa
Celera, bo tak została nazw ana firma, pochodzi od
angielskiego słowa ce le rity, które w w olnym tłu m a­
czeniu znaczy szybkość. W łaśnie szybkość pro w a­
dzenia przez tę firm ę badań je s t jej głów nym atutem.
W edług szefów firmy now atorskie podejście do se­
kw encjonow ania genom u, opierające się na m eto ­
dzie „sh o tg u n ” (objaśnionej w kolejnym rozdziale),
jak i 300 w pełni autom atycznych sekw enatorów
PRISM 3700 firmy Perkin E lm er [27], które p o łączo ­
ne są z najpotężniejszym ze stosowanych, cyw ilnym
kom puterem , m a przyczynić się do światowej d o m i­
nacji w przedsięwzięciu badania sekwencji gen o ­
mów organizm ów wyższych, a w szczególności g e­
nom u człowieka. Każdy z tych sekw enatorów za w ie­
ra 96 kapilar, a w ydajność w szystkich 300 szacow a­
na je s t na ponad 100 m ilionów odczytanych zasad
dziennie. Komputer, który stw orzyła firma C om paq
ma gigantyczną moc obliczenio w ą — 1,3 tryliona
operacji na sekundę.
III—1. Strategia sekwencjonow ania
Strategia, stosowana przez tę firm ę polega na se­
kw encjonow aniu losowych klonów pokryw ających
cały ludzki genom (ang. w hole-genom e shotgun
seq u en cin g ) [28]. G łów nym jej założeniem je s t sekw encjonow anie ludzkiego D N A jak o całości, bez
wstępnej selekcji fragmentów, w przeciw ieństw ie do
strategii przyjętej w HGP, w której do analiz w ybiera
się konkretne odcinki genom u (patrz rozdział I I - 1).
Inną istotną różnicą w stosunku do strategii sto sow a­
nej przez HGP je s t klonow anie pofragm entow anego
DNA bezpośrednio do w ektorów sekwencyjnych.
(Ryc. Ib)
Tę strategię badawczą, jak o alternatyw ną i tańszą,
zaproponowali w 1997 roku Projektowi B ad aw cze­
m u — Genom Człowieka, J a m e s W e b e r i E u ­
g e n e M a y e r s (obecnie zatrudniony w firmie C e­
lera) [28]. Spotkała się ona je d n a k z ostrą krytyką
[29] ze strony badaczy zaangażow anych, w roz w ija­
nie pierw otnie przyjętej strategii sekw encjonow ania
(rozdział II-1). Sugerowali oni, że z pow odu wielu
przerw w uzyskanej sekwencji doprow adzenie jej do
postaci kompletnej będzie bardzo kosztowne, a całe
przedsięwzięcie niezw ykle ryzykowne.
Etapy uzyskiwania sekwencji w strategii „sh o t­
gun” :
1. Fizyczna fragm entacja całego genom ow ego
D N A na krótkie odcinki o długości około 2 kpz,
POSTĘPY BIOCHEMII 46(2), 2000
oraz niezależna fragm entacja na odcinki dłuższe
około 10 kpz. A utonom iczne pozyskiw anie frag­
m entów o długości około 150 kpz. (m etodę opi­
sano w rozdziale I I - 1.1.)
2. W klonow anie fragm entów ~2 kpz i - 1 0 kpz do
wektorów plazm idow ych pochodnych pUC, o d ­
pow iednio o w ysokim i o niskim w spółczynniku
replikacji. Klony z krótszym i insertami stanow ią
większość m atryc do sekw encjonow ania, p o d ­
czas gdy klony z dłuższym i insertami są m atryca­
mi obejm ującym i m.in. elem enty repetytywne
np. L in e -1. F ragm enty o wielkości około 150 kpz
w k lonow yw ane są do w ektorów BAC. F rag m en ­
ty sekwencji insertów uzyskane z tych klonów,
stanow ią „platform ę” , na k tórą nanoszone są se­
kwencje insertów uzyskane z klonów po ch o d ­
nych pUC. Sekwencje końców BAC po zyskiw a­
ne są także z „serwera k lo n ó w ” HGP [15].
3. Sekw encjonow anie odcinków o długości około
500 pz z obu końców insertu, z losowo w yb iera­
nych klonów pUC i BAC. Ponieważ sekwencjonow ane są tylko końce insertów, a nie całe inser­
ty, całkow ita długość uzyskanej sekwencji musi
być kilkukrotnym ek w iw alentem jej wyjściowej
długości [10].
4. Analiza uzyskanych w yników przy pom ocy spe­
cjalistycznego oprogram ow ania, składającego
fragm enty sekwencji w całość, zainstalow anego
na kom puterze C om paą.
5.
Identyfikacja i uzupełnianie przerw w uzyskanej
sekwencji. W celu identyfikacji przerw w y k o ­
rzystuje się takie techniki jak: hybrydyzację
DNA m etod ą Southerna lub FISH do rozciągnię­
tych w łókien chrom atynow ych [13]. W celu ich
uzupełniania stosuje się B LA S TX , czyli k o m pu ­
terow y algorytm, w ykorzystujący końcow e se­
kwencje kontigów w w yszuk iw aniu „łączników
pep tyd ow ych ” ja k rów nież kroczenie starterami,
których sekwencje także p o ch odzą z końcow ych
elem entów kontigów. Na tym etapie, kłopotliwy
dla badacza jest brak uporządkow anych b iblio­
tek klonów, które w strategii sekw encjonow ania
stosowanej przez HGP stan ow ią punkt odniesie­
nia (punkt 3 i 4 w rozdziale I I -1). Punktem odn ie­
sienia dla stosujących m etodę „shotgun” jest cały
genom ow y DNA.
III-2. Postęp w sekw encjonow aniu genomu
Wybór przez firmę Celera G enom ics kontrow er­
syjnego podejścia [28, 29] do sekw encjonow ania
ludzkiego genom u, nie był bezpodstawny. P ierw ­
szym organizm em , którego genom został całkowicie
http://rcin.org.pl
193
poznany właśnie tą metodą, była bakteria H a em o p h i­
lus in ß u en za e [30]. Jednak porów nanie genom u tego
prokarionta — 1,83 Mpz, z genom em człow ieka —około 3 miliardam i pz je s t co najmniej ryzykowne.
Fakt ten dla b adaczy z firmy J . C . V e n t e r a zdaje
się nie stanowić trudności nie do pokonania. W e
wrześniu 1999 roku, firm a C elera ogłosiła, że za ko­
ńczyła fazę sekw encjonow ania genom u D rosophila
m elanogaster — m uszki ow ocow ej, organizm u m o ­
delowego, posiadającego genom zaw ierający 180
M pz [31]. Następnie, w raz z badaczam i biorącym i
udział w Projekcie P oznania G e n om u D rosophila z
U niwersytetu B erkeley w Kalifornii został w y k o n a­
ny ostatni etap poznaw ania sekwencji — składanie
jej fragm entów w całość [32]. Z sekw encjonow anie
genom u D rosophila, poza oczyw istym i korzyściam i
naukow ym i, pozw oliło bad aczom firmy Celera p o ­
znać m ożliw ości p osiadanego sprzętu, ja k i spraw ­
dzić stosow aną strategię w sek w encjonow aniu d u ­
żych genom ów. Pom im o, że genom tego organizm u
był intensywnie badany na długo przed utw orzeniem
firmy, Celera zidentyfikow ała kilka tysięcy now ych
genów, z około 14 tysięcy, jak im i dysponuje D ro ­
sophila. Po zsekw encjon ow aniu takiej liczby frag­
m entów DNA, że ich łączna długość przekraczała
13-krotnie wielkość genom u i próbie złożenia cząst­
kowych sekwencji w całość, pozostało nadal 1300
przerw w ciągłości sekwencji. Liczba ta w zestaw ie­
niu z 11 przerw am i, jak ie pozostały w w yniku złoże­
nia fragm entów sekwencji ch ro m oso m u 22, daje
pogląd na dokładność m etody „ shotgun”. Szybkość
m etody zaważyła je d n a k na jej wyborze, również
przez badaczy zw iązanych z HGP, do sekw encjono ­
wania genom u myszy [33].
Po zakończeniu etapu sekw encjo no w ania genom u
D ro sophila, w sierpniu 1999 roku firma Celera p o d ­
jęła badania genom u ludzkiego. Po sześciu m ie­
siącach, 10 stycznia 2000 C elera rozpow szechniła
wiadom ość, o zsekw encjonow aniu 90 % ludzkiego
genom ów 4 kolejnych ludzi i o zamiarze złożenia
uzyskanych fragm entów sekwencji w sekwencję g e ­
nom u w okresie 3 do 6 tygodni. Liczba nukleotydów
uzyskana podczas sekw encjonow ania pierwszego
genom u była zaledwie trzykrotnym , a nie jak w cze­
śniej planowano, dla zapew nienia dokładności uzy­
skanej sekwencji, dziesięciokrotnym ekw iw alentem
jeg o długości. W edług badaczy skupionych w HGP,
osiągnięty etap m ożna traktować jed ynie jako
półmetek, który nie p rzesądza o ostatecznym po w o ­
dzeniu projektu firmy Celera.
III-3. Źródła inform acji
Dostęp do danych prywatnej firmy, j a k ą je s t C ele­
ra, zgrom adzonych w procesie sekw encjonow ania
ludzkiego genom u je s t na tym etapie badań bardzo
utrudniony, poniew aż wartość nowo poznanej se­
kwencji, je s t w yjątkow o w ysoka, a Celera m a ró w ­
nież konkurentów w postaci innych pryw atnych
firm, takich ja k Incyte, GeneBio. Ponadto wielkie
koncerny farm aceutyczne, których założeniem jest
czerpanie korzyści z praktycznych zastosow ań w ie ­
dzy podstawowej, d ążą do opracow ania no w o c ze­
snych leków, na podstaw ie znanej sekwencji genów.
Według ostatnich doniesień [36], dopiero, gdy cała
sekwencja ludzkiego genom u zostanie poznana, b ę ­
dzie ona dostępna na dyskach optycznych, ja k i pod
internetowym adresem firmy [37]. R oczny dostęp do
podstaw ow ych danych będzie kosztować du żą firmę
kom ercyjną około 15 m ilionów USD, a opłata dla la­
boratoriów uniw ersyteckich m a wynieść od 5 do 15
tysięcy USD. Jest to niepokojąca w iadom ość, tym
bardziej, ż e C r a i g V e n t e r zapewniał wcześniej
komisję K ongresu Stanów Zjednoczonych, że
w szystkie dane, grom adzone w trakcie sekw encjon o­
wania ludzkiego genom u, deponow ane będ ą co
kwartał, w publicznej bazie danych GenBank. Innym
faktem je st zadeklarow any przez firmę Celera, z a ­
DNA, co w porów naniu z osiągnięciam i HGP było
nad wyraz dobrym w ynikiem [34], W rzeczy samej,
powyższa inform acja nie była do końca prawdziwa,
gdyż firma w ykorzystała rów nież sekw encje zgro­
madzone w GenBank, czyli uzyskane m.in. w w y n i­
miar patentowania nowo poznanej sekwencji kilku­
set genów, co w edług wielu badaczy może opóźnić
postęp w ich badaniach i potencjalnym w yk o rz y sta­
niu.
ku prac HGP. Udział tych ostatnich w ynosił 9 %. Na
podstawie analiz statystycznych ja k i porów nania ze
znanymi genami, V e n t e r sugerował, że 97 procent
wszystkich ludzkich genów znajdow ało się ju ż w b a ­
zie danych jeg o firmy [35],
6 kwietnia 2000 roku, J . C . V e n t e r ogłosił
ukończenie etapu sekw encjon ow an ia genom u p ierw ­
szego człowieka, anonim ow ego mężczyzny, infor­
mując jedn ocześn ie o planach sekw encjonow ania
III-4. Firma Celera G enom ics w XXI wieku
194
Głównym celem, jaki postawili sobie badacze z
firmy Celera je s t zsekw encjonow anie ludzkiego g e ­
nomu, zanim dokona tego HGP. Faza sam ego se­
kwencjonowania, została ju ż ukończona. Do końca
roku 2000 sekwencja genom u człow ieka m a być
dokładnie opisana i opublikowana. W krótce po tym,
firma planuje poznanie sekwencji genom ów kolej­
http://rcin.org.pl
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
nych organizm ów : myszy, ryżu, czy niektórych m i­
kroorganizm ów i odegranie znaczącej roli w b a d a ­
niach proteo m u [38]. R ów nie istotnym zadaniem ,
w edług szefów firmy, je s t rozw ijanie dom eny bioinform atycznej, której narzędzia służące do analizy
poznanej ju ż sekw encji p rzy czy n ią się do jej lepsze­
go zrozum ienia. Bardziej daleko siężny m celem fir­
my, jest zd ob ycie pozycji n ajw iększego i najp ełniej­
szego źródła inform acji, dotyczącej genom iki i b io ­
logii m olekularnej na Ziem i [37].
IV. P od su m ow an ie
W artykule tym przed staw ion e zostały dwa p o d e ­
jścia do s ek w e n cjo now ania genom u człowieka. Stra­
tegia sek w en cjo now ania „klon po klo n ie” , k tórą sto­
sują laboratoria skupione w HGP, oraz strategia se­
k w encjono w an ia losow ych klo nów pokryw ających
cały ludzki genom , k tó rą w ykorzystuje firm a Celera.
N iezależnie od tego, która z nich okaże się szybsza i
skuteczniejsza, osiągnięty cel w postaci całkowitej
sekwencji ludzkiego D N A b ędzie najw ażniejszym z
dotych czasow y ch osiągnięć w badaniach biologii
człowieka. N aw iązu jąc do w yp ow ied zi F . C o 11 i n s a [39], m ożna przypom nieć je g o słowa, że w łaści­
wie w każdej z chorób człow ieka czynnik g en etycz­
ny gra sw oją rolę. Gdy cała sekw encja ludzkiego g e ­
nom u będzie poznana, w yszu kiw an ie i wyjaśnianie
korelacji p om iędzy genami, a chorobam i ulegnie
znacznem u przyspieszeniu.
Należy je d n a k pam iętać, że nie m a jednej sek w e n ­
cji genom u, je s t ich w łaściw ie ponad 6 miliardów,
tyle ile je s t ludzi na Ziemi. Z uwagi na to, trw ają ju ż
intensywne prace zm ierzające do poznania ró ż n o ­
rodności gen o m u w obrębie gatunku ludzkiego. P o ­
wstało m.in. konsorcjum do badań polim orfizm ów
pojedynczych nu kleotydów SNP, którego celem jest
zidentyfikow anie kilkuset tysięcy miejsc polimorficznych, w ystępu jących w genom ie człowieka[40].
Inną w ażną inicjatyw ą je s t realizow any od kilku lat
Projekt P oznania G enom u K om órek N o w o tw o ro ­
wych (ang. C ancer G enom e A n a t om y P roject) [41].
Jego celem jest poznanie, w w yniku kom pleksow o
prow adzonych badań, w szystkich szlaków m utacy j­
nych i zm ian w ekspresji genów, które w a run kują p o ­
w staw anie nowotworów . W ym ienione przykładow e
obszary badań genom iki, prz eży w a ją obecnie d y n a­
m iczny rozwój. Poznanie całkowitej sekwencji ge­
nom u człow ieka nada tym badaniom now y wymiar.
Podziękowania
Praca finansow ana z grantu KBN — 6P04B 031 18
POSTĘPY BIOCHEM II 46(2), 2000
Artykuł otrzymano 6 kwietnia 2000 r.
Zaakceptowano do druku 17 kwietnia 2000 r.
P iśm iennictw o
1. W a t s o n J D , C r i c k F H C (1953) Nature 171: 737
2. S a n g e r F (1977) Proc Natl A cad Sci U S A 74: 5463-5467
3. USDept. o f Health and Human Services, US Dept, o f Energy ( 1990)
Gov Print Office 1590
4. C z a r n y J, J a s i ń s k a A, K o z ł o w s k i P , N a p i e r a ł a
M , S o b c z a k K, W o ź n i a k M ( 1997) W : K r z y ż o s i a k W
(red) Genom Człowieka — największe wyzwanie współczesnej gene­
tyki i medycyny molekularnej, PW N, Warszawa.
5. C o l l i n s F S , P a t r i n o s A, J o r d a n E, C h a k r a v a r t i
A, G e s t e l a n d R , W a l t e r s L (1998) Science 282: 682-689
6. D u n h a m I, S h i m i z n N , R o e B A i w s p , (1999) Nature
402: 489-495
7. http://www.sanger.ac.uk/HGP/overview.shtml
8. V e n t e r J C , S m i t h H O , H o o d L (1996) Nature 381:
364-366
9. S h i z u y a H, B i r r e n B , K i m U, M a n c i n o V, Ś l e p a k
T, T a c h i r i Y , S i m o n M (1992) Proc Natl Acad Sci 89:
8794-8797
10. B o d e n t e i c h A i w s p . ( 1 9 9 4 ) W: A d a m s M D ,
F i e l d s C h , V e n t e r J C (red) Autom ated DNA sequencing and
analysis. Academic Press, USA San Diego, str. 42-50
11. http://www.genome.ou.edu
12. R o a c h J C , S i e g l A F , E n g h G, T r a s k B, H o o d L
(1999) Nature 401: 843-845
1 3 . S j o b e r g A, P e e l m a n L J , C h o w d h a r y B P (1997)
Chromosome Res 5: 247-253
14. Z h a o S (2000) Nucleic Acids Res 28: 129-132
15. http://www.ncbi.nlm.nih.gov
16. M a r s h a l E (1999) Science 284: 1439-41
17. M o r t o n N E (1991) Proc Nat A cad Sci USA 88: 7474-7476
18. Z u L , F i g u e r o a K P , G r e w a l R, P u l s t S M (1999) A m J
Hum Gen 64: 594-599
19. The MHC Sequencing Consortium (1999) Nature 401: 921-923
20. Human Genome Project (2000) Press Release 13 kwiecień,
http://w ww.om l.gov/hgm is/project/51619jgi.htm l
2 1 . W h e e l e r D L , C h a p p c y C, L a s h A E , L e i p e D D ,
M a d d e n TL , S c h u l e r GD , T a t u s o v a T A, R a p p BA
(2000) Nucleic Acids Res 28: 10-14
22. B e n s o n D A , K a r s c h - M i z r a c h i I, L i p m a n D J ,
O s t e l l J , R a p p B A , W h e e l e r D L (2000) Nucleic Acids
Res 28: 15-18
23. O u e l l e t t e F (1999) Clin Genet 56: 179-185
24. http://www.nhgri.nih.gov:80/NEW S/collins_approp.html
25. P e n n i s i E (2000) Science 267: 1178-1181
26. V e n t e r J C , A d a m s M D , S u t t o n G G , K e r l a v a g e
A R , S m i t h H O , H u n k a p i l l e r M (1998) Science 280:
1541-1542
27. M u l l i k i n J C , M e M u r r a y A A (1999) Science 283:
1867-1868
28. W e b e r J L , M a y e r s E W (1997) Genome Res 7: 401-409
29. G r e e n P (1997) Genome Res 7: 410-417
30. F l e i s h m a u n R, A d a m s M D , W h i t e O i w s p . (1995)
Science 296: 496-511
31. P e n n i s i E (2000) Science 287: 2182-2184
32. A d a m s M D , C e l n i k e r S E , H o l t R A i w s p . (2000)
Science 287: 2185 — 2195 (i inne artykuły w tym numerze Science)
33. P c n n i s i E (2000) Science 287: 1179-1180
34. Celera Genomics (2000) PE Press Releases
35. S m a g l i k P, B u t l e r D (2000) Nature 403: 119
36. B u t l e r D, S m a g l i k P (2000) Nature 403: 231
37. http://www.celera.com
38. Sendee RF (2000) Science 287: 2136-2138
39. http://www.nhgri.nih.gov/NEW S/Freegenes/indcx.html
40. M a s o o d E (1999) Nature 398: 545-546
4 1 . S t r a s b u r g e r R L , B u e t o w KH, E m m e r t - B u c k MR,
K l a u s n c r R D (2000) TIG 16: 103-105
http://rcin.org.pl
195
Prenumerata P O S T Ę P Ó W
B I O C H E M I I rok 2000
dla nie zrzeszonych w PTBioch
dla członków PTBioch
dla zakładów i bibliotek
40.00 zł
20.00 zł
70.00 zł
Składka P.T.Bioch.
za rok 2000
studenci
30.00 zł
10.00 zł
http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
Download PDF

advertising