Automatização de ensaios enzimáticos usando a análise por

Automatização de ensaios
enzimáticos usando a análise por
injecção sequencial
André Ricardo Tomás dos Santos Araújo Pereira
Tese do 3º Ciclo de Estudos Conducentes ao Grau de Doutor em
Ciências Farmacêuticas com especialização em Química Analítica
Trabalho realizado sob a orientação da
Professora Doutora Maria Lúcia Marques Ferreira de Sousa Saraiva
e co-orientação do
Professor Doutor José Luís Fontes da Costa Lima
Porto
Fevereiro de 2011
É autorizada a reprodução integral desta tese apenas para efeitos de investigação,
mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete.
ii
iii
Dedico esta tese à memória do meu pai.
À minha mãe e ao meu irmão.
À Catarina, por existir.
Agradecimentos
Agradecimentos
Ao Professor Costa Lima agradeço o convite e a oportunidade de me ter acolhido
no grupo de investigação de Química-Física, bem como de ter sido co-orientador do
trabalho aqui apresentado.
À Professora Lúcia Saraiva agradeço o facto de ter sido a minha orientadora e de
me ter acompanhado ao longo destes anos. Foi um privilégio ter iniciado consigo a
estrada da investigação e agradeço-lhe todos os ensinamentos transmitidos e de me ter
concedido autonomia, apoio e a sua amizade.
A todos os docentes da faculdade que, de uma forma ou outra, me ajudaram a
crescer em sabedoria e humanidade. Agradeço em especial aos professores do nosso
departamento, em especial ao Professor João Santos, pelo companheirismo, e à
Professora Salette pela amizade, presença e colaboração num dos trabalhos da tese.
Uma palavra de grande estima para o Professor Carlos Afonso, porque despertou em
mim o sentimento de investigação, pelo exímio exemplo que representa, pela grande
amizade que nutro e pela disponibilidade que sempre manifestou.
Ao Professor Victor Cerda por me ter acolhido no seu laboratório em Palma de
Mallorca, pela ajuda e amizade demonstradas, bem como ao Professor José Manuel
Estela a simpatia, a camaradagem e a supervisão do trabalho desenvolvido.
A todos os meus colegas do serviço de Química-Física, desde as gerações
anteriores até à actual, pelo companheirismo, pela ajuda e pela presença. Ao David
Ribeiro, a quem considero como um irmão, pela aventura, ajuda, partilha e preocupação
constante. Ao Rodrigo, pela ajuda prestada ao longo destes anos, pela amizade e pela
integridade sempre demonstrada. Uma palavra de estima para a Marlene, pela presença
e pela atenção sempre demonstradas e pela ajuda em momentos mais difíceis. Uma
palavra de carinho para a Eunice, pela forma tão especial como sempre me tratou, pelos
momentos partilhados e pelo sentimento de amizade eterno.
À Engenheira D. Manuela o pronto-socorro, a boa disposição e a simpatia sempre
demonstradas.
A todos os colegas além-fronteiras que enriqueceram muito o nosso laboratório.
Um abraço em especial aos cabras Josué, José Rufino e Prof. Júnior, do Brasil, e ao
Daniel e à Vanesa de Valência.
A todos os colegas do laboratório de Palma pela forma como me receberam, como
partilharam a minha estadia e a forma como se despediram. Agradeço a oportunidade de
ter embarcado nesta experiência. Um abraço especial ao Fernando, pela amizade e
ajuda constantes e o facto de ter sido decisivo no trabalhado desenvolvido e ao
vii
Agradecimentos
Carlos, pelo companheirismo. Um beijo especial para a Mailén, Jessica, Ruth e Camélia,
pelo carinho sempre demonstrado. Uma palavra sentida ao meu amigo Matias, pela
experiência partilhada no Porto, pelo “suporte humano” em Palma e pela amizade
verdadeira, recíproca e eterna.
A todos os meus amigos, que se cruzaram nesta longa caminhada, que mesmo
não estando presentes, foram muitos importantes e me fizeram evoluir como Homem.
A toda a minha família, em especial aos meus padrinhos e primos, aos meus pais
e ao meu irmão. Aos meus padrinhos Alfredo e Aurora, por me terem acompanhado
desde sempre e aos meus primos Hugo e Luís por representarem uma fonte de alegria,
inspiração e carinho constante. Aos meus pais Rodrigo e Rosa, por tudo o que sempre
fizeram e fazem por mim, pelo amor e carinho, pela dedicação contínua…simplesmente
ao meu grande pai por tudo o que representa, que certamente seria das pessoas mais
felizes se estivesse entre nós. À minha grande mãe, que este momento represente algum
reconforto nesta fase da vida, alegria e orgulho por termos chegado até aqui. Ao meu
mano Jorge, os ensinamentos desde pequeno, a partilha ao longo desta caminhada, o
carinho, a preocupação de irmão e a motivação.
Agradeço também à família da Catarina, em especial aos meus sogros Manuel
Joaquim e Guiomar, pela motivação e ajuda permanentes, e ao meu cunhado Rafael, por
ter preenchido o nosso espaço com alegria e boa disposição, pela companhia e pela
amizade construída.
Por último agradeço à minha esposa Catarina, a quem dedico esta tese. Primeiro,
porque foi quem me incentivou a optar por este caminho. Depois, pela companhia,
paciência e motivação que sempre demonstrou. Pela esperança que sempre teve, nos
momentos mais difíceis. Pela força e dedicação que me transmitiu para encerrar esta
etapa da vida. Por último, pela esposa que é e pela mãe que virá a ser. O meu sincero
obrigado.
viii
Resumo
Resumo
Neste trabalho, foram exploradas as potencialidades da associação da biocatálise
com as vantagens inerentes da automatização recorrendo ao conceito de análise por
injecção
sequencial.
O
conjunto
de
procedimentos
enzimáticos
automáticos
desenvolvidos serviu de base ao surgimento de alternativas válidas e economicamente
viáveis na resolução de problemas a nível clínico, farmacêutico, alimentar e ambiental.
Em cada situação analítica foram avaliadas as condições que melhor se coadunavam
com a acção biocatalítica das enzimas e seleccionadas as condições óptimas de
operação dos sistemas de fluxo, visando a obtenção de módulos analíticos que
viabilizassem a realização dos ensaios em ambiente confinado e controlado de forma
estrita, com elevada eficiência, precisão e rapidez, mantendo os consumos e os efluentes
gerados a um valor mínimo.
As montagens desenvolvidas contemplaram o emprego das enzimas em duas
vertentes diferentes: como ferramentas bioanalíticas, para a determinação de substrato,
produto ou activador/inibidor, ou como analitos, para a avaliação da actividade enzimática
e sua inibição.
Foi implementado um sistema para a determinação dos substratos glutationa
reduzida e oxidada em amostras de sangue humano, baseado num ensaio de
amplificação da resposta à glutationa com a utilização do cromogéneo ácido 5,5´ditiobis(2-nitrobenzóico) e da enzima glutationa redutase.
Desenvolveu-se um sistema em que se propôs uma nova abordagem para a
determinação do metanol em amostras de biodiesel. Com a injecção directa das
amostras de biodiesel através de uma válvula de injecção e após passagem numa
unidade de extracção membranar, o metanol extraído era determinado em meio aquoso,
usando um sistema bienzimático constituído pela álcool oxidase imobilizada e pela
peroxidase em solução.
Propõe-se uma montagem para a avaliação da actividade enzimática da
fosfolípase A2 e do efeito inibitório de diferentes anti-inflamatórios sobre esta, com a
utilização de lipossomas como ambiente reaccional. Avaliaram-se as vantagens da
incorporação de câmaras de mistura no sistema, ao criaram-se condições favoráveis para
a monitorização da mudança do ambiente hidrofóbico em redor da sonda de
fluorescência interfacial empregue, causada pelo desenvolvimento da reacção enzimática
seleccionada.
Avaliou-se a actividade enzimática da tirosinase em meios reaccionais contendo
líquido iónico através da determinação dos parâmetros cinéticos da reacção de oxidação
ix
Resumo
do ácido caféico, confirmando estes meios reaccionais como alternativas vantajosas aos
solventes orgânicos convencionais para estudos biocataliticos. Adicionalmente, foi
estudado o comportamento de substratos análogos ao ácido caféico como inibidores da
reacção catalisada pela tirosinase.
Foi igualmente desenvolvida uma metodologia hifenizada SIA-MSFIA para a
avaliação do efeito de diferentes derivados fenólicos na reacção de quimiluminescência
baseada na oxidação do luminol, catalisada pela peroxidase. A utilidade analítica do
sistema proposto foi demonstrada na determinação do índice polifenólico e do teor de
fenol em vinhos e águas, respectivamente.
As metodologias automáticas propostas forneceram resultados estatisticamente
comparavéis aos obtidos usando o método de referência aplicável ou convencional de
comparação, quando estes existiam. Adicionalmente, as vantagens e limitações dos
sistemas propostos são discutidas.
Palavras-chave: Análise por injecção sequencial (SIA); enzimas; substrato; cinética;
inibição enzimática.
x
Abstract
Abstract
In this work the potentialities of the assembly of biocatalysis with the inherent
advantages obtained by means of automatization resorting to the sequential injection
analysis concept were exploited. The developed automatic enzymatic procedures showed
to be valuable and economical alternative solutions in several application fields, ranging
from clinical, pharmaceutical, food to environmental ones. In each analytical case it were
optimized the best conditions for the biocatalytic action of the enzymes and selected the
optimal values for the flow systems operation, with the aim of obtaining analytical modules
that enabled the assays to be performed in a closed and strictly controlled environment,
with high efficiency, precision and within a shorter timeframe, while minimising reagents
consumption and subsequent effluent generation.
The developed manifolds encompass the use of the enzymes in two categories: as
bioanalytical
tools,
with
the
aim
of
determining
the
substrate,
product
or
enhancer/inhibitor, or as analytes for the enzyme activity and inhibition determination.
An analytical system for the determination of the reduced and oxidized glutathione
substrates in human whole blood samples was implemented, based on the glutathione
recycling system with the combined use of the GSSG reductase enzyme and 5,5`dithiobis(2-nitrobenzoic acid).
A new approach for carrying out the methanol quantification in biodiesel samples
was proposed. With the direct injection of the biodiesel samples by means of an injection
valve and its propulsion through a membrane-based extraction unit, the extracted
methanol was determined in an aqueous environment, using a bienzymatic system
composed by the immobilized alcohol oxidase and soluble peroxidase.
A manifold for the evaluation of phospholipase A2 activity and the assessment of
the inhibitory effect of different anti-inflammatory drugs on its activity, using lipossomes as
reaction medium, was conceived. The advantages of placing mixing chambers in the
manifold, enabling favourable conditions to be created for an environmental shift to occur
around the interfacial fluorescence probe due to the hydrolytic action of phospholipase A2
on phospholipids, were evaluated.
The enzymatic activity of tyrosinase in reaction media containing ionic liquid was
assessed by the determination of kinetic parameters for the reaction of oxidation of the
poorly-water soluble substrate caffeic acid, supporting these reaction media as
advantageous alternatives to the conventional organic solvents for kinetic studies of
biocatalytic processes. Additionally, the behaviour of substrates analogues of caffeic acid
as potential tyrosinase inhibitors was estimated.
xi
Abstract
A hyphenated SIA-MSFIA system for the assessment of the effect of different
phenolic derivatives on the peroxidase-catalysed luminol chemiluminescence reaction
was developed. The analytical usefulness of the proposed system was demonstrated in
the polyphenol index and phenol content determination in wine and water samples,
respectively.
Finally, the results obtained by the developed automatic methodologies were
similar to those reported in the literature as well as statistically comparable with those
furnished by batch procedures. The advantages and limitations of the proposed flow
systems are also discussed.
Keywords: Sequential injection analysis (SIA); enzymes; substrate; kinetic; inhibition.
xii
Resumen
Resumen
En este trabajo, se investigó el potencial de la combinación de la biocatálisis con
las inherentes ventajas de los sistemas automatizados, mediante el uso de sistemas de
análisis por inyección secuencial. El conjunto de procedimientos enzimáticos automáticos
desarrollados sirvió de base para la aparición de alternativas válidas y económicamente
viables para la resolución de problemas a nivel clínico, farmacéutico, alimentario y
ambiental. En cada situación analítica se evaluaron las condiciones que mejor se
adaptaban a la acción biocatalítica de las enzimas y se seleccionaron las condiciones
óptimas de operación de los sistemas en flujo, con el fin de obtener procedimientos
analíticos que posibilitasen la realización de ensayos en ambientes confinados y
controlados de forma estricta, con una elevada eficiencia, precisión y rapidez,
minimizando tanto el consumo de reactivos como la generación de desechos.
Los montajes desarrollados contemplaron el uso de enzimas de dos modos
diferentes: como herramienta bioanalítica, para la determinación de substrato, producto o
activador/inhibidor, o como analitos, para evaluar su actividad enzimática y su inhibición.
Se implementó un sistema para la determinación de los sustratos glutatión
reducido y oxidado en muestras de sangre humana, basado en el ensayo de
amplificación de la respuesta de la glutationa mediante la utilización del cromóforo ácido
5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico y la enzima glutationa reductasa.
Se desarrolló un sistema en el que se propone un nuevo enfoque para la
determinación de metanol en muestras de biodiesel. Mediante la inyección directa de las
muestras de biodiesel, usando para ello una válvula de inyección y el posterior paso por
una unidad de extracción de membrana, el metanol extraído en medio acuoso se
determinó, mediante un sistema bienzimático constituido por la alcohol oxidasa
inmovilizada y la peroxidasa en disolución.
Se propuso un montaje para la evaluación de la actividad enzimática de la
fosfolipasa A2 y el efecto inhibitorio de diferentes antiinflamatorios sobre esta, mediante el
uso de liposomas como medio de reacción. Se evaluaron las ventajas de la incorporación
de cámaras de mezcla en el montaje, creándose las condiciones favorables para la
monitorización, mediante el uso de una sonda de fluorescencia interfacial, del cambio del
medio hidrofóbico envolvente causado por la reacción enzimática seleccionada.
Se evaluó la actividad enzimática de la tirosinasa en medios de reacción que
contenían líquidos iónicos mediante la determinación de los parámetros cinéticos de la
reacción de oxidación del ácido caféico, confirmando que en estudios biocatalíticos estos
medios de reacción son una alternativa ventajosa con respecto a los medios orgánicos
xiii
Resumen
convencionales. Adicionalmente, se estudió el comportamiento de substratos análogos al
ácido caféico como inhibidores de la reacción catalizada por la tirosinasa.
Finalmente se desarrolló una metodología SIA-MSFIA para la evaluación del
efecto de diferentes derivados fenólicos en la reacción de quimioluminiscencia basada en
la oxidación del luminol, catalizada por la peroxidasa. Este sistema se utilizó para la
determinación del índice de polifenoles y del contenido de fenol en vinos y agua,
respectivamente.
Las
metodologías
automáticas
propuestas
suministraron
resultados
estadísticamente comparables a los obtenidos usando métodos de referencia aplicables o
convencionales de comparación, cuando estos existían. Adicionalmente, se discutieron
las ventajas y limitaciones de los sistemas propuestos.
Palabras clave: Análisis por inyección secuencial (SIA); enzimas; substrato; cinética;
inhibición enzimática.
xiv
Índice geral
Índice geral
Agradecimentos
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vii
Resumo
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ix
Abstract
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xi
Resumen
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xiii
Índice geral
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xv
Índice de figuras
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xxi
Índice de tabelas
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.
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xxv
Lista de abreviaturas .
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.
.
.
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.
.
xxvii
Capítulo 1 – Introdução
.
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.
.
.
.
.
1
1.1. Métodos automáticos de análise
.
.
.
.
.
.
3
1.1.1. Análise por injecção sequencial .
.
.
.
.
.
6
1.1.1.1. Fundamentos e características .
.
.
.
.
6
1.1.1.2. Componentes
.
.
.
.
7
.
.
.
.
10
.
14
.
.
18
.
.
19
.
.
22
1.2.1.1.2. Sistemas SIA baseados em biosensores enzimáticos .
29
.
.
.
1.1.1.3. Dispersão e sobreposição de zonas
1.2. Associação dos ensaios enzimáticos à análise por injecção sequencial
1.2.1. Emprego das enzimas como reagentes bioanalíticos .
1.2.1.1. Utilização das enzimas imobilizadas
.
.
1.2.1.1.1. Sistemas SIA com reactores enzimáticos
1.2.1.2. Utilização das enzimas livres em solução
.
.
.
33
1.2.2. Emprego das enzimas em ensaios de actividade e inibição
enzimática
.
.
.
.
.
.
40
1.3. Enquadramento geral e objectivos propostos .
.
.
.
.
44
1.4. Referências bibliográficas
.
.
.
.
.
.
.
45
Capítulo 2 – Parte experimental
.
.
.
.
.
.
.
55
2.1. Introdução
.
.
.
.
.
.
.
.
57
2.2. Reagentes e soluções
.
.
.
.
.
.
.
.
57
2.3. Instrumentação .
.
.
.
.
.
.
.
.
58
2.3.1. Equipamento auxiliar
.
.
.
.
.
.
.
58
2.3.2. Sistemas de fluxo
.
.
.
.
.
.
.
59
2.3.2.1. Unidades de aspiração/propulsão
.
.
.
.
59
2.3.2.2. Dispositivos de selecção de fluidos
.
.
.
.
61
.
.
.
.
xv
Índice geral
2.3.2.3. Tubagem e outros componentes das montagens
.
.
63
2.3.2.4. Registo e aquisição do sinal analítico .
.
.
.
66
2.3.2.5. Controlo informático dos sistemas
.
.
.
67
.
2.4. Estudo das variáveis e avaliação das características de funcionamento dos
.
.
.
.
.
.
68
2.5. Tratamento estatístico dos resultados .
.
.
.
.
.
70
2.6. Referências bibliográficas
.
.
.
.
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71
métodos desenvolvidos
.
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.
.
Capítulo 3 – Determinação da glutationa reduzida e glutationa oxidada em
sangue total .
.
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.
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.
.
.
.
73
3.1. Introdução
.
.
.
.
.
.
.
.
.
75
3.1.1. Desenvolvimento de um sistema automático para a determinação da
glutationa reduzida e oxidada em amostras de sangue
3.2. Material e métodos
.
.
.
.
75
.
.
.
.
.
.
.
80
3.2.1. Reagentes e soluções .
.
.
.
.
.
.
80
3.2.2. Colheita da amostra e processamento .
.
.
.
.
81
3.2.3. Aparelhagem
.
.
.
.
81
3.2.4. Metodologia convencional de comparação
.
.
.
.
83
3.2.5. Procedimento experimental
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
84
.
.
.
.
.
.
.
86
3.3.1. Optimização do sistema .
.
.
.
.
.
.
87
3.3.2. Análise de amostras de sangue humano
.
.
.
.
91
3.3.3. Estudo de interferentes .
.
.
.
.
94
3.3.4. Figuras de mérito e validação do método desenvolvido
.
.
95
3.3. Resultados e sua discussão
3.4. Conclusões
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
99
3.5. Referências bibliográficas
.
.
.
.
.
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.
101
Capítulo 4 – Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
com extracção líquido-líquido por membrana
.
.
.
.
.
107
4.1. Introdução
.
.
.
.
.
109
.
.
.
.
4.1.1. Desenvolvimento de um sistema automático para a determinação do
metanol em amostras de biodiesel
.
.
.
.
.
.
109
.
.
.
.
.
.
.
113
4.2.1. Reagentes e soluções .
.
.
.
.
.
.
113
4.2.1.1. Reagentes usados no processo de imobilização
.
.
113
4.2.1.2. Procedimento de imobilização .
.
.
113
4.2. Material e métodos
xvi
.
.
.
Índice geral
4.2.2. Aparelhagem
.
.
.
.
.
.
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.
114
4.2.3. Metodologia convencional de comparação
.
.
.
.
116
4.2.4. Procedimento experimental
.
.
.
.
.
.
118
.
.
.
.
.
.
.
119
4.3.1. Optimização do sistema .
.
.
.
.
.
.
119
.
.
.
.
.
127
4.3. Resultados e sua discussão
4.3.2. Análise das amostras de biodiesel
4.4. Conclusões
.
.
.
.
.
.
.
.
.
129
4.5. Referências bibliográficas
.
.
.
.
.
.
.
130
Capítulo 5 – Avaliação do efeito dos anti-inflamatórios não-esteróides
sobre a actividade da fosfolípase A2 utilizando lipossomas
.
.
.
133
5.1. Introdução
.
.
.
135
.
.
.
.
.
.
5.1.1. Desenvolvimento de um sistema automático para a avaliação do
efeito dos anti-inflamatórios não-esteróides na actividade da fosfolípase A2
usando lipossomas como modelos membranares
5.2. Material e métodos
.
.
.
.
.
135
.
.
.
.
.
.
.
138
5.2.1. Reagentes e soluções .
.
.
.
.
.
.
138
5.2.2. Preparação dos lipossomas
.
.
.
.
.
.
138
5.2.3. Aparelhagem
.
.
.
.
.
.
139
5.2.4. Método discreto de comparação
.
.
.
.
.
141
5.2.5. Procedimento experimental
.
.
.
.
.
.
141
.
.
.
.
.
.
.
144
5.3.1. Optimização do sistema .
.
.
.
.
.
.
144
.
5.3. Resultados e sua discussão
.
5.3.2. Aplicação do método desenvolvido para avaliar o efeito inibitório dos
AINEs e do ácido lipóico na actividade da PLA2
.
.
.
.
147
5.3.3. Validação dos resultados obtidos pelo método desenvolvido com os
fornecidos pelos ensaios realizados em modo discreto
5.4. Conclusões
.
.
.
.
149
.
.
.
.
.
.
.
.
151
5.5. Referências bibliográficas
.
.
.
.
.
.
.
153
Capítulo 6 – Avaliação da cinética da oxidação do ácido caféico catalisada
pela tirosinase em sistemas contendo líquido iónico .
.
.
.
157
6.1. Introdução
.
.
.
159
.
.
.
.
.
.
6.1.1. Desenvolvimento de um sistema automático para a avaliação da
cinética da reacção de oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase
em meio de líquido iónico
.
.
.
.
.
.
.
159
xvii
Índice geral
6.2. Material e métodos
.
.
.
.
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.
.
.
162
6.2.1. Reagentes e soluções .
.
.
.
.
.
.
162
6.2.2. Aparelhagem
.
.
.
.
.
.
163
.
.
.
.
.
.
164
.
.
.
164
.
.
6.2.3. Procedimento experimental
6.2.3.1. Determinação das velocidades de reacção
6.3. Resultados e sua discussão
.
.
.
.
.
.
.
166
6.3.1. Optimização do sistema .
.
.
.
.
.
.
167
6.3.1.1. Ordem de aspiração e volume de solução enviado para o
detector
.
.
.
.
.
.
.
.
.
168
6.3.1.2. Concentração de enzima
.
.
.
.
.
169
6.3.1.3. pH e temperatura reaccional
.
.
.
.
.
170
6.3.2. Determinação dos parâmetros cinéticos da reacção de oxidação do
ácido caféico catalisada pela tirosinase em sistemas aquosos contendo
LI/solvente orgânico
.
.
.
.
.
.
.
.
172
6.3.3. Avaliação do efeito dos inibidores sobre a actividade difenolase da
tirosinase em sistemas aquosos contendo LI .
6.4. Conclusões
.
.
.
.
.
175
.
.
.
.
.
.
.
.
178
6.5. Referências bibliográficas
.
.
.
.
.
.
.
179
Capítulo 7 – Avaliação do efeito de diferentes derivados fenólicos no
sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase .
.
.
.
.
.
183
7.1. Introdução
.
.
.
.
.
185
.
.
.
.
7.1.1. Desenvolvimento de uma metodologia automática para a avaliação
do
efeito
de
diferentes
derivados
fenólicos
no
sistema
de
quimiluminescência composto por luminol, peróxido de hidrogénio e
.
.
.
.
.
.
.
.
185
.
.
.
.
.
.
.
.
187
7.2.1. Reagentes e soluções .
.
.
.
.
.
.
187
7.2.2. Aparelhagem
.
.
.
.
.
.
188
7.2.3. Metodologias convencionais de comparação .
.
.
.
189
7.2.4. Procedimento experimental
peroxidase
.
7.2. Material e métodos
.
.
.
.
.
.
.
190
.
.
.
.
.
.
.
192
7.3.1. Optimização do sistema .
.
.
.
.
.
.
192
7.3.1.1. Parâmetros físicos
.
.
.
.
.
.
192
7.3.1.2. Parâmetros químicos
.
.
.
.
.
.
194
7.3. Resultados e sua discussão
xviii
.
Índice geral
7.3.2. Aplicação da metodologia SIA-MSFIA desenvolvida à avaliação do
efeito dos derivados fenólicos sobre o sistema luminol-H2O2-POD .
.
196
7.3.3. Determinação do teor de compostos fenólicos em matrizes
alimentares e ambiental
.
.
.
.
.
.
.
200
.
.
.
.
.
.
.
.
207
7.5. Referências bibliográficas
.
.
.
.
.
.
.
208
Capítulo 8 – Conclusões gerais
.
.
.
.
.
.
.
213
7.4. Conclusões
.
xix
Índice de figuras
Índice de figuras
Capítulo 1 – Introdução
Figura 1.1. Esquema básico de uma montagem de um sistema de análise por injecção sequencial
(parte superior). Representação esquemática da sobreposição das zonas de reagentes e de
amostra e formação do produto da reacção (parte inferior)
.
.
.
.
.
7
Figura 1.2. Representação esquemática de duas posições consecutivas da válvula selectora de
fluidos
.
.
.
.
.
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.
.
.
.
.
8
Figura 1.3. Diagrama esquemático ilustrativo da versatilidade dos sistemas SIA como ferramenta
de manipulação e processamento das amostras
.
.
.
.
.
.
9
Figura 1.4. Representação esquemática do contributo da inversão do sentido de escoamento na
dispersão da amostra no transportador
.
.
.
.
.
.
.
10
Figura 1.5. Representação esquemática da dispersão radial promovida no tubo enrolado em
figuras de oito
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
11
Figura 1.6. Representação gráfica do grau de sobreposição de duas zonas adjacentes num
sistema SIA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
12
Figura 1.7. Esquema básico de uma montagem de um sistema de análise por injecção sequencial
com enzimas imobilizadas .
.
.
.
.
.
.
.
.
19
Figura 1.8. Representação esquemática de um corte transversal do chip microfluídico, na qual
pode ser observada a coluna enzimática imobilizada .
.
.
Figura 1.9. Esquema representativo de uma célula de fluxo “jet ring cell”
.
.
.
26
.
.
.
31
Capítulo 2 – Parte experimental
Figura 2.1. Representação esquemática dos componentes de uma válvula selectora da Valco
Instruments
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
61
Figura 2.2. Representação esquemática das posições da válvula de injecção do equipamento
Crison utilizado no Capítulo 4
.
.
.
.
.
.
.
Figura 2.3. Válvula solenóide de 3 vias (A); Representação esquemática do seu interior (B)
.
62
.
63
Figura 2.4. Fotografia da unidade de extracção (A); Representação esquemática da vista de topo
da cavidade da referida unidade (B)
.
.
.
.
.
.
.
64
.
.
.
.
.
.
65
Figura 2.6. Fotografia da câmara de agitação magnética
.
.
.
.
.
65
Figura 2.7. Fotografia da câmara de mistura
.
.
.
.
.
66
.
76
Figura 2.5. Fotografia do reactor enzimático
.
Capítulo 3 – Determinação da glutationa reduzida e da glutationa oxidada em sangue total
Figura 3.1. Estruturas químicas da glutationa reduzida (GSH) e da glutationa oxidada (GSSG)
Figura 3.2. Esquema do módulo analítico desenvolvido para a quantificação da glutationa
reduzida e oxidada em amostras de sangue humano (A). Fotografia da montagem desenvolvida
(B)
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
82
Figura 3.3. Curvas de calibração para a GSH e para a GSSG obtidas usando a metodologia
convencional de comparação, expressas em GSH
.
Figura 3.4. Ensaio de regeneração DTNB-glutationa redutase
.
.
.
.
.
84
.
.
.
.
86
xxi
Índice de figuras
-1
Figura 3.5. Estudo de diferentes concentrações do par GR/NADPH: (♦) 0,4 U mL GR / 0,4 mmol
-1
-1
-1
-1
-1
L NADPH; (□) 5,0 U mL GR / 0,4 mmol L NADPH; (▲) 4,0 U mL GR / 0,8 mmol L NADPH e
-1
-1
(○) 5,0 U mL GR / 0,8 mmol L NADPH
.
.
.
.
.
.
.
88
Figura 3.6. Estudo da influência da concentração de KH2PO4 (□) e do pH (♦) da solução
transportadora na sensibilidade do método .
.
.
.
.
.
.
90
Figura 3.7. Registo gráfico da penetração de zonas correspondentes aos reagentes envolvidos na
reacção de amplificação
.
.
.
.
.
.
.
.
.
91
Figura 3.8. Influência do volume de transferência, para o tubo de diluição, no factor de diluição
obtido, usando 25 (♦) e 50 µL (□) de amostra. Factor de diluição: grau de diluição obtido pela
razão entre os sinais obtidos com e sem diluição
.
.
.
.
.
.
94
Figura 3.9. Registo obtido na análise do teor de GSSG em amostras de sangue humano. (A)
branco e série de padrões com as concentrações em GSSG de 0,050 (P1); 0,125 (P2); 0,250
(P3); 0,750 (P4) e 1,500 (P5) µmol L ; (B) amostras de sangue humano
-1
.
.
.
96
Capítulo 4 – Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel com extracção
líquido-líquido por membrana
Figura 4.1. Reacções químicas envolvidas na determinação colorimétrica do metanol pelo sistema
bienzimático AOD/POD
.
.
.
.
.
.
.
.
.
111
Figura 4.2. Esquema do módulo analítico desenvolvido para a determinação do metanol em
amostras de biodiesel (A). Fotografia da montagem desenvolvida (B) .
.
.
.
115
Figura 4.3. Registos obtidos na análise do teor de metanol em amostras de biodiesel pelo método
de cromatografia gasosa: A – Padrão com as concentrações em metanol e etanol de 0,025%
(m/m); B – Amostra de biodiesel proveniente de girassol (50%) e mamona (50%)
.
.
117
Figura 4.4. Imagens obtidas por microscopia electrónica de varrimento da morfologia da superfície
das esferas de vidro alquilaminado: (a) AGB 200×, (b) AGB 30,000×
.
.
.
.
120
Figura 4.5. Etapas do procedimento de imobilização envolvendo as esferas de vidro
alquilaminado e o glutaraldeído
.
.
.
.
.
.
.
.
120
Figura 4.6. Imagem obtida por microscopia electrónica de varrimento do filtro de membrana de
PVFD, onde se podem observar os microporos da mesma
.
.
.
.
.
123
Figura 4.7. Variação da sensibilidade do método com o volume de amostra (□) e o período de
paragem do fluxo (♦). Condições: aspiração de 50 µL de solução aquosa aceitadora
.
.
125
Figura 4.8. Curvas de calibração obtidas correspondentes aos intervalos até 0,015%(m/m) (A) e
0,200%(m/m) (B) de metanol
.
.
.
.
.
.
.
.
126
Figura 4.9. Registo obtido na análise do teor de metanol em amostras de biodiesel. Série de
padrões com as concentrações em metanol de 0,020; 0,050; 0,100 e 0,200% (m/m)
.
.
126
Capítulo 5 – Avaliação do efeito dos anti-inflamatórios não-esteróides sobre a actividade da
fosfolípase A2 utilizando lipossomas
Figura 5.1. Representação esquemática do princípio do ensaio empregue para o estudo da
actividade da PLA2 e para a avaliação do efeito inibitório dos AINEs sobre a PLA2
.
.
137
Figura 5.2. Representação esquemática da preparação de MLV e LUV pelo método de hidratação
do filme lipídico .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
139
Figura 5.3. Montagem de fluxo para o estudo da actividade da PLA2 e para a avaliação do efeito
inibitório dos AINEs e do ALA (A). Fotografia da montagem desenvolvida (B)
xxii
.
.
.
140
Índice de figuras
Figura 5.4. Influência da concentração de PLA2 no sinal analítico obtido (intensidade de
fluorescência em %)
.
.
.
.
.
.
.
.
.
147
Figura 5.5. Avaliação da eficiência de inibição da PLA2 (%) exibida pelo ALA de acordo com o tipo
de incubação: dentro (○) e fora (●) do sistema
.
.
.
.
.
.
148
Figura 5.6. Avaliação da eficiência de inibição da PLA2 (%) exibida pelos AINEs testados:
tolmetina (♦); meloxicam (□) e ibuprofeno (▲)
.
.
.
.
.
.
148
Figura 5.7. Avaliação da eficiência de inibição exibida pelos fármacos testados pelo método
discreto de comparação. Resultados obtidos da incubação dos AINEs com os lipossomas:
ibuprofeno: 0 µmol L (○); 4 µmol L (□); 8 µmol L (▲); meloxicam: 0 µmol L (○); 6 µmol L (♦)
-1
-1
-1
-1
e da incubação do ALA com PLA2: 0 µmol L (○); 4 µmol L (□)
-1
-1
.
.
-1
.
.
150
Capítulo 6 – Avaliação da cinética da oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase
em sistemas contendo líquido iónico
Figura 6.1. Estrutura química do catião polialquil imidazólio dos líquidos iónicos orgânicos
.
160
Figura 6.2. Esquema do módulo analítico desenvolvido para a avaliação da cinética da reacção
de oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase em meio de LI (A). Fotografia da
montagem desenvolvida (B)
.
.
.
.
.
.
.
.
163
Figura 6.3. Registo obtido da oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase em sistemas
aquosos contendo LI durante os ensaios. Os brancos são realizados na ausência da enzima. A
-1
concentração de substrato é igual a 0,053 mmol L
.
.
.
.
.
.
165
Figura 6.4. Oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase com formação da o-quinona
correspondente .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
166
-1
Figura 6.5. Espectro de ultravioleta-visível do ácido caféico (0,55 mmol L ) dissolvido na mistura
[bmim][BF4]/tampão 1:1 antes (linha tracejada) e após (linha contínua) a adição da tirosinase (200
-1
U mL ). Todos os ensaios foram efectuados a 25ºC usando uma cuvete termostatizada, com
agitação magnética e com um percurso óptico de 1 cm. Os varrimentos foram efectuados no
intervalo de comprimento de onda de 200-600nm. As setas ilustram o aumento ou a diminuição da
absorvância
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
167
-1
Figura 6.6. Velocidades de reacção (∆UA s ) (n=3; RSD < 3,0%) obtidas com uma solução
-1
padrão de ácido caféico 0,311 mmol L para diferentes intervalos de tempo de propulsão da zona
reaccional para o detector antes da aquisição do sinal
.
.
.
.
.
169
-1
Figura 6.7. Velocidades de reacção (∆UA s ) (n=3; RSD < 3,9%) obtidas com uma solução
-1
padrão de ácido caféico 0,053 mmol L utilizando diferentes concentrações de enzima .
.
170
-1
Figura 6.8. Velocidades de reacção (∆UA s ) obtidas no intervalo de concentrações de ácido
-1
caféico 0,026 – 0,158 mmol L a pH igual a 5,5 (□); 6,0 (♦); 6,5 (▲); 7,0 (x) e 7,5 (○) unidades
.
171
-1
Figura 6.9. Velocidades de reacção (∆UA s ) obtidas no intervalo de concentrações de ácido
-1
caféico 0,026 – 0,158 mmol L à temperatura de 25 (♦); 30 (□); 40 (▲); 50 ºC (x)
.
.
172
Figura 6.10. Gráficos de Michaelis-Menten em sistemas aquosos contendo LI/solvente orgânico:
LI:tampão 1:1 (■); LI:tampão 1,5:1 (▲); LI:tampão 2:1 ( ) e metanol:tampão 1:1 ( )
.
.
173
Figura 6.11. Monitorização da absorvância ao longo do tempo da reacção da tirosinase com os
-1
inibidores (0,263 mmol L ) testados (A – ácido trans-cinâmico; B - ácido 3,4-dihidroxibenzóico) na
ausência do ácido caféico .
.
.
.
.
.
.
.
.
175
Figura 6.12. Avaliação da eficiência de inibição da tirosinase (%) apresentada pelo ácido transcinâmico (A) e pelo ácido 3,4-dihidroxibenzóico (B)
.
.
.
.
.
.
176
xxiii
Índice de figuras
Figura 6.13. Influência da concentração dos inibidores na actividade da tirosinase: (■) ácido transcinâmico; (◊) ácido 3,4-dihidroxibenzóico
.
.
.
.
.
.
.
177
Capítulo 7 – Avaliação do efeito de diferentes derivados fenólicos no sistema de QL
luminol-H2O2-peroxidase
Figura 7.1. Representação esquemática do módulo analítico desenvolvido para a avaliação do
efeito de diferentes derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-POD (A). Fotografia da
montagem desenvolvida (B)
.
.
.
.
.
.
.
.
188
Figura 7.2. Estudo da influência do caudal durante a etapa de detecção (A) e do volume de
amostra, H2O2 e POD injectado no reactor (B) no sinal analítico obtido (intensidade de QL).
−1
Condições experimentais: H2O2 1,0 mmol L , luminol 0,1 mmol L
−1
e POD 10 U mL
−1
.
.
193
Figura 7.3. Estudo da influência do tempo de paragem de fluxo no reactor no sinal analítico
−1
−1
obtido. Condições experimentais: H2O2 1,0 mmol L , luminol 0,1 mmol L , POD 10 U mL
fenol 1 mg L
−1
.
.
.
.
.
.
.
.
.
−1
e
.
194
Figura 7.4. Estudo da influência da concentração dos reagentes na diferença da intensidade de
QL: (A) luminol; (B) H2O2 e (C) POD
.
.
.
.
.
.
.
195
Figura 7.5. Avaliação do efeito de potenciação do fenol e dos clorofenóis sobre o sistema luminolH2O2-POD
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
197
Figura 7.6. Avaliação do efeito de inibição dos nitrofenóis, dimetilfenóis e polifenóis sobre o
sistema luminol-H2O2-POD
.
.
.
.
.
.
.
.
198
Figura 7.7. Registo dos sinais analíticos obtidos para a solução de branco e soluções padrão de
ácido tânico (A) e fenol (B) e respectivas concentrações
xxiv
.
.
.
.
.
204
Índice de tabelas
Índice de tabelas
Capítulo 1 – Introdução
Tabela 1.1. Selecção de aplicações que envolvem a utilização de enzimas imobilizadas em
sistemas SIA
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
21
Tabela 1.2. Selecção de aplicações que envolvem a utilização de enzimas livres em solução
(sistemas mono-, bi- e multienzimáticos) em sistemas SIA
.
.
.
.
.
34
Capítulo 3 – Determinação da glutationa reduzida e da glutationa oxidada em sangue total
Tabela 3.1. Comparação de diferentes metodologias de determinação da glutationa em amostras
biológicas
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
78
Tabela 3.2. Protocolo analítico para a determinação da glutationa reduzida e glutationa oxidada
em amostras de sangue
.
.
.
.
.
.
.
.
.
85
Tabela 3.3. Intervalos de valores estudados na optimização dos diferentes parâmetros do sistema
e os valores escolhidos para a sua operação
.
.
.
.
87
Tabela 3.4. Estudo dos análogos de GSH como possíveis interferentes
.
.
.
.
.
95
Tabela 3.5. Resultados obtidos pela metodologia SIA e pela metodologia de comparação para a
determinação de glutationa total e glutationa oxidada em amostras de sangue total
.
.
97
Capítulo 4 – Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel com extracção
líquido-líquido por membrana
Tabela 4.1. Protocolo analítico para a determinação do metanol em amostras de biodiesel
.
118
Tabela 4.2. Resultados obtidos pela metodologia SIA e pela metodologia de referência para a
determinação de metanol em amostras de biodiesel .
.
.
.
.
.
127
Capítulo 5 – Avaliação do efeito dos anti-inflamatórios não-esteróides sobre a actividade da
fosfolípase A2 utilizando lipossomas
Tabela 5.1. Procedimento analítico para o estudo da actividade da PLA2 e para a avaliação do
efeito inibitório dos AINEs e do ALA usando a metodologia SIA
.
.
.
.
143
Tabela 5.2. Intervalos de valores usados para o estudo dos diferentes parâmetros do sistema e
valores seleccionados para a sua operação .
.
.
.
.
.
.
146
Capítulo 6 – Avaliação da cinética da oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase
em sistemas contendo líquido iónico
Tabela 6.1. Protocolo analítico para o estudo da cinética de oxidação do ácido caféico pela
tirosinase e sua inibição em sistemas aquosos contendo LI/solvente orgânico
.
.
.
164
Tabela 6.2. Intervalos de valores estudados na optimização dos diferentes parâmetros do sistema
e os valores escolhidos para a sua operação
.
.
.
.
.
.
168
Tabela 6.3. Constantes cinéticas obtidas na oxidação biocatalítica do ácido caféico pela tirosinase
em sistemas aquosos contendo LI/solvente orgânico .
.
.
.
.
.
172
xxv
Índice de tabelas
Capítulo 7 – Avaliação do efeito de diferentes derivados fenólicos no sistema de QL
luminol-H2O2-peroxidase
Tabela 7.1. Procedimento analítico efectuado na montagem SIA-MSFIA para a avaliação do efeito
de diferentes derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-POD .
.
.
.
191
Tabela 7.2. Avaliação do comportamento de diversos compostos fenólicos no sistema de QL
luminol-H2O2-POD
.
.
.
.
.
.
.
.
.
199
Tabela 7.3. Métodos automáticos para a determinação do teor de polifenóis totais/capacidade
antioxidante em vinhos
.
.
.
.
.
.
.
.
.
201
Tabela 7.4. Resultados obtidos pela metodologia de fluxo e pela metodologia de referência para a
determinação de ácido tânico em vinhos e grainhas de uva
.
.
.
.
.
202
Tabela 7.5. Resultados obtidos pela metodologia de fluxo e pela metodologia de referência para a
determinação de fenol em amostras de água fortificadas
.
.
.
Tabela 7.6. Métodos automáticos para a determinação do teor de fenol em águas
xxvi
.
.
203
.
.
206
Lista de abreviaturas
Lista de abreviaturas
ABTS
Ácido 2,2´-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico
AGB
Esferas de vidro alquilaminado
AINEs
Anti-inflamatórios não esteróides
ALA
Ácido α-lipóico
AMG
Amiloglucosidase
ANS
Ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico
AOD
Álcool oxidase
[bmim][BF4]
Tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio
BP
Bomba peristáltica
CCα
α
Limite de decisão
β
CCβ
Capacidade de detecção
CM
Câmara de mistura
DMSO
Dimetilsulfóxido
DR
Desvio relativo
DTNB
Ácido 5,5´-ditiobis(2-nitrobenzóico)
EDTA
Sal dipotássico do ácido etilenodiaminotetracético
EPC
Fosfatidilcolina da gema de ovo
FC
Folin-Ciocalteu
FIA
Análise por injecção em fluxo
FTIR
Espectrofotometria de absorção no Infravermelho com transformada de
Fourier
GOD
Glucose oxidase
GR
Glutationa redutase
GSH
Glutationa reduzida
GSSG
Glutationa oxidada
HPLC
Cromatografia líquida de alta eficiência
IF
Intensidade de fluorescência
KMap
Constante de Michaelis-Menten aparente
LI
Líquido iónico
M2VP
Trifluorometilsulfonato de 1-metil-2-vinilpiridínio
xxvii
Lista de abreviaturas
MEKC
Cromatografia micelar electrocinética
MSFIA
Análise por injecção em fluxo baseada em multisseringa
m/m
Relação massa por massa
m/v
Relação massa por volume
NAD+
β-nicotinamida adenina dinucleótido (forma oxidada)
NADH
β-nicotinamida adenina dinucleótido (forma reduzida)
NADP+
β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (forma oxidada)
NADPH
β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (forma reduzida)
NEM
N-etilmaleiimida
PLA2
Fosfolípase A2
POD
Peroxidase
PTFE
Politetrafluoroetileno
PVC
Cloreto de polivinilo
PVDF
Fluoreto de poliviniletileno
QL
Quimiluminescência
RMN
Ressonância magnética nuclear
RSD
Desvio padrão relativo
SIA
Análise por injecção sequencial
Sy/x
Estimativa do desvio padrão da distribuição normal dos pontos da curva
de calibração usada, segundo o método dos mínimos quadrados
TA
Tubo de armazenamento
TD
Tubo de diluição
TNB
Ácido 2-nitro-5-tiobenzóico
Tris
Tris(hidroximetil)aminometano
U.A.
Unidades de absorvância
UE
Unidade de extracção
Vmaxap
Velocidade de reacção máxima aparente
VS
Válvula selectora de fluidos
2-VP
2-vinilpiridina
xxviii
CAPÍTULO 1
Introdução
Introdução
1.1. Métodos automáticos de análise
Nos últimos anos, como resultado da expansão da capacidade, desempenho e
versatilidade da instrumentação disponível e do progresso tecnológico a nível da
electrónica e computação, tem vindo a acentuar-se o recurso a procedimentos analíticos
automáticos para o controlo de qualidade de produtos finais e intermédios.
Campos de aplicação tão diversos, desde a análise farmacêutica e alimentar,
estendendo-se aos de índole clínico e ambiental, têm assistido ao emergir das técnicas
de fluxo como ferramentas para automatização dos diferentes procedimentos analíticos.
O crescimento deste novo grupo de técnicas tem permitido intervir ao nível de um
conjunto de factores que limitam o desempenho dos procedimentos analíticos
convencionais, resultando em estratégias analíticas que possibilitam a análise de um
elevado número de amostras, a minimização dos volumes de amostra e reagentes, a
redução de exposição do operador face a amostras/reagentes perigosos, a eliminação de
erros associados ao factor humano (dada a sua intervenção reduzida) com consequente
aumento da precisão, de elevada eficiência analítica. Não obstante pois à importância
dos métodos discretos, e sobretudo dos métodos robotizados, na implementação e
automatização de procedimentos laboratoriais, os métodos de fluxo, especialmente os de
fluxo contínuo não segmentado, têm ganho especial relevo na automatização de
metodologias analíticas nas mais diversas áreas. Este tipo de estratégia de gestão de
fluidos caracteriza-se por um escoamento contínuo, no espaço e no tempo, das soluções,
baseando-se na introdução de uma alíquota de amostra, no interior de tubagem de
dimensões reduzidas, e transporte da mesma segundo um percurso predefinido até ao
detector. Durante este percurso, a amostra pode estar ou não sujeita a uma ou mais
reacções químicas ou operações unitárias. A zona reaccional formada origina no sistema
de detecção um sinal analítico, cuja intensidade é correlacionada com uma propriedade
física ou química da solução analisada. Estas técnicas caracterizam-se assim por uma
elevada reprodutibilidade nos processos de amostragem e de detecção, favorecida pela
configuração fechada dos sistemas de fluxo, não sendo normalmente necessário atingir
condições de equilíbrio físico ou químico, sendo a detecção baseada na aquisição de
sinais transientes, o que resulta numa redução considerável do tempo de análise. A
principal vantagem exibida por estas técnicas prende-se, fundamentalmente, com
menores custos de instalação e operação e com uma flexibilidade acrescida, dada a sua
estrutura modular, a qual permite, com o mesmo equipamento base, idealizar um número
considerável de montagens, com fácil readaptação às necessidades inerentes a cada
situação analítica a implementar.
3
Capítulo 1
A primeira técnica de fluxo contínuo não segmentado, a análise por injecção em
fluxo (FIA, do inglês “Flow Injection Analysis”) [1] surge em 1975 e assenta no conceito
de dispersão controlada no tempo e espaço e presume que qualquer amostra/solução
injectada sofre exactamente a mesma dispersão no sistema de fluxo. O movimento da
amostra gera um gradiente de concentrações, por reacção química ou por dispersão
física, que se traduz num sinal transiente cuja forma e intensidade são condicionados,
sob o ponto de vista meramente físico, pela distância e o tipo de percurso entre o ponto
de inserção da amostra e o detector. A estratégia FIA traduzia-se numa maior rapidez de
análise, com baixos custos de instalação e operação, bem como robustez na
implementação dos sistemas analíticos, pois dispensava os dispositivos para a remoção
das bolhas de ar previstos na técnica de fluxo segmentada [2]. Os conceitos em que o
FIA se baseia tornaram-se assim na base comum das diferentes estratégias de fluxo que
posteriormente foram desenvolvidas. As principais desvantagens desta técnica residem
no consumo elevado de amostra e reagentes, devido ao seu escoamento contínuo, no
carácter monoparamétrico das montagens e na necessidade de reconfiguração física
sempre que é alterado o procedimento analítico.
Nos anos 90, surge a análise por injecção sequencial (SIA, do inglês “Sequential
Injection Analysis”) [3], tornando possível a automatização de procedimentos mais
complexos, que podem envolver um maior número de reagentes, fazendo uso dos
avanços na área da computação na definição do volume de amostra inserido, nas suas
condições de transporte e na aquisição do sinal transiente.
Actualmente, destaca-se o aparecimento de diferentes estratégias de controlo de
fluidos, abrindo múltiplas perspectivas no momento de desenvolver e implementar uma
metodologia analítica, como os sistemas baseados na multicomutação [4], na
multisseringa [5], a lab-on-valve [6], os sistemas multibomba [7] e os sistemas de fluxo de
interface única (SIFA, do inglês “Single Interface Flow Analysis”) [8].
Os sistemas baseados na multicomutação e na multisseringa baseiam-se na
utilização de válvulas solenóides para a criação de redes de fluxo. Os primeiros integram
válvulas solenóides, que podem ser dispostas em configurações distintas e actuar
individualmente ou de forma combinada, permitindo a formação de uma rede de fluxo
com uma elevada versatilidade em termos de manipulação da zona de amostra. Os
segundos caracterizam-se pela utilização de um módulo de quatro seringas como
dispositivo de propulsão, as quais se encontram ligadas em bloco a um único motor
(operação multicanal) e possuem um êmbolo responsável pelo seu enchimento e
esvaziamento. À saída de cada seringa existe acoplada uma válvula solenóide de três
vias com a função de ligar a seringa ao sistema de fluxo ou ao reservatório da solução
4
Introdução
que retém, de forma a aumentar a flexibilidade do sistema e permitir a economia de
reagentes.
Os módulos de análise lab-on-valve correspondem a uma versão miniaturizada da
metodologia SIA apresentando, portanto, os mesmos princípios de funcionamento. A
miniaturização é conseguida através da concepção de uma estrutura compacta e robusta
designada por unidade central de processamento da amostra, que se adapta à cabeça
rotativa de uma válvula selectora de fluidos, usada na técnica SIA, e integra os seus
canais de processamento com uma célula de fluxo que permite o acoplamento de vários
sistemas de detecção.
Mais recentemente, foram propostos os sistemas multimbomba e os sistemas
SIFA. O funcionamento dos primeiros assenta na utilização de microbombas solenóides
unidireccionais, que permitem a impulsão individual da amostra e reagentes,
responsáveis pela criação de um fluxo pulsado. Os segundos divergem do conceito
tradicional de análise em fluxo contínuo pelo facto de não implicar a inserção de volumes
definidos de amostra e reagente no percurso analítico mas por se basearem na
penetração mútua de zonas de amostra e reagente numa interface única de reacção. Os
dispositivos de inserção e propulsão das soluções podem ser buretas automáticas ou as
microbombas solenóides e ainda válvulas solenóides para direccionamento do fluxo.
5
Capítulo 1
1.1.1. Análise por injecção sequencial
A análise por injecção sequencial (SIA) é considerada a segunda geração de
sistemas de análise por injecção em fluxo. Foi concebida em 1990 por Ruzicka e Marshall
[3] no sentido de simplificar mecanicamente os sistemas FIA, facilitando a implementação
dos métodos de fluxo na monitorização em linha de processos industriais, onde a
robustez, a estabilidade a longo prazo, a rotina de manutenção espaçada, a calibração
automática e a automatização são requisitos essenciais [9]. De facto, esta técnica
constitui uma ferramenta para incrementar a versatilidade dos sistemas analíticos,
tornando possível a sua adaptação a diferentes amostras, bem como reacções químicas,
de acordo com o carácter multi-paramétrico a ela associado. Hoje em dia, a análise por
injecção sequencial é largamente aplicada na determinação de inúmeras espécies num
leque abrangente de matrizes [10].
1.1.1.1. Fundamentos e características
Os princípios de injecção da amostra, dispersão controlada e elevada precisão
dos tempos de reacção são comuns ao FIA e ao SIA [9].
A análise por injecção sequencial é um método de fluxo não segmentado baseado
no princípio do controlo da dispersão e manipulação reprodutível da amostra. Este
método assenta no conceito de fluxo programado e envolve a sobreposição reprodutível
das zonas de amostra e reagente, através da conjugação de períodos de paragem e
mudanças de sentido do escoamento. Durante uma análise, volumes precisos prédeterminados de reagentes e amostra são aspirados sequencialmente para o tubo de
armazenamento (TA, Figura 1.1; “holding coil”, em inglês). Após a inversão do sentido do
escoamento, a zona composta resultante da sobreposição das zonas de amostra e
reagentes é transportada em direcção ao detector através de tubo de reacção (RE,
Figura 1.1; “reaction coil”, em inglês) (Figura 1.1. – parte inferior), onde a sobreposição
das zonas ocorre por uma combinação de efeitos dos processos de transporte
conveccional e de difusão molecular [9, 11].
6
Introdução
1.1.1.2. Componentes
A instrumentação em um sistema SIA (Figura 1.1.) pode ser dividida em três
componentes principais: dispositivo propulsor, válvula selectora de fluidos e dispositivo de
detecção, ligados entre si por uma única linha de transmissão formada por tubos de
diâmetro interno reduzido e comandados por microcomputador.
A
VS
RE
TA
9 8 7
1
2
E
6
10
T
5
3
4
D
R1
R2
BP
R1
R2
A
E
Produto
A
T
T
A)
T
T
B)
Figura 1.1. (Parte superior) Esquema básico de uma montagem de um sistema de análise por
injecção sequencial. T -Transportador; BP - Bomba peristáltica bidireccional; TA - Tubo de
armazenamento; VS -Válvula selectora de multiposição; A - Amostra; R1 e R2 - Reagentes; E Esgoto; RE - Reactor; D - Detector. (Parte inferior) Representação esquemática da sobreposição
das zonas de reagentes e de amostra e formação do produto da reacção: A) Aspiração sequencial
dos reagentes e da amostra; B) Inversão do sentido de fluxo e propulsão do produto de reacção
em direcção ao detector.
7
Capítulo 1
A válvula selectora de fluidos (VS, Figura 1.1), considerada o coração do sistema
SIA, é o componente principal, contendo de seis a dez portas, além de uma porta central,
que tem acesso a cada uma das outras por comutação da válvula (Figura 1.2.). As portas
laterais permitem o acesso aos reagentes necessários para a aplicação do método
analítico, à amostra e ao detector e também possibilitam procedimentos de manipulação
da amostra. O dispositivo de propulsão, em geral uma bomba peristáltica ou uma seringa,
ligado pelo TA à porta central da válvula selectora, assegura a condução bidireccional
dos fluidos através da mesma.
R1
R1
R9
R3
R10
R2
R10
R2
R9
R3
TA
TA
R8
R4
R7
R5
R7
R5
R8
R4
R6
R6
Posição 1
Posição 2
Figura 1.2. Representação esquemática de duas posições consecutivas da válvula selectora de
fluidos.
Uma das características básicas dos sistemas SIA é o facto de apresentarem um
computador, componente responsável pelo controlo sincronizado do dispositivo de
propulsão e da válvula selectora de fluidos. Por controlo informático, é assim possível
seleccionar a conexão da porta central da válvula com as portas laterais e dar instruções
ao dispositivo de propulsão de modo a definir o caudal, o volume e a direcção de
escoamento das diferentes soluções. Ao mesmo tempo permite efectuar a aquisição e o
respectivo tratamento dos dados. Desta forma, dado o modo flexível e eficaz de definir as
diferentes
variáveis
hidrodinâmicas,
por
simples
alteração
no
teclado
do
microcomputador, possibilita a extensão da aplicação do sistema a variadas condições de
medida ou determinações sem necessidade de reconfiguração física do próprio sistema.
A análise por injecção sequencial é uma técnica de gestão de fluidos versátil que
permite efectuar procedimentos complexos de manipulação em linha e de pré-tratamento
de amostras antes da etapa de detecção [12], tais como a diluição de amostras ou de
8
Introdução
padrões, a separação por diálise ou por difusão gasosa, a extracção líquido-líquido e gáslíquido, a extracção em fase sólida, entre outros. Para este efeito são acopladas às
portas laterais da válvula selectora de fluidos de multiposição as unidades necessárias,
tais como reservatórios, reactores, separadores, detectores, entre outros dispositivos
(Figura 1.3.).
Dispositivos
Tubo de reacção
Unidade de diálise
Unidade de extracção
Unidade de difusão gasosa
Unidade de filtração
Tubo de diluição
Câmara de mistura
Unidade de fotoreacção (UV)
Bomba bidireccional
Mini-colunas
Bomba peristáltica
Desborbulhador
Bomba de pistão
Bomba miliGAT
Detectores
VS
TA
9
8
1
2
Luminimétrico
7
6
10
T
Espectrofotométrico
Potenciométrico
5
3
4
Amperométrico
Condutivimétrico
Etc
Amostras
Líquidos
Suspensões
Células
Gases
Padrões
Fluidos
Líquidos
imiscíveis
Soluções de
lavagem
Ar
Reagentes
Líquidos
Reagentes
liofilizados
Sólidos
Figura 1.3. Diagrama esquemático ilustrativo da versatilidade dos sistemas SIA como ferramenta
de manipulação e processamento das amostras. Modificado de [13].
A principal limitação da SIA relativamente à metodologia FIA é o aumento do
tempo requerido para a análise de uma determinada amostra devido, não só, ao tempo
de reacção e de medida, como também, ao tempo dispendido na aspiração sequencial
das diferentes soluções e na comutação entre as diferentes portas laterais da válvula
selectora. Estes factores acarretam a reduções significativas dos ritmos de amostragem o
que poderá ser prejudicial quando se pretende medidas analíticas em larga escala.
9
Capítulo 1
1.1.1.3. Dispersão e sobreposição de zonas
O controlo da dispersão de modo a promover uma maior ou menor mistura de
reagentes é essencial para o estabelecimento de uma montagem SIA.
Para a dispersão dos segmentos de amostra e reagentes contribuem dois
processos: o transporte por convecção, condicionado pelas dimensões da tubagem, e o
transporte por difusão. O transporte por convecção predomina no início do transporte, no
qual as partículas inseridas num escoamento laminar estão sujeitas ao longo do diâmetro
do tubo a um perfil parabólico de velocidades, em que as partículas junto à parede do
tubo têm uma velocidade linear nula enquanto que as que se movem no centro têm o
dobro da velocidade média. O transporte por difusão acontece segundo os gradientes de
concentração gerados nos diversos instantes do transporte por convecção, sendo que
pode ser axial ou radial. A difusão axial ocorre na direcção do fluxo e é responsável por
uma diluição acentuada do segmento de zona composta e pelo próprio alargamento dos
picos. A difusão radial provoca o movimento das partículas adjacentes às paredes do
tubo para o seu centro e vice-versa, perpendicularmente à direcção do fluxo, o que
retarda a diluição da zona composta (preservando assim a sua identidade), traduzindo-se
num aumento de sensibilidade, e dá origem a picos mais estreitos.
Num sistema SIA com a inversão do sentido de escoamento a dispersão axial dos
segmentos de amostra e reagentes é minorada, o que contribui para um perfil de
concentrações relativamente simétrico que implica que, na passagem pelo detector, seja
registada uma distribuição de concentrações com a forma de um pico aproximadamente
gaussiano. Esta inversão do sentido de fluxo exerce um papel preponderante na mistura
das soluções num sistema SIA. A Figura 1.4. representa graficamente o que acontece no
momento de aspiração da amostra (A) e nos segundos após o início do escoamento do
transportador em direcção ao detector durante a inversão de fluxo (B).
A)
B)
Figura 1.4. Representação esquemática do contributo da inversão do sentido de escoamento na
dispersão da amostra no transportador. Adaptado de [14].
10
Introdução
Mudanças frequentes e acentuadas no percurso das soluções, conseguidas
usando tubagem com uma configuração em figuras de oito (serpentina), promovem e
intensificam a dispersão radial das soluções ao longo do seu percurso, como ilustrado na
Figura 1.5.
Figura 1.5. Representação esquemática da dispersão radial promovida no tubo enrolado em
figuras de oito. Note-se que com a inversão do sentido de escoamento, as linhas de corrente radial
também invertem em direcção. Adaptado de [14].
A dispersão da amostra no fluido transportador vai depender, não só, do próprio
percurso no módulo analítico, dos volumes intrínsecos do próprio módulo, bem como de
outros dispositivos que alterem as condições de fluxo mas também, dos volumes e
características físico-químicas das soluções envolvidas (ex. viscosidade).
A extensão com que a reacção procede vai depender, além do tempo de
residência no sistema, do grau de sobreposição das zonas adjacentes de reagente e
amostra, o qual está intimamente relacionado com a dispersão mútua sofrida pelas zonas
de amostra e reagente [9]. Neste sentido, foram definidos parâmetros que auxiliam a
compreensão da dispersão das zonas. Estes incluem: o coeficiente de dispersão (D) [1];
o S1/2, que corresponde ao volume injectado necessário para se atingir um D igual a 2
unidades [9, 15] e o grau de sobreposição de zonas (S).
Fixando-se as dimensões e a geometria do reactor, o grau de sobreposição de
duas zonas adjacentes num sistema SIA pode ser avaliado por aspiração alternada de
uma solução corada em substituição do reagente e da amostra, registando-se o sinal
correspondente dos gradientes de concentração e sobrepondo-os no mesmo gráfico,
como mostrado na Figura 1.6.
11
Capítulo 1
O grau de sobreposição (S) é definido pela expressão:
S=
2Ls
(La + Lr )
onde La e Lr são as larguras de pico na linha de base da amostra e reagente,
respectivamente, enquanto Ls é a largura da base da região de sobreposição das zonas.
Quando S = 1 ocorre sobreposição total das zonas, porém quando S = 0 não existe
sobreposição. Na ausência de sobreposição completa, como habitualmente acontece,
observa-se um ponto de isodispersão (ID, Figura 1.6.) no qual os coeficientes de
dispersão da amostra e do reagente são idênticos, de modo que a razão das
concentrações é igual à das soluções puras antes de serem injectadas no sistema. O
estudo de sobreposição de zonas é essencial para garantir a implementação efectiva e
rentabilização máxima de uma montagem SIA [9], pois permite assim definir um
parâmetro que descreve o grau de penetração de zonas, de modo a estabelecer o
intervalo de tempo em que é possível obter uma medida significativa baseada em altura
ou área de pico.
dispersão
R
ID
A
S
Ls
Lr
tempo
La
Figura 1.6. Representação gráfica do grau de sobreposição de duas zonas adjacentes num
sistema SIA.
O grau de sobreposição depende das dimensões dos tubos usados, do caudal, da
ordem de aspiração e da relação dos volumes das soluções aspiradas [16, 17].
12
Introdução
Uma das limitações da técnica SIA prende-se com o número de zonas que podem
ser misturadas por inversão de fluxo, num reactor tubular, já que os segmentos de
amostra e reagentes são colocados “topo a topo” e, portanto, é mais difícil a
sobreposição das zonas de amostra e reagentes adjacentes.
13
Capítulo 1
1.2. Associação dos ensaios enzimáticos à análise por injecção sequencial
As enzimas são catalisadores biológicos de natureza proteica responsáveis por
incrementar a velocidade da maioria das reacções químicas que mantêm a homeostase
animal. Em virtude do elevado grau de regioselectividade e estereoespecificidade com
que exercem a catálise, as enzimas vêm sendo muito utilizadas em diversas áreas como
química analítica, medicina, agricultura, tecnologia de alimentos e estudos ambientais
[18].
O recurso a metodologias enzimáticas como base de análise, em variadas
matrizes, possibilita a obtenção de procedimentos analíticos expeditos e torna as
determinações menos sujeitas a interferências de outros elementos que não o analito.
Adicionalmente, a utilização de enzimas com fins analíticos evita o recurso a produtos
químicos tóxicos e vai assim ao encontro das preocupações da química analítica
moderna, ao conceito de Química Verde, permitindo reduzir o volume de efluentes
nocivos. Efectivamente, as enzimas são produtos naturais biodegradáveis com reduzido
impacto ambiental.
Paralelamente à implementação de procedimentos enzimáticos, sobretudo nos
campos clínico e bioquímico, é importante o desenvolvimento de técnicas e
instrumentação que permitam a determinação de vários analitos de forma rápida e exacta
[19]. Como requisitos adicionais, temos a automatização com uma intervenção mínima do
operador e os baixos custos de operação e manutenção [20].
A automatização dos ensaios enzimáticos [19] contempla a preparação da mistura
reaccional bem como a determinação da actividade enzimática ou de um dos reagentes
envolvidos. Neste contexto, a análise por injecção sequencial parece constituir uma
ferramenta ideal para a automatização de métodos baseados em reacções enzimáticas.
Esta metodologia permite um controlo rigoroso e reprodutível das condições
reaccionais em termos de tempo e espaço, o que permite a fácil implementação de
determinações cinéticas, nas quais é necessário um controlo preciso do tempo de
paragem do fluxo. Os métodos enzimáticos de análise possuem na sua essência um
carácter cinético. A cinética de uma conversão biocatalítica é uma função das
concentrações dos reagentes, do tempo, das condições reaccionais, entre outros
factores. Deste modo, para a determinação exacta da concentração de substrato ou da
actividade enzimática, todos estes parâmetros devem estar estritamente controlados e
neste contexto a análise por injecção sequencial ganha especial relevo. O tempo de
reacção e as condições de transporte são claramente definidos através da configuração
da montagem SIA (caudal, volume, tamanho do tubo de reacção, etc.) e como tal é
garantida reprodutibilidade em todas as operações, o que se traduz em iguais condições
14
Introdução
ao longo das determinações. Além disso, as próprias condições químicas da reacção
(tais como o pH, força iónica, etc.) podem ser facilmente determinadas pela composição
da solução transportadora usada.
Adicionalmente, a associação do SIA a procedimentos enzimáticos, possibilita
uma
redução
do
volume
de
enzima(s),
substrato(s)
e
outros
reagentes,
comparativamente aos métodos convencionais. No caso da imobilização das enzimas a
um suporte, pode permitir uma reutilização contínua e a utilização de concentrações mais
elevadas e, consequentemente, poder conduzir a um aumento do rendimento da reacção.
Por outro lado abre possibilidades no sentido de efectuar determinações sequenciais de
vários substratos uma vez que as diferentes enzimas podem ser colocadas em pontos
distintos do sistema de fluxo.
Por outro lado, a versatilidade da técnica SIA enquanto ferramenta de prétratamento de amostras torna esta metodologia apropriada para aplicações de índole
clínico, biomédico, alimentar e ambiental, nas quais procedimentos prévios de
manipulação das amostras são frequentemente necessários antes da determinação
propriamente dita. Assim, a metodologia SIA permite não só a automatização da etapa
correspondente à da reacção enzimática, bem como de todas as outras constituintes do
procedimento analítico. Adicionalmente, como cada etapa pode ser optimizada
independentemente, estes sistemas vão proporcionar condições óptimas nas etapas de
amostragem, da remoção/“dissimulação” de interferentes, da conversão enzimática e
finalmente da detecção.
Pode-se afirmar que a combinação das potencialidades da análise por injecção
sequencial com o emprego das enzimas tem sido utilizada transversalmente, em imensas
aplicações, como se pode constatar pelo número de publicações em revistas científicas.
A implementação de procedimentos analíticos enzimáticos, em sistemas SIA, tem
contribuído para simplificar e potencializar os processos analíticos e, igualmente,
proporcionar soluções alternativas mais eficientes e rápidas a metodologias existentes,
realizadas de um modo discreto ou, mesmo, com algum grau de automatização.
Neste sentido, é possível constatar os esforços que têm sido realizados
nomeadamente ao nível da incorporação das enzimas em sistemas de fluxo, com o
objectivo de criar condições operacionais óptimas para as mesmas, de reduzir o seu
consumo, bem como de diminuir o tempo de resposta do sistema analítico. A utilização
de enzimas em sistemas SIA tem assumido vários contornos e, de uma forma geral, nas
metodologias desenvolvidas é possível encontrar as enzimas livres em solução,
imobilizadas
num
suporte
físico
inerte,
integradas
em
sensores
ópticos
ou
electroquímicos [21]. A escolha da forma de utilização da enzima depende
15
Capítulo 1
essencialmente do fim a que o módulo analítico se destina e das características da
própria enzima.
A extraordinária selectividade para substratos (incluindo quimio-, régio- e enantioespecificidade) tem sido explorada de forma cada vez mais intensa, sendo que a
aplicação eficaz das enzimas na catálise de reacções encontra-se intimamente ligada à
sua estabilidade operacional. Desta forma, torna-se imperativo a criação de um ambiente
reaccional adequado para a manutenção da conformação estrutural da enzima
cataliticamente activa. Para além do meio aquoso, considerado por excelência o habitat
natural das enzimas, há a considerar os meios misto e orgânico como uma forma de
ultrapassar limitações inerentes ao ambiente aquoso (estabilidade enzimática, pouca
solubilidade de analitos com características hidrofóbicas, entre outras) e aproveitar as
vantagens destes dois últimos meios (enzimas cataliticamente activas em meios
hidrófobos naturais, mimetização e o paralelismo de ambientes biológicos, etc.). Por outro
lado, existem factores do próprio meio reaccional que afectam a cinética das reacções
enzimáticas, podendo aumentar ou diminuir a velocidade da reacção, pela modificação
na estrutura dos locais activos das diferentes enzimas e, consequentemente, alterando a
actividade catalítica. Os principais factores são o pH, a temperatura e a força iónica [22].
As enzimas apresentam um pH óptimo no qual possuem actividade máxima, o
qual é determinado experimentalmente nas condições de trabalho. As curvas de variação
de actividade enzimática em diferentes valores de pH reflectem o estado de ionização
dos importantes grupos doadores ou aceitadores de protões no centro catalítico e seus
respectivos estados de ionização adequados. A dependência da actividade enzimática
com o pH tem a forma de uma curva em forma de sino, cujo máximo (que corresponde ao
pH óptimo) varia de enzima para enzima [23]. A velocidade catalítica das enzimas pode
assim ser regulada por variações do pH do meio em que se encontram.
No que respeita à temperatura, pode-se dizer que para cada enzima existe uma
temperatura óptima para um determinado conjunto experimental. Geralmente, a
velocidade de reacção aumenta à medida que se aumenta a temperatura. Este aumento
induz um aumento da agitação molecular e da frequência de colisão entre as moléculas
da enzima e do substrato. Para temperaturas elevadas, de uma forma geral, a
desnaturação proteica por modificação da estrutura espacial da enzima toma lugar.
A força iónica afecta o equilíbrio do sistema influindo na reacção enzimática. A
actividade de um sistema enzimático depende não só do valor de pH, mas também do
tipo de solução tampão utilizada, que pode afectar a actividade ou a estabilidade de uma
enzima, devido a presença de cargas, termodinâmica da reacção, efeitos de
complexação, entre outros factores [23]. Desta forma, deve-se eliminar a interferência de
determinados iões e controlar a força iónica do meio reaccional.
16
Introdução
Outros factores que influenciam a cinética das reacções enzimáticas são os
cofactores e a presença de inibidores [22]. Os primeiros são substâncias necessárias à
enzima para torná-la activa ou aumentar o seu poder catalítico. Os segundos são
compostos que interagem com a própria enzima ou com o substrato. O efeito dos
inibidores pode traduzir-se em inibições competitiva, não-competitiva e acompetitiva.
Uma vez que o trabalho desenvolvido teve por objectivo a implementação de
metodologias enzimáticas em sistemas SIA em que se pretendeu explorar o potencial
analítico da utilização das enzimas em diferentes situações analíticas, considerou-se de
interesse efectuar uma avaliação da evolução dos casos analíticos reportados na
literatura, considerando as estratégias empregues e as vantagens/desenvolvimentos a
eles associados. Os casos descritos pretendem respeitar as designações e modelos
originais relativamente às metodologias e estratégias desenvolvidas pelos autores.
As reacções catalisadas por enzimas têm sido utilizadas com diferentes
finalidades como sendo a determinação da própria actividade enzimática, ou de um
analito que esteja envolvido na reacção enzimática (substrato, cofactor, produto ou
inibidor) [24]. Deste modo, para as situações analíticas a seguir expostas, as enzimas
podem constituir ferramentas bioanalíticas como reagentes para a determinação dos
seus substratos ou produtos ou funcionar como analitos (ensaios de actividade e inibição
enzimática).
17
Capítulo 1
1.2.1. Emprego das enzimas como reagentes bioanalíticos
A utilização analítica das enzimas está predominantemente relacionada com a
determinação dos respectivos substratos. Estas aplicações beneficiam com um elevada
actividade biocatalítica de forma a permitir a maior conversão possível do analito em
questão num produto detectável. A actividade enzimática deve assim ser constante, para
se assegurar que o produto de reacção resultante do decurso da reacção enzimática é
dependente apenas da concentração do substrato e não de quaisquer outros factores.
As enzimas empregues na determinação de um analito que esteja envolvido na reacção
enzimática, como sendo o substrato, cofactor, produto ou inibidor, podem ser utilizadas
livres em solução ou imobilizadas. Ao contrário do que se sucede nas aplicações
enzimáticas em sistemas FIA, encontram-se reportados quantidades assinaláveis de
montagens SIA empregando as enzimas como ferramentas bioanalíticas quer em solução
quer imobilizadas. Na realidade, os sistemas FIA explorando a utilização de enzimas em
solução são raramente reportados na literatura, dado o consumo elevado de enzima e
reagentes, devido ao escoamento contínuo das soluções, restringindo-se sobretudo a
enzimas de baixo custo, de elevada disponibilidade e eficiência catalítica, como a glucose
oxidase (GOD) [25] e como tal na maioria dos sistemas FIA as enzimas são aplicadas na
forma imobilizada. Com a análise por injecção sequencial, o consumo de enzimas é
minimizado, tendo em conta as características desta metodologia.
18
Introdução
1.2.1.1. Utilização das enzimas imobilizadas
De forma similar ao observado nos sistemas FIA, existem duas formas de
incorporação das enzimas imobilizadas num sistema SIA. A enzima pode ser utilizada
como uma parte constituinte do sistema, mas separada dele, sob a forma de um reactor
enzimático, ou pode ser integrada no próprio detector do sistema, como biosensor,
funcionado assim como receptor do processo de reconhecimento biomolecular (Figura
1.7.).
D
E
RE
BP
VS
TA
9
8
1
2
7
6
10
T
A
5
3
4
B
A
R
E
E
TR
ET
ER
Figura 1.7. Esquema básico de uma montagem de um sistema de análise por injecção sequencial
com enzimas imobilizadas. T -Transportador; BP - Bomba peristáltica bidireccional; TA - Tubo de
armazenamento; VS -Válvula selectora de multiposição; A - Amostra; R - Reagente; E - Esgoto. A
zona composta resultante da sobreposição das zonas de amostra e reagente é transportada em
direcção ao detector, seguindo o percurso: A) Reactores enzimáticos (RE – Reactor enzimático; D
- Detector) ou o percurso B) Biosensores enzimáticos (TR - Tubo de reacção; ET - Eléctrodo de
trabalho (eléctrodo enzimático); ER - Eléctrodo de referência). Os reactores enzimáticos podem
não estar posicionados imediatamente antes do detector, como será descrito posteriormente.
A principal vantagem da imobilização enzimática é o facto de permitir uma
reutilização contínua das enzimas. Como vantagens adicionais, temos o aumento da
termoestabilidade em decorrência da interacção com o suporte bem como o aumento da
estabilidade operacional. Por outro lado, devem, porém, ser tomadas em conta os
seguintes aspectos negativos inerentes à própria imobilização: a susceptibilidade de
estruturas activas da macromolécula aos reagentes utilizados e/ou às tensões
conformacionais impostas pela união forçada a um material estranho (suporte), podendo
traduzir-se numa possível perda (parcial ou mesmo total) da actividade da enzima; a
19
Capítulo 1
actividade catalítica pode diminuir devido à forte ligação existente entre o suporte e a
enzima, podendo, por exemplo, limitar a capacidade do catalisador de assumir
modificações estruturais adequadas, que favoreçam o encaixe perfeito do substrato no
seu local activo; a inexistência de um método geral de imobilização e a dificuldade de se
estabelecer as melhores condições de imobilização; o facto da união do suporte com a
enzima ser aleatória e por último os suportes usados não serem recuperáveis com
facilidade.
A Tabela 1.1. apresenta uma selecção de aplicações que envolvem a utilização de
enzimas imobilizadas, que ilustram diferentes estratégias de imobilização das enzimas
para incorporação em sistemas SIA.
20
0,86 – 7,13 g L
1-1000 µmol L-1
FTIR
Electroquímica
(amperometria)
Glucose oxidase imobilizada
num canal de um microchip
microfluídico
Amiloglucosidase imobilizada
na célula de fluxo
Biosensor (eléctrodo de grafite
e eléctrodo impresso) de álcool
desidrogenase
Alimentar/Adoçantes comerciais
Alimentar/Vinhos
Alimentar/Leites
Geral
Alimentar/Cervejas
Biotecnologia e
alimentar/Caldos de
fermentação de vinhos e vinhos
Farmacêutica/Produtos
farmacêuticos
Alimentar/Sumos de fruta
Aspartame
Glicerol e
etanol
Glucose
Glucose
Hidratos de
carbono
(maltose)
Etanol
Lactato
Glucose
0,03 – 0,30 g L-1 (glicerol)
Espectrofotometria
(Ultravioleta)
Três biosensores de glucose
oxidase
Biosensor sol-gel (eléctrodo de
platina) de lactato oxidase
Reactor empacotado com a
glucose oxidase e peroxidase
co-imobilizadas
Reactores empacotados de
glicerol desidrogenase e álcool
desidrogenase
25 – 350 mg L
Espectrofotometria
(Visível)
Reactores empacotados de αquimotripsina e a álcool oxidase
Electroquímica
(voltametria)
Electroquímica
(amperometria)
-3
-1
Até 3,0 mmol L-1
5x10 – 5x10 mol L
-5
0,01 – 5,0 mmol L
Quimiluminiscência
-1
18 - 120 mg L
Espectrofotometria
(Visível)
-1
-1
0,10 – 0,50 %(v/v) (etanol)
-1
0,15 – 30 mg L-1 (etanol)
5 – 750 mg L (glucose)
Electroquímica
(amperometria)
Reactores empacotados de
glucose oxidase e álcool
oxidase
-1
0,1 – 1,8 g L (penicilina)
-1
0,01 – 7,0 g L-1 (glucose)
Biotecnologia/Caldos de
fermentação da cerveja
Espectrofotometria
(Visível) e
Quimiluminiscência
Glucose e
etanol
Reactores tubulares de glucose
oxidase e penicilinase
Intervalo linear
Biotecnologia/Caldos de
fermentação
Sistema de de detecção
Glucose e
penicilina
Agente(s) imobilizado(s)
Área de aplicação/Matriz
Analito(s)
Tabela 1.1. Selecção de aplicações que envolvem a utilização de enzimas imobilizadas em sistemas SIA
-1
-1
–
-5
-1
1 x10 mol L
1 µmol L-1
–
10 µmol L-1
18 mg L
0,005 %(v/v)
(etanol)
0,008 g L-1
(glicerol)
2,16 mg L
-
-
Limite de
detecção
–
40
30
– (tempo de
reacção de 10
minutos)
20
10
22,5
15
50
15
Ritmo de
determinação (h-1)
[35]
[34]
[33]
[32]
[31]
[30]
[29]
[28]
[27]
[26]
Ref.
Introdução
21
Capítulo 1
1.2.1.1.1. Sistemas SIA com reactores enzimáticos
Os sistemas SIA baseados em reactores enzimáticos resultam numa configuração
versátil, uma vez que o(s) reactor(es) enzimático(s) pode(m) encontrar-se em diferentes
posições. O reactor pode ser acoplado a uma das portas laterais da válvula selectora [26,
36-38] ou estar posicionado entre a válvula selectora e o detector [27, 30, 39-42] e
nalguns casos imediatamente antes do tubo de reacção [28].
Ao contrário dos sistemas SIA baseados em biosensores, neste tipo de sistemas
as condições operacionais para o reactor enzimático podem ser optimizadas
separadamente. Isto torna-se especialmente importante quando existe mais de uma
enzima envolvida na bioconversão do analito, pois, deste modo, cada reactor enzimático
pode estar posicionado separadamente, em diferentes pontos do sistema, e operar em
condições óptimas. Além disso, nestes sistemas, é possível colocar diferentes reactores
enzimáticos em paralelo, permitindo assim a determinação simultânea de dois ou mais
analitos com o mesmo detector. Os reactores podem, por exemplo, estar posicionados no
seguimento um do outro permitindo a bioconversão de um substrato e de um produto
resultante da primeira conversão enzimática [28, 41], tal como acontece no caso de coimobilização de duas enzimas no mesmo reactor [30].
Estes sistemas apresentam uma aplicabilidade mais vasta, comparativamente aos
com biosensores. Os reactores enzimáticos podem ser utilizados em sistemas SIA com
detecção espectrofotométrica, fluorimétrica, quimioluminimétrica, entre outras. Na
realidade, existe apenas uma aplicação de reactores enzimáticos com sistema de
detecção electroquímica [27], na qual a GOD e a álcool oxidase (AOD) são imobilizadas
em esferas de vidro alquilaminado, para a monitorização simultânea em linha de glucose
e de etanol em caldos de fermentação da cerveja através da monitorização
amperométrica do peróxido de hidrogénio formado. Este tipo de estratégia parece
oferecer vantagens em relação aos biosensores enzimáticos (descritos na secção
seguinte), uma vez que obvia a necessidade de uma penetração no interior da camada
biocatalítica e subsequente difusão das espécies electroactivas formadas para a
superfície do transdutor [43].
A principal desvantagem apresentada por estes sistemas contendo reactores
enzimáticos é a dispersão da zona da amostra, que ocorre nos reactores empacotados,
onde a enzima é imobilizada num suporte, inerte, que preenche a coluna. Para minorar
este aspecto, usam-se reactores enzimáticos com uma concentração elevada de enzima,
o que possibilita uma conversão enzimática do analito rápida e eficiente.
No que concerne à técnica de imobilização nos reactores enzimáticos, que se
baseia na ligação a um suporte, a enzima é retida num sólido mediante interacções
22
Introdução
estabelecidas entre matriz e enzima. A interacção mais usual é a ligação covalente entre
os grupos dos resíduos de aminoácidos localizados na estrutura proteica da enzima (de
preferência, em posições não estratégicas para a catálise) e os grupos reactivos
existentes no suporte.
O método mais popular de imobilização covalente de enzimas resulta da formação
de ligações covalentes cruzadas entre as moléculas de enzima e o suporte insolúvel, com
reagentes funcionais, como sendo o glutaraldeído [44]. Numa primeira fase, o suporte
reage com o glutaraldeído, com activação dos seus grupos funcionais. Posteriormente,
após remoção do excesso de activador, o suporte e a enzima são postos em contacto.
Esta mistura é deixada sob condições moderadas de temperatura por um dado tempo, a
fim de que as ligações covalentes entre o suporte e a enzima se estabeleçam. Deste
modo, o glutaraldeído estabelece uma ponte de união entre a enzima e o suporte, com os
quais forma ligações covalentes análogas.
O uso do glutaraldeído como agente activador do suporte utilizado no processo de
imobilização dos reactores enzimáticos incorporados em sistemas SIA tem sido
transversal à maioria das aplicações analíticas desenvolvidas. Em relação ao suporte
utilizado, este varia desde esferas de sílica [39, 40, 45, 46], tubo de nylon [26, 36, 37],
esferas de vidro alquilaminado [27-31, 41, 42], até nanopartículas magnéticas [47].
Shu et al. [39, 40] desenvolveram dois sistemas SIA com reactores enzimáticos
empacotados para a determinação do D-ácido láctico. As enzimas empregues, D-Lactato
desidrogenase e L-alanina aminotransferase foram co-imobilizadas em esferas de sílica
modificadas com grupos aminopropiltrietoxisilano e a determinação era efectuada através
da medição da absorvância do β-nicotinamida adenina dinucleótido (forma reduzida,
NADH) formado (λ=340 nm) após paragem de fluxo no reactor enzimático, na presença
de NAD+. Na primeira aplicação [39], o D-ácido láctico foi determinado em carnes, ao
passo que posteriormente este analito foi monitorizado ao longo do processo de
fermentação de microorganismos de Lactobacillus delbrueckii [40]. Nesta última
aplicação, o sistema de fluxo incluía adicionalmente uma unidade de filtração acoplada
ao fermentador, seguida de uma unidade de diluição que permitia realizar a amostragem
através da válvula selectora. O mesmo grupo de investigação desenvolveu mais tarde um
método para a determinação de etanol em meios de fermentação de Thermoanaerobium
brockii [45]. Esta determinação compreendia a utilização da álcool desidrogenase
imobilizada em esferas de sílica colocadas num reactor enzimático, incorporado num
sistema SIA semelhante ao referido anteriormente e com o mesmo sistema de detecção.
Davidsson et al. [46] desenvolveram um sistema SIA microfluídico para a
monitorização em tempo real da produção e libertação de glucose e etanol das leveduras.
23
Capítulo 1
Para o efeito, a GOD ou AOD foram co-imobilizadas com a peroxidase (POD) em esferas
de sílica funcionalizadas num microchip do tipo “flow-through”. O peróxido de hidrogénio
resultante da oxidação enzimática da glucose (no caso da GOD) ou do etanol (no caso da
AOD) era posteriormente determinado por quimiluminescência (QL) na superfície do
microchip através da oxidação do luminol pela POD potenciada pela presença do piodofenol.
Contrariamente aos reactores enzimáticos empacotados, os reactores tubulares
não têm qualquer tipo de sobrepressão, sendo que a sua maior limitação prende-se com
o facto de apresentarem uma área de superfície reactiva relativamente pequena. Para
contrabalançar esta situação, recorre-se à estratégia de paragem de fluxo, aumentando
assim o tempo de residência dentro do sistema ou aumenta-se o tamanho do reactor,
sem que isto implique um aumento desproporcionado da dispersão da zona de amostra.
Neste sentido, Min et al. publicaram dois estudos em que a montagem SIA incorporava
reactores enzimáticos tubulares com um comprimento igual a 1 m, cujo suporte de
imobilização era um tubo de nylon modificado por o-alquilação [26, 36]. O primeiro estudo
[36] visou a determinação simultânea de glucose, ácido láctico e penicilina para a
monitorização de cultivos de fungos Penicillium chrysogenum. A determinação da glucose
e do ácido láctico era baseada na conversão enzimática, utilizando GOD e lactato
oxidase, respectivamente, com formação de peróxido de hidrogénio e consequente
reacção quimiluminimétrica com o luminol catalisada pelo hexacianoferrato de potássio.
No caso da determinação da penicilina, esta era baseada na formação do ácido
penicilóico, por acção da penicilinase, que depois reagia com o iodo e a detecção da
quantidade remanescente de iodo era efectuada por via quimiluminimétrica utilizando o
luminol. Com base na mesma abordagem, os autores procederam à monitorização em
linha da glucose e da penicilina num caldo de fermentação de Penicillium chrysogenum
[26]. Neste caso, os autores adoptaram a estratégia de paragem de fluxo bem como
promoveram a propulsão e a aspiração da zona da amostra no reactor tubular com GOD,
para aumentar o rendimento da conversão enzimática da glucose. O ácido penicilóico era
determinado
quimiluminimetricamente,
conforme
descrito
anteriormente,
ou
espectrofotometricamente pelo método iodométrico clássico, onde o consumo de iodo era
determinado pelo decréscimo de absorvância (descoloração) do complexo de iodo-amido.
Liu e Hansen [37] também propuseram um sistema SIA com um reactor tubular de nylon
contendo a GOD imobilizada para a determinação de glucose em caldos de fermentação.
A estratégia seguida foi semelhante à de Min et al. [36]. Neste caso, é implementado um
período de paragem de fluxo após a propulsão da amostra para o reactor enzimático.
Com o intuito de obviar a associação dos sistemas SIA a baixos ritmos de
amostragem, Segundo e Rangel [29] conceberam uma nova configuração de sistema
24
Introdução
SIA, no qual foram incorporadas uma válvula de injecção e uma bomba peristáltica
adicional, para a determinação do glicerol e do etanol em vinhos. Os reactores contendo
glicerol desidrogenase e álcool desidrogenase foram colocados nas alças da válvula de
injecção de 8 portas. Assim, numa primeira fase, o cofactor NAD+ e a amostra eram
aspirados para o TA e, após inversão do sentido de fluxo, estas zonas eram
propulsionadas para uma das alças onde estava localizada um reactor enzimático,
enquanto que a outra alça era continuamente lavada com transportador com o auxílio da
bomba peristáltica adicional. Numa segunda fase, após um determinado período de
paragem, a posição da válvula de injecção era trocada, possibilitando o envio do NADH
formado para o detector, o qual era determinado espectrofotometricamente a 340 nm, e o
envio do transportador através do outro reactor enzimático. Posteriormente, esta
sequência de operações era repetida para o outro reactor.
Foram desenvolvidos dois sistemas SIA que incorporavam reactores enzimáticos
colocados sequencialmente, em que o produto formado após a passagem no primeiro
reactor era depois enviado para o segundo reactor [28, 41]. Peña et al. [28] imobilizaram
a α-quimotripsina e a AOD para a conversão do aspartame em peróxido de hidrogénio, o
qual era misturado, por confluência de zonas imediatamente antes do tubo de reacção,
com a solução reagente de desenvolvimento de cor, formada pelo ácido 2,2´-azino-bis-3etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) e pela POD, com produção do catião radical ABTS
(420 nm). O sistema proposto foi aplicado à determinação do aspartame em adoçantes
comerciais. Alhadeff et al. [41] imobilizaram a AOD e a POD com vista à determinação de
etanol em bebidas alcoólicas destiladas e não destiladas, bem como à sua monitorização
num caldo de fermentação alcoólica. Contrariamente ao sistema proposto por Lapa et al.
[27], em que a unidade de diálise incorporada no sistema SIA permitia o ajuste dos níveis
de concentração de etanol no caldo de fermentação à zona de resposta linear do método,
no presente estudo a amostra era filtrada e diluída manualmente antes da sua introdução
no sistema. A estratégia proposta por estes autores contemplava um período de paragem
de fluxo no reactor da AOD para maximizar a conversão enzimática do etanol. O peróxido
de hidrogénio formado nesta reacção era depois enviado para o segundo reactor, que
continha a POD imobilizada. No trabalho desenvolvido por Araujo et al. [30] para a
determinação da glucose em leites, a GOD e a POD foram co-imobilizadas e dispostas
de forma sequencial de forma que o peróxido formado da oxidação da glucose actuasse
como o substrato da POD. Contrariamente à estratégia proposta por Peña et al. [28],
nestes dois trabalhos quer a amostra quer o reagente cromogénico (composto pela 4aminofenazona e pelo fenol) tinham que ser propulsionados para o detector através do
próprio reactor enzimático, com formação de um produto corado, o que pode condicionar
o tempo de vida operacional do reactor enzimático.
25
Capítulo 1
A incorporação de reactores enzimáticos em sistemas SIA pode também ser
usada com o objectivo de minimizar interferências [42]. Sendo o ácido úrico um
constituinte das amostras de humor vítreo e também o produto de oxidação do analito
hipoxantina, foi necessário introduzir outro reactor, com uricase imobilizada, conectado a
uma das portas laterais da válvula selectora, para reduzir a quantidade de ácido úrico
antes da determinação do analito. De seguida, por activação de uma válvula solenóide a
amostra era direccionada para o reactor com xantina oxidase imobilizada, ou para um
reactor de iguais dimensões que continha apenas esferas de vidro alquilaminado
(realizando desta forma um branco das amostras, dado o teor de ácido úrico
remanescente). Decorrido o período de paragem de fluxo, o fluido era finalmente
propulsionado para o sistema de detecção, onde era medido o ácido úrico a 290 nm. O
sistema desenvolvido permitia a determinação conjunta do teor de hipoxantina e de
potássio (por potenciometria) em amostras de humor vítreo, para uma estimação mais
exacta do intervalo post mortem.
Xu e Fang [31] procederam à imobilização da GOD em esferas de vidro
alquilaminado e aprisionaram-nas de uma forma peculiar nas paredes de um dos canais
de um microchip microfluídico de polidimetilsiloxano (PDMS) (Figura 1.8.). A
aplicabilidade deste sistema microfluídico desenvolvido consistiu na determinação da
glucose, como analito modelo, por detecção quimiluminimétrica. Neste sistema SIA, o
luminol e o hexacianoferrato de potássio eram continuamente propulsionados por
gravidade para o microchip microfluídico e misturados com o segmento de amostra
enviado para o reactor enzimático (com formação de peróxido de hidrogénio) através da
válvula selectora, devido ao percurso sinuoso imprimido pelos canais microfluídicos
desenhados.
Canal de mistura
de reagentes
Esferas de vidro
alquilaminado
PDMS
Vidro
Coluna com a
enzima imobilizada
Canal de
esgoto
Figura 1.8. Representação esquemática de um corte transversal do chip microfluídico, na qual
pode ser observada a coluna enzimática imobilizada. Copyright 2004 Elsevier Science Publishers.
26
Introdução
Por último, Sohn et al. [47] elaboraram um estudo sobre a imobilização da GOD e
da lactato desidrogenase em nanopartículas magnéticas activadas com glutaraldeído. As
partículas imobilizadas de GOD foram depois empacotadas num tubo de silicone, o qual
foi integrado num sistema SIA, para determinação da glucose com potencial aplicação a
processos de monitorização de bioprocessos. A amostra e o substrato cromogénico
(ABTS e POD) eram enviados sequencialmente para o reactor empacotado com GOD,
sendo o ABTS oxidado medido espectrofotometricamente a 405 nm.
Foram reportados outros processos de imobilização que dispensavam o uso do
glutaraldeído como agente funcionalizador do suporte utilizado [32, 38, 48-50].
A integração da enzima imobilizada no próprio detector, que conduz a uma
simplificação do sistema de fluxo, foi também explorada [32, 50]. Haberkorn et al. [32]
conceberam um sensor de infravermelho médio do tipo “flow-through” para a
monitorização in situ da reacção enzimática da amiloglucosidase (AMG) com os hidratos
de carbono. Esta enzima era imobilizada em esferas de agarose modificadas e colocada
na célula de infravermelho. As soluções de calibração de maltose eram preparadas
dentro do próprio sistema a partir da solução mãe, numa câmara de mistura colocada
numa entrada da válvula selectora, e de seguida enviadas para o sensor, com aquisição
do sinal analítico durante 10 minutos por espectrofotometria de absorção no
Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). O método proposto foi depois
aplicado à determinação do teor de hidratos de carbono em cervejas utilizando o método
de adição padrão. Recentemente, Armenta et al. [50] do mesmo grupo, adoptaram a
mesma estratégia de imobilização para a acetilcolinesterase, bem como a mesma
configuração do sistema SIA, para a determinação da actividade enzimática e sua
inibição (secção 1.2.2.).
Rhee [38] e Laiwattanapaisal et al. [48] reportaram dois métodos de imobilização
enzimática distintos dos anteriores. O primeiro [38] incorporou no sistema um reactor em
que a trealase se encontrava imobilizada num suporte polimérico, que convertia a
trealose em glucose com vista à monitorização em linha da concentração da trealose
num tanque de agitação como simulador da monitorização de bioprocessos. Os
segundos [48] procederam à co-imobilização da L-glutamato desidrogenase e da Dfenilglicina aminotransferase em microesferas de poliestireno num microchip de silício,
que possibilitava a implementação de uma reacção de amplificação de resposta ao
NADH formado a partir do substrato L-glutamato. A introdução e a remoção (no caso de
um
decréscimo
da
actividade
enzimática)
destas
esferas
eram
efectuadas
automaticamente através do sistema SIA microfluídico.
27
Capítulo 1
O uso de extractos brutos e/ou tecidos vegetais pode apresentar em alguns casos
uma certa desvantagem na selectividade do método analítico e na própria
reprodutibilidade dos ensaios aquando do uso de novo extracto. Por outro lado são
extremamente económicos e geralmente possuem um tempo de vida superior quando
comparados com as enzimas purificadas, visto que ao se encontrarem naturalmente
imobilizadas, nas células dos materiais biológicos (habitat natural), são mais estáveis,
além de geralmente possuírem o seu cofactor disponível [24]. Neste âmbito, Mei et al.
[49] imobilizaram um extracto bruto de folhas de plântula de ervilha, como fonte da
enzima diamina oxidase, para a determinação quimiluminimétrica de diaminas, como a
putrescina e a cadaverina, em amostras de peixe. A coluna de teflon com o tecido vegetal
encontrava-se conectada a uma das portas laterais da válvula selectora do sistema SIA.
O ciclo analítico compreendia a aspiração da amostra a partir da porta lateral onde se
encontrava a coluna, ocorrendo a oxidação das diaminas com produção de peróxido de
hidrogénio, e a subsequente reacção com o luminol catalisada pelo cobalto.
28
Introdução
1.2.1.1.2. Sistemas SIA baseados em biosensores enzimáticos
Os biosensores enzimáticos são dispositivos formados basicamente por duas
partes: sensor e enzima imobilizada. O sensor electroquímico, de acordo com o seu
princípio de funcionamento, poderá ser amperométrico ou potenciométrico, sendo a
escolha função da substância a ser medida, a qual por sua vez será determinada pela
enzima particular empregue. A integração da enzima no detector conduz a uma
simplificação do sistema SIA. A dispersão nestas montagens é significantemente
reduzida contribuindo assim para um aumento da sensibilidade do método, uma vez que
as mudanças na concentração dos bioreagentes responsáveis pelo sinal analítico obtido
decorrem directamente na superfície do detector.
Por outro lado, a integração do biosensor num sistema SIA limita a optimização do
próprio biosensor. As condições óptimas de operação do detector e da enzima são em
muitos casos diferentes e como tal a optimização tem que ser efectuada como um
compromisso de ambas, o que influirá negativamente na eficiência do sistema de
biodetecção. Uma das desvantagens possíveis relaciona-se com o efeito de memória dos
biosensores e consequentemente com o longo período para o retorno à linha de base.
Esta desvantagem pode ser minimizada com a escolha de um método de imobilização
enzimática que possibilite uma penetração eficiente na camada biocatalítica bem como o
transporte de espécies através da mesma. Em última análise, a escolha do método de
imobilização condicionará o tempo de vida operacional da camada biocatalítica e por
inerência o tempo de vida útil do biosensor.
Os biosensores enzimáticos incorporados em sistemas SIA são maioritariamente
amperométricos. Os eléctrodos à base de carbono representam o material mais utilizado
na construção destes biosensores. O motivo para tal prende-se com as vantagens que
estes materiais oferecem tais como, um fácil manuseamento e um baixo custo quando
comparado com, nomeadamente, ouro ou platina [34, 51]. De entre os tipos de eléctrodos
utilizados em sistemas de fluxo destacam-se os eléctrodos de pasta de carbono, grafite,
carbono vítreo e fibra de carbono.
Os sistemas baseados em biosensores enzimáticos têm sido aplicados à
monitorização de analitos em caldos de fermentação. Schuhmann et al. [52]
desenvolveram um sistema SIA de elevada flexibilidade que permitia o controlo
simultâneo até quatro fermentadores ou quatro zonas de amostragem diferentes num
único fermentador. O sistema foi aplicado à determinação de glucose e lactato em caldos
de fermentação de Saccharomyces cerevisiae. Para o efeito, a GOD e a lactato oxidase
foram imobilizadas em poliuretano e fixadas ao respectivo eléctrodo entre duas
membranas de diálise, para a detecção amperométrica do peróxido de hidrogénio
29
Capítulo 1
formado. Mais tarde, o mesmo grupo de investigação [33] reportou o desenvolvimento de
um biosensor amperométrico para a determinação do etanol em bebidas. O biosensor era
preparado por ligações cruzadas da enzima álcool desidrogenase a um complexo
polimérico na superfície de eléctrodos de grafite ou eléctrodos impressos (“ScreenPrinted Electrode”, em inglês). Este biosensor, quando integrado num sistema SIA, com
configuração similar ao descrito anteriormente [52], permitiu a monitorização em linha de
etanol em processos de fermentação de vinhos, para além da determinação do seu teor
em vinhos. Kurzawa et al. [51] apresentaram uma nova tecnologia de imobilização
enzimática baseada na deposição local de filmes poliméricos contendo enzimas, por
indução electroquímica. Para o efeito, foi construído um biosensor de glucose baseado
no aprisionamento da GOD (por precipitação do polímero) na superfície do eléctrodo de
platina e a sua estabilidade a longo prazo foi avaliada com uma montagem SIA
semelhante à mencionada anteriormente [52].
A aplicabilidade dos sistemas baseados em biosensores enzimáticos estendeu-se
à determinação de analitos de interesse no campo farmacêutico. Stefan et al. [53-63]
desenvolveram vários sistemas SIA para a determinação de compostos farmacêuticos
utilizando
biosensores
amperométricos.
Nalguns
trabalhos,
foram
construídos
biosensores bienzimáticos [58-60] e mesmo multienzimáticos [63]. Por outro lado, um dos
sistemas propostos [55] apresentava também um biosensor potenciométrico para a
determinação do S-captopril. A pasta de carbono representou o material mais utilizado na
construção dos biosensores enzimáticos empregues como detectores nos sistemas SIA
referidos. No que respeita à configuração dos próprios sistemas SIA, estes eram
semelhantes, apresentando um tubo de armazenamento e, um ou dois tubos reaccionais,
de acordo com a determinação ser respectivamente de um ou dois enantiómeros [53, 55,
57-59]. Estes sistemas desenvolvidos mostraram-se úteis para o controlo em linha de
processos de síntese e permitiam também a resolução de enantiómeros. Recentemente,
Gomes et al. [34] construíram um biosensor amperométrico para a determinação de
lactato em produtos farmacêuticos. A lactato oxidase foi incorporada na superfície do
eléctrodo de platina usando a tecnologia sol-gel.
Mayer e Ruzicka [64] apresentaram uma nova classe de sensores electroquímicos
com o uso de esferas (designadas pelos autores de “beads”) condutoras (partículas de
carbono vítreo) para formar eléctrodos descartáveis bem como de esferas não
condutoras (oxirano e de vidro alquilaminado) para formar camadas renováveis de
enzimas imobilizadas. Para o efeito, testaram-se diferentes oxidases: galactose, lactato,
álcool e glucose oxidases, e os biosensores resultantes das duas últimas foram aplicados
à determinação de etanol e glucose em cervejas e vinhos. O sistema SIA era então
conectado a uma célula de fluxo especialmente desenhada para proporcionar a
30
Introdução
renovação da sua superfície, denominada de “jet ring cell” (Figura 1.9.). A suspensão de
beads com enzima imobilizada era introduzida no sistema através da válvula selectora,
sendo aprisionada na “jet ring cell” (Figura 1.9., etapa A) e depois formando como que
uma coluna empacotada de beads (etapa B). De seguida, o analito era aspirado e
transportado até às beads (etapa C) com formação de peróxido de hidrogénio (produto
comum às reacções enzimáticas envolvidas), o qual era medido amperometricamente. A
particularidade da célula de fluxo residia na possibilidade de reter as beads sobre a
superfície condutora enquanto se realizava a análise, e proceder ao descarte das beads
quando se impunha a sua substituição, por propulsão do fluxo para o esgoto, após
abertura do intervalo existente entre a “jet ring cell” e o eléctrodo auxiliar (etapa D). Desta
forma, a estratégia era bastante vantajosa na medida em que proporcionava uma porção
de enzima nova em cada ensaio, evitando, desta forma, contaminações da superfície do
sensor em ensaios subsequentes. Por último, os ensaios efectuados com a GOD
imobilizada em partículas de carbono vítreo, usadas como sensores amperométricos
servindo assim de mediação para o processo electroquímico, confirmaram a eficácia de
renovação da enzima e da própria superfície do eléctrodo numa só etapa.
3
5
4
2
1
2
Figura 1.9. Esquema representativo de uma célula de fluxo “jet ring cell”. 1 – eléctrodo de
trabalho; 2 – eléctrodo de referência; 3 – eléctrodo auxiliar; 4 – PTFE; 5 – beads; A) inserção das
beads na célula de fluxo; B) acomodação das beads sobre a superfície do sensor; C) propulsão da
amostra e monitorização amperométrica; D) purga das beads. Copyright 1996 American Chemical
Society.
31
Capítulo 1
Lindfors et al. [65] utilizaram a mesma abordagem para a determinação de glucose. O
sistema SIA era conectado à célula de fluxo “jet ring cell”, que continha um suporte sólido
renovável, constituído por esferas de agarose com GOD imobilizada. De modo similar, a
suspensão de esferas era introduzida no sistema através da válvula selectora, sendo
aprisionada na célula de fluxo. A subsequente injecção de glucose originava a formação
de peróxido de hidrogénio, o qual era medido amperometricamente. Posteriormente, a
suspensão era removida de forma diferente da reportada anteriormente, através da
inversão de fluxo, e substituída por uma nova suspensão para a determinação de glucose
subsequente.
Recentemente, Gutes et al. [35] propuseram uma “língua electrónica enzimática”
para a determinação voltamétrica da glucose. Este arranjo consistia em três biosensores
contendo GOD e três catalisadores metálicos distintos, permitindo desta forma uma
resposta diferenciada para as espécies primárias e interferentes. Os resultados obtidos
eram tratados recorrendo a ferramentas quimiométricas, nomeadamente por modelização
de redes neuronais artificiais. Esta célula de fluxo conectada ao sistema SIA foi aplicada
à determinação da glucose em sumos de fruta na presença de um interferente clássico, o
ácido ascórbico. O sistema SIA apresentava uma câmara de mistura conectada a uma
das portas da válvula selectora para a preparação automática dos padrões de glucose e
ácido ascórbico.
32
Introdução
1.2.1.2. Utilização das enzimas livres em solução
A utilização das enzimas livres em solução no formato SIA para a determinação
de analitos tem tido uma expressão semelhante à sua utilização na forma imobilizada,
contrariamente ao formato FIA. Este modo de utilização das enzimas é interessante pela
sua praticabilidade, pois possibilita a aplicação directa do produto na sua forma
comercial, evitando desta forma os procedimentos complicados inerentes à imobilização
enzimática, que pode conduzir a um certo grau de inactivação enzimática e por outro lado
implica o emprego de enzima em grandes quantidades.
A Tabela 1.2. apresenta uma selecção de aplicações que envolvem a utilização de
enzimas livres em solução em sistemas SIA, desde sistemas monoenzimáticos a
multienzimáticos.
33
34
Área de aplicação/Matriz
Alimentar/Vinhos
Farmacêutica/Formulações
farmacêuticas
Clínica e ambiental/Soros e
águas
Ambiental e
Alimentar/Fertilizantes e
Leites
Biotecnologia/Caldos de
fermentação
Geral
Alimentar/Vinhos
Biotecnologia/Caldos de
fermentação
Biotecnologia/Caldos de
fermentação
Clínica/Urinas
Analito(s)
L(-) malato
Alopurinol
Nitratos e
nitritos
Ureia
Glucose
Glucose
L(+)-lactato
Metanol
Glicerol e
glucose
Pirofosfato
Reagente enzimático multicomponente
(aldolase, frutose-6-fosfato cinase
dependente de pirofosfato, glicerofosfato
desidrogenase e triosefosfato isomerase)
Reagente enzimático multicomponente
(glicerol cinase, glicerol fosfato oxidase e
POD; hexocinase e glucose-6-fosfato
desidrogenase)
Álcool oxidase e peroxidase
Lactato oxidase e peroxidase
Glucose oxidase e peroxidase
Glucose oxidase e peroxidase
Extracto bruto de urease
Nitrato redutase
Xantina oxidase
L-malato desidrogenase
Sistema enzimático
Espectrofotometria
(Ultravioleta)
Espectrofotometria
(Visível/Ultravioleta)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Electroquímica
(potenciometria)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Ultravioleta)
Espectrofotometria
(Ultravioleta)
Sistema de de detecção
-1
Cinético: 5 – 25 µmol L
-
-2
-1
-1
-1
-1
0,4 – 20 mg L
-1
Glucose: 35 – 1000 mg L
Glicerol: 20 – 120 mg L-1
0,5 – 2 g L
0,25 – 2,5 g L-1
100 – 1000 mg L
0,04 - 5 g L
-1
1,0x10 – 1,0x10 mol L
-3
Águas: Até
Até
50 mg L (NO3 )
3 mg L-1 (NO2-)
-1
Soros: 0,4 – 4 mg L (NO3 )
-1
0,1 – 3 mg L (NO2 )
-
-1
0,38 mg L
–
0,12 g L
-1
0,074 g L-1
–
–
-4
6,0 x 10 mol L
0,73 mg
0,03 mg
-1
L (NO3 )
L-1 (NO2-)
-1
-1
0,14 mg L (NO3 )
-1
0,03 mg L (NO2 )
1,3 µmol L
-1
1,8
–
7
14
120
–
20
12 (6 para NO3- e 6
para NO2-)
34
15
-1
-1
6,2 µmol L
Tempo fixo: 25 – 75 µmol L
-1
22
0,009 g L-1
0,01 – 0,15 g L-1
Ritmo de
-1
determinação (h )
Limite de
detecção
Intervalo linear
Tabela 1.2. Selecção de aplicações que envolvem a utilização de enzimas livres em solução (sistemas mono-, bi- e multienzimáticos) em sistemas SIA
[76]
[75]
[74]
[73]
[72]
[71]
[70]
[68, 69]
[67]
[66]
Ref.
Capítulo 1
Introdução
A maioria das aplicações que empregam enzimas em solução para a
determinação de analitos envolve a utilização de apenas uma enzima. As matrizes
utilizadas são na maioria de índole alimentar, mas surgem também aplicações nos
campos farmacêutico [67], biológico [68, 76] e ambiental [69, 77].
Segundo e Rangel [66] desenvolveram um sistema SIA com vista à determinação
de L(-) malato em vinhos. Para o efeito, implementaram um método cinético baseado na
medição da velocidade de formação de NADH (340 nm), resultante da reacção catalisada
pela L-malato desidrogenase, aquando da paragem de fluxo no detector da zona
composta de amostra, NAD+ e enzima. A principal vantagem da implementação do
método cinético prendia-se com o facto de permitir eliminar a interferência devido à
absorção intrínseca das amostras de vinho, já que neste método era medida a variação
do sinal (absorvância) ao longo do tempo. Mais tarde, Oliveira et al. [78] e Dominguez et
al. [79] aplicaram a mesma estratégia e o mesmo sistema base para a determinação de
glicerol em vinhos e cervejas e em processos de fermentação de Saccharomyces
cerevisiae, respectivamente. Nestes casos, a enzima empregue foi a glicerol
desidrogenase. Páscoa et al. [80] implementaram a determinação de etanol em vinhos,
mas contrariamente aos trabalhos anteriores, a paragem de fluxo era implementada no
próprio tubo reaccional, para promover a reacção da amostra, do cofactor e da álcool
desidrogenase, com formação do NADH, o qual era depois encaminhado para o detector.
De forma genérica, a determinação pode ser efectuada em tempo fixo, através da
medição dos sinais transientes obtidos, ou em modo cinético, com a monitorização do
produto formado durante o período de paragem de fluxo no detector e subsequente
cálculo das velocidades iniciais de reacção. Silvestre et al. [67] e Vidigal et al. [81]
adoptaram ambas as estratégias na determinação do alopurinol em produtos
farmacêuticos baseada na inibição da xantina oxidase e do etanol em vinhos,
respectivamente. Mais tarde, Vidigal et al. [82], aproveitando a versatilidade do sistema
obtido, propuseram uma metodologia baseada na monitorização do peróxido de
hidrogénio em soluções de limpeza e de desinfecção de lentes de contacto. Na presente
aplicação, a determinação era apenas efectuada em tempo fixo, com a medição do sinal
transiente correspondente ao radical catião ABTS formado. O sistema miniaturizado labon-valve incluía uma unidade de diálise, acoplada a uma das portas laterais da válvula
selectora, que permitia uma diluição acentuada da amostra em linha, pois as soluções de
limpeza apresentavam teores elevados de peróxido de hidrogénio.
Considerando ainda a matriz alimentar, foram propostos dois sistemas SIA de
características diferentes para a determinação da glucose em bebidas energéticas e mel.
O primeiro era um sistema SIA híbrido, em que a válvula selectora (característica dos
sistemas SIA) permitia a introdução da amostra e da GOD e o fluxo unidireccional e
35
Capítulo 1
contínuo (característico dos sistemas FIA) aplicado permitia a mistura rápida em
confluência do peróxido de hidrogénio formado com o luminol, imediatamente antes do
detector [83]. O segundo era um sistema SIA convencional, que graças à ordem de
aspiração adoptada bem como às condições experimentais implementadas, permitia
acomodar a reacção de QL [84]. Para tal, foi implementado um período de paragem de
fluxo após a aspiração dos segmentos de amostra e GOD para o TA, para aumentar a
eficiência de conversão enzimática da glucose, e foi utilizado um catalisador da reacção
de QL (cobalto). Adicionalmente, este sistema tinha a particularidade de incluir um canal
de diluição acoplado a uma das portas laterais da válvula selectora, que permitia a
diluição automática em linha das amostras, adequando assim o seu teor de glucose ao
intervalo de linearidade do método proposto.
Samanta et al. [77] e Pinto et al. [69] reportaram dois estudos sobre a
determinação enzimática de analitos em águas. Os primeiros [77] implementaram um
método cinético baseado no lisado de amebócito Limulus (LAL) para a determinação de
endotoxinas bacterianas em água de torneira. O LAL contém várias proteases, que em
presença das endotoxinas, promovem a hidrólise de um substrato cromogénico sintético,
que era monitorizado espectrofotometricamente durante o período de paragem de fluxo
no detector. Os segundos [69] implementaram a determinação de nitratos e nitritos em
águas de diferentes origens, através da reacção de Griess–Ilosvay, com a incubação
faseada da amostra, da enzima nitrato redutase e dos restantes reagentes numa câmara
de mistura conectada a uma porta lateral da válvula selectora. O sistema SIA
desenvolvido incluía ainda um tubo de diluição acoplado a uma das portas laterais da
válvula selectora, que permitia a diluição em linha das amostras de água que possuíam
teores de nitratos superiores a 50 mg L-1. Estes autores utilizaram a mesma abordagem
para a determinação dos nitratos e nitritos em amostras de soro, que constituem
marcadores habitualmente usados como indicadores em muitas doenças [68].
O uso de extractos brutos em alternativa às enzimas purificadas comerciais foi
também proposto em duas aplicações envolvendo sistemas monoenzimáticos em
solução. Silva et al. [70] conceberam um sistema SIA para a determinação de ureia em
amostras de fertilizantes e leite, recorrendo ao extracto bruto de Canavalia ensiformis
como fonte de urease. O sistema analítico era semelhante ao proposto por Lima et al.
[85] para a mesma determinação, com a diferença deste último oferecer uma maior
versatilidade na etapa de detecção ao incluir dois sistemas de detecção: detecção
espectrofotométrica, através da mudança de cor de uma solução de indicador de azul de
bromotimol e detecção condutimétrica, com a formação do ião borato a partir de uma
solução de ácido bórico. Decorrida a hidrólise enzimática da ureia num TA adicional
(termostatizado a 30 ºC), promovida com um período de paragem de fluxo, as zonas de
36
Introdução
amostra e extracto eram enviadas para o canal dador da unidade de difusão gasosa. O
amoníaco produzido difundia-se para o canal aceitador, onde ocorria a sua conversão a
ião amónio, que era medido num eléctrodo selectivo a esta espécie. Mais tarde, os
mesmos autores [86] utilizaram uma solução de extracto de leveduras Saccharomyces
cerevisiae, como fonte de invertase, para a hidrólise de hidratos de carbono do açúcar da
cana e do milho. A hidrólise enzimática da sacarose ocorria de modo similar aos dois
trabalhos anteriores, e de seguida, ocorria a redução de periodato pelos açucares
redutores formados, sendo o periodato remanescente medido com um eléctrodo selectivo
a esta espécie.
Foram desenvolvidos dois sistemas SIA monoenzimáticos com finalidades
distintas das descritas anteriormente [87, 88]. No primeiro estudo, foi implementado um
ensaio de inibição enzimática baseado na reacção hidrolítica de um substrato de
fluoresceína pela β-galactosidase para demonstrar a aplicabilidade de uma bomba de
escoamento electrosmótico a sistemas SIA microfluídicos [87]. O segundo estudo
compreendeu a exploração da reacção enzimática da POD para a avaliação da
capacidade sequestrante (“scavenging”) do peróxido de hidrogénio através da oxidação
do substrato ácido homovanílico ao seu dímero fluorescente [88]. O presente estudo
confirmou a exequibilidade dos sistemas SIA para a automatização de reacções químicas
envolvendo três ou mais reagentes e permitiu avaliar os principais factores que
influenciam a dispersão de zonas nestes sistemas.
Considerando as aplicações envolvendo duas enzimas, Chung et al. [71]
desenvolveram um sistema SIA para a monitorização em linha e em intervalos de tempo
pré-programados da glucose em caldos de fermentação de Saccharomyces cerevisiae. A
reacção utilizada era a reacção de Trinder, a qual se baseia na formação de uma
quinonimina por reacção entre o peróxido de hidrogénio (resultante da acção da GOD
sobre o analito glucose), fenol e aminoantipirina, catalisada pela POD. A medição era
efectuada por paragem de fluxo do produto reaccional no detector e com subsequente
monitorização da absorvância (λ=504 nm) ao longo do tempo. Chen e Ruzicka [72]
desenvolveram um sistema lab-on-valve para a determinação rápida da glucose e do
etanol. A glucose era também determinada pelo sistema bienzimático GOD/POD, com
formação de uma quinonimina (λ=500 nm). A determinação do etanol era efectuada
apenas com a álcool desidrogenase (e o cofactor NAD+), por medição do NADH formado.
Os ensaios foram conduzidos a 22ºC e a 37 ºC utilizando reagentes de kits enzimáticos.
O ritmo de amostragem era comparável ao reportado em sistemas FIA graças ao grau de
miniaturização atingido e ao aproveitamento do tempo da paragem de fluxo do produto
reaccional no detector para a aspiração das zonas de amostra e reagentes referentes à
37
Capítulo 1
análise seguinte. Recentemente, Araujo et al. [30] empregou a GOD e a POD para a
determinação da glucose em leites em dois sistemas SIA. As enzimas foram usadas em
meio homogéneo (livres em solução) e heterogéneo (imobilizadas, discutido na secção
1.2.1.1.1.). O ciclo analítico envolvia a avaliação do branco da amostra de leite. Numa
segunda fase, no caso das enzimas em solução, o reagente enzimático e a amostra,
depois de aspirados para o TA, eram propulsionados através de um tubo de reacção
termostatizado (37 ºC) para o detector.
Têm sido desenvolvidos sistemas SIA baseados noutros sistemas bienzimáticos,
constituídos pela lactato oxidase [73] ou pela AOD [74], com a POD.
Araujo et al. [73] desenvolveram um sistema SIA para a determinação
espectrofotométrica do L(+)-lactato em vinhos. O sistema incorporava uma unidade de
diálise entre o dispositivo propulsor e a válvula selectora que permitia a diluição em linha
e minimizava as interferências provenientes da matriz da amostra. O canal superior da
unidade de diálise encontrava-se conectado à porta central da válvula selectora e o canal
inferior preenchido com transportador em estado estacionário funcionava como câmara
de armazenamento do analito. A amostra e reagentes eram aspirados para a unidade de
diálise, onde eram implementados períodos de paragem de fluxo, e no final promovia-se
o envio do produto formado, uma quinonimina (λ=510 nm), para o detector.
Com vista à monitorização em linha do metanol em caldos de fermentação de
Pichia pastoris, nas quais uma lipase recombinante de Rhizopus oryzae estava a ser
produzida, Surribas et al. [74] conceberam um sistema SIA que incluía uma câmara de
diluição (câmara de mistura), que permitia ajustar a concentração de metanol da amostra
(até 2 g L-1) ao intervalo linear do método, bem como uma válvula rotatória que permitia a
realização da amostragem, ambas conectadas a portas laterais da válvula selectora. O
ciclo analítico consistia na aspiração intercalada das soluções enzimáticas (AOD e POD),
reagentes e amostra para o TA. Após um período de paragem de fluxo, ocorria a inversão
de fluxo
e
envio
da
quinonimina formada
para
o
detector,
sendo
medida
espectrofotometricamente a 470 nm.
Nalgumas aplicações, é empregue um reagente enzimático multicomponente
(Tabela 1.2.).
Wu et al. [75] desenvolveram um sistema miniaturizado lab-on-valve para a
monitorização da fermentação da Escherichia coli. Para o efeito, foram efectuadas as
determinações da amónia, do ferro livre, do glicerol e da glucose. Estes dois últimos
sofriam a acção de um reagente enzimático multicomponente, resultando na formação de
uma quinonimina, determinada espectrofotometricamente a 540 nm, ou do NADH,
medido a 340 nm, respectivamente. Estas determinações eram efectuadas aquando da
38
Introdução
paragem da zona composta de glicerol ou glucose e do respectivo reagente enzimático
multicomponente na célula de fluxo.
Simonet et al. [76] desenvolveram um sistema SIA para a determinação de
pirofosfato em urina. Na presente aplicação, a amostra e a solução reagente
multienzimática eram aspiradas sequencialmente para o TA e após um período de 15
minutos a mistura era propulsionada para o detector. A diminuição da concentração de
NADH, proporcional à quantidade de pirofosfato, era medida espectrofotometricamente a
340 nm. No caso das amostras de urina, era necessário efectuar a correcção do branco
das amostras, dada a absorção intrínseca das mesmas a este comprimento de onda.
39
Capítulo 1
1.2.2. Emprego das enzimas em ensaios de actividade e inibição enzimática
Os esquemas enzimáticos para a determinação de substratos descritos na secção
1.2.1. podem ser facilmente adaptados para os ensaios de actividade das enzimas
empregues. Neste sentido, utilizando o mesmo sistema de detecção e adoptando uma
determinada concentração de substrato constante, os sinais analíticos obtidos no sistema
SIA, após um certo período de reacção enzimática, são função da actividade da enzima
utilizada. A própria actividade enzimática pode ainda ser determinada a partir da
velocidade da reacção que a própria catalisa sob condições específicas.
Os procedimentos bioanalíticos, quer orientados para a determinação da
actividade enzimática quer baseados na inibição enzimática, podem ser facilmente
implementados no formato SIA. Adicionalmente, é importante mencionar que a
determinação da actividade enzimática abre a oportunidade para outras aplicações
analíticas relacionadas com a determinação indirecta de compostos que influem na sua
actividade.
Ruzicka e Gübeli [89] reportaram o primeiro estudo de determinação da actividade
enzimática implementado num sistema SIA. A enzima monitorizada foi uma enzima
proteolítica do tipo da subtilisina (savinase), a qual se encontra nas partículas do ar, que
despoletam reacções asmáticas quando inaladas, mesmo em quantidades vestigiais,
dado o seu elevado potencial alergénico. O substrato empregue foi um tripeptídeo,
contendo 7-amino-4-metilcumarina como fluoróforo. Uma determinada secção da zona
composta de amostra (enzima) e reagente era aprisionada no detector, permitindo assim
a medição da velocidade de reacção da hidrólise do substrato. Mais tarde, a mesma
determinação foi implementada num sistema lab-on-valve, permitindo uma diminuição
significativa das quantidades de reagente e amostra [6].
O principal domínio de aplicações dos sistemas SIA desenvolvidos para a
determinação da actividade enzimática prende-se essencialmente com enzimas de
produção industrial. Neste âmbito, foram propostos diferentes sistemas SIA com vista à
determinação de enzimas como a AMG, a α-amilase e a β-fructofuranosidase, de
extrema importância na indústria alimentar. As estratégias para a quantificação da
actividade enzimática compreendiam a incubação da amostra (enzima) e do substrato
numa câmara de mistura [90-92] ou num tubo de reacção [93] termostatizados, acoplados
a uma das portas da válvula selectora.
Hansen et al. [90] conceberam um sistema SIA para a determinação da actividade
enzimática da AMG, a qual intervém no processo de fermentação, degradando a maltose
40
Introdução
a α-D-glucose. A determinação era depois efectuada com o envio para o detector da
zona de reagente enzimático, constituído pela mutarotase, glicerol desidrogenase e
NAD+, e de uma alíquota da câmara de mistura, com medição do NADH formado após a
implementação de um período de paragem de fluxo.
Schindler et al. [91] implementaram a determinação da actividade da βfructofuranosidase com detecção por FTIR. Após um período de incubação de 3 minutos
da sacarose e da amostra, eram registados os espectros da mistura reaccional (substrato
sacarose, glucose e frutose) e comparados com o espectro do substrato puro recorrendo
a ferramentas quimiométricas, nomeadamente por um modelo de calibração multivariada
segundo o método dos mínimos quadrados parciais. Foi também implementado no
mesmo sistema a determinação simultânea das actividades da β-fructofuranosidase e
AMG [92]. A determinação da actividade da AMG era avaliada a partir da concentração
de glucose formada, após subtracção da parcela originada por acção da
β-
fructofuranosidase. Neste estudo, a quantificação da actividade era efectuada após um
período de incubação de 10 minutos.
Min et al. [93] procederam à avaliação da actividade da α-amilase em cultivos de
Aspergillus oryzae, através da monitorização da descoloração do complexo azul de iodoamido (650 nm). Neste caso, o conteúdo do tubo de reacção, correspondente ao amido
remanescente, era no final misturado com uma alíquota de iodo e enviados para o
detector.
Em alguns trabalhos, é também explorado o efeito inibitório apresentado por
certos compostos sobre a actividade da enzima.
Chen et al. [94] desenvolveram um sistema miniaturizado lab-on-valve para
efectuar estudos de cinética e inibição enzimática. As enzimas modelo ensaiadas foram a
enzima conversora da angiotensina e a acetilcolinesterase. O sistema compreendia uma
câmara de mistura, designada de microreactor pelos autores, posicionada numa das
portas laterais da válvula selectora, para onde eram enviadas as alíquotas de tampão,
enzima, substrato e inibidor (aquando dos estudos de inibição enzimática). A velocidade
inicial da reacção era medida no próprio microreactor, com recurso a um sistema de
detecção baseado em fibras ópticas. No final do ciclo, o microreactor era esvaziado com
uma seringa auxiliar. Para a determinação das constantes cinéticas, a concentração dos
reagentes na mistura reaccional foi determinada através de estudos de dispersão com
um corante.
Armenta et al. [50] descreveram um sistema SIA para a determinação da
actividade da acetilcolinesterase e para estudos de inibição enzimática, mas
41
Capítulo 1
contrariamente aos estudos anteriores esta encontrava-se imobilizada, e colocada na
célula de infravermelho termostatizada, conforme descrito na secção 1.2.1.1. Diferentes
misturas do substrato acetilcolina e de inibidor tacrina (para os estudos de inibição) eram
enviadas para o detector, onde ocorria paragem de fluxo. As constantes cinéticas, bem
como o efeito inibitório da tacrina, eram depois calculados tendo por base as diferenças
espectrais derivadas da própria reacção. Mais tarde, o mesmo grupo [95] utilizou a
mesma abordagem para a avaliação da actividade da frutose-1,6-difosfatase e sua
inibição pela adenosina 5′-monofosfato, utilizando a frutose-1,6-difosfato como substrato.
Muito recentemente, Vidigal et al. [96] propuseram um sistema miniaturizado labon-valve para a determinação da actividade da POD em extractos de vegetais. Esta
enzima exerce um efeito negativo na cor e aroma dos alimentos e a sua determinação
pode ser um indicador de deterioração dos alimentos e/ou de eficácia de tratamento
térmico com à vista à conservação dos mesmos que conduz à inactivação das enzimas.
A estratégia de determinação, bem como o próprio ciclo analítico são semelhantes ao
trabalho anterior dos mesmos autores [82], com a diferença de neste caso a amostra ser
a própria enzima e de ter sido implementado um período de paragem de fluxo no próprio
detector, para o registo da variação da absorvância ao longo desse período de tempo que
se relacionava com a concentração de POD. O sistema desenvolvido permitiu ainda a
monitorização em linha do processo de inactivação térmica da POD.
A avaliação da actividade enzimática foi também efectuada em ambientes
diferentes do meio aquoso, considerado o habitat natural das enzimas, nomeadamente
em meios contendo líquidos iónicos [97] e micelares [98]. Pinto et al. [97] desenvolveram
um sistema SIA para a análise comparativa da actividade da POD na presença de um
solvente orgânico convencional, o metanol, e de um líquido iónico, tetrafluoroborato de 1butil-3-metilimidazólio. A actividade enzimática era avaliada comparando os declives das
curvas de calibração para o naftol obtidos no meio orgânico e no líquido iónico. O ciclo
analítico compreendia a aspiração de pequenas alíquotas de solução aquosa de enzima,
peróxido de hidrogénio, naftol e 4-aminoantipirina dissolvidos em misturas de
tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio ou metanol/água, seguido do envio das
zonas aspiradas através de um tubo de reacção em direcção ao detector. O produto
formado era depois medido espectrofotometricamente a 510 nm. Passos et al. [98]
também exploraram a avaliação da actividade da POD, em meio micelar relativamente ao
meio aquoso. Para o efeito, a oxidação enzimática pelo peróxido de hidrogénio de duas
fenotiazinas, uma hidrossolúvel e a outra lipossolúvel (solubilizada em meio micelar) foi
implementada num sistema SIA. A determinação era efectuada em tempo fixo, com
42
Introdução
paragem do fluxo no tubo reaccional posicionado imediatamente antes do detector,
através da monitorização espectrofotométrica a 527 nm do intermediário formado,
permitindo assim examinar a cinética da reacção nos dois meios considerados.
43
Capítulo 1
1.3. Enquadramento geral e objectivos propostos
A incorporação de processos biocatalíticos em procedimentos analíticos permite
alargar o leque de analitos que são determinados pelos métodos convencionais e por
outro lado melhorar a selectividade destes métodos dada a elevada especificidade do
reconhecimento biomolecular exibida pelas enzimas. Os métodos analíticos resultantes
são dotados de elevada versatilidade, podendo ser aplicados directamente na
determinação dos substratos, produtos ou da actividade enzimática ou indirectamente na
determinação de compostos que exerçam efeito sobre a actividade enzimática, tais como
inibidores, activadores, cofactores, etc.
A utilização do SIA apresenta características de funcionamento, que parecem
facilitar a implementação de métodos enzimáticos, e conduzir a metodologias simples, de
elevada eficiência e envolvendo consumos reduzidos de enzima, amostra e restantes
reagentes.
Neste contexto, o trabalho apresentado nesta dissertação visa a integração de
dois aspectos fundamentais: a utilização das enzimas como ferramentas analíticas e a
técnica SIA como um modo de rentabilizar o uso das primeiras, quer em ensaios de
rotina, de diferentes áreas de intervenção, quer em estudos sistemáticos. Em cada
situação analítica, e em função dos substratos e das relações substrato/enzima que se
pretendam monitorizar, serão seleccionadas as condições adequadas à acção
biocatalítica das enzimas (pH, temperatura, força iónica do meio, próprio meio reaccional
e outras), de acordo com as características destas e com o fim a que o módulo analítico
se destina. Serão alvo de automatização ensaios enzimáticos com vista à determinação
de substratos ou da actividade enzimática e sua inibição em meios aquosos e em meios
não convencionais, como os constituídos por lipossomas, líquidos iónicos e solventes
orgânicos. Adicionalmente, dada a versatilidade do SIA, preconiza-se a aplicação de
diferentes tipos de intervenção sobre a amostra (diluição, extracção, incubação, entre
outras) em linha, de modo a simplificar e melhorar os processos analíticos resultantes e
assim proporcionar soluções alternativas atractivas face aos métodos existentes.
44
Introdução
1.4. Referências bibliográficas
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Determination of Iron in Plant Digests. Anal Chim Acta 1994 Jul 20; 293 (1-2): 129-38.
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Introdução
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Introdução
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[49]
Mei
Y,
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Ying
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Yuan
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D-methotrexate
using
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sequential
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49
Capítulo 1
analysis/amperometric biosensors system. Biosens Bioelectron 2003 Nov 30; 19 (3): 2617.
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(D-T-4),
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using
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sensors/sequential injection analysis system. Talanta 2004 Sep 8; 64 (1): 151-5.
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of
enalapril,
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using
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Introdução
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Capítulo 1
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52
Introdução
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micellar media based on horseradish peroxidase-hydrogen peroxide system using a SIA
manifold. Talanta 2008 Dec 15; 77 (2): 484-9.
53
CAPÍTULO 2
Parte experimental
Parte experimental
2.1. Introdução
Neste capítulo são descritos os aspectos experimentais gerais, comuns aos
diversos trabalhos realizados, evitando assim repetições subsequentes nas secções
experimentais incluídas em cada trabalho. São assim referidos os equipamentos e
material utilizados no decurso dos capítulos bem como os procedimentos gerais usados
na preparação dos reagentes. São ainda apresentados o procedimento de optimização
seguido no desenvolvimento das metodologias propostas e o tratamento estatístico
empregue para avaliação da qualidade dos resultados obtidos. É, também, abordado o
modo de controlo dos sistemas analíticos desenvolvidos.
2.2. Reagentes e soluções
A preparação das soluções foi realizada com água ultra-pura, obtida através de
um sistema de purificação Millipore RG munido de um conjunto de resinas de leito misto
QPack2 – CPMQ004D2 e de um filtro de partículas 0,45 µm Millipak 40 Gamma gold.
Este sistema de purificação permite obter uma água com uma resistividade superior a 18
MΩ cm. Todos os reagentes usados eram de qualidade analítica ou equivalente, não
tendo sido realizado qualquer tratamento de purificação adicional.
As soluções padrão concentradas eram obtidas por pesagem rigorosa do
respectivo reagente sólido em balança analítica e dissolução, em solvente apropriado, em
material de vidro classe A ou equivalente, convenientemente lavado. As soluções padrão
de trabalho eram obtidas por diluição rigorosa da solução mãe usando pipetas
automáticas Gilson modelos P20, P100, P1000 e P5000 de volume variável e com
capacidades máximas de 20, 100, 1000 e 5000 µL, respectivamente, com pontas de
plástico descartáveis. As pipetas automáticas eram regularmente calibradas com água.
No caso de reagentes líquidos, a preparação das soluções mais concentradas era
realizada por diluição directa a partir do reagente. As soluções mais diluídas eram obtidas
por diluições rigorosas da solução mais concentrada.
Na secção de material e métodos de cada um dos seguintes capítulos (3 a 7) irão
descrever-se todos os reagentes utilizados ao longo dos trabalhos realizados e os
cuidados obedecidos na preparação das soluções quando justificável.
57
Capítulo 2
2.3. Instrumentação
Neste ponto descrevem-se os equipamentos que foram utilizados no decorrer do
trabalho experimental que deu origem a esta dissertação. São referidos quer os
equipamentos empregues nos sistemas de fluxo desenvolvidos, quer os utilizados nos
diferentes procedimentos de comparação.
2.3.1. Equipamento Auxiliar
De acordo com a precisão necessária, todos os reagentes e amostras foram
pesados numa balança analítica Mettler Toledo AG285 (precisão de 2x10-5 g) ou numa
balança Kern 440-35N (precisão de 1x10-2 g).
Para a agitação das soluções foi utilizada uma placa de aquecimento e agitação
da Falc - F60.
Quando necessário, o pH foi ajustado utilizando um milivoltímetro de alta
impedância de entrada da marca Crison Instruments modelo GLP 22 acoplado a um
eléctrodo de vidro combinado de Ag/AgCl da mesma marca e modelo 52-02. A calibração
do eléctrodo combinado era realizada com os padrões comerciais pH = 4,00 (RiedeldeHaën, 33543), pH = 7,00 (Riedel-deHaën, 33546) e pH = 9,00 (Merck, 9889).
Para o desarejamento das soluções, quando necessário, foi utilizado um banho de
ultra-sons da VWR USC 100T5.
Para o estabelecimento e manutenção da temperatura na determinação da
glutationa (Capítulo 3) e no estudo da cinética da reacção catalisada pela tirosinase em
líquido iónico (Capítulo 6) foi utilizado um banho termostatizado GLF Thermed, modelo
5001.
Para o processamento das amostras de sangue, no Capítulo 3, foram utilizados
um vórtice da marca Unimag Zx (UniEquip) e uma centrífuga da marca Jouan BR4i
Thermo Electron Corporation.
Todas as medidas espectrofotométricas preconizadas pelos procedimentos de
comparação para os parâmetros estudados foram efectuadas num espectrofotómetro
UV/VIS Perkin Elmer λ50 usando células de quartzo com 1 cm de passo óptico (Hellma,
ref. 6030-UV), num espectrofluorímetro Perkin Elmer LS 50 B usando células de quartzo
com o mesmo passo óptico (Hellma, ref.104-QS), bem como no leitor de microplacas
Synergy HT, BIO-TEK. Para a realização do método de referência da determinação do
metanol em amostras de biodiesel [1] foi utilizado um cromatógrafo de gás
ThermoFinnigan Trace (Milan, Italy) equipado com um injector do tipo com/sem divisão
do fluxo (em inglês, “split-splitess injector”), associado a um detector de ionização em
58
Parte experimental
chama (FID, do acrónimo em inglês “Flame Ionization Detector”). Para a separação
cromatográfica usou-se uma coluna capilar de sílica fundida (Equity®, Supelco) com 30 m
de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 5 µm de espessura da fase estacionária.
As montagens de fluxo desenvolvidas incorporaram como sistema de detecção:
- espectrofotómetro de visível, da marca Jenway (modelo 6300), equipado com uma
célula de fluxo de 80 µL da marca Hellma, com a referência 178.710 QS no Capítulo 3 e
com uma célula de fluxo de 18 µL da mesma marca com a referência 178.712 QS no
Capítulo 4;
- espectrofotómetro de UV/VIS da marca Heλios γ equipados com um suporte de células
termostatizado e uma célula de fluxo de 80 µL da marca Hellma, com a referência
178.710 QS, usado no trabalho descrito no Capítulo 6;
- fluorímetro da marca Jasco, modelo FP-2020, equipado com uma célula de fluxo de 16
µL no Capítulo 5;
- luminómetro equipado com uma célula de construção laboratorial em forma de espiral (4
cm de comprimento, 0,14 cm de largura, 0,09 cm de profundidade, 50 µL de volume
interno, 0,9 cm de diâmetro da espiral e 0,8 cm2 de área de superfície efectiva de
emissão de luz), fabricada em polimetilmetacrilato, colocada em frente de um
fotomultiplicador (Hamamatsu City, Japan, modelo H5784), que apresenta uma zona de
resposta para comprimentos de onda no intervalo de 195 a 850 nm, utilizado no trabalho
descrito no Capítulo 7. A célula de fluxo bem como o módulo fotossensor eram
acomodados numa caixa plástica negra para proteger o sistema de detecção da luz
externa. Outro componente fundamental é o circuito de realimentação que permite
controlar o ganho do fotomultiplicador por intermédio de um potenciómetro externo de 10
kΩ, cuja posição regula a voltagem de realimentação que pode variar entre 0,3 V (Ganho
= 1) e 0,8 V (Ganho = 1000).
2.3.2. Sistemas de fluxo
Descrevem-se em seguida algumas características do equipamento/material
utilizado na montagem dos sistemas de fluxo.
2.3.2.1. Unidades de aspiração/propulsão
Os sistemas de aspiração/propulsão utilizados foram de dois tipos:
a) Bomba peristáltica, Minipuls 3 da Gilson de 4 canais [2]. O caudal das soluções
aspiradas/bombeadas depende da velocidade de rotação seleccionada e, igualmente, do
59
Capítulo 2
diâmetro interno do tubo de impulsão utilizado. Os tubos de impulsão eram de cloreto de
polivinilo (PVC, do acrónimo em inglês “Polyvinyl chloride”), de 1,02 ou 1,30 mm de
diâmetro interno ou de fluorelastómero (para solventes orgânicos, Capítulo 4) de 1 mm de
diâmetro interno, da mesma marca. A escolha do diâmetro interno do tubo de impulsão
era efectuada tendo em conta o caudal de propulsão pretendido e os volumes de solução
a aspirar. Os tubos eram substituídos logo que se detectavam sinais de mau
funcionamento tais como alterações do caudal, perda de elasticidade ou aumento do
número de pulsos.
A calibração dos tubos de impulsão era efectuada por cálculo da variação de volume
aspirado ou impulsionado, por pesagem [3]. A diferença obtida após pesagem de um
goblé com água, previamente tarado, sujeito a aspirações ou propulsões a partir da
válvula selectora, permitia estabelecer uma relação entre tempo e caudal, que permitia a
definição dos volumes, a aspirar ou propulsionar, em termos de tempo. Este
procedimento foi realizado sempre que necessário. O funcionamento da bomba
peristáltica era controlado por computador, em termos de sentido e velocidade da
rotação, posição de paragem da cabeça rotativa, início e paragem de funcionamento.
No Capítulo 3, na determinação da glutationa em amostras de sangue, a bomba
apresentava um dispositivo de contacto que controlava a sua paragem numa posição
predefinida, através de um íman fixado na cabeça rotativa da bomba peristáltica e de um
“reed relay” numa zona exterior à cabeça da bomba [4]. Aquando da sua aproximação,
havia passagem de corrente eléctrica e consequente activação da válvula solenóide de
três 3 vias, colocada entre a bomba e o tubo de armazenamento. Desta forma, o controlo
do início do movimento da bomba peristáltica a partir da mesma posição assegurava
reprodutibilidade dos volumes aspirados e propulsionados.
No sistema referente ao trabalho do Capítulo 4 foi incorporada uma bomba peristáltica
adicional através da qual se fazia o carregamento da alça de amostragem da válvula de
injecção, com amostra.
b) Multisseringa BU4S, Crison Instruments, com quatro seringas (Microliter, Hamilton)
com capacidades de 10,00; 5,00 e 1,00 mL, usada no Capítulo 7. As seringas são de
vidro e incluem êmbolos e ligadores em politetrafluoroetileno (PTFE). Trata-se de uma
bomba de pistão multi-canal que permite a movimentação simultânea dos êmbolos das
quatro seringas, que estão ligadas a uma barra movimentada pelo motor de uma bureta
automática, controlado a partir de um computador através de uma porta série. O
movimento completo do êmbolo da seringa corresponde a 5000 passos, sendo que o
volume correspondente a cada passo é dependente da seringa utilizada. O caudal de
aspiração/bombeamento é definido pelo volume da seringa adoptada e pela velocidade a
que o êmbolo é movido. Junto à saída de cada seringa está acoplada uma válvula
60
Parte experimental
solenóide de três vias, enquanto que na extremidade oposta se encontra o êmbolo
responsável pelos movimentos de aspiração/propulsão das soluções. Estas válvulas
determinam a ligação das seringas à restante montagem analítica ou ao reservatório das
soluções, consoante se encontram na posição “On” ou “Off”, respectivamente,
independentemente do sentido do movimento assumido pelo êmbolo (aspiração ou
propulsão) [5].
2.3.2.2. Dispositivos de selecção de fluidos
Como dispositivo selector de fluidos foi utilizada uma válvula selectora de 10
portas da marca Vici modelo C25-3180D (Valco Instruments, Houston, TX, EUA) (Figura
2.1.). Esta válvula apresenta um canal central que a cada momento pode estar conectado
com um dos 10 canais laterais, permitindo o direccionamento dos fluidos.
a
d
b
e
f
c
Figura 2.1. Representação esquemática dos componentes de uma válvula selectora da Valco
Instruments: a) corpo da válvula; b) accionador; c) rotor; d) estator; e) orifícios de ligação das
portas da válvula; f) parafusos de fixação da cabeça da válvula. Adaptado de [6].
A montagem, apresentada no Capítulo 4, utilizou um equipamento Crison que
incorporava uma válvula selectora de 8 portas, semelhante à descrita para as restantes
montagens, e uma válvula de injecção de 6 portas. A válvula de injecção incorporava,
entre as portas 2 e 5, uma alça de amostragem constituída por uma porção de tubo de
teflon de 0,8 mm de diâmetro interno, com 20 cm de comprimento. Esta válvula tem duas
posições possíveis, uma que permitia o enchimento da alça com amostra (Posição de
enchimento) e outra em que ocorria a passagem do xileno pela alça, empurrando a
amostra em direcção à unidade de extracção (Posição de injecção) (Figura 2.2.).
61
Capítulo 2
Posição enchimento
Posição injecção
unidade de extracção
unidade de extracção
amostra
amostra
2
2
3
3
1
5
xileno
6
4
6
4
1
5
esgoto
esgoto
xileno
Figura 2.2. Representação esquemática das posições da válvula de injecção do equipamento
Crison utilizado no Capítulo 4.
No Capítulo 7, foi também usada uma válvula selectora de 8 portas da marca
Crison.
Foram também utilizadas como dispositivos de selecção de fluidos válvulas
solenóides de três vias (uma entrada/duas saídas) NResearch P/N 161T031 [7] nos
Capítulos 3 e 4. Estas válvulas são activadas electromecanicamente por solenóide. O seu
funcionamento é condicionado pela direcção da pressão exercida sobre uma membrana
em teflon, que define o percurso das soluções: o accionamento do núcleo do solenóide
empurra a membrana de PTFE, estabelecendo um dos percursos; após o desligar da
válvula, uma mola helicoidal recoloca a membrana de PTFE na sua posição inicial
estabelecendo o percurso alternativo (Figura 2.3.). As válvulas possuem um volume
interno de cerca de 27 µL, um tempo de actuação inferior a 30 ms e todo o material da
válvula que fica em contacto com a solução é de PTFE. No Capítulo 3 foi utilizada uma
válvula solenóide de três vias ligada à bomba peristáltica, como interruptor do
escoamento entre a bomba e o tubo de armazenamento, conforme descrito na secção
anterior. No Capítulo 4, também foi acoplada uma válvula solenóide de três vias, com o
objectivo de coordenar o canal do reagente (ABTS+POD) e o canal do transportador
ligados à bomba peristáltica, de forma a inserir um volume definido de reagente
cromogénico e de peroxidase no tubo de reacção aquando da sua activação. De outro
modo, esta solução fluía em circuito fechado até posterior activação da válvula.
62
Parte experimental
(A)
(B)
d
e
a
g
b
f
c
Figura 2.3. (A) Válvula solenóide de 3 vias; (B) Representação esquemática do seu interior: a,b –
canais de entrada; c – mola; d – solenóide; e,f – membranas de PTFE; g – canal de saída.
Adaptado de [7].
2.3.2.3. Tubagem e outros componentes das montagens
A tubagem utilizada para a interligação entre os diferentes módulos constituintes
de cada sistema de fluxo foi de PTFE (Omnifit), com 0,8 mm de diâmetro interno e 1,6
mm de diâmetro externo [8]. Todos os tubos de armazenamento e reactores utilizados
foram construídos com PTFE tendo sido adoptada uma configuração em figuras de oito,
por enrolamento dessa forma ao longo de uma malha de plástico de 2 cm, com o
objectivo de intensificar o transporte radial e diminuir o transporte laminar das soluções
ao longo do percurso [9]. O comprimento dos tubos de armazenamentos utilizados
asseguravam uma dispersão mínima e ao mesmo tempo possuíam volume suficiente
para
garantir
que
as
soluções
aspiradas
não
atingissem
a
unidade
de
aspiração/propulsão. A tubagem utilizada na bomba peristáltica foi de PVC ou de
fluorelastómero, sendo substituída sempre que apresentava sinais de desgaste.
As confluências utilizadas eram de construção laboratorial e fabricadas em
Perspex® com uma configuração similar aos modelos de construção apresentados por
Alegret et al. [10]. Foram utilizadas confluências com configurações em “duplo-T”, “Y” e
“T”, que permitiam que os líquidos confluíssem em diferentes ângulos.
Foram ainda construídos diferentes dispositivos cujas potencialidades são
avaliadas em cada determinação.
No trabalho que se apresenta no Capítulo 4, da determinação do metanol em
amostras de biodiesel, foi usada uma unidade de extracção para permitir a passagem do
metanol da amostra orgânica, solução dadora, para a solução tampão aceitadora. Este
63
Capítulo 2
componente feito de PTFE, com um volume interno de cerca de 160 µL, era constituído
por dois paralelepípedos que apresentavam uma cavidade com configuração em “U” (2,0
mm de largura e 0,5 mm de profundidade) (Figura 2.4. A e B). A membrana hidrofílica de
fluoreto de poliviniletileno (PVDF, do acrónimo em inglês “polyvinylidene fluoride”;
Millipore Durapore®, Ref. SVLP09050), com diâmetro de poro de 5 µm e espessura de
125 µm, era colocada entre as duas cavidades justapostas face a face e o seu aperto era
conseguido por intermédio de quatros parafusos. A ligação das cavidades com o exterior
fazia-se por canais com 0,8 mm de diâmetro interno.
(A)
(B)
B
Bloco de
teflon
Parafusos
A
C
Membrana
Figura 2.4. (A) Fotografia da unidade de extracção; (B) Representação esquemática da vista de
topo da cavidade da referida unidade: dimensões A = 25 mm, B = 10 mm, C = 4 mm e
profundidade do canal = 0,5 mm.
64
Parte experimental
Neste módulo analítico, foi também utilizada uma coluna como reactor enzimático
(Figura 2.5.), de construção laboratorial, fabricada em Perspex®, com 20 mm de
comprimento, que apresentava cavidade tubular com 1,5 mm de diâmetro interno. Em
cada uma das extremidades das colunas era colocado um disco de filtro, da marca
MoBiTec (Goettingen, Germany), com poros de 35 µm de diâmetro. Ambas as
extremidades da coluna possuíam um rosqueamento que permitia a ligação ao sistema
de fluxo através de um ligador convencional.
Figura 2.5. Fotografia do reactor enzimático.
Foi, neste sentido, também avaliada uma câmara de agitação cilíndrica (Figura 2.6.)
(volume interno de 400 µL; raio da base igual a 4 mm e altura igual a 8 mm), colocada
sobre um agitador magnético que promovia a rotação de uma barra magnética
(comprimento de 6 mm e largura de 3mm) colocada no seu interior, como alternativa aos
reactores descritos anteriormente para estudar a influência do empacotamento das
esferas de vidro com enzima imobilizada.
Figura 2.6. Fotografia da câmara de agitação magnética.
65
Capítulo 2
Para a avaliação da actividade da fosfolípase A2 sobre os lipossomas (Capítulo 5)
foram usadas duas câmaras de mistura de Perspex® (Figura 2.7.), com agitação
mecânica, de volume interno regulável, através do ajuste da posição de uma peça móvel
no topo das mesmas. Eram constituídas por uma cavidade cilíndrica, perfurada na base
em dois pontos diametralmente opostos, bem como no centro da peça móvel formando
um canal para o exterior das câmaras. Estas eram também colocadas sobre um agitador
magnético que promovia a rotação de uma barra magnética (comprimento de 6 mm e
largura de 3mm) colocada no seu interior. Nesta montagem, um dos canais da base das
câmaras foi obstruído com um ligador e como tal o líquido entrava pelo outro canal lateral
emergindo pelo canal situado no topo das mesmas (Figura 2.7.).
Figura 2.7. Fotografia da câmara de mistura.
2.3.2.4. Registo e aquisição do sinal analítico
Nos trabalhos descritos nos Capítulos 3, 4, 5 e 6 a aquisição do sinal analítico foi
assegurada por um registador da marca Linseis (modelo L250 E) acoplado às unidades
detectoras anteriormente referidas e através de software desenvolvido em QuickBasic 4.5
[11]. No trabalho descrito no Capítulo 7 a aquisição foi efectuada por meio do programa
Autoanalysis 5.0 (Sciware, Palmanyola, Espanha) através de livrarias de ligação
dinâmicas (DLLs, do inglês “Dynamic Link Libraries”) [12].
66
Parte experimental
2.3.2.5. Controlo informático dos sistemas
Os dispositivos selectores de fluidos (válvulas solenóides, válvula selectora,
válvula de injecção) e os dispositivos de aspiração/propulsão (bomba peristáltica)
encontravam-se interligados, através de um computador Pentium I, por uma interface
activa da marca Advantech PCL-711B.
O controlo da posição da válvula selectora de 10 portas era efectuado por desactivação,
em combinações predefinidas de 6 saídas digitais de 5 V. A bomba peristáltica era, por
seu lado, controlada por apenas duas saídas digitais da mesma voltagem, que definiam a
activação e sentido de rotação da bomba. A velocidade de rotação da bomba era
controlada por uma saída analógica de modo que os sinais enviados pelo computador
variavam entre 0 e 5 V, correspondendo às velocidades de rotação mínima (0 rotações
por minuto) e máxima (48 rotações por minuto). Dado que o funcionamento das válvulas
solenóides de três vias requer uma tensão de 12 V foi colocado, entre cada válvula e a
placa de controlo, um interruptor electrónico de alimentação que era accionado por
intermédio da activação de uma saída digital da placa [13].
As metodologias baseadas na técnica SIA assentavam na actuação automática e
sincronizada do dispositivo de aspiração/propulsão e dos dispositivos selectores de
fluidos. Os programas usados nos vários métodos apresentados eram escritos em
Microsoft QuickBasic 4.5 (implementada em ambiente DOS) e foram adaptados aos
elementos utilizados em cada situação. De um modo geral, cada programa permitia
definir a sequência de etapas para cada determinação, bem como a sua repetição
programada quando necessário. Em cada caso particular as instruções dadas referiam-se
à posição da válvula selectora a aceder, ao tempo de permanência na posição definida,
ao sentido de funcionamento das unidades de aspiração/propulsão e ainda à posição da
válvula solenóide nos casos em que foi utilizada.
No trabalho descrito no Capítulo 7, o controlo do equipamento englobado na montagem
foi efectuado a partir de um computador, através da porta de comunicação RS 232. O
software utilizado foi o Autoanalysis, permitindo um controlo, por parte do utilizador, dos
dispositivos (sentido e velocidade de deslocamento do pistão da multisseringa e posição
das válvulas solenóides e válvula selectora de fluidos), assim como a aquisição do sinal
analítico.
67
Capítulo 2
2.4. Estudo das variáveis e avaliação das características de funcionamento dos
métodos desenvolvidos
A selecção dos valores mais adequados para as variáveis em estudo em cada
montagem foi efectuada pelo método univariante, que consiste em variar, num
determinado intervalo, o parâmetro a estudar, sendo os restantes mantidos fixos. A
optimização dos diferentes parâmetros do sistema foi efectuada tendo em conta diversos
factores que afectam o desempenho da montagem analítica, nomeadamente a
sensibilidade, o ritmo de amostragem, o limite de detecção, a precisão, a exactidão bem
como o consumo de amostra e reagentes.
O intervalo de concentrações em que se verificava uma relação linear entre a
concentração da espécie e o valor médio do sinal analítico do detector era definido
através do traçado de curvas de calibração, com soluções de concentração crescente da
espécie a determinar. A concentração das amostras foi obtida por interpolação nas
curvas de calibração, previamente estabelecidas, do sinal analítico obtido na análise de
cada amostra.
A precisão da metodologia era avaliada em termos de desvio padrão relativo
(RSD, do acrónimo em inglês “Relative Standard Deviation”), expresso em percentagem.
Amostras, com diferentes concentrações da espécie a determinar, eram injectadas 10
vezes consecutivas, no sistema de fluxo, sendo calculada a concentração média obtida e
o respectivo desvio padrão, de forma a avaliar a repetibilidade da metodologia, ao longo
de todo o intervalo de concentração linear.
A avaliação da exactidão das metodologias propostas foi efectuada por
comparação com os respectivos métodos de referência ou de comparação.
O limite de detecção de uma operação analítica foi definido como o valor mínimo
de concentração (CLD) para o qual se consegue obter uma resposta analítica (YLD)
significativamente diferente do valor de um branco ou do ruído de fundo [14]. Desta
forma, YLD pode ser obtido de duas formas: a) a partir da equação: YLD = b + 3 Sy/x, em
que b corresponde à ordenada na origem e Sy/x representa o desvio padrão dos valores
de y numa regressão linear, calculado por
∑ ( y − yi)
n−2
2
, em que C LD =
(YLD − b )
, sendo
a
a o declive da recta de regressão linear; b) através da equação YLD = YB + 3 SB, onde YB
corresponde à média de dez medições do sinal analítico do branco e SB ao desvio padrão
dessas mesmas medições. As medições do branco foram efectuadas pela injecção no
sistema de uma solução com a mesma composição das soluções padrão com excepção
68
Parte experimental
do analito a determinar. A concentração mínima detectável (CLD) era calculada por
interpolação na curva de calibração do valor de YLD [15].
O limite de quantificação (também designado por limite de determinação), definido
como o valor mínimo de concentração (CLQ) para o qual se consegue obter uma resposta
quantitativa e precisa (YLQ), pode ser obtido após o cálculo do YLQ através das equações:
YLQ = b + 10 Sy/x ou YLQ = YB + 10 SB [15].
No trabalho descrito no Capítulo 4, foi também calculado o limite de decisão
(CCα) e a capacidade de detecção (CCβ) do método analítico de acordo com as normas
ISO 11843-2 [16]. O CCα corresponde à concentração acima da qual pode ser decidido
se a medida é realmente maior que o limite de resíduo máximo (MRL, do acrónimo em
inglês “Maximum Residue Limit”) para um nível de confiança de 95%. Por seu lado, o
CCβ é definido como a concentração a partir da qual o método permite a quantificação do
analito para um nível de confiança de 95%.
O ritmo de determinação, expresso como o número de determinações por hora, foi
definido com base no período de tempo resultante da soma do tempo necessário à
execução de cada etapa do ciclo analítico, acrescido do tempo necessário para a
comunicação de instruções entre o computador e os restantes dispositivos do sistema.
69
Capítulo 2
2.5. Tratamento estatístico dos resultados
Os valores dos parâmetros a determinar eram obtidos a partir da avaliação da
intensidade dos sinais analíticos registados na análise das amostras, sendo esta
calculada a partir de um conjunto de 3 medidas consecutivas da mesma amostra. O valor
final do parâmetro a determinar era calculado por interpolação da intensidade de sinal
obtido, na curva de calibração estabelecida para cada metodologia.
A exactidão de cada metodologia era avaliada por comparação dos resultados
obtidos com os fornecidos pelo método de referência aplicável ou por outro convencional
bem estabelecido. Em todos os capítulos, aos resultados da análise pelos métodos
propostos e de comparação encontra-se sempre associado o desvio padrão de 3
determinações (Resultado ± Desvio Padrão). Para cada determinação calcularam-se os
desvios relativos para cada par de resultados obtidos (DR, %) com base na
expressão: DR % =
(C Método proposto − CMétodo referência )
C Método referência
× 100 .
Nas metodologias referentes aos Capítulos 3, 4 e 7, os resultados foram comparados
através de uma regressão linear do tipo CMétodo proposto = C0 + S × CMétodo referência. A eventual
concordância entre os dois métodos era avaliada a partir do valor do coeficiente de
correlação (r) e dos intervalos de confiança, para um nível de significância de 95%, para
a ordenada da origem (C0) e para o declive (S), indicados entre parêntesis [17].
Desejavelmente o valor de r situava-se próximo de 1 e os valores de C0 e S incluíam o
zero e a unidade, respectivamente.
Nestes casos, foi ainda aplicado um teste t de Student emparelhado (em inglês, “paired ttest”) aos valores obtidos pelas duas metodologias. O valor de t foi calculado com base
na expressão t =
X
× n , com n-1 graus de liberdade e onde X é a média da diferença
S
entre cada par de valores, S é o desvio padrão e n o número de medidas. O valor
calculado (t
calculado)
quando comparado com o valor tabelado (t
tabelado),
para um nível de
significância de 95%, permite confirmar a concordância entre os dois métodos quando se
verifica a hipótese nula [15].
70
Parte experimental
2.6. Referências bibliográficas
[1] Resolução Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis ANP Nº 42
Brazil 2004.
[2]Minipuls 3 Peristaltic Pump. Disponível em http://www.gilson.com/en/AI/Products/32.47/
[acedido em 25/01/2011].
[3] Valcarcel M, Luque de Castro MD. Flow-injection analysis – Principles and
Applications. Chichester: Ellis Horwood Limited; 1987. p. 104.
[4] Pinto PCAG. A análise por injecção sequencial como base de sistemas automáticos
em fluxo contínuo [dissertação]. Porto: Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto;
2005.
[5] Albertus F, Horstkotte B, Cladera A, Cerda V. A robust multisyringe system for process
flow analysis - Part I. On-line dilution and single point titration of protolytes. Analyst 1999
Sep; 124 (9): 1373-81.
[6] Low Pressure Selectors. Disponível em http://www.vici.com/cval/cval.php [acedido em
25/01/2011].
[7] 3-way Isolation Valves. Disponível em http://www.nresearch.com/ [acedido em
25/01/2011].
[8] Omnifit Fitting Systems. Disponível em https://www.omnifit.com/cart/store/comersus
_listOneCategory.asp?idCategory=281 [acedido em 25/01/2011].
[9] vanStaden JF, Marshall GD. Operational parameters affecting zone penetration in
sequential injection analysis. Process Contr Qual 1992; 3: 251-61.
[10] Alegret S, Alonso J, Bartroli J, Machado AASC, Lima JLFC, Paulis JM. Construction
of equipment for potentiometric determinations in flow injection analysis. Quim Anal 1987;
6: 278-92.
[11] Albrecht B, Wiegand W, Brown D. QuickBasic Made Easy - Version 4.5. California:
McGraw-Hill, Inc.; 1989.
[12] Becerra E, Cladera A, Cerda V. Design of a very versatile software program for
automating analytical methods. Lab Robotics Automat 1999; 11 (3): 131-40.
71
Capítulo 2
[13] Reis BF, Gine MF, Zagatto EAG, Lima JLFC, Lapa RA. Multicommutation in FlowAnalysis .1. Binary Sampling - Concepts, Instrumentation and Spectrophotometric
Determination of Iron in Plant Digests. Anal Chim Acta 1994 Jul; 293 (1-2): 129-38.
[14] International Union of Pure and Applied Chemistry - Nomenclature, Symbols, Units
and their Usage in Spectrochemical Analysis - II. Data Interpretation. Pure and Applied
Chemistry 1976; 45: 99-103.
[15] Miller JN, Miller JC. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. 4th ed.
Great Britain: Pearson Education; 2000.
[16] ISO 11843-2: Capability of detection-Part 2: Methodology in the linear calibration
case. Geneva 2000.
[17] Miller JN. Basic Statistical-Methods for Analytical-Chemistry .2. Calibration and
Regression Methods - a Review. Analyst 1991 Jan; 116 (1): 3-14.
72
CAPÍTULO 3
Determinação da glutationa reduzida
e da glutationa oxidada em sangue total
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
3.1. Introdução
O presente trabalho envolve a determinação dos substratos glutationa reduzida e
glutationa oxidada utilizando para o efeito a enzima glutationa redutase em solução como
ferramenta bioanalítica. A metodologia escolhida é baseada no ensaio de regeneração
DTNB-GR e consequente amplificação da resposta à glutationa. Estes analitos foram
determinados em matriz biológica (amostras de sangue). O ambiente reaccional para a
operação da glutationa redutase é aquoso, constituído pela solução tampão fosfato de pH
igual a 7,0 unidades.
3.1.1. Desenvolvimento de um sistema automático para a determinação da
glutationa reduzida e oxidada em amostras de sangue
A glutationa (tripeptídeo γ-glutamilcisteinilglicina) é um tiol intracelular de baixo
peso molecular que está envolvido em inúmeras funções celulares, incluindo a síntese de
proteínas, metabolismo e protecção celular. A diminuição da concentração deste tiol tem
sido associada a numerosas condições patológicas, tais como diabetes, doença alcoólica
do fígado, SIDA, cataractogénese, artrite reumatóide, distrofia muscular, esclerose lateral
amiotrófica, doença de Alzheimer, síndroma respiratório agudo, erosões hemorrágicas
gástricas agudas, stress oxidativo induzido por xenobióticos e envelhecimento [1]. A
glutationa encontra-se amplamente distribuída e apresenta um papel importante na
protecção contra o stress oxidativo, destoxificação de xenobióticos e na modulação da
actividade enzimática pelo balanço redox (2-SH <-> -S-S-) [2].
Nas células, a oxidação da glutationa reduzida (GSH), forma predominante,
conduz à formação da glutationa dissulfido (glutationa oxidada, GSSG) (Figura 3.1.) e,
por troca de dissulfidos catalisada por tioltransferases, a glutationa pode ser incorporada
em dissulfidos mistos (GSSR). O “pool” de glutationa intracelular é eficientemente
mantido na forma reduzida por uma ubíqua e crucial flavoenzima, GSSG redutase (GR),
interligada ao sistema β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+)/NADPH
(forma reduzida) [3]. Quando as células humanas são expostas a um elevado stress
oxidativo, a razão GSH/GSSG decresce em consequência de uma acumulação de GSSG
[4]. Assim, a razão GSH/GSSG é usada para avaliar o “status” de stress oxidativo em
sistemas biológicos, o qual tem sido reconhecido em diferentes doenças crónicas.
Dado que as concentrações sanguíneas de glutationa podem reflectir o “status” de
glutationa em órgãos menos acessíveis (tais como fígado e rim), a determinação da GSH
e da GSSG no sangue tem sido considerada essencial como um índice do “status” de
glutationa global e um útil indicador de risco de doença [5]. Desta forma, um dos
75
Capítulo 3
objectivos deste trabalho foi o de efectuar a determinação da GSH e da GSSG no sangue
total de forma a poder avaliar o “status” de glutationa total.
NH2
H
N
HO
NH2
HO
O
H
N
O
N
H
O
HS
O
O
O
O
O
N
H
S
S
H
N
O
HO
OH
NH2
N
H
O
OH
OH
O
O
GSSG
GSH
Figura 3.1. Estruturas químicas da glutationa reduzida (GSH) e da glutationa oxidada (GSSG).
Existem na literatura numerosos métodos com vista à determinação de GSH e
GSSG em amostras biológicas, os quais foram revistos recentemente por Monostori et al.
[6], dividindo-os em métodos sem separação e em métodos com etapa de separação
(métodos cromatográficos e de electroforese capilar), mas poucos são apropriados para a
sua análise rotineira directa. Na Tabela 3.1. encontram-se compilados alguns métodos de
determinação de GSH e GSSG em amostras de índole biológica.
Encontram-se descritos diversos métodos de cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC, do acrónimo em inglês “High performance liquid chromatography”)
acoplados a diferentes tipos de detectores para a determinação de GSH e/ou GSSG,
conforme reportado recentemente [7]. No entanto, nestes métodos é normalmente
requerida uma preparação da amostra morosa com uma derivatização pré- ou pós-coluna
[8] ou um equipamento particular no caso das detecções electroquímicas [9] e por
espectrometria de massa [10, 11]. Em alguns casos é obtida uma sobrestimação do teor
de GSSG, causada pela oxidação da GSH durante a alcalinização e a derivatização das
amostras antes da injecção destas no sistema [5].
Têm sido propostos outros métodos para esta finalidade, incluindo electroforese
capilar [12, 13], cromatografia micelar electrocinética (MEKC, do acrónimo em inglês
“Micellar
electrokinetic
chromatography”)
[14],
electroquímicos
[15],
ressonância
magnética nuclear (RMN) [16, 17], fluorescência [18] e métodos baseados em
quimiluminiscência [19, 20].
76
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
Adicionalmente, os métodos enzimáticos são mais vantajosos que os métodos
que envolvem a derivatização inespecífica dos grupos sulfidrilo com um cromóforo ou um
fluoróforo [21] dada a elevada especificidade inerente. Os métodos enzimáticos dividemse, praticamente, em duas categorias: ensaio de regeneração do ácido 5,5´-ditiobis(2nitrobenzóico) (reagente de Ellman, DTNB)-GR (primeiramente referido por Owens e
Belcher [22] e mais tarde modificado por Tietze [23]) e o método do ponto final da
glutationa-S-transferase com o 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) [24]. No ensaio de
regeneração, GSSG e/ou GSH + GSSG são determinados através do uso combinado da
GR e do DTNB, constituindo este um dos métodos mais largamente aplicados devido à
sua simplicidade e sensibilidade inerentes e ao seu baixo custo. O método do ponto final
permite determinar apenas GSH, com maior precisão mas com menos sensibilidade que
o ensaio de regeneração, no qual há uma amplificação da resposta à glutationa. No
entanto, a grande desvantagem do ensaio que emprega um esquema de amplificação de
resposta ao substrato é o facto de ser laborioso e moroso aquando da análise de um
largo número de amostras, sendo evidente a necessidade de aumentar o grau de
automatização. Shaik e Mehvar [25] desenvolveram um ensaio em leitor de microplacas,
baseado no referido ensaio de regeneração, para a determinação da GSH e GSSG em
tecido de fígado e bílis de rato, sendo esta última avaliada após “scavenging” da GSH
com o trifluorometilsulfonato de 1-metil-4-vinilpiridínio, o qual permitia a análise de um
elevado número de amostras, apesar da grande dependência de intervenção do
operador.
Neste sentido, uma tentativa de automatização foi proposta por Redegeld et al.
[26], na qual a GSH e a GSSG foram determinados através de um sistema FIA, baseado
na reacção de amplificação de Tietze, em hepatócitos de rato, sendo a forma oxidada
avaliada depois da alquilação da forma reduzida com o N-etilmaleiimida (NEM). Mais
recentemente, e também recorrendo a um sistema FIA, foi desenvolvido um método de
quimiluminiscência para a determinação de GSH em eritrócitos hemolisados humanos,
baseado no efeito desta sobre o sinal quimiluminescente resultante da oxidação do
luminol pelo periodato de sódio em meio alcalino [27].
77
78
Sangue humano
Sangue de coelho
Electroquímica e
Fluorimetria
Espectrometria de massa
Fluorimetria
Espectrofotometria
(Ultravioleta)
Amperometria
RMN de1H –
Transferência de
coerência de quantum
duplo
Fluorimetria
Quimiluminométrica
Fluorimetria
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Ultravioleta)
Espectrofotometria
(Visível)
Quimiluminométrica
HPLC
HPLC
Electroforese capilar
MEKC
Electroquímica
RMN
Fluorescência
Quimiluminescência (QL)
Não-enzimática
Enzimática (GSSG reductase)
Enzimática (GSH transferase)
Análise por injecção em fluxo
Análise por injecção em fluxo
Eritrócitos hemolisados
humanos
Hepatócitos de rato
Fígados perfundidos
Sangue humano, saliva,
urina, plasma de rato,
homogeneizados de
fígado e rim
Sangue de rato e
homogeneizados de
fígado
Sangue de coelho e
microdialisado de
cérebro de rato
Sangue humano e fígado
de porco
Plasma
Plasma
Sangue humano
Plasma
Sangue humano
Espectrofotometria
(Ultravioleta)
HPLC
Amostra biológica
Detecção
Metodologia
0,065-32.5
GSH
tGSH
2,0x10-2-10
0,0-7,5
GSH
tGSH
1-25
GSSG
GSH
GSSG
3,25x10-3-3,25x10-2
5,0x10-4
4,0x10-3-0,4
GSH
8,0x10-3
0,05
0,3
-
0,065
1,1 × 10−4
5,0x10-3-0,2
GSH
-
2
1000-50000
GSH
2-500
0,4
8-40
GSH
0,8
16-81
GSSG
0,012
0,046
-
0,008
0,001
0,5
Limite de detecção
(µmol L-1)
GSH
GSSG
0,22-45,00
6,25-100
GSH
250-2000
GSSG
0-0,8
GSH
0-10
GSH
2-500
GSSG
50-1500
GSH
Intervalo linear (µmol L-1)
GSSG
Compostos
Reacção de QL 8 s
Derivatização / Tempo de
residência 235 s
Ponto final aos 5 min
Derivatização /
Desenvolvimento de cor aos 6
min
Tempo de reacção de 1520 min
Reacção de QL 10 s
Derivatização de 5 min
20 min
Equilíbrio do sinal aos 35 s
Tempo de corrida de 20 min
Derivatização / Tempo de
migração de 6 min
Derivatização / Tempo de
corrida de 6 min
Derivatização / Tempo de
corrida de 14 min
Derivatização / Tempo de
corrida de 24 min
Tempo de análise
Tabela 3.1. Comparação de diferentes metodologias de determinação da glutationa em amostras biológicas
[27]
[26]
[24]
[23]
[21]
[19]
[18]
[16]
[15]
[14]
[12]
[10]
[9]
[8]
Ref.
Capítulo 3
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
De forma a ultrapassar as desvantagens inerentes aos diferentes métodos
citados, nomeadamente o elevado custo do equipamento inerente e o consumo de
amostras e reagentes, neste trabalho propõe-se o desenvolvimento de um sistema SIA
com detecção espectrofotométrica para a automatização da determinação quer da GSH
quer da GSSG no sangue total. A metodologia escolhida é baseada no ensaio de
regeneração DTNB-GR, o qual tem sido aceite como método “padrão” para a
determinação de glutationa em fluidos biológicos, tais como amostras de sangue [28].
Este método responde tanto à GSH bem como à GSSG, tendo que, por conseguinte, a
glutationa total (GSH e GSSG) e a GSSG serem determinadas separadamente. A GSSG
é analisada após tratamento da GSH presente na amostra com o trifluorometilsulfonato
de 1-metil-2-vinilpiridínio (M2VP, do inglês “1-methyl-2-vinyl-pyridinium trifluoromethane
sulfonate”). A concentração de GSH é estimada como sendo a diferença entre as
concentrações de glutationa total e da GSSG.
79
Capítulo 3
3.2. Material e métodos
3.2.1. Reagentes e soluções
A solução de transporte empregue no sistema SIA para a determinação da GSH e
GSSG em amostras de sangue era uma solução tampão obtida por dissolução do
diidrogenofosfato de potássio (Riedel-de-Haën) numa concentração de 0,1 mol L-1 e sal
dipotássico do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (Fluka) 1 mmol L-1. O pH desta
solução era ajustado a 7,0 unidades com uma solução de hidróxido de potássio
(Pronalab) 2 mol L-1.
As soluções de 3,0 mmol L-1 de DTNB (Fluka) e 1,2 mmol L-1 do sal tetrassódico
de β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato na forma reduzida (NADPH, SigmaAldrich) eram preparadas diariamente na solução tampão.
A solução padrão concentrada de 2 mmol L-1 de GSH (Fluka) e de GSSG (Fluka)
eram diariamente preparadas dissolvendo a quantidade apropriada de glutationa na
solução tampão. A partir destas soluções eram preparadas as soluções padrão de
trabalho por diluição adequada com tampão.
A solução de GR (EC 1.6.4.2, da levedura do pão da espécie Saccharomyces
cerevisiae, em suspensão de sulfato de amónio, com actividade específica de 160 U mg-1
de proteína, Sigma-Aldrich) de 5 U mL-1 era igualmente preparada na solução tampão
sendo congelada a uma temperatura de -20ºC e descongelada a 25ºC aquando do seu
uso.
A solução de DTNB era mantida à temperatura ambiente e as soluções do
NADPH e dos padrões de GSH e GSSG eram colocadas em gelo no decorrer dos
ensaios.
Todas estas soluções eram protegidas da luz ao longo do seu uso.
Para os estudos de penetração de zonas, recorreu-se a soluções do corante azul
de bromotimol. A solução concentrada de azul de bromotimol era preparada dissolvendo
0,4 g de corante em 25 mL de etanol 96 %, perfazendo-se o volume de 100 mL com uma
solução de bórax 0,01 mol L-1. Seguidamente preparava-se uma solução de trabalho
diluindo 1 mL da solução de azul de bromotimol em 199 mL de solução de bórax [29].
80
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
3.2.2. Colheita da amostra e processamento
As amostras de sangue eram fornecidas por voluntários adultos saudáveis. O
sangue venoso era colhido para tubos contendo EDTA como anticoagulante.
Seguidamente, eram colocadas alíquotas de 50 ou 100 µL de sangue em tubos de
microcentrífuga para a determinação da GSH total ou da GSSG, respectivamente. Para a
avaliação da GSSG, eram previamente adicionados nos tubos de microcentrífuga 10 µL
do agente sequestrante de grupos tiol, M2VP (OxisResearch, Portland), de forma a evitar
a auto-oxidação da GSH [30]. As amostras eram depois congeladas a -70 ºC, podendo o
tempo de análise das mesmas estender-se por um período de 30 dias. O processamento
propriamente dito das amostras de sangue incluía o descongelamento das mesmas e
uma etapa de precipitação proteica com ácido meta-fosfórico (Fluka) a 5 % (m/v) a 4 ºC.
A mistura era depois agitada em vórtice e centrifugada a 14 000 rotações por minuto
durante 10 minutos a 4 ºC. Os sobrenadantes resultantes eram directamente analisados
pelo método desenvolvido ou, após diluição com o tampão, analisados pela metodologia
convencional de comparação adoptada.
3.2.3. Aparelhagem
O sistema de injecção sequencial apresentava na unidade propulsora um tubo de
impulsão de PVC com 1,02 mm de diâmetro interno. O tubo de armazenamento e o
reactor apresentavam comprimentos de 150 e 300 cm, respectivamente, ambos com
configuração em figuras de oito. O tubo de diluição apresentava um comprimento de 100
cm e era enrolado com a mesma configuração que os anteriores.
Todos os outros componentes constantes da montagem (Figura 3.2.),
designadamente, bomba peristáltica, válvulas, banho termostatizado, espectrofotómetro e
registador, foram previamente descritos no Capítulo 2.
81
Capítulo 3
(A)
E
VS
BP
25 ºC
RE
TA
vs
2
3
1 10
9
4
5 6
Ai
E
412 nm
8
7
NADPH
D
GR
TD
DTNB
T
Amostra
DTNB
GR
NADPH
(B)
Figura 3.2. (A) Esquema do módulo analítico desenvolvido para a quantificação da glutationa
reduzida e oxidada em amostras de sangue humano: T – Solução transportadora de tampão
-1
fosfato 0,1 mol L pH 7,0; BP – Bomba peristáltica bidireccional; vs – Válvula solenóide; TA –
Tubo de armazenamento; VS – Válvula selectora de fluidos; Ai – Amostra; TD – Tubo de diluição;
-1
-1
DTNB – Solução de DTNB 3,0 mmol L ; GR – Solução de glutationa redutase 5 U mL (também
-1
imersa no banho termostatizado a 25ºC); NADPH – Solução de NADPH 1,2 mmol L ; RE –
Reactor; D – Detector espectrofotométrico (λ = 412 nm); E – Esgoto. (B) Fotografia da montagem
desenvolvida.
82
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
3.2.4. Metodologia convencional de comparação
Para a avaliação da exactidão dos resultados fornecidos pela metodologia SIA,
determinou-se também o teor de GSH e GSSG presente nas amostras de sangue usando
um kit comercializado pela Bioxytech “GSH/GSSG-412 assay” (Cat. No. 21040). Estes
kits são usados frequentemente em laboratórios clínicos e, devido ao facto de não estar
definido um método de referência para esta determinação, quer para o pré-tratamento da
amostra quer para a quantificação da glutationa em amostras de sangue, justifica-se o
uso do mesmo como metodologia de comparação. Esta permite a avaliação
espectrofotométrica dos teores de GSH e GSSG recorrendo ao método de Tietze [23]. O
ensaio propriamente dito começava com a adição de 200 µL de tampão (ensaio em
branco) ou de um dos padrões de GSSG incluídos no kit (0,050-1,500 µmol L-1) (ou das
amostras correspondentes à determinação da GSH total ou da GSSG) para uma cuvete.
De seguida procedia-se às adições de 200 µL do cromogéneo DTNB e 200 µL de GR
com subsequente mistura e incubação à temperatura ambiente por um período de 5
minutos. Finalmente, eram adicionados 200 µL de NADPH e registava-se a absorvância a
412 nm durante 3 minutos. Desta forma, eram determinadas as velocidades de reacção
em mUA min-1. Depois eram estabelecidas as curvas de calibração dos padrões de
GSSG incluídos no kit da seguinte forma: no caso da determinação da GSH total, eram
consideradas as concentrações de 0; 1,50 e 3,00 µmol L-1 e no caso da determinação da
GSSG eram consideradas as concentrações de 0; 0,10; 0,25 e 0,50 µmol L-1, dada a
grande diferença de concentrações entre a GSH total e a GSSG (Figura 3.3.). As
concentrações de GSH total e de GSSG das amostras de sangue eram então obtidas
após interpolação nas curvas de calibração e multiplicação dos valores obtidos pelo
factor de diluição aplicado (60 ou 488 no caso das determinações da GSSG ou da GSH
total, respectivamente).
83
Capítulo 3
GSSG
300
250
200
150
100
50
0
50
Velocidade
(mUA min-1)
Velocidade
(mUA min-1)
GSH
40
30
20
10
0
0,00
1,00
2,00
3,00
0,00
Concentração de GSH (µmol L-1)
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
Concentração de GSH (µmol L-1)
-1
Figura 3.3. Curvas de calibração para a GSH (Velocidade (mUA min ) = 85,93 (± 21,96) CGSH
-1
2
-1
(µmol L ) + 1,497 (± 42,54), R = 0,9996) e para a GSSG (Velocidade (mUA min ) = 85,52 (±
-1
2
15,33) CGSSG (µmol L ) - 0,239 (± 4,35), R = 0,9965) obtidas usando a metodologia convencional
de comparação, expressas em GSH.
3.2.5. Procedimento experimental
O ciclo analítico proposto para a determinação da GSH e GSSG em amostras de
sangue total era composto por 9 etapas (Tabela 3.2.), quando o procedimento de diluição
dentro do sistema das amostras era necessário (etapas D1-D2, Tabela 3.2.). Assim, 25
ou 50 µL de amostra eram aspirados para o TA e em seguida estas zonas aspiradas
eram propulsionadas para o tubo de diluição (Figura 3.2., TD), por um período de tempo
previamente definido, garantindo a diluição da amostra para níveis de glutationa total e
oxidada determináveis pela metodologia desenvolvida (etapas D1-D2). A aspiração dos
200 µL de amostra (etapa a) ocorria então a partir do tubo de diluição, nos casos em que
fora aplicado o procedimento de diluição, ou a partir da porta da válvula correspondente à
amostra para o TA. Depois eram sequencialmente aspirados para o TA 50 µL de DTNB,
50 µL de GR e 50 µL de NADPH (etapas b-d) e com inversão do sentido de fluxo o
conjunto destas quatro zonas era propulsionado até ao reactor (etapa e), o qual se
encontrava imerso num banho termostatizado (Figura 3.2.). Após um período de paragem
de fluxo de 120 segundos no reactor (etapa f), a zona de reacção era propulsionada para
o detector a um caudal de 1,90 mL min-1 (etapa g).
84
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
Tabela 3.2. Protocolo analítico para a determinação da glutationa reduzida e glutationa oxidada
em amostras de sangue
Etapa
Posição da
válvula
Tempo de
operação (s)
Caudal
-1
(mL min )
3
D1
4
Volume
(µ
µL)
25
0,50
6
50
Descrição
Aspiração da amostra de GSH para
o TA
Aspiração da amostra de GSSG
para o TA
D2
5
8,70
5,85
2,00
290
195
Diluição da amostra de GSH
Diluição da amostra de GSSG
a
4/5
15
0,80
200
Aspiração da amostra
diluída/padrão para o TA
b
6
3,75
0,80
50
Aspiração da solução 3,0 mmol L
DTNB para o TA
c
7
3,75
0,80
50
Aspiração da solução 5,0 U mL
GR para o TA
d
8
3,75
0,80
50
Aspiração da solução 1,2 mmol L
NADPH para o TA
e
9
37
1,90
1172
Propulsão do conteúdo do TA até
ao reactor
f
9
120
-
-
Período de paragem
g
9
81
1,90
2565
Aquisição do sinal analítico e
propulsão do líquido transportador
para lavar a célula de fluxo
-1
-1
-1
85
Capítulo 3
3.3. Resultados e sua discussão
A amplificação da resposta à glutationa utilizada resulta da acção combinada do
DTNB e da GR (Figura 3.4.). Esta reacção é baseada no aumento de absorvância a 412
nm causado pela redução do DTNB pela GSH, gerando a GSSG e o ácido 2-nitro-5tiobenzóico (TNB) (na forma de anião tiolato), composto de cor amarela. Na presença da
GR dá-se a oxidação do cofactor NADPH pela GSSG gerada, levando à formação da
GSH, que entra novamente no ciclo de amplificação. A quantidade de TNB formada é
proporcional à soma de GSH e GSSG presentes. Com a junção destas duas reacções,
obtém-se assim um ciclo de amplificação que aumenta drasticamente a sensibilidade do
método de determinação da glutationa. O factor de amplificação foi avaliado através da
comparação dos declives das rectas de calibração obtidos com o sistema de amplificação
(Abs (U.A.) = 0,1231CGSH (µmol L-1) + 0,097, R2 = 0,9989) e com a reacção entre o GSH e
o DTNB, sem a GR e o cofactor NADPH (Abs (U.A.) = 0,0044CGSH (µmol L-1) + 0,050, R2
= 0,9956). Verificou-se que no modo estequiométrico a resposta à glutationa foi apenas
3,6 % da resposta obtida com o sistema de amplificação.
NO2
S
HOOC
O2 N
S
COOH
2 GSH
DTNB
HOOC
GR
S
GSSG
2
O2 N
Ácido 2-nitro-5-tiobenzóico (TNB)
λ max: 412 nm
Figura 3.4. Ensaio de regeneração DTNB-glutationa redutase.
86
NADP+
NADPH + H+
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
3.3.1. Optimização do sistema
Com o objectivo de obter uma sensibilidade que viabilizasse a determinação dos
baixos teores de GSSG presentes no sangue, os diferentes parâmetros do sistema foram
estudados e optimizados. O intervalo estudado para as diferentes variáveis bem como os
valores seleccionados estão sumarizados na Tabela 3.3.
A optimização do sistema foi efectuada usando padrões de GSH dado o seu
menor custo comparativamente aos padrões de GSSG. A redução de uma molécula de
GSSG origina duas moléculas de GSH e como tal a resposta à GSSG é o dobro da
resposta à GSH para concentrações equimolares, como foi comprovado com ensaios de
padrões mistos de GSH e GSSG.
Após alguns estudos preliminares, foram escolhidas como condições de partida
para a optimização dos parâmetros químicos e físicos do sistema: padrões de GSH até
20 µmol L-1; caudal do tampão transportador igual a 0,70 mL min-1; pH igual a 7,5
unidades; um reactor com 75 cm de comprimento e volumes iguais a 50 µL de DTNB, GR
e NADPH.
Tabela 3.3. Intervalos de valores estudados na optimização dos diferentes parâmetros do sistema
e os valores escolhidos para a sua operação
Parâmetro
Intervalo
Valor seleccionado
Concentração da enzima (U mL-1)
0,4 – 5,0
5,0
Concentração de NADPH (mmol L-1)
0,4 – 1,6
1,2
Concentração de DTNB (mmol L-1)
1,5 – 3,0
3,0
Volume de amostra (µL)
50 - 300
200
Temperatura (ºC)
Banho de gelo 30
25
Concentração do tampão fosfato (mmol L-1)
100 - 400
100
pH da solução tampão transportadora
6,5 – 8,5
7,0
Tempo de paragem de fluxo no reactor (s)
0 – 200
120
Caudal de propulsão do transportador (mL min-1)
0,70 – 2,86
1,90
87
Capítulo 3
A ordem de aspiração dos reagentes constitui um factor importante que exerce
influência sobre a amplitude do sinal analítico e dispersão [31]. No presente trabalho, esta
influência é ainda mais pronunciada na medida em que é considerada a sobreposição de
quatro zonas. A ordem pela qual as quatro soluções eram aspiradas para o TA era a
seguinte: padrão/amostra, DTNB, enzima e NADPH (Figura 3.2. A). Apesar de haver uma
sobreposição completa destas quatro zonas aquando da passagem no detector, a
amostra e o DTNB eram aspirados primeiro para minimizar a dispersão quer da enzima
quer do NADPH. No caso do DTNB, observava-se uma diminuição do sinal analítico de
cerca de 15% se este fosse o primeiro reagente a ser aspirado. Desta forma, a alíquota
de maior volume (200 µL), referente ao padrão/amostra, era a primeira a ser aspirada
seguido do DTNB e dos outros dois reagentes, iniciando-se assim a reacção de
amplificação.
1,200
UA
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
Concentração de GSH (µmol L-1)
-1
Figura 3.5. Estudo de diferentes concentrações do par GR/NADPH: ( ) 0,4 U mL GR / 0,4 mmol
-1
-1
L NADPH; (
(
-1
-1
-1
) 5,0 U mL GR / 0,4 mmol L NADPH; ( ) 4,0 U mL GR / 0,8 mmol L NADPH e
-1
-1
) 5,0 U mL GR / 0,8 mmol L NADPH.
A extensão da reacção de amplificação depende, entre outros, de dois parâmetros
que estão interligados: concentração de GR e NADPH. Assim, a concentração de GR foi
estudada entre 0,4 e 5,0 U mL-1 e verificou-se um aumento do sinal analítico com a
concentração (Figura 3.5.). Estabelecendo 5,0 U mL-1 como a concentração limitante de
GR, avaliou-se a concentração do seu cofactor NADPH no intervalo 0,4-1,6 mmol L-1.
Observou-se um aumento de 30 % da actividade enzimática até à concentração de 1,2
mmol L-1 de NADPH. A diferença de apenas de 2 % entre as concentrações de 1,2 e 1,6
mmol L-1 não justificava o uso de concentrações superiores à de 1,2 mmol L-1.
88
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
Seguidamente
foram
efectuadas
curvas
de
calibração
para
diferentes
concentrações de DTNB (1,5 - 3,0 mmol L-1) e verificou-se um aumento da produção de
TNB de cerca de 20% usando uma concentração de 3,0 mmol L-1, apesar da perda de
linearidade para concentrações superiores a 10 µmol L-1 de GSH. Para usufruir de um
novo aumento da concentração de DTNB, seria necessário aumentar em simultâneo as
concentrações dos outros reagentes envolvidos na reacção de amplificação. Desta forma,
foi escolhida uma concentração de DTNB igual a 3,0 mmol L-1.
Por outro lado, o sinal de branco, devido à redução lenta do DTNB pela GR [32]
influencia o limite de quantificação do método mascarando a diferença entre o sinal do
branco e do padrão de GSH 0,5 µmol L-1, o que pode limitar a avaliação do teor de GSSG
nalgumas amostras de sangue. Neste sentido, e sabendo que o aumento de volume de
amostra é uma forma efectiva de aumentar a sensibilidade [33], foram estudados
diferentes volumes de amostra entre 50 e 300 µL. Com um volume de amostra igual a 50
µL, a diferença entre o sinal do padrão de GSH 0,5 µmol L-1 e do branco não é
significativa, havendo um aumento da sensibilidade de cerca de 40% até um volume de
200 µL, o qual foi escolhido para os estudos de optimização seguintes.
A actividade da GR é dependente do pH e como tal foi estudada a influência da
composição do tampão. O tampão era inicialmente preparado como descrito em [34]:
solução de diidrogenofosfato de potássio numa concentração de 0,1 mol L-1 e EDTA 1
mmol L-1 com pH igual a 7,5 unidades. Tanto a concentração de diidrogenofosfato de
potássio como o valor de pH foram avaliados (Figura 3.6.). A concentração de tampão foi
estudada entre 0,1 e 0,4 mol L-1.Para concentrações de GSH entre 0,50 e 10,00 µmol L-1,
foram estabelecidas curvas de calibração a um pH igual a 7,5 unidades. Um aumento da
concentração de KH2PO4 traduziu-se na diminuição do sinal analítico, provavelmente
devido a um aumento da força iónica do meio reaccional e consequente inibição da
actividade da GR [35]. Para a avaliação do pH, foram efectuadas curvas de calibração
para valores de pH entre 6,5 e 8,5 e o máximo de sensibilidade foi obtido a pH 7,0. A pH
6,5, a sensibilidade era 39,2% menor que a obtida a pH 7,0 e o seu valor diminuía para
valores de pH superiores a 7,0 (3,1 e 18,6% para valores de pH iguais a 7,5 e 8,5
unidades, respectivamente). Assim, quando todas as soluções foram preparadas em
tampão pH 7,0, verificou-se um aumento da sensibilidade do método, com uma redução
do intervalo de zona linear (até 3,00 µmol L-1 GSH). Deste modo, foi usado um tampão de
concentração 0,1 mol L-1 e com pH igual a 7,0 unidades para a realização de ensaios
posteriores, sendo inclusive o pH das amostras ajustado a 7,0 unidades, garantindo
assim um valor de pH constante e subsequentemente evitando quaisquer flutuações do
pH óptimo dentro da montagem desenvolvida.
89
0,5
9,0
0,4
8,5
8,0
0,3
7,5
0,2
7,0
0,1
6,5
0
6,0
0,020
pH
KH2PO4 (mol L-1)
Capítulo 3
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
Sensibilidade (UA µ mol-1 L)
Figura 3.6. Estudo da influência da concentração de KH2PO4 (
) e do pH (
) da solução
transportadora na sensibilidade do método.
Para avaliar a influência da temperatura sobre a actividade enzimática, a solução
de GR foi ensaiada em três condições físicas diferentes: mergulhada em banho de gelo,
colocada num banho termostatizado a 25 e a 30ºC. Para as diferentes condições
testadas verificou-se um aumento da actividade até 25ºC com a obtenção de sinais
analíticos de maior magnitude e precisão.
Nas condições optimizadas, nesta reacção de amplificação, é atingida uma
completa sobreposição das quatro zonas envolvidas com um tubo de reacção com 300
cm de comprimento e com configuração em figuras de oito, conforme comprovado com
os ensaios efectuados com o azul de bromotimol (Figura 3.7.). Nos sistemas de fluxo, o
sinal analítico é adquirido antes do estabelecimento do equilíbrio químico e a extensão da
reacção é condicionada para além das características do tubo de reacção pelos caudais
de fluxo empregues [36]. Assim, o caudal de propulsão do transportador foi estudado
entre 0,70 e 2,86 mL min-1 e obteve-se um aumento da absorvância com a diminuição do
caudal, apesar de ser insuficiente para obter a sensibilidade desejada, provavelmente
devido ao concomitante aumento da dispersão. Deste modo, é importante obter uma
condição que por um lado limite a dispersão e por outro lado proporcione um maior tempo
de reacção. Neste sentido, foi implementado um período de paragem de fluxo no reactor,
imerso no banho termostatizado. Apesar do aumento da sensibilidade com o tempo,
foram adoptados um tempo de paragem de 120 segundos e um caudal de propulsão do
transportador igual a 1,90 mL min-1 como um compromisso entre o ritmo de amostragem
90
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
e a sensibilidade de modo a permitir a determinação de GSH e GSSG nos níveis de
concentração presentes nas amostras de sangue.
UA
0,120
0,100
Amostra
0,080
DTNB
GR
0,060
NADPH
0,040
0,020
0,000
0
20
40
60
80
Tempo (s)
Figura 3.7. Registo gráfico da penetração de zonas correspondentes aos reagentes envolvidos na
reacção de amplificação.
3.3.2. Análise de amostras de sangue humano
Os níveis de GSH e GSSG determinados, presentes no sangue de indivíduos
normais, são altamente dependentes do processamento e armazenamento das amostras
empregues. Desta forma, o processamento das amostras constitui uma etapa chave para
a determinação exacta de GSH e especialmente de GSSG. As concentrações de
GSH/GSSG determinadas são influenciadas pelos seguintes factores: (a) oxidação dos
tióis em amostras acidificadas; (b) oxidação após armazenamento a pH neutro/alcalino;
(c) oxidação durante a etapa de desproteinização; (d) mudança no equilíbrio GSH/GSSG
devido ao “bloqueio” irreversível dos tióis livres e (e) reacção dos grupos electrofílicos
com grupos amina. É de salientar que a oxidação durante a etapa de desproteinização
com ácido pode influenciar e mesmo produzir artefactos (30-150 µmol L-1 GSSG podem
ser produzidos por este procedimento) [5]. Desta forma, o método de processamento a
adoptar deve ter em conta as fontes de erro descritas.
Inicialmente o ácido 5-sulfosalicílico a 5 % (m/v) [37], habitualmente usado para a
precipitação das proteínas presentes nas amostras de sangue, foi considerado para
análise. No entanto, este foi abandonado já que este tipo de ácido dava origem a valores
de GSH superiores às quantidades adicionadas às amostras de sangue (ensaios de
91
Capítulo 3
recuperação). Pensou-se que esta ocorrência era devida à formação de complexos por
reacção do soro e o ferro da hemoglobina [38] com o ácido 5-sulfosalicílico durante o
processamento das amostras, os quais exibem absorção no comprimento de onda
utilizado (412 nm) [39]. Desta forma, o ácido meta-fosfórico foi seleccionado para a etapa
de desproteinização [40], a qual é de extrema importância já que evita a degradação da
GSH e GSSG catalisada pela γ-glutamiltransferase e previne a auto-oxidação da GSH
[30].
Antes da quantificação da GSSG pelo ensaio de regeneração do DTNB-GR, as
amostras de sangue são submetidas a um apropriado sequestro (“scavenging”) dos
grupos tiol, recorrendo para o efeito ao NEM [3] ou 2-vinilpiridina (2-VP) [41], para evitar a
oxidação rápida da GSH em extractos biológicos, aparentemente causada pela presença
das proteínas que a oxidam. Na verdade, a GSH oxida-se rapidamente em amostras
homogeneizadas de tecidos e de sangue ao ponto de durante o período de apenas 10
minutos uma fracção substancial de GSH oxidar-se formando GSSG [30]. No método
proposto, as amostras de sangue foram tratadas com um derivado da 2-VP, 1-metil-2vinilpiridínio (M2VP), o qual aprisiona rapidamente os grupos tiol (em menos de 1 minuto)
e não exerce qualquer acção inibitória sobre a GR [42]. Deste modo, não é necessário
qualquer procedimento de remoção do agente sequestrante de grupos tiol antes da
reacção de amplificação, como acontece quando o NEM é usado, e esta reacção de
derivatização apresenta uma cinética rápida contrariamente aquando do uso da 2-VP que
permite alguma auto-oxidação da GSH durante esta derivatização lenta. Além disso, os
teores de GSSG foram avaliados usando 2-VP e o M2VP e verificou-se uma
sobrestimação de cerca de 5 vezes com o primeiro.
Tendo em conta os teores de GSH e GSSG habitualmente presentes no sangue
(aproximadamente 1 mmol L-1 e alguns µmol L-1, respectivamente) [43] e dada a
variabilidade existente entre as diferentes amostras, foi desenvolvido um procedimento
de diluição dentro do próprio sistema SIA para, quando necessário, ajustar as
concentrações reais de GSH e GSSG presentes nas amostras ao intervalo de resposta
linear do método proposto.
Várias estratégias de diluição em linha têm vindo a ser utilizadas em sistemas
SIA, de modo a tornar os sistemas analíticos mais autónomos e a obter graus de diluição
apropriados, por um processo controlado e reprodutível, já que a diminuição do volume
de amostra não é muitas vezes suficiente para atingir os níveis de diluição desejados.
Assim, e fazendo uso da simplicidade e versatilidade da válvula selectora de
multiposições para o pré-tratamento de amostras, na maioria dos casos, os
procedimentos de diluição em linha são implementados recorrendo a um tubo de diluição,
colocado numa das portas da válvula selectora, para gerar um gradiente de
92
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
concentrações [44-50]. No sistema de fluxo desenvolvido a diluição era conseguida
recorrendo a um tubo de diluição, localizado numa das portas da válvula selectora (Figura
3.2., TD), através da análise de uma secção do gradiente de concentração aí gerado, e
traduziu-se na adição de apenas duas etapas ao ciclo analítico descrito anteriormente
(Tabela 3.2, etapas D1-D2). Num procedimento de diluição deste género o grau de
diluição depende do volume de amostra (volume de amostra aspirado a partir da porta 4
para o TA – etapa D1, Tabela 3.2.), do volume de transferência (que inclui o volume de
amostra bem como de transportador transferidos do TA para o TD – etapa D2, Tabela
3.2.) e do volume de análise (volume de alíquota aspirado do TD para o TA) [45]. Estes
três parâmetros foram estudados e optimizados de forma a obterem-se factores de
diluição de 60 e 6 para as amostras de GSH e GSSG, respectivamente, garantindo assim
a análise de amostras num largo intervalo de concentrações de glutationa. Uma vez que
o procedimento de diluição pretendia introduzir o mínimo de alterações na metodologia, já
optimizada, considerou-se como volume final 200 µL (aspirado a partir do TD), volume já
optimizado para a determinação directa sem diluição da amostra. Sendo assim, o perfil
do gradiente de concentração gerado no TD e consequentemente correspondendo aos
referidos 200 µL, resulta do efeito combinado entre o volume de amostra utilizado e da
dispersão que esta zona sofria durante o seu percurso do TA até ao TD. Os factores de
diluição acima apontados foram obtidos com uma boa repetibilidade usando volumes de
amostra de 25 ou 50 µL e volumes de transferência de 290 ou 195 µL para as amostras
de GSH total e GSSG, respectivamente. É de salientar que outros factores de diluição
podiam ser obtidos através da mudança do volume de transferência (Figura 3.8.). Os
estudos relativos ao procedimento de diluição decorreram comparando os sinais
analíticos obtidos por diluição de padrões no interior do sistema, pelo procedimento de
diluição desenvolvido, com os fornecidos pela análise de padrões preparados por diluição
volumétrica manual, fora do sistema de fluxo, de forma a estabelecer o nível de diluição
atingido em cada situação.
93
Capítulo 3
Factor de diluição
200
175
150
125
100
75
50
25
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Volume de transferência (µ
µ L)
Figura 3.8. Influência do volume de transferência, para o tubo de diluição, no factor de diluição
obtido, usando 25 (
) e 50 µL (
) de amostra. Factor de diluição: grau de diluição obtido pela
razão entre os sinais obtidos com e sem diluição.
3.3.3. Estudo de interferentes
Agentes redutores tais como ácido ascórbico, β-mercaptoetanol, ditiotreitol e
cisteína ou mesmo compostos que reagem com grupos tióis podem interferir com o
ensaio da glutationa. Desta forma, compostos com grupos SH, agentes redutores e
materiais reactivos a grupos SH devem ser evitados durante o processamento da
amostra, uma vez que podem reagir com o DTNB [26].
Para avaliar se os diferentes compostos análogos à GSH constituíam
interferentes, a sua resposta era comparada com a obtida para o padrão de GSH. Os
valores foram expressos como percentagem de padrão de GSH. Um composto era
considerado interferente quando este originava uma variação na resposta superior a 5 %
em relação à resposta obtida para o padrão GSH de igual concentração. Os análogos
testados bem como os valores de interferência são os indicados na Tabela 3.4.
94
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
Tabela 3.4. Estudo dos análogos de GSH como possíveis interferentes
Análogos
µmol L-1
Absorvância
µmol L-1 GSH
% GSH
GSH
7,50
0,685
7,50
100,00
Cisteína
7,50
0,094
0,36
4,83
Ácido ascórbico
7,50
0,078
0,17
2,32
N-acetilcisteína
7,50
0,101
0,44
5,93
Ditiotreitol
7,50
0,126
0,75
9,94
Penicilamina
7,50
0,105
0,49
6,53
β -mercaptoetanol
7,50
0,102
0,46
6,14
Para eliminar qualquer grau de interferência dos compostos estudados, testaramse iguais concentrações de GSH e dos seus análogos, sendo que o GSH é o tiol nãoproteico mais abundante nas amostras biológicas [51]. Observou-se nas condições
apontadas uma interferência não significativa quer do ácido ascórbico quer da cisteína
(compostos endógenos). Assim, mesmo a cisteína, o segundo tiol mais abundante no
sangue, não interfere na determinação da glutationa [51]. Neste sentido, pode-se afirmar
que o método proposto permite a determinação directa e selectiva da glutationa na
presença da cisteína. Por outro lado, verificou-se que os compostos não endógenos,
como a N-acetilcisteína, ditiotreitol, penicilamina e o β-mercaptoetanol, podem interferir
no ensaio da glutationa.
3.3.4. Figuras de mérito e validação do método desenvolvido
Nas condições optimizadas, foram obtidas curvas de calibração (Abs (U.A.) =
0,123 (±0,002) CGSH (µmol L-1) + 0,097 (±0,003), R2=0,9989; Abs (U.A.) = 0,245 (±0,003)
CGSSG (µmol L-1) + 0,098 (±0,002), R2=0,9994), com intervalo de resposta linear até 3,00 e
1,50 µmol L-1 para a GSH e GSSG, respectivamente, permitindo a sua determinação em
amostras de sangue humano. Observou-se que GSH e GSSG dão origem à mesma
curva de calibração quando expressas em equivalentes de GSH, estando de acordo com
resultados anteriores [22, 23].
O limite de detecção foi de 0,031 µmol L-1 para a GSH e 0,014 µmol L-1 para a
GSSG.
95
Capítulo 3
Relativamente à repetibilidade do procedimento SIA, foram determinados valores
de RSD de 4,4 % para amostras de GSSG (2,05 µmol L-1) e 1,5 % para GSH total (810,93
µmol L-1), o que mostra diferenças não significativas num intervalo alargado de
concentrações.
O tempo requerido para completar um ciclo analítico foi de 280 segundos, o que
corresponde a cerca de 13 determinações por hora.
Na Figura 3.9. apresenta-se um registo obtido durante os ensaios, com a
metodologia SIA.
(A)
5 min
P5
0,1 UA
P4
Branco
P2
P1
P3
(B)
Amostra 1
Amostra 4
Amostra 2
Amostra 5
Amostra 3
Figura 3.9. Registo obtido na análise do teor de GSSG em amostras de sangue humano. (A)
branco e série de padrões com as concentrações em GSSG de 0,050 (P1); 0,125 (P2); 0,250 (P3);
0,750 (P4) e 1,500 (P5) µmol L ; (B) amostras de sangue humano. Em todos os casos procedeu-1
se à injecção em triplicado.
Finalmente, a metodologia de fluxo optimizada foi aplicada na determinação de
GSH total e GSSG (por diferença obtém-se a GSH) em amostras de sangue total. De
forma a avaliar a exactidão do método desenvolvido, os resultados obtidos por análise de
14 amostras de sangue total no sistema SIA foram comparados com os fornecidos pela
metodologia de comparação referida.
96
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
Os resultados encontram-se na Tabela 3.5, onde também se podem analisar os
desvios relativos obtidos entre as duas metodologias. Como se pode observar não se
verificaram desvios estatisticamente significativos entre os resultados obtidos pela
metodologia de fluxo e de comparação, apesar do desvio relativo ter sido superior a 5 %
para 3 amostras de GSSG.
Tabela 3.5. Resultados obtidos pela metodologia SIA e pela metodologia de comparação para a
determinação de glutationa total e glutationa oxidada em amostras de sangue total
Amostras
SIA
GSH totala
Desvio relativo (%)
GSH totalb
GSH total
GSSG
(mmol L )
(µmol L )
(mmol L )
GSSGb
(µmol L-1)
1
0,80 (±0,01)
0,99 (±0,07)
0,823 (±0,02)
1,0 (±0,1)
-3,1
-3,9
2
0,655 (±0,004)
2,6 (±0,2)
0,66 (±0,02)
2,9 (±0,2)
-0,2
-10,1
3
0, 79 (±0,01)
1,28 (±0,01)
0,766 (±0,005)
1,06 (±0,05)
+3,3
+20,8
4
0,81 (±0.01)
7,6 (±0,3)
0,78 (±0,01)
7.6 (±0,1)
+3,4
+1,1
5
0,910 (±0.007)
5,48 (±0,07)
0,89 (±0,01)
5,2 (±0,2)
+2,4
+4,6
6
0,759 (±0.009)
1,4 (±0,2)
0,77 (±0.01)
1,4 (±0,2)
-1,6
+0,7
7
0,826 (±0.005)
1,5 (±0,3)
0,81 (±0,02)
1,51 (±0,08)
+1,8
+1,3
8
0,77 (±0,02)
1,0 (±0,3)
0,78 (±0,02)
1,0 (±0,4)
-2,2
+5,1
9
0,89 (±0,01)
8,2 (±0,4)
0,92 (±0,02)
8,6 (±0,1)
-3,2
-3,9
10
0,805 (±0,009)
7,3 (±0,2)
0,78 (±0,01)
7,4 (±0,2)
+3,4
-1,4
11
0,69 (±0,02)
7,5 (±0,2)
0,670 (±0,003)
7,8 (±0,2)
+3,0
-4,6
12
1,04 (±0,01)
1,3 (±0,2)
0,1018 (±0,007)
1,08 (±0,07)
+2,4
+22,2
13
0,693 (±0,002)
1,55 (±0,07)
0,71 (±0,01)
1,51 (±0,01)
-2,9
+2,6
14
0,96 (±0,01)
0,48 (±0,06)
0,97 (±0,01)
0,50 (±0,05)
-0,9
-4,0
-1
GSSGa
Metodologia de comparação
-1
-1
a
média e desvio padrão de 3 determinações consecutivas
b
média e desvio padrão de 2 determinações consecutivas
97
Capítulo 3
Os resultados obtidos por aplicação das metodologias a amostras de sangue total
foram ainda confirmados pelo estabelecimento de uma regressão linear entre as duas
metodologias, tanto para a GSH total (CSIA (µmol L-1) = 8 (±105) + 1,0 (±0,1) CMétodo
comparação
(µmol L-1), r=0,9797) como para a GSSG (CSIA (µmol L-1) = 0,1 (±0,2) + 0,97
(±0,03) CMétodo
calculado
de comparação
(µmol L-1), r=0,9984) e por aplicação do teste t de Student (t
0,53 e 0,33 para GSH total e GSSG; t
tabelado
2,16). Ambos os testes confirmaram a
concordância entre os dois métodos, para um nível de confiança de 95 %.
98
de
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
3.4. Conclusões
A metodologia desenvolvida permitiu quantificar a GSH total e a GSSG em
amostras de sangue humano, com resultados comparáveis aos obtidos pela metodologia
convencional de comparação, com recurso a reduzidos volume de amostra biológica e
consumo de enzima. Além disso, a implementação do procedimento de diluição em linha
tornou a metodologia muito versátil, permitindo que pudessem ser determinadas
concentrações distintas de GSH e GSSG, uma vez que podiam ser obtidos diferentes
factores de diluição através de uma simples mudança de tempo numa etapa do ciclo
analítico (Etapa D2, Tabela 3.2.). Desta forma, o largo intervalo de concentrações
determináveis é conseguido introduzindo a amostra directamente no sistema, após o
processamento referido na secção 3.2.2. Muitas vezes este tipo de tratamento (etapa de
diluição) acontece numa fase anterior à introdução da amostra no sistema, o que se
traduz geralmente numa diminuição do ritmo de amostragem e num aumento
considerável da possibilidade de ocorrerem erros durante a manipulação da amostra.
Comparando as duas metodologias, pode-se afirmar que com a metodologia SIA
o método é mais rápido, já que a metodologia convencional de comparação inclui um
período de incubação de 5 minutos e um de 3 minutos de leitura cinética, mais o tempo
consumido na adição dos reagentes às cuvetes. Adicionalmente, o controlo rigoroso do
tempo durante cada ensaio é inerente à metodologia de fluxo, o qual é difícil de
assegurar quando é efectuada a análise de séries de diferentes amostras pela
metodologia de comparação.
Comparando o método desenvolvido com os métodos de determinação da
glutationa em amostras biológicas reportados na literatura (Tabela 3.1.), o método
automático de SIA usando a reacção de amplificação de Tietze parece ser uma
ferramenta alternativa interessante para o efeito. Neste sentido, o método desenvolvido
junta as vantagens do SIA à especificidade conferida pela GR (que constitui um factor
importante dada a complexidade da matriz de sangue) e selectividade (no caso da
determinação da GSSG, após rápida e eficiente derivatização da GSH com M2VP)
derivadas do ensaio de regeneração DTNB-GR utilizado. No caso dos métodos
electroquímicos, a selectividade não é assegurada [15] e no caso da ressonância
magnética nuclear não há discriminação entre a GSH e GSSG [16]. De facto, a
metodologia proposta apresenta um processamento de amostras rápido, dado o tempo
reduzido (menos de 1 minuto) de derivatização total da GSH, contrastando com os
procedimentos morosos de alguns métodos de HPLC [8]. Por sua vez, os métodos
baseados em MEKC não requerem qualquer etapa de derivatização [14], mas os limites
de detecção são superiores aos aqui atingidos. Com este sistema SIA, é então possível
99
Capítulo 3
determinar de forma exacta as concentrações de GSH e GSSG no sangue, com limites
de detecção comparáveis aos obtidos com outros métodos [12]. Adicionalmente, o
sistema proposto pode ser aplicado a outras amostras biológicas como plasma ou
eritrócitos, após algumas modificações no processamento das amostras.
Por outro lado, dado que algumas portas da válvula selectora de fluidos se
encontram disponíveis, seria possível efectuar outras determinações usando a mesma
montagem, sem ser necessária grande reconfiguração física do sistema. Desta forma, a
determinação da actividade da GR podia ser facilmente implementada, introduzindo um
outro tubo de reacção numa das portas disponíveis, utilizando o método colorimétrico
adoptado [52]. Alternativamente, poderia ser necessário outro detector, no caso das
determinações
serem
efectuadas
espectrofotometricamente
a
340
nm,
como
consequência da medida do consumo de NADPH envolvido na redução da GSSG pela
GR [53].
A metodologia proposta preenche assim os requisitos experimentais e clínicos
para a determinação directa de GSH total e GSSG em amostras de sangue, permitindo a
determinação da razão GSH/GSSG, a qual constitui um indicador útil do stress oxidativo,
podendo ser usado para avaliar o “status” redox global do organismo ou mesmo
monitorizar a eficácia de estratégias de intervenção com antioxidantes. Esta metodologia
pode assim constituir uma escolha para a implementação da avaliação rotineira do teor
de glutationa como alternativa aos métodos discretos de comparação e representar uma
importante ferramenta como biomarcador do estado de saúde e/ou risco de doença em
humanos.
100
Determinação da glutationa reduzida e oxidada em sangue total
3.5. Referências bibliográficas
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105
CAPÍTULO 4
Determinação do teor de metanol em
amostras de biodiesel com extracção
líquido-líquido por membrana
Determinação do teor de metanol em
amostras de biodiesel com extracção
líquido-líquido por membrana
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
4.1. Introdução
No presente trabalho, as enzimas utilizadas foram empregues como reagentes
analíticos para a determinação do metanol em amostras de biodiesel. Para o efeito, foi
implementado um sistema bienzimático constituído pela álcool oxidase e pela peroxidase,
sendo a primeira imobilizada em esferas de vidro alquilaminado.
As amostras de biodiesel de natureza orgânica eram directamente injectadas num
fluxo de xileno e após passagem numa unidade de extracção líquido-líquido, o metanol
extraído era convertido enzimaticamente em ambiente aquoso, constituído pela solução
tampão com pH igual a 7,4 unidades, e monitorizado espectrofotometricamente a 420
nm.
4.1.1. Desenvolvimento de um sistema automático para a determinação do metanol
em amostras de biodiesel
Devido ao crescente aumento do preço do petróleo e o curto tempo de vida do
fuel fóssil conjuntamente com os problemas ambientais inerentes aos fuéis derivados do
petróleo, a procura de energias alternativas tem vindo a intensificar-se. Neste contexto, o
biodiesel surge como um promissor combustível renovável e biodegradável alternativo
aos combustíveis convencionais. O biodiesel é obtido a partir da transesterificação de
óleos ou gorduras, de origem animal ou vegetal, com um álcool (por exemplo, metanol)
na presença de um catalisador [1, 2].
Tendo em conta o tipo de matéria-prima ou o processo de transesterificação
empregues, é de extrema importância que o grau de pureza bem como o tipo de
contaminantes presentes no biodiesel devam ser avaliados antes do seu uso. Neste
sentido, existem normas europeias, mais propriamente, European Standard EN 14214
[3], que define as especificações e os métodos para avaliação dos diferentes parâmetros
de qualidade do biodiesel.
Um dos pontos-chave de controlo de qualidade do biodiesel é o metanol. Por
razões de segurança o excesso de metanol resultante do processo de transesterificação
tem que ser removido por destilação [4]. O metanol pode influenciar o ponto de fulgor e
causar corrosão em peças de alumínio e zinco, bem como a redução do número de
cetano e lubricidade do biodiesel. Desta forma, foi estabelecido um limite máximo
permitido de metanol em biodiesel pela citada norma europeia, sendo de 0,2% (m/m).
Os métodos analíticos de determinação de metanol em biodiesel estão reportados
num artigo de revisão recente [5] e resumem-se essencialmente aos métodos
cromatográficos, nomeadamente cromatografia gasosa [4,6], e aos de espectrofotometria
109
Capítulo 4
de infravermelho próximo [7, 8]. Os primeiros são laboriosos, implicando derivatização [4]
ou uma etapa de extracção [6] prévias, e os segundos implicam o uso da quimiometria na
análise dos dados gerados pelo método.
Assim, numa tentativa de ultrapassar as limitações apontadas, foi desenvolvido
uma metodologia de fluxo para a determinação de metanol em amostras de biodiesel de
uma forma directa, rápida, económica e fiável. Dada a versatilidade oferecida pelas
metodologias de fluxo, nomeadamente no que respeita aos procedimentos de
manipulação e pré-tratamento de amostra [9], implementou-se uma extracção líquidolíquido dentro do sistema para permitir uma separação selectiva do analito de interesse
(metanol) da amostra orgânica complexa. A determinação é feita em meio aquoso e
assim o consumo de solventes orgânicos é reduzido. Para tal, a extracção do metanol da
fase orgânica (amostra de biodiesel) para a fase aquosa foi efectuada dentro do sistema
minimizando o manuseamento da amostra e o consequente risco de contaminação ou
perda do analito e por outro lado permitindo automatizar por completo o processamento
da amostra, tornando as análises mais rápidas e económicas.
O uso de técnicas de extracção por membrana em sistemas de fluxo constitui uma
ferramenta útil para efectuar o pré-tratamento em linha de amostras complexas [10], pois
não são necessárias as fases de segmentação e separação integrantes das extracções
líquido-líquido convencionais em sistemas de fluxo [11, 12]. As membranas empregues
podem ser não porosas, microporosas ou poliméricas, resultando em técnicas de
extracção baseadas em duas ou três fases [13]. As aplicações envolvendo extracções de
compostos orgânicos de soluções aquosas dadoras para soluções orgânicas aceitadoras
[14] são mais comuns, sendo as membranas utilizadas de natureza hidrofóbica. No caso
específico da extracção com base em membranas líquidas suportadas (SLM, do inglês
“Supported Liquid Membrane”), é a própria fase orgânica que geralmente constitui a
interface membranar [15]. Não obstante disso, a extracção por membrana tem também
exibido a sua utilidade aquando do manuseamento de amostras orgânicas dadoras. Uma
membrana porosa de natureza hidrofóbica foi usada para a separação de herbicidas
triazinas dos óleos para a solução aceitadora composta por metanol e água [16]. Por sua
vez, foram extraídos e pré-concentrados fenóis de óleos alimentares através da sua
passagem numa membrana de natureza hidrofílica, neste caso promovida pela sua
conversão em aniões na solução aquosa alcalina aceitadora [17].
No presente trabalho, a determinação do metanol em amostras de biodiesel é
então efectuada em meio aquoso após uma extracção líquido-líquido utilizando uma
membrana microporosa de natureza hidrofílica que permite a extracção do metanol da
fase orgânica dadora para a fase aquosa aceitadora, a qual preenche assim os poros da
membrana. O metanol extraído é depois determinado usando um sistema bienzimático
110
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
constituído pela álcool oxidase (AOD) imobilizada e pela peroxidase (POD) (Figura 4.1.).
O peróxido de hidrogénio, resultante da oxidação do metanol pela acção da AOD, é
depois determinado com elevada sensibilidade usando a POD livre em solução e o ácido
2,2´-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS), dando origem a um composto de
cor verde (catião radical ABTS) monitorizado a 420 nm [18].
AOD imobilizada
Metanol + O2
Formaldeído + H2O2
POD
2H2O + ABTS●+
H2O2 + ABTS
Figura 4.1. Reacções químicas envolvidas na determinação colorimétrica do metanol pelo sistema
bienzimático AOD/POD.
São diversas as abordagens efectuadas pelos diferentes autores no que respeita
à utilização das enzimas em sistema de fluxo. Em alguns casos são usadas em solução,
noutros imobilizadas em suportes inertes e ainda fazendo parte integrante de sensores
ópticos ou electroquímicos [19]. As escolhas efectuadas fundamentam-se nos mais
variados aspectos, estando relacionadas com a estabilidade que as enzimas apresentam
face a qualquer um dos processos, com a economia da quantidade de enzima, com o tipo
de matrizes utilizadas e/ou facilidade de utilização. O processo de imobilização
enzimática propriamente dito consiste na confinação da enzima a uma região restrita,
garantindo a retenção da actividade catalítica e assegurando a possibilidade da sua
utilização
de
forma
repetida.
Esta
estratégia
apresenta
algumas
vantagens
nomeadamente o aumento da estabilidade catalítica da enzima e a possibilidade de sua
reutilização, o que consequentemente permite a diminuição do consumo de enzimas
dispendiosas, conforme discutido no Capítulo 1. Pode-se contudo, também apontar
algumas desvantagens [20], relativamente a este procedimento como sejam a oclusão
gradual dos locais activos (com diminuição gradual da actividade enzimática ao longo do
tempo) e bloqueamento/contaminação por pequenas partículas presentes nas amostras
(por exemplo, no caso de amostras biológicas, determinados componentes complexos
poderão provavelmente interferir com a estabilidade da coluna enzimática), ou a
compressibilidade do material da coluna que origina um aumento de pressão e uma
diminuição do caudal ou mesmo a sua colmatação. Os caudais adoptados devem neste
contexto ter em conta um tempo de contacto suficiente entre as superfícies activas e a
111
Capítulo 4
amostra. Além disso, apesar da enzima não se consumir na reacção química, podem
surgir perdas físicas de enzima da coluna. Muitos outros factores, como sejam, a
contaminação bacteriana, alteração de pH, força iónica, adsorção de interferentes podem
contribuir para a rápida desactivação. Por último, o procedimento de imobilização requer
pessoal treinado bem como a utilização de reagentes de toxicidade elevada, sendo que
este não pode ser aplicado a todas as enzimas.
No trabalho aqui apresentado, empregou-se a POD livre em solução e a AOD
imobilizada. A primeira é menos dispendiosa, o volume inserido no sistema era pequeno,
definido pelo tempo de activação da válvula de solenóide (cuja solução recirculava em
circuito fechado até nova activação), e caso fosse imobilizada, estaria sujeita à passagem
contínua do reagente de desenvolvimento de cor que prejudicaria o tempo de vida do
reactor enzimático. A segunda foi imobilizada, de forma a aumentar a sua estabilidade
catalítica e reutilização, com consequente diminuição do consumo desta enzima
dispendiosa.
112
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
4.2. Material e métodos
4.2.1. Reagentes e soluções
A solução de transporte empregue na determinação do metanol em amostras de
biodiesel era uma solução tampão obtida por dissolução do diidrogenofosfato de potássio
(Riedel-de-Haën) numa concentração de 0,1 mol L-1. O pH desta solução era ajustado a
7,4 unidades com uma solução do hidróxido de potássio 0,1 mol L-1 (Merck).
Para a solução reagente de desenvolvimento de cor, eram preparadas soluções
mãe do ABTS (Sigma-Aldrich) 3 mmol L-1 e da POD (EC 1.11.1.7, peroxidase proveniente
do rábano, do inglês “horseradish peroxidase, HRP”, da espécie Amoracia rusticana, do
tipo VI-A, com actividade específica de 1280 U mg-1 de sólido, Sigma-Aldrich) 2,5 x 106 U
L-1, em solução tampão, as quais eram estáveis ao longo de 1 mês quando armazenadas
a 4ºC. As respectivas soluções de trabalho de ABTS (0,86 mmol L-1) e POD (3 U mL-1)
eram preparadas diariamente, por diluição apropriada das respectivas soluções mãe na
solução tampão, e a solução reagente de desenvolvimento de cor resultante era mantida
à temperatura ambiente e protegida da luz no decorrer dos ensaios.
A solução padrão concentrada de metanol (Fisher Scientific) 2% (m/m) e as
soluções padrão de trabalho eram preparadas diariamente por diluição rigorosa com o
xileno.
As amostras de biodiesel eram de diferentes origens, sendo analisadas de acordo
com o método de referência [21].
4.2.1.1. Reagentes usados no processo de imobilização
A AOD (EC 1.1.3.13) da levedura da espécie Hansenula polymorpha (SigmaAldrich) apresentava uma actividade específica de 22 U mg-1 de proteína.
As esferas de vidro alquilaminado (AGB, do inglês “aminopropyl glass beads”)
usadas no processo de imobilização eram também da marca Sigma e apresentavam
granulometrias de 80-120 e 200-400 mesh e um diâmetro médio de poro de 700 Å.
A solução de glutaraldeído a 2,5 % era obtida por diluição da solução de
glutaraldeído a 25 % (Sigma-Aldrich) com a solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,4.
4.2.1.2. Procedimento de imobilização
O procedimento utilizado envolveu numa primeira fase a activação das esferas e
numa segunda fase a imobilização propriamente dita [22].
113
Capítulo 4
Para a activação das esferas a 2,5 mL da solução de glutaraldeído a 2,5% foram
adicionadas 0,125 g de esferas de vidro alquilaminado. Este conjunto foi colocado numa
placa de agitação durante uma hora à temperatura ambiente. Durante a primeira hora, de
10 em 10 minutos, fazia-se borbulhar azoto para remover o oxigénio. Finalmente as
esferas eram lavadas com água desionizada e solução de tampão fosfato 0,1 mol L-1 com
pH 7,4.
Para a imobilização da enzima na superfície das esferas, anteriormente activadas,
eram adicionadas 6,4 mg da enzima AOD. O goblé era colocado em gelo durante cerca
de 4 horas. Durante a primeira meia hora, e de 10 em 10 minutos, fazia-se igualmente
borbulhar azoto. Terminada esta fase realizava-se uma filtração em funil de Buckner e as
esferas com a enzima imobilizada eram lavadas sucessivamente com água e solução
tampão de fosfato 0,1 mol L-1 com pH 7,4. Após lavagem e filtração as enzimas
imobilizadas nas esferas eram armazenadas na solução tampão a 4ºC.
O reactor enzimático era obtido por empacotamento de 33 mg AGB-AOD numa
coluna de Perspex® (descrita no Capítulo 2), em cujas extremidades se colocaram 2
discos de filtro com diâmetro de poro de 35 µm (Mobicol M1002), de modo a reter as
esferas no seu interior. O reactor com as esferas, quando não estava a ser utilizado, era
armazenado com solução tampão de fosfato 0,1 mol L-1 com pH 7,4 a 4ºC e permanecia
estável durante cerca de 2 meses. Deste modo, podiam ser efectuadas cerca de 600
determinações trabalhando de forma contínua com um decréscimo de sensibilidade
inferior a 5%.
4.2.2. Aparelhagem
O sistema de fluxo (Figura 4.2.) apresentava como unidades propulsoras 2
bombas peristálticas com tubos de impulsão de PVC (1,30 mm de diâmetro interno) e de
fluorelastómero (1 mm de diâmetro interno). Uma das bombas peristálticas permitia a
inserção da solução padrão ou amostra de biodiesel no sistema de fluxo, estando
conectada a uma das portas da válvula de injecção. A outra bomba permitia o acesso ao
tubo de armazenamento e através deste ao canal central da válvula de selecção.
O tubo de armazenamento e o reactor apresentavam comprimentos de 150 e 100
cm, respectivamente, ambos com configuração em figuras de oito.
Foi também usada uma unidade de extracção (UE), descrita no Capítulo 2, para
permitir a passagem do metanol da amostra orgânica, solução dadora, para a solução
tampão aceitadora. O canal superior da UE encontrava-se conectado a uma das portas
da válvula de injecção, enquanto que o canal inferior permitia o acesso à coluna
enzimática através de uma das portas da válvula selectora. A membrana de extracção
114
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
colocada entre as duas cavidades da unidade era obtida a partir dos filtros de membrana
da marca Millipore Durapore (ref. SVLP09050). Antes da primeira utilização a membrana
de extracção era condicionada em solução tampão.
Todos os outros componentes constantes da montagem (Figura 4.2.),
designadamente, bomba peristáltica, válvulas, espectrofotómetro e registador, foram
previamente descritos no Capítulo 2.
(A)
VI
BP 1
xileno
6
1
4
3
5
amostra
E
UE
22
1
VS
T
E
1
TR
E
420
nm
RE
TA
BP 2
1
2
3
4
D
vs
SR
T
(B)
Figura 4.2. (A) Esquema do módulo analítico desenvolvido para a determinação do metanol em
amostras de biodiesel: BP1 e BP2 – Bombas peristálticas bidireccionais; VI – Válvula de injecção;
-1
UE – Unidade de extracção; T – Solução transportadora de tampão fosfato 0,1 mol L pH 7,4; SR
– Solução reagente de desenvolvimento de cor (ABTS + POD); vs – Válvula solenóide; TA – Tubo
de armazenamento; VS – Válvula selectora de fluidos; RE – Reactor enzimático (AOD); TR – Tubo
de reacção de 100 cm; D – Detector espectrofotométrico (λ = 420 nm); E – Esgoto. (B) Fotografia
da montagem desenvolvida.
115
Capítulo 4
4.2.3. Metodologia convencional de comparação
O método de referência considerado [21] foi efectuado com o cromatógrafo de gás
ThermoFinnigan Trace (Milan, Italy). O instrumento era equipado com um injector do tipo
com/sem divisão do fluxo, associado a um detector de ionização por chama de
hidrogénio. Para a separação cromatográfica usou-se uma coluna capilar de sílica
fundida (Equity®, Supelco) com 30 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 5
µm de espessura da fase estacionária. O método permitia a quantificação do metanol
e/ou etanol presentes no biodiesel e os respectivos padrões eram preparados utilizando o
n-butanol (Sigma-Aldrich) como solvente. Foi utilizada a técnica de padronização interna
e o padrão interno era o tert-butanol (Sigma-Aldrich). As amostras de biodiesel foram
injectadas pelo menos três vezes e a concentração do componente de interesse
(metanol) nas amostras era obtida através da interpolação na curva de calibração obtida
com a relação das áreas entre os picos dos padrões de metanol e do padrão interno e as
concentrações dos respectivos padrões. Depois era efectuada uma média entre os
valores obtidos para as três injecções e era expressa em percentagem mássica (%
(m/m)). Cada corrida cromatográfica demorava cerca de uma hora e a unidade de
aquisição e processamento de dados do sistema de cromatografia fazia o registo do
traçado correspondente ao cromatograma, bem como os tempos de retenção de cada
composto detectado e as áreas dos respectivos picos cromatográficos.
Apresenta-se na Figura 4.3. dois cromatogramas obtidos durante os ensaios para
uma solução padrão 0,025% (m/m) de metanol e de etanol (A) e para uma amostra de
biodiesel proveniente de óleo de girassol e de mamona (B).
116
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
mVolt
4000000
A
n-Butanol
2000000
tert-Butanol
1000000
500000
250000
0
1,00
Etanol
Metanol
100000
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
11,00
12,00
13,00
14,00
15,00
Tempo (min)
mVolt
4000000
B
n-Butanol
2000000
tert-Butanol
1000000
500000
250000
0
1,00
2,00
Etanol
Metanol
100000
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
11,00
12,00
13,00
14,00
15,00
Tempo (min)
Figura 4.3. Registos obtidos na análise do teor de metanol em amostras de biodiesel pelo método
de cromatografia gasosa: A – Padrão com as concentrações em metanol e etanol de 0,025%
(m/m); B – Amostra de biodiesel proveniente de girassol (50%) e mamona (50%). São apenas
indicados os picos correspondentes aos compostos de interesse, nomeadamente do metanol, do
padrão interno tert-butanol e do solvente n-butanol.
117
Capítulo 4
4.2.4. Procedimento experimental
O ciclo analítico proposto para a determinação do metanol em amostras de
biodiesel era composto por duas fases: extracção do metanol das amostras de biodiesel
e subsequente determinação do mesmo com base no sistema bienzimático (AOD + POD)
e no ABTS (Tabela 4.1.).
Assim, no início de cada ciclo o padrão, ou a amostra, eram propulsionados para
a UE com o xileno (etapa a), onde ocorria um período de contacto entre a zona de
amostra e a membrana de extracção durante 30 segundos por paragem da bomba
peristáltica (etapa b), com extracção do metanol para a fase aquosa aceitadora.
Posteriormente era bombeado xileno durante 44 segundos para um esgoto secundário
(etapa c), com o objectivo de eliminar a amostra presente no canal superior da UE. O
metanol extraído era então aspirado para o TA através de umas das portas da válvula
selectora (etapa d) e depois, após a inversão do sentido de fluxo, a amostra era
transportada na direcção do reactor enzimático até ao tubo de reacção, ocorrendo a
conversão do metanol em peróxido de hidrogénio pela AOD (etapa e). Na etapa seguinte,
a válvula solenóide era activada permitindo a mistura em confluência da solução reagente
de desenvolvimento de cor com o peróxido de hidrogénio obtido (etapa f), formando-se o
catião radical ABTS●+, o qual era determinado espectrofotometricamente a 420 nm (etapa
g). O ciclo terminava com a renovação da solução aquosa aceitadora da UE por
propulsão da solução tampão transportadora (etapa h).
Tabela 4.1. Protocolo analítico para a determinação do metanol em amostras de biodiesel
Etapa
a
b
Posição
Tempo(s)
Válvula de
selecção
Válvula de
injecçãoa
a
1
I
16
b
1
I
c
1
d
Caudal (mL min-1)
Direcçãob
Posição da
válvula
solenóide
Descrição
BP 1
BP 2
0,7
P
-
Off
Propulsão da amostra/padrão para a
unidade de extracção com o xileno
30
-
-
-
Off
Período de paragem de fluxo da solução
dadora na unidade de extracção
I
44
0,7
P
-
Off
Propulsão do segmento de amostra/padrão
através da unidade de extracção para um
esgoto secundário
1
E
3,75
9,38
0,8
-
A
Off
Aspiração de 50 µL ou 125 µL da solução
aquosa aceitadora para o TA
e
2
E
20
1,0
A
P
Off
Propulsão da alíquota aspirada em direcção
ao reactor enzimático com o tampão e
enchimento da alça de amostra
f
2
E
12
1,0 + 1,0
-
P
On
Mistura da solução reagente com o H2O2
formado
g
2
E
100
1,0
-
P
Off
Propulsão da mistura reaccional em
direcção ao detector
h
1
E
50
1,0
-
P
Off
Renovação da solução aquosa aceitadora
por propulsão da solução transportadora
I: injecção; E: enchimento
A: aspiração; P: propulsão
118
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
4.3. Resultados e sua discussão
4.3.1. Optimização do sistema
A optimização do sistema propriamente dita foi dividida em duas partes:
a) optimização da determinação bienzimática do metanol e
b) optimização da extracção do metanol das amostras de biodiesel com recurso à
unidade de extracção membranar.
A AOD foi então usada imobilizada em esferas de vidro e o peróxido de hidrogénio
formado era misturado com a POD e o ABTS em solução, numa confluência em “Y”, a
caminho do detector, de forma semelhante ao reportado por Peña et al. [23]. O uso da
POD e do ABTS garante a sensibilidade necessária à determinação de baixos teores de
peróxido de hidrogénio formados [18]. O reactor enzimático situava-se entre a válvula e o
detector, mesmo antes da confluência (Figura 4.2.). A técnica de imobilização usada foi a
ligação a um suporte inerte, na qual a enzima é retida à superfície de um sólido mediante
interacções estabelecidas entre a matriz e enzima, particularmente por ligação covalente
entre os resíduos de aminoácidos da enzima e os grupos reactivos do suporte [24]. Este
tipo de imobilização é apropriado para reactores de fluxo contínuo, pois oferece uma
imobilização forte e estável [25] contrariamente à imobilização não covalente. Esta última
baseia-se numa interacção física (simples adsorção) não específica entre a enzima e a
superfície do suporte e como tal as preparações enzimáticas resultantes podem ser
susceptíveis ao fluxo contínuo. Por outro lado, a imobilização covalente tem a vantagem
de permitir a exposição dos grupos reactivos à superfície da enzima [24].
Efectivamente, o recurso à imobilização em suportes sólidos oferece várias
vantagens relativamente à sua utilização em meio homogéneo, como sendo: controlo
preciso da extensão da reacção, fácil separação dos reagentes e dos produtos formados
e reutilização da enzima com consequente diminuição de custos. Adicionalmente, o facto
da conversão do substrato se verificar na interface sólido-liquido, onde a concentração da
enzima é mais elevada, conduz a um rendimento superior e a limites de detecção mais
baixos, necessários para a determinação dos teores de metanol nas amostras de
biodiesel.
No processo de imobilização da AOD, foram utilizadas como suporte as esferas
de vidro alquilaminado [26], cuja morfologia da superfície se apresenta na Figura 4.4., e o
glutaraldeído como agente de activação destas últimas [24], os quais constituem o
método mais popular de imobilização covalente de enzimas.
119
Capítulo 4
Figura 4.4. Imagens obtidas por microscopia electrónica de varrimento da morfologia da superfície
das esferas de vidro alquilaminado [27]: (a) AGB 200×, (b) AGB 30,000×. Copyright 2009 Elsevier
Science Publishers.
O procedimento de imobilização (descrito em 4.2.1.2.) utilizado envolveu numa primeira
fase a activação das esferas com o glutaraldeído e numa segunda fase a imobilização
propriamente dita, de acordo com a Figura 4.5.
CHO
(CH2)3
CHO
I)
R NH2
II)
R N CH (CH2)3CHO + H2 N ENZIMA
+
R N CH (CH2)3CHO
R N CH (CH2)3CH N ENZIMA
Figura 4.5. Etapas do procedimento de imobilização envolvendo as esferas de vidro alquilaminado
e o glutaraldeído.
Procedeu-se então à optimização das condições de empacotamento da coluna
com a enzima imobilizada, tendo em conta os principais factores que afectam a eficiência
da conversão enzimática, designadamente o tamanho das partículas do suporte, o
coeficiente de difusão do substrato e a quantidade de enzima presente, os quais
condicionam a resistência interna à transferência do substrato/produto propriamente dito
[28]. A eficiência do efeito catalítico da enzima depende do número de moléculas de
catalisador aprisionadas e da capacidade do analito de atingir os locais activos [29]. Para
o primeiro, de forma a aumentar a eficiência de imobilização da AOD, foram efectuados
120
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
alguns ensaios sobre a influência do tamanho das AGB e observou-se um ganho de
sensibilidade de cerca de 20% com as partículas 80-120 mesh, comparativamente às de
200-400 mesh. Para o segundo e considerando a difusão o mecanismo de interacção
entre as moléculas de substrato e a matriz insolúvel contendo a enzima [30], foi estudada
a influência do empacotamento da AOD no reactor na actividade enzimática de forma a
melhorar o acesso aos locais activos disponíveis do biocatalisador imobilizado aquando
da passagem do substrato. Foi, no entanto, verificado um decréscimo da sensibilidade
com uma câmara com agitação com 400 µL (Figura 2.6., Capítulo 2), comparativamente
aos reactores convencionais empacotados com enzima (Figura 2.5., Capítulo 2). Apesar
de se conseguir um movimento aleatório das partículas com a agitação e
consequentemente um aumento da probabilidade do substrato penetrar nos poros das
AGB, o elevado volume morto da câmara conduziu a uma maior dispersão da amostra,
com uma diminuição acentuada do sinal analítico (78%). Assim, nos estudos
subsequentes, foram utilizados reactores convencionais e AGB com granulometria de 80120 mesh.
Foi, posteriormente, avaliada a quantidade de esferas de vidro activado com
enzima imobilizada (AGB-AOD), entre 30 e 120 mg, para o intervalo de concentrações de
metanol estudado e escolheu-se uma quantidade baixa de enzima (33 mg AGB-AOD) e
decidiu-se variar o volume de solução aquosa aceitadora aspirado para o TA de forma a
aumentar a sensibilidade do método.
Seguidamente, foi estudado o caudal de propulsão do transportador, o qual
influencia o tempo de residência da amostra no reactor enzimático e consequente
formação de peróxido de hidrogénio, bem como a dispersão da zona de reacção no
percurso até ao detector. A velocidade de formação do produto é controlada pela
transferência do substrato para a superfície e difusão através do vidro poroso para os
locais activos da coluna enzimática [31]. Por outro lado, a dispersão que ocorre no
reactor enzimático, que condiciona a eficiência de conversão, tem que ser minimizada e
para tal, além do próprio empacotamento e da diminuição do diâmetro das partículas do
suporte, concorre a velocidade do fluido [28]. Seleccionou-se, desta forma, para o caudal
da solução de transporte, no intervalo entre 0,5 e 1,5 mL min-1, o valor de 1,0 mL min-1
como um compromisso entre o ritmo de amostragem e a sensibilidade. Para valores
superiores o decréscimo de sensibilidade era de 30 %.
Relativamente ao volume inserido de solução reagente de desenvolvimento de
cor, composta pelo ABTS e POD, este era determinado pelo tempo de activação da
válvula solenóide (vs, Figura 4.2.), uma vez que o caudal já se encontrava definido (1,0
mL min-1). Foram avaliados volumes de solução reagente entre 50 e 200 µL,
conjuntamente com o tempo do ciclo analítico da etapa e (Tabela 4.1.), da propulsão da
121
Capítulo 4
alíquota aspirada da UE em direcção ao reactor enzimático, de forma a assegurar uma
completa mistura com a zona da amostra. Foi então seleccionado um volume de 200 µL,
tendo em conta a magnitude e a diferença dos sinais analíticos obtidos para os padrões
de metanol, o qual era inserido no tubo de reacção 20 segundos após a propulsão da
zona da amostra através do reactor enzimático. Com este tempo, era assegurada uma
sobreposição efectiva das duas zonas confirmada pela forma e altura dos sinais
analíticos.
No que se refere à optimização da extracção do metanol das amostras de
biodiesel, o primeiro passo consistiu na optimização da estratégia de amostragem, para a
injecção directa das amostras de biodiesel no sistema sem qualquer necessidade de prétratamento. Para o efeito, foram incorporadas uma válvula de injecção (VI, Figura 4.2.) e
uma unidade de extracção (UE, Figura 4.2.), para além de uma bomba peristáltica
adicional. Esta última permitia a limpeza e o enchimento da alça de amostra, ao mesmo
tempo que a alíquota aspirada da UE era propulsionada em direcção ao reactor
enzimático no sistema principal com a BP2 (Etapa e, Tabela 4.1.).
Num segundo passo, após o estabelecimento da configuração do sistema de
fluxo, foram elaborados vários estudos tendo como objectivo a escolha do solvente
orgânico mais apropriado, a geometria do canal da unidade de extracção, o tipo de
membrana, o volume de injecção da amostra, o volume de tampão aspirado do canal
aceitador da câmara de extracção bem como o tempo de paragem de escoamento na
referida unidade (período de contacto).
A elevada viscosidade das amostras afectava negativamente a taxa de extracção
do metanol. Deste modo era importante dissolver as amostras num solvente que
reduzisse a viscosidade da solução dadora. Os primeiros ensaios foram realizados
usando o n-hexano como transportador, mas com este solvente os teores de metanol
obtidos eram inferiores às quantidades adicionadas às amostras de biodiesel. Os estudos
seguintes foram efectuados com outros solventes, tais como acetato de etilo, éter
petróleo e éter dietílico, mas estes provocavam uma constante introdução de bolhas no
sistema de fluxo dada a sua alta volatilidade bem como a deterioração da membrana de
extracção. Finalmente, testou-se o xileno como solução transportadora das amostras de
biodiesel e com ele foram ultrapassadas as limitações anteriormente apontadas,
justificando o seu uso.
A membrana de extracção a usar deve ser mecanicamente estável e de fácil
manuseamento. Foram usadas dois tipos de membrana: uma de fluoreto de
poliviniletileno (PVDF) de natureza hidrofílica e outra de PTFE de natureza hidrofóbica.
Com a membrana de teflon, verificou-se contaminação da solução aceitadora com gotas
de solvente orgânico e como tal foi seleccionada a membrana microporosa de PVDF
122
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
(Figura 4.6.). Esta última era condicionada na solução aquosa aceitadora (solução
tampão) e tendo em conta a sua natureza hidrofílica não havia solução orgânica na
solução aceitadora. Os poros da membrana ficavam assim preenchidos com a solução
aquosa e a solução orgânica, imiscível com o solvente aquoso, encontrava-se em
contacto com a membrana e como tal era estabelecida uma área de contacto interfacial
na superfície da membrana onde o processo de extracção ocorria. O material que
constituía a unidade de extracção era PTFE dada a sua inércia química e resistência aos
diferentes solventes orgânicos. A membrana era cortada, condicionada em solução
tampão e depois colocada entre os dois paralelepípedos impressos (Figura 2.4., Capítulo
2), sendo sempre substituída quando se verificasse um decréscimo de sensibilidade
superior a 5%.
Figura 4.6. Imagem obtida por microscopia electrónica de varrimento do filtro de membrana de
PVFD, onde se podem observar os microporos da mesma.
Em sistemas de fluxo que recorrem à extracção, sem as etapas de segmentação
e separação, o tempo de contacto entre os fluxos dador e aceitador é controlado pela
geometria do canal das unidades de extracção e pelo caudal de ambas as soluções [14].
Deste modo, avaliou-se a eficiência de diferentes unidades de extracção que
apresentavam cavidades com configurações e dimensões diferentes, através do
estabelecimento de curvas de calibração para padrões de metanol até 0,300% (m/m): (A)
canal de configuração linear com uma área de superfície de 72 mm2; (B) canais de
configuração em formas de “U” com áreas de superfície 184 mm2 e (C) e de 322 mm2. Os
resultados denotam um aumento de sensibilidade com a área de superfície. A
configuração alongada em formas de “U” apresentada pelas unidades B e C permite uma
123
Capítulo 4
maior taxa de transferência de metanol para a solução aquosa aceitadora. Por seu turno,
a unidade C, com maior área de superfície, proporcionou a sensibilidade mais elevada
(cerca de 90% superior que com a unidade A e 52% que a unidade B), tendo sido
escolhida para os ensaios seguintes.
O volume de amostra é um dos parâmetros que mais condicionou o
desenvolvimento da metodologia quer em termos de estratégia de amostragem quer em
termos da sensibilidade do método. Um factor relevante que pode prejudicar a eficiência
das unidades de extracção é a pressão. Como forma de prevenir derrames ou fugas de
um dos lados da membrana, a pressão do canal dador (superior) e aceitador (inferior)
bem como a diferença de pressão sobre a membrana devem ser bastante reduzidas.
Neste caso, é especialmente importante manter a pressão do canal aceitador o menor
possível, pois a fase aquosa pode facilmente ser impelida dos poros da membrana
hidrofílica. Por outro lado, a viscosidade inerente às amostras de biodiesel pode conduzir
a diferenças de pressão e afectar a taxa de transferência do analito através do módulo de
separação [32]. Desta forma o volume de amostra de biodiesel a inserir deve-se dispersar
no transportador (xileno). Os volumes de amostra foram estudados entre 50 e 250 µL
(Figura 4.7.) e apesar do aumento concomitante dos sinais analíticos com o volume de
amostra, foi escolhido um volume igual a 100 µL, para garantir total homogeneização da
amostra no transportador e consequente minimização do fluxo hidrodinâmico dos líquidos
através da membrana.
Para incrementar a eficiência de extracção, foi efectuada uma paragem de
escoamento na UE. O fluxo da solução dadora contendo a amostra homogeneizada era
parado na unidade de extracção por períodos de 30 e 60 segundos. Os resultados
obtidos demonstraram que a sensibilidade aumentava cerca de 25% entre 0 e 30
segundos de paragem de fluxo e cerca de 5% entre 30 e 60 segundos (Figura 4.7.).
Desta forma, foram adoptados 30 segundos como o tempo de paragem de fluxo, apesar
da perda de linearidade até à concentração de 0,500% (m/m).
124
300
70
250
60
50
200
40
150
30
100
20
50
10
0
0,000
0
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
Tempo de paragem de fluxo (s)
Volume de amostra ( µ L)
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
Sensibilidade (UA CMeOH -1)
Figura 4.7. Variação da sensibilidade do método com o volume de amostra (
paragem do fluxo (
) e o período de
). Condições: aspiração de 50 µL de solução aquosa aceitadora.
A fracção da solução aquosa aceitadora que permanecia em contacto com a
membrana de extracção, durante o período de paragem da bomba peristáltica, era depois
aspirada para o TA. A variação deste volume permitiu definir dois intervalos de resposta
linear. Assim, dos volumes estudados entre 50 e 200 µL, para 50 µL obtinha-se um
intervalo de resposta linear até 0,200% (m/m) e com 125 µL o intervalo de resposta linear
era até 0,015% (m/m). Para volumes superiores de solução aquosa aceitadora, o sinal
analítico obtido para os padrões de metanol mais concentrados era constante e portanto
seria necessário aumentar as concentrações quer de enzima quer da solução reagente
de desenvolvimento de cor para a conversão de todo o peróxido de hidrogénio formado.
Finalmente, a eficiência de extracção foi calculada comparando os resultados
obtidos com a análise do mesmo volume de solução aspirada, do dispositivo de
extracção ou de uma das portas laterais da válvula selectora de fluidos. Os sinais obtidos
sem a unidade de extracção eram 80% superiores aos obtidos com esta unidade,
resultando numa eficiência de separação de 20%.
O sistema assim optimizado viabilizou a obtenção de curvas de calibração (Abs
(U.A.) = 36,271 (±1,431) CMeOH (% (m/m)) + 0,093 (±0,012), R2=0,9954; Abs (U.A.) =
1,606 (±0,026) CMeOH (% (m/m)) + 0,039 (±0,002), R2=0,9989), com intervalo de resposta
linear até 0,015% (m/m) (A) e 0,200% (m/m) (B) de metanol, respectivamente (Figura
4.8.).
125
UA
Capítulo 4
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
A
B
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
Concentração de metanol (% m/m)
Figura 4.8. Curvas de calibração obtidas correspondentes aos intervalos até 0,015% (m/m) (A) e
0,200% (m/m) (B) de metanol.
Apresenta-se na Figura 4.9. um registo analítico da solução de branco e das
soluções de calibração.
P 0,200 % (m/m)
5 min
P 0,100 % (m/m)
0,1 UA
Branco
Branco
P 0,020 % (m/m)
Branco
Branco
P 0,050 % (m/m)
Figura 4.9. Registo obtido na análise do teor de metanol em amostras de biodiesel. Série de
padrões com as concentrações em metanol de 0,020; 0,050; 0,100 e 0,200% (m/m). Em todos os
casos procedeu-se à injecção em triplicado.
Foram obtidos limites de detecção de 0,0002% (m/m) e de quantificação de
0,0010% (m/m) para o intervalo de baixos níveis de metanol e valores de 0,007% (m/m) e
0,016% (m/m) para o intervalo de altos níveis, respectivamente.
Neste caso, foram também calculados o limite de decisão (CCα) e a capacidade
de detecção (CCβ), descritos no Capítulo 2, ao nível da concentração limite de resíduo
máximo estabelecida (0,2% (m/m) de metanol). O CCα e CCβ foram de 0,206% (m/m) e
0,211% (m/m), respectivamente.
126
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
Em termos de precisão, foram determinados valores de RSD de 3,5% para
amostras de biodiesel com 0,0055% (m/m) de metanol e 4,5% para amostras com
0,0236% (m/m) de metanol, o que denota diferenças não significativas num intervalo
alargado de concentrações.
O tempo requerido para completar um ciclo analítico foi de 285 segundos, o que
corresponde a cerca de 13 determinações por hora.
4.3.2. Análise das amostras de biodiesel
A metodologia de fluxo desenvolvida e optimizada foi então aplicada na
determinação de metanol em amostras de biodiesel de diferentes origens e
consequentemente com diferentes composições químicas. De forma a averiguar a
exactidão do método desenvolvido, submeteram-se as oito amostras de biodiesel a
análise paralela pelo método proposto e pela metodologia de referência [21]. Os
resultados encontram-se na Tabela 4.2., onde também se podem analisar os desvios
relativos obtidos entre as duas metodologias. Como se pode observar não se verificaram
desvios estatisticamente significativos entre os resultados obtidos pela metodologia de
fluxo e de referência.
Tabela 4.2. Resultados obtidos pela metodologia SIA e pela metodologia de referência para a
determinação de metanol em amostras de biodiesel
Amostras
Metodologia SIA
Método de referência
Metanola (% (m/m))
Metanola (% (m/m))
Soja + Palmoleína
0,0113 (± 0,0002)
0,0117 (± 0,0009)
- 3,42
Colza
0,0231 (± 0,0026)
0,0224 (± 0,0019)
+ 3,13
Girassol
0,0240 (± 0,0006)
0,0234 (± 0,0007)
+ 2,56
Girassol (50%) +
Mamona (50%)
0,0344 (± 0,0002)
0,0338 (± 0,0004)
+ 1,78
Soja 1
0,0120 (± 0,0012)
0,0125 (± 0,0004)
- 4,00
Soja 2
0,0183 (± 0,0002)
0,0173 (± 0,0008)
+ 5,78
Soja 3
0,0197 (± 0,0003)
0,0189 (± 0,0007)
+ 4,30
Girassol (80%) +
Mamona (20%)
0,0055 (± 0,0002)
0,0063 (± 0,0005)
- 12,01
a
Desvio relativo (%)
média e desvio padrão de 3 determinações
127
Capítulo 4
Os resultados obtidos por aplicação das metodologias a amostras de biodiesel
foram ainda confirmados pelo estabelecimento de uma regressão linear entre as duas
metodologias, do tipo CSIA (% (m/m)) = -0,0008 (±0,0011) +1,0591 (±0,0568) CMétodo
referência
(%(m/m)), r=0,9986) e por aplicação do teste t de Student (t
calculado
1,01; t
de
tabelado
2,36). Ambos os testes confirmaram a concordância entre os dois métodos, para um nível
de confiança de 95 %.
128
Determinação do teor de metanol em amostras de biodiesel
4.4. Conclusões
A metodologia desenvolvida permitiu quantificar o teor de metanol em amostras
de biodiesel e foi obtida uma boa correlação entre os resultados obtidos com esta
metodologia e pelo método de referência.
O ritmo de amostragem fornecido pelo sistema desenvolvido é de cerca de 13
determinações por hora, representando uma notável melhoria na eficiência e rapidez
quando comparado com o método de referência [21].
Por outro lado, neste sistema, com a inclusão da UE e consequente extracção do
metanol da amostra orgânica, a determinação enzimática do analito é efectuada em meio
aquoso. Neste caso, a extracção líquido-líquido convencional, com as fases de
segmentação e separação, foi então substituída por um procedimento mais simples, de
extracção membranar.
A metodologia proposta quando comparada com um procedimento discreto para a
determinação do teor de metanol em amostras de gasolina-mistura, que utiliza também a
AOD e a POD co-imobilizadas numa matriz polimérica espongiforme de hidrogel [33],
mostra-se claramente vantajosa. Neste último, são consumidas 15 mg de AOD e o tempo
de vida operacional do biosensor é limitado a 60 determinações, ao passo que no método
proposto apenas são usadas 6,4 mg de AOD e a durabilidade do reactor (período durante
o qual não se verificava perda de actividade) era cerca de 2 meses. Para além disso, é
também necessária a diluição manual das amostras de fuel com um solvente orgânico
antes da sua análise no procedimento discreto. No método proposto, com o procedimento
de imobilização covalente da AOD assegurou-se um aumento da sua estabilidade
catalítica e a sua utilização de forma repetida, as quais permitiram economizar a
quantidade de enzima despendida.
De um modo geral, podemos afirmar que a metodologia baseada em extracção
por membrana representa uma importante ferramenta para o controlo de qualidade do
biodiesel com potencial aplicação na indústria de energias alternativas, constituindo um
método robusto, selectivo e com sensibilidade adequada à análise de amostras orgânicas
complexas sem qualquer pré-tratamento.
129
Capítulo 4
4.5. Referências bibliográficas
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Capítulo 4
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132
CAPÍTULO 5
Avaliação do efeito dos anti-inflamatórios
não-esteróides sobre a actividade da
fosfolípase A2 utilizando lipossomas
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
5.1. Introdução
O presente trabalho envolve a utilização de lipossomas como ambiente reaccional
para efectuar ensaios com a fosfolípase A2 (PLA2) cuja acção decorre na interface lípidoágua. A metodologia desenvolvida é baseada na utilização de uma sonda de
fluorescência interfacial para a monitorização da mudança do ambiente hidrofóbico em
redor da sonda, causada pela reacção hidrolítica da PLA2 sobre os lipossomas. Para o
efeito, recorreu-se a câmaras de mistura para permitir numa primeira fase a incubação da
sonda com os lipossomas e posteriormente da própria PLA2. Após o estudo e
optimização da actividade enzimática neste ambiente, procedeu-se à avaliação do efeito
de diferentes anti-inflamatórios sobre a PLA2.
5.1.1. Desenvolvimento de um sistema automático para a avaliação do efeito dos
anti-inflamatórios
não-esteróides
na
actividade
da
fosfolípase
A2
usando
lipossomas como modelos membranares
A inflamação é um mecanismo essencialmente de defesa dos seres vivos
desencadeada por vários tipos de agentes agressores, sendo comum a vários tipos de
tecidos [1] e consiste num complexo conjunto de alterações celulares que envolve a
activação de enzimas e libertação de diversos mediadores químicos [2]. Dos mediadores
intervenientes na reacção inflamatória salientam-se, pela sua importância, os resultantes
da síntese das prostaglandinas (PGs). A síntese das PGs é activada, em resposta ao
estímulo inflamatório, pela PLA2 que, actuando sobre fosfolípidos membranares, liberta o
ácido araquidónico, que irá ser metabolizado por duas vias diferentes, prosseguindo
desta forma a cascata inflamatória.
A PLA2 (EC 3.1.1.4) é uma enzima largamente distribuída no organismo humano
que, pertence à classe das enzimas esterases [3] e hidrolisa os fosfolípidos da membrana
na posição éster sn-2 [4]. O resultado é a formação de lisofosfolípidos e de ácidos gordos
livres. Actuando desta forma, a PLA2 está envolvida numa primeira etapa da referida
cascata do processo inflamatório, a libertação do ácido araquidónico da membrana
celular que induzirá a formação de mediadores pró-inflamatórios [4]. A PLA2 pode
constituir um caminho alternativo no combate de diversas doenças inflamatórias já que
esta foi considerada o alvo mais importante da terapia anti-inflamatória [5]. Desta forma, o
estudo de inibidores da PLA2 é de extrema importância, pois estes podem actuar numa
fase mais precoce da doença inflamatória em curso.
Encontram-se descritos vários métodos de “screening” de inibidores da actividade
da PLA2 [6-18]. O método por excelência devia aliar sensibilidade e reprodutibilidade
135
Capítulo 5
elevadas com a capacidade de monitorizar continuamente a hidrólise dos substratos. Os
métodos comummente utilizados nos ensaios das fosfolípases são o método radioactivo
de cromatografia em camada delgada (CCD) e o método titulométrico pH-stat [6, 19]. O
primeiro é provavelmente o mais exacto e sensível dos métodos disponíveis, mas
apresenta várias desvantagens, nomeadamente o facto de só permitir monitorização
descontínua, de ser tedioso e dispendioso. Deste modo, o ensaio radioactivo da E. coli
tornou-se uma alternativa ao ensaio de CCD para fosfolípases de mamíferos nãopancreáticas, sendo menos moroso e dispendioso, mas este não é apropriado para
estudos cinéticos rigorosos. O ensaio de pH é frequentemente empregue quando a
monitorização do ensaio é contínua, mas a sensibilidade é baixa. No caso de utilização
de enzimas purificadas, quando os grupos tióis livres não estão presentes, o ensaio
espectrofotométrico do tiol pode ser usado [18]. Este método apresenta uma
sensibilidade semelhante ao do método de pH e é mais conveniente e reprodutível, mas
usa substratos que não estão disponíveis comercialmente. Desta forma, não obstante
dos métodos de determinação disponíveis, a procura de um método conveniente,
sensível e contínuo continua. Dos métodos que permitem uma monitorização contínua da
actividade da PLA2, com sensibilidade elevada, destacam-se os que usam a
fluorescência [13].
Neste contexto, foi desenvolvido um método que combina a sensibilidade da
detecção fluorimétrica, recorrendo à sonda de fluorescência ácido 1-anilinonaftaleno-8sulfónico (ANS), a monitorização contínua da actividade da PLA2 e a elevada
reprodutibilidade característica dos métodos de fluxo, para a avaliação da potencial
inibição dos anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) da actividade da enzima.
A PLA2, apesar de ser uma enzima solúvel em água, apresenta uma preferência
catalítica para substratos de fosfolípidos agregados, tais como micelas, monocamadas ou
lipossomas e funciona optimamente na interface água-fosfolípido [20]. Neste sentido,
foram usados lipossomas unilamelares de fosfatidilcolina da gema de ovo (EPC, do inglês
“egg yolk phosphatidilcoline”) como substrato para a PLA2, pois estes mimetizam o
microambiente lipídico fluido e anisotrópico existente nas membranas biológicas. Na
realidade, estes fosfolípidos contendo colina, geralmente denominados lecitinas, são os
mais abundantes na natureza e os mais usados na preparação de lipossomas [21].
A sonda interfacial ANS, a qual é um indicador sensível de mudanças
conformacionais nas membranas apresenta uma elevada intensidade de fluorescência
quando ligada às membranas lipídicas (Figura 5.1. A). No entanto, quando a PLA2 se liga
à interface da membrana, esta hidrolisa a ligação sn-2 dos fosfolípidos da membrana
originando grupos hidroxilo acídicos de natureza hidrofílica que levam a uma mudança do
ambiente em redor da sonda, causando uma diminuição da intensidade de fluorescência
136
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
(Figura 5.1. B). Desta forma, se os compostos AINEs estudados forem capazes de inibir a
acção da PLA2, o ambiente em redor da sonda ANS permanecerá hidrofóbico e a
fluorescência da sonda não irá diminuir ou irá sofrer um ligeiro aumento (Figura 5.1. C).
É possível assim estudar a actividade da PLA2 e avaliar o efeito inibitório de alguns
AINEs na actividade da mesma.
INIBIDORES:
(A)
ANS
PLA2
Flu
or
es
cê
n
cia
ANS
(C)
(B)
PLA2
PLA2
Flu
or
es
cê
nc
ia
IBUPROFENO
ANS
MEIO
AQUOSO
MEIO
AQUOSO
MEIO
AQUOSO
INIBIDOR
MEIO
LIPÍDICO
MELOXICAM
MEIO
LIPÍDICO
MEIO
LIPÍDICO
TOLMETINA
ÁCIDO LIPÓICO
Figura 5.1. Representação esquemática do princípio do ensaio empregue para o estudo da
actividade da PLA2 e para a avaliação do efeito inibitório dos AINEs sobre a PLA2.
A interacção fármaco-membrana revela-se um elemento importante na avaliação
do(s) mecanismo(s) de acção dos fármacos em estudo e pode também clarificar alguns
aspectos inerentes aos mecanismos de toxicidade que a eles se encontram associados.
No presente trabalho, prevê-se que os AINEs estudados exerçam uma actividade
inibitória sobre a PLA2. Contudo, este mecanismo de acção ainda não se encontra
completamente descrito. Actualmente sabe-se que uma parte dos inibidores da PLA2
modificam as propriedades biofísicas das bicamadas fosfolípidicas, condicionando o
acesso da enzima aos fosfolípidos e a sua capacidade catalítica, enquanto outra parte
poderá ligar-se directamente à enzima e inibí-la alostericamente. Em relação ao segundo
mecanismo, está descrito que o ácido α-lipóico (ALA) inibe directamente a PLA2 [22], o
qual foi usado como controlo positivo para o nosso ensaio. No que respeita aos fármacos,
foram testados AINEs representativos de diferentes classes químicas, nomeadamente do
ácido arilpropiónico (ibuprofeno), do ácido arilacético (tolmetina) e derivados de oxicamos
(meloxicam).
A avaliação do efeito dos AINEs citados sobre a actividade da PLA2 foi efectuada
num sistema de fluxo, cujas características como o controlo rigoroso e preciso da
manipulação dos reagentes bem como das condições reaccionais, permitem ultrapassar
algumas
dificuldades
inerentes
às
metodologias
discretas,
como
sendo
a
irreprodutibilidade e a morosidade dos ensaios aquando da análise de séries de
amostras.
137
Capítulo 5
5.2. Material e métodos
5.2.1. Reagentes e soluções
A solução de transporte empregue na avaliação do efeito dos AINEs na actividade
da PLA2 era uma solução tampão preparada com Tris-(hidroximetil)-aminometano (Tris
base, Riedel-de-Haën) 10 mmol L-1, cloreto de sódio 150 mmol L-1 e cloreto de cálcio
diidratado 1 mmol L-1 e o pH desta solução era ajustado a 8,9 unidades com uma solução
do ácido clorídrico 2 mol L-1 (Pronalab).
A solução padrão de 1200 µmol L-1 da sonda ANS (Molecular Probes, Invitrogen)
era preparada dissolvendo a quantidade apropriada na solução tampão contendo 1%
(v/v) de metanol (Fisher Scientific).
A solução padrão de fosfatidilcolina da gema de ovo (3000 µmol L-1, EPC, SigmaAldrich) era armazenada em tampão a 4ºC.
A solução de fosfolípase A2 (PLA2, EC 3.1.1.4, de veneno de abelha da espécie
Apis mellifera, com actividade específica de 1460 U mg-1 de proteína, Sigma-Aldrich) de 5
U mL-1 era igualmente preparada na solução tampão sendo descongelada a 25ºC e
mantida em gelo durante o seu uso.
As soluções de trabalho dos anti-inflamatórios não-esteróides (meloxicam,
tolmetina e ibuprofeno; Sigma-Aldrich), do ácido α-lipóico (ALA, Fluka), da sonda ANS e
do EPC eram preparadas diariamente por diluição adequada das respectivas soluções
padrões com a solução tampão.
Todas estas soluções eram protegidas da luz no decorrer dos ensaios.
5.2.2. Preparação dos lipossomas
A sua preparação foi feita através do método de hidratação do filme lipídico
(Figura 5.2.) [23, 24]. Num primeiro passo o lípido EPC é dissolvido numa mistura de
solventes orgânicos, clorofórmio-metanol (9:1) e evaporado em corrente de azoto para
remover vestígios dos solventes usados. Num segundo passo, o filme lipídico formado é
hidratado com tampão e é agitado em vórtice. Agora a mistura consiste em lipossomas
multilamelares (MLVs). Num terceiro passo, os MLVs são extrudidos através de
membranas (Nucleopore) com porosidade apropriada, neste caso 100 nm, obtendo-se
lipossomas unilamelares (LUVs). Esta extrusão, assim como a hidratação do filme
lipídico, foi feita a uma temperatura superior à de transição de fase dos lípidos (neste
caso à temperatura ambiente) que vão constituir os LUVs. A concentração de EPC nas
suspensões de lipossomas foi determinada pela quantificação do fósforo (uma mole de
138
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
fósforo corresponde a uma mole de fosfolípido) pelo método do fosfomolibdato
modificado [25].
Figura 5.2. Representação esquemática da preparação de MLV e LUV pelo método de hidratação
do filme lipídico. Adaptado de [21].
5.2.3. Aparelhagem
O sistema de fluxo apresentava na unidade propulsora um tubo de impulsão de
PVC com 1,30 mm de diâmetro interno.
O tubo de armazenamento apresentava um comprimento de 150 cm com
configuração em figuras de oito.
Foram também usadas duas câmaras de mistura, descritas no Capítulo 2, ligadas
a duas das portas da válvula selectora e colocadas sobre placas de agitação
termostatizadas a 25ºC, que apresentavam um volume interno de cerca de 350 µL
(incluindo a barra magnética). Este valor foi avaliado por pesagem, através da diferença
entre o seu valor quando cheia com a solução de trabalho e quando vazia.
Todos os outros componentes constantes da montagem (Figura 5.3.),
designadamente, bomba peristáltica, válvula selectora de fluidos, fluorímetro e registador,
foram previamente descritos no Capítulo 2.
139
Capítulo 5
(A)
CM 2
BP
VS
E
E
ar
9 8 7
6
10
5
1
4
2
3
TA
ANS
T
ALA
D
CM 1
EPC
E
PLA2
E
(B)
Figura 5.3. (A) Montagem de fluxo para o estudo da actividade da PLA2 e para a avaliação do
-1
efeito inibitório dos AINEs e do ALA: T – Solução transportadora de tampão Tris 10 mmol L pH
8,9; BP – Bomba peristáltica bidireccional; TA – Tubo de armazenamento; VS – Válvula selectora
de fluidos; ANS – Solução de sonda ANS; EPC – Solução de lipossomas ou mistura incubada
lipossomas-fármaco; PLA2 – Solução de enzima ou mistura incubada enzima-fármaco; ALA –
Solução de ácido lipóico; CM 1 e CM 2 – Câmaras de mistura 1 e 2; D – Detector fluorimétrico
(λexcitação=377 nm; λemissão=475 nm); E – Esgoto. (B) Fotografia da montagem desenvolvida.
140
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
5.2.4. Método discreto de comparação
A acção hidrolítica da PLA2 sobre os lipossomas foi monitorizada com a sonda
interfacial ANS por um ensaio de fluorescência no espectrofluorímetro Perkin-Elmer LS
50B. Todos os ensaios foram efectuados a 25 ºC usando uma célula de percurso óptico
de 1 cm.
Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram os mesmos que os
usados na metodologia de SIA.
Inicialmente, a mistura reaccional constituída por tampão, substrato EPC (50 µmol
L-1) e ANS (10 µmol L-1) era continuamente agitada durante aproximadamente 10
minutos. De seguida, era efectuada a adição da PLA2 para começar a reacção hidrolítica.
O efeito dos inibidores na acção hidrolítica da PLA2 foi estudado com o mesmo
ensaio de fluorescência. Foram testados dois tipos de procedimentos de incubação. No
primeiro, a solução stock de PLA2 (5 U mL-1) foi incubada com diferentes concentrações
de fármacos (0-8 µmol L-1) durante 30 minutos e a reacção foi monitorizada após a adição
desta mistura incubada à solução stock de EPC (50 µmol L-1). No segundo, a solução
stock de EPC foi incubada com diferentes concentrações de fármacos (0-8 µmol L-1)
durante 30 minutos antes da adição da solução stock de PLA2 (5 U mL-1) para iniciar a
reacção.
5.2.5. Procedimento experimental
O procedimento analítico compreendeu o estudo da actividade da PLA2 e a
avaliação do efeito inibitório dos AINEs e do ALA sobre a actividade da PLA2. O ciclo
analítico resultante está sumarizado na Tabela 5.1.
Para o estudo da actividade da PLA2, o ciclo analítico inicia-se com a aspiração de
uma bolha de ar (etapa a), seguido da aspiração de igual volume de sonda ANS e de
substrato EPC (etapas b e c) e nova aspiração de uma bolha de ar (etapa d). Esta
sequência, após inversão do sentido de fluxo, era direccionada para a câmara de mistura
1 (CM 1, Figura 5.3.) (etapa e), onde se verificava a incubação dos lipossomas de EPC
com a sonda ANS com paragem do fluxo (etapa f). Seguidamente, uma alíquota de PLA2,
precedida de uma bolha de ar (etapas g e h), era também propulsionada para a CM 1
(etapa i), onde ocorria hidrólise do EPC pela PLA2 durante o período de permanência na
câmara (paragem de fluxo) (etapa j). Depois, era retirada uma alíquota da CM 1 para o
TA (etapa k) que finalmente era propulsionada para o detector (etapa l), com aquisição do
sinal analítico obtido. O ciclo analítico terminava com a lavagem e esvaziamento da CM 1
(etapas m-o), de modo a que no ciclo seguinte não se encontrassem na câmara vestígios
141
Capítulo 5
da mistura reaccional da determinação anterior. A lavagem compreendia uma etapa em
que a solução transportadora era propulsionada para a câmara a um caudal elevado,
saindo pelo canal de esgoto (etapa m). Na etapa seguinte, procedia-se ao esvaziamento
da câmara por aspiração da solução transportadora que permaneceu no seu interior
(etapa n). Na etapa o, a solução aspirada da câmara era direccionada para uma porta de
esgoto, de modo a garantir que toda a tubagem estivesse preenchida apenas com
solução transportadora.
Para a avaliação do potencial efeito inibitório dos fármacos, as soluções de EPC
ou de PLA2 eram pré-incubadas com diferentes concentrações dos fármacos (de forma
semelhante ao método discreto de comparação) e as misturas sujeitas a incubação de
lipossomas ou enzima com fármacos eram aspiradas em vez dos lipossomas ou da
enzima (etapa c ou h, respectivamente).
Para a incubação dentro do sistema do ALA com a enzima foi conectada uma
segunda câmara de mistura (CM 2, Figura 5.3.) a uma das portas da válvula selectora.
Neste caso particular, o ciclo analítico inicia-se com a aspiração de uma bolha de ar,
seguido do ALA e da enzima e de uma segunda bolha de ar (etapas A-D). Esta
sequência era depois enviada para a CM 2 (Etapa E). A incubação do EPC com a sonda
ANS era efectuada enquanto a incubação do ALA e da enzima decorria na CM 2, uma
vez que era efectuada uma paragem de 10 min (Etapa f). De seguida, uma alíquota da
mistura em CM 2 (etapa h), precedida de uma bolha de ar, era direccionada para a CM 1
com paragem de fluxo. A partir daqui, o ciclo analítico prosseguia de acordo com o
descrito na Tabela 5.1. e terminava com a limpeza da CM 2 com a solução tampão
transportadora (etapas M-O), de forma semelhante ao descrito para a CM 1 (etapas m-o).
142
6
8
4
6
9
6
1
2
6
3
3
6
4 ou 9
3
3
3
5
3
3
7
9
9
7
A*
B*
C*
D*
E*
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
k
l
m
n
o
M*
N*
O*
2,5
180
15
50
35
25
40
35
25
40
3,8
1
5,6
11,2
1
6,8
1
5,6
5,6
1
4,5
300 ou 600*
1
Tempo de
operação (s)
3,0
0,8
2,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
3,0
0,8
0,8
0,8
0,8
3,0
0,8
Caudal (mL min-1)
Aspiração de uma bolha de ar
Aspiração de 75 µL de ALA
Aspiração de 150 µL de PLA2
Aspiração de uma bolha de ar
Propulsão da sequência para CM 2
Aspiração de uma bolha de ar
Aspiração de 75 µL de ANS
Aspiração de 75 µL de EPC (ou da mistura incubada EPC-fármaco)
Aspiração de uma bolha de ar
Propulsão da sequência para a CM 1
Período de paragem – Incubação 1
Aspiração de uma bolha de ar
Aspiração de 50 µL de PLA2 (ou da mistura incubada PLA2fármaco) ou da CM 2
Propulsão da sequência para a CM 1
Período de paragem – Incubação 2
Aspiração da mistura da CM 1
Propulsão da mistura para o detector
Limpeza da CM 1 com o transportador
Aspiração do transportador de limpeza da CM 1
Propulsão do transportador de limpeza para o esgoto
Limpeza da CM 2 com o transportador
Aspiração do transportador de limpeza da CM 2
Propulsão do transportador de limpeza para o esgoto
Descrição
* Etapas adicionais quando a incubação do ALA e da PLA2 é efectuada dentro do sistema.
Posição da
válvula
Etapa
Tabela 5.1. Procedimento analítico para o estudo da actividade da PLA2 e para a avaliação do efeito inibitório dos AINEs e do ALA usando a metodologia SIA
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
143
Capítulo 5
5.3. Resultados e sua discussão
5.3.1. Optimização do sistema
Como a metodologia proposta não se encontrava definida em ensaios discretos,
foi imperativo estabelecer numa primeira fase condições em batch para a determinação
da actividade da PLA2 com a ANS e só depois proceder à automatização do ensaio.
Desta forma, as condições iniciais utilizadas no método discreto de comparação (secção
5.2.4.) foram transportadas para o sistema de fluxo e depois procedeu-se à optimização
das condições óptimas para a operação da montagem SIA.
Dada a versatilidade de operações oferecidas pela válvula selectora de fluidos,
foram incorporadas duas câmaras de mistura, descritas no Capítulo 2. A utilização destas
em sistemas SIA é vantajosa para a diluição e mistura de soluções muito concentradas
ou para garantir uma mistura efectiva entre três ou mais zonas [26]. No presente trabalho,
as câmaras de mistura, conectadas às portas laterais da válvula selectora (Figura 5.3.)
proporcionavam uma mistura efectiva da solução viscosa dos lipossomas com outros
reagentes e possibilitavam a incubação da amostra com os reagentes isolada do resto do
sistema, durante a qual o sistema podia acomodar outras etapas do ciclo analítico. O
posicionamento da câmara e o modo de funcionamento peculiar dos sistemas SIA, com
inversão do sentido do fluxo, facilitaram a criação das condições óptimas para o
desenvolvimento da reacção enzimática, ao permitir a aspiração das diferentes zonas de
reagentes em diferentes momentos e a sua introdução na câmara de mistura na altura
propícia. Foram assim criadas as condições de mistura e incubação adequadas para o
desenvolvimento da reacção hidrolítica da PLA2 sobre os lipossomas e consequente
mudança do ambiente em torno da sonda ANS.
Recorreu-se também à estratégia de fluxo monosegmentado [27], que se
caracteriza pela aspiração da zona reaccional entre duas bolhas de ar, o que se traduz
numa redução da dispersão e consequentemente num aumento da sensibilidade da
determinação. Optou-se assim por aspirar as zonas correspondentes à sonda ANS e ao
EPC e mais tarde à enzima PLA2 entre duas bolhas de ar antes da entrada na câmara de
mistura, garantindo assim a sua individualidade e limitando a sua dispersão no
transportador. O fluxo era depois parado após a entrada da segunda bolha de ar na
câmara permitindo a incubação da sonda com os lipossomas e a enzima. Efectivamente,
intercalando as zonas dos reagentes envolvidos entre duas bolhas de ar, era possível
mantê-las separadas das restantes zonas e misturá-las apenas na câmara de mistura,
evitando uma diluição excessiva destes com o transportador quer no TA quer na própria
câmara de mistura. Por outro lado, era possível controlar, através do movimento da
144
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
primeira bolha aspirada, o percurso das zonas aspiradas para a câmara de mistura, o que
permitia um controlo rigoroso do tempo necessário para introduzir todas as zonas na
câmara, sem dispersão adicional devido à entrada de transportador. Devido ao facto de a
câmara de mistura se encontrar conectada ao sistema através de um dos seus orifícios
laterais (conforme descrito no Capítulo 2, Secção 2.3.), encontrando-se o outro fechado,
as bolhas de ar, ao entrarem na câmara de mistura, eram de imediato expelidas pelo
canal de esgoto superior, não afectando a repetibilidade dos sinais analíticos obtidos.
Os primeiros estudos com esta montagem foram efectuados utilizando a
sequência de adição de reagentes adoptada no ensaio discreto, uma vez que esta
garantia a mistura da sonda com o EPC antes da adição da PLA2. Neste sentido, o sinal
de branco, considerado 100%, era obtido pela incubação da sonda ANS com os
lipossomas. Por sua vez, o sinal obtido após a adição da PLA2 à anterior mistura
incubada era considerado como correspondendo a uma percentagem relativa, permitindo
em último caso a determinação da actividade da PLA2.
A montagem SIA foi então optimizada com o objectivo de se estabeleceram as
concentrações óptimas de substrato EPC, de sonda e de enzima bem como os tempos
de incubação (ou tempos de residência dentro da câmara) antes e após a adição de
PLA2. A Tabela 5.2. sumariza as condições seleccionadas para a avaliação da actividade
da PLA2 e subsequente estimação do efeito inibitório dos AINEs sobre esta actividade.
Os factores de dispersão [28] na CM 1 foram determinados utilizando uma
solução de quinino 10 mg L-1 (λexcitação=250 nm; λemissão=450 nm). Obtiveram-se como
factores de dispersão 8,5, 6,5 e 8,0 para as soluções de ANS, EPC e enzima,
respectivamente, e as soluções de trabalho correspondentes foram então preparadas
com base nestes factores.
145
Capítulo 5
Tabela 5.2. Intervalos de valores usados para o estudo dos diferentes parâmetros do sistema e
valores seleccionados para a sua operação
Parâmetro
Intervalo estudado
Valor
seleccionado
25 - 150
50
Concentração de PLA2 (U mL )
0,125 - 1,250
0,625
Concentração de ANS (µ
µmol L )
5 - 15
10
Período de incubação da ANS com EPC (min)
0 - 10
5
Período de incubação após a adição da PLA2
(min)
0 - 10
3
0.5 - 2.0
2.0
Concentração de EPC (µ
µmol L )
-1
-1
-1
-1
Propulsion carrier flow rate (ml min )
Nas experiências realizadas em modo discreto, os tempos de incubação antes e
depois da adição da PLA2 eram de 10 e de 5 min, respectivamente. No que respeita ao
sistema SIA, o primeiro tempo de incubação (etapa f, Tabela 5.1.) foi reduzido para 5 min,
uma vez que este tempo proporcionava a maior razão sinal analítico/branco. Para o
período de incubação após a adição da PLA2 (etapa j, Tabela 5.1.), foi um escolhido um
tempo de 3 min, já que a razão sinal analítico/ruído para um tempo de 5 min aumentou
apenas cerca de 6 %. Adicionalmente, o caudal de propulsão do transportador em
direcção ao detector foi fixado como sendo 2,0 mL min-1, dada que a reacção estava
completa na CM 1.
A concentração final do substrato EPC foi estudada entre 25 e 150 µmol L-1. À
medida que a concentração aumenta, há um incremento do sinal de branco, sendo que a
diferença entre o branco e o sinal analítico é maior para a concentração de 50 µmol L-1 de
EPC, a qual foi escolhida para os ensaios seguintes.
A concentração de enzima foi seguidamente avaliada até 1,250 U mL-1. Como se
pode ver na Figura 5.4., há um decréscimo da intensidade de fluorescência de cerca de
20% até uma concentração 0,625 U mL-1 de PLA2. Para concentrações superiores, a
diminuição foi de apenas cerca de 7%. A concentração de PLA2 escolhida como óptima
foi então 0,625 U mL-1, pois a diferença de intensidade de fluorescência obtida não
justifica um aumento da quantidade de enzima em 50% e a precisão dos ensaios ronda
os 2%.
146
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
100
IF (%)
95
90
85
80
75
70
0,000
0,250
0,500
0,750
1,000
Concentração de PLA2 (U mL-1)
1,250
Figura 5.4. Influência da concentração de PLA2 no sinal analítico obtido (intensidade de
fluorescência em %).
Uma vez estabelecidas as concentrações finais óptimas do substrato lipídico e da
enzima (50 µmol L-1 EPC e 0,625 U mL-1 PLA2), foi escolhida como óptima uma
concentração de 10 µmol L-1 da sonda ANS entre 5 e 15 µmol L-1. É importante salientar
que quer o intervalo de concentrações de ANS testado (a razão lípido:sonda foi sempre
inferior a 300:1) quer a concentração de metanol utilizada (1%, v/v) para promover a
solubilização da sonda não interferem com o ambiente estrutural dos lipossomas [29-32].
5.3.2. Aplicação do método desenvolvido para avaliar o efeito inibitório dos AINEs e
do ácido lipóico na actividade da PLA2
O método optimizado foi então aplicado a AINEs de diferentes classes químicas,
designadamente derivados do ácido arilpropiónico (ibuprofeno), do indol (tolmetina) e do
oxicam (meloxicam) bem como ao ALA.
Neste caso, o ciclo analítico descrito anteriormente é precedido por dois
procedimentos diferentes de incubação, dos fármacos com os lipossomas ou com a
PLA2, com a duração de 10 minutos, tempo a partir do qual não há melhoria de resultados
de acordo com as experiências efectuadas em modo discreto.
As actividades medidas com a mistura fármacos-PLA2 ou EPC foram consideradas
como uma percentagem relativa da actividade da PLA2 obtida sem os fármacos, a qual
corresponde a 0 % de inibição. Assim, a eficiência de inibição da PLA2 foi expressa como
uma percentagem de inibição da acção hidrolítica da PLA2 sobre os lipossomas em
função da concentração final dos inibidores testados (Figuras 5.5. e 5.6.).
147
Capítulo 5
Inibição PLA2 (%)
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
Concentração de ALA (µ
µ mol
25
30
35
L-1)
Figura 5.5. Avaliação da eficiência de inibição da PLA2 (%) exibida pelo ALA de acordo com o tipo
de incubação: dentro (
) e fora (
) do sistema.
Inibição PLA2 (%)
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
Concentração de AINE (µ
µ mol
8
L-1)
Figura 5.6. Avaliação da eficiência de inibição da PLA2 (%) exibida pelos AINEs testados:
tolmetina (
); meloxicam (
) e ibuprofeno (
).
No que respeita ao controlo positivo do ensaio, ALA, os resultados obtidos
mostram o seu efeito inibitório sobre a PLA2 apenas quando a incubação é feita com a
própria PLA2. Estes resultados estão em concordância com os encontrados na literatura
[22], apontando para a interacção directa do ALA com a enzima. Como referido
anteriormente, foi efectuada a incubação dentro do sistema SIA do ALA com a enzima
através da introdução de uma outra câmara de mistura (CM 2, Figura 5.3), tornando a
automatização de todo o processo possível e minimizando desta forma o manuseamento
da amostra e consequentemente o risco de contaminação ou perda do analito. Foram
148
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
obtidos resultados satisfatórios (Figura 5.5.) quando foi efectuado um período de
incubação de 10 minutos (Etapa f, Tabela 5.1.).
No caso dos AINEs testados, estes exerceram um efeito inibitório sobre a PLA2
dependente da sua concentração, exceptuando o ibuprofeno, o qual apenas exibiu a
acção inibitória numa concentração final de 8 µmol L-1 (Figura 5.6.). É de ressalvar que
este efeito inibitório dos AINEs sobre a PLA2 apenas se verificou quando a sua incubação
foi efectuada com os lipossomas, sugerindo que estes eventualmente alteram as
propriedades biofísicas dos lipossomas e consequentemente limitam o acesso da PLA2
ao substrato lipídico. Na verdade tem sido reportado que quer a capacidade de ligação à
superfície do agregado fosfolipídico quer o “turnover” catalítico estão altamente
dependentes do estado físico e do empacotamento molecular do substrato [33]. Assim,
alguns inibidores interagem directamente com a enzima enquanto que outros como que
alteram a “qualidade da interface” por modificação das propriedades da bicamada
fosfolipídica, tornando esta inacessível à enzima [22]. Comparando a capacidade dos
diferentes AINEs como inibidores da PLA2, concluiu-se que a tolmetina foi o fármaco mais
potente, apresentando inclusive uma eficiência de inibição superior à do controlo positivo
ALA. Na verdade, a tolmetina tem uma localização preferencial ao nível da superfície
membranar (confirmada através de ensaios de desactivação de fluorescência [34]), o que
pode interferir com a adsorção da enzima ao substrato lipídico com a consequente
redução da hidrólise dos fosfolípidos.
5.3.3. Validação dos resultados obtidos pelo método desenvolvido com os
fornecidos pelos ensaios realizados em modo discreto
Os resultados obtidos com o método proposto apresentaram concordância com os
atingidos pelo método discreto de comparação. Na realidade, foram observadas
percentagens comparáveis de inibição de PLA2 entre os dois métodos para similares
períodos de inibição da hidrólise fosfolípidica e para as mesmas concentrações de
inibidores (Figura 5.7.). Adicionalmente, os ensaios efectuados em modo discreto
suportam que a PLA2 é efectivamente inibida pelos AINEs e pelo ALA de acordo com os
mecanismos anteriormente referidos. Não obstante disso, foi verificada uma variação
significativa dos sinais analíticos referentes a réplicas dos ensaios em modo discreto,
devido a um ineficiente controlo de tempo, contrariamente ao rigoroso controlo de tempo
da metodologia de fluxo empregue. No que respeita à precisão do método desenvolvido,
foi estimado um RSD de 1,6% para uma concentração de 0,625 U mL-1 PLA2.
Adicionalmente, o método desenvolvido é vantajoso em termos de rapidez, já que os
149
Capítulo 5
métodos discretos incluem um período de incubação inicial de 10 minutos e um período
de leitura cinética após a adição da PLA2 ao substrato [35], para além do tempo
dispendido na adição dos reagentes. No presente método, são necessários cerca de 720
segundos para completar um ciclo analítico.
Meloxicam
105
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
IF (%)
IF (%)
Ibuprofeno
0
50
100
150
200
250
105
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
0
300
50
100
150
200
250
300
Tempo (s)
Tempo (s)
ALA
120
100
IF (%)
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
Tempo (s)
Figura 5.7. Avaliação da eficiência de inibição exibida pelos fármacos testados pelo método
discreto de comparação. Resultados obtidos da incubação dos AINEs com os lipossomas:
ibuprofeno: 0 µmol L (
-1
(
) ; 4 µmol L (
-1
); 8 µmol L (
-1
) e da incubação do ALA com PLA2: 0 µmol L (
150
-1
); meloxicam: 0 µmol L (
-1
) ; 4 µmol L (
-1
).
) ; 6 µmol L
-1
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
5.4. Conclusões
A metodologia SIA proposta foi aplicada com sucesso à avaliação da actividade
da PLA2 bem como da eficiência de inibição dos AINEs sobre a PLA2, com resultados
comparáveis aos obtidos com procedimentos discretos. Esta metodologia automática
representa uma notável melhoria na precisão, eficiência e rapidez quando comparado
com os ensaios realizados em modo discreto. Por outro lado, o controlo rigoroso do
tempo no decorrer de todos os ensaios inerente à metodologia proposta reveste-se de
extrema importância, sendo praticamente impossível de o assegurar aquando da análise
de diferentes amostras com o método de comparação.
O sistema desenvolvido ilustra bem a versatilidade deste tipo de técnica ao
permitir a incorporação, numa das portas da válvula selectora, de uma câmara de mistura
que garantiu o estabelecimento das condições óptimas para o desenvolvimento da
reacção da PLA2, cuja acção ocorre na interface lípido-água. Foi também demonstrada a
possibilidade de automatização de todo o procedimento analítico com vista à avaliação
do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2 com a incorporação de uma segunda
câmara de mistura. O modo de funcionamento peculiar da válvula selectora e a facilidade
de inversão do sentido do fluxo facilitaram a gestão das soluções envolvidas nas
reacções ao permitir a aspiração das diferentes zonas correspondentes em diferentes
momentos e a sua introdução na câmara de mistura na altura propícia. Assim, foram
criadas condições favoráveis à reacção hidrolítica da PLA2 sobre os lipossomas e
consequente mudança do ambiente em torno da sonda ANS, o que se mostrou
determinante para a sensibilidade e viabilidade do estudo da actividade da PLA2. A
introdução da câmara de mistura permitiu por outro lado a manipulação das soluções de
lipossomas de natureza viscosa e subsequente incubação com a sonda ANS.
As características particulares da montagem permitiram ainda a implementação
de uma estratégia de fluxo monosegmentado durante a aspiração das soluções
envolvidas na avaliação da actividade da PLA2 sobre os lipossomas.
Esta metodologia constitui uma alternativa válida para a avaliação do efeito dos
anti-inflamatórios sobre a PLA2 e como tal pode constituir uma estratégia importante para
o desenvolvimento de novos e mais potentes agentes anti-inflamatórios no campo
farmacêutico-biomédico. Por outro lado, esta metodologia representa uma ferramenta
conveniente, útil e económica, que pode ser usada em outros estudos de inibição da
PLA2 ao nível da interface das membranas. Esta metodologia permite pois a realização
de estudos de modulação da actividade enzimática por alteração das propriedades
interfaciais e, em segundo plano, a mimetização e o paralelismo com algumas situações
a nível biológico.
151
Capítulo 5
A aplicação de sistemas microheterogéneos em sistemas SIA abre pois
interessantes oportunidades de análise sistemática da actividade enzimática, ou mesmo
da monitorização em tempo real de analitos.
152
Avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2
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Capítulo 5
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155
Capítulo 5
[34] Lúcio M, Ferreira H, Lima JLFC, Matos C, Castro B, Reis S. Influence of some antiinflammatory
drugs
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fluidity
studied
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156
CAPÍTULO 6
Avaliação da cinética da oxidação do
ácido caféico catalisada pela tirosinase
em sistemas contendo líquido iónico
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
6.1. Introdução
No presente trabalho, a enzima utilizada constitui o próprio analito e foram
conduzidos ensaios de actividade e de inibição enzimática. O substrato seleccionado foi
um derivado fenólico pouco solúvel em água, o ácido caféico. Neste sentido, o sistema
aquoso contendo líquido iónico permitia a solubilização do ácido caféico e por outro lado
constituía o ambiente reaccional da tirosinase. Após o estudo e optimização da actividade
enzimática neste ambiente, procedeu-se à determinação dos parâmetros cinéticos da
oxidação do ácido caféico pela tirosinase, designadamente os valores das constantes
aparentes de Michaelis-Menten e de velocidade de reacção máxima, e testaram-se
diferentes concentrações do líquido iónico tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio.
Adicionalmente, estes parâmetros cinéticos foram comparados com os obtidos num
ambiente contendo um solvente orgânico convencional, e também se procedeu à
avaliação do efeito de substratos análogos como inibidores.
6.1.1. Desenvolvimento de um sistema automático para a avaliação da cinética da
reacção de oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase em meio de líquido
iónico
Na última década os líquidos iónicos (LIs) têm sido alvo de crescente atenção
devido às suas características particulares, sendo considerados actualmente um meio
reaccional muito promissor no âmbito da Química Verde. Como solventes, os LIs
apresentam em relação aos solventes convencionais a vantagem de não terem pressão
de vapor mensurável à temperatura ambiente. Geralmente, a emissão de vapores
verifica-se a temperaturas bastante elevadas com a decomposição dos LIs, a qual por
vezes não ocorre mesmo a temperaturas superiores a 400ºC [1]. Como desvantagens
destes solventes, são normalmente referidas a viscosidade, que dificulta a agitação e a
homogeneização do meio reaccional, o elevado custo e o desconhecimento da sua
toxicidade a longo prazo [2].
Os LIs contendo catiões do tipo polialquil imidazólio (Figura 6.1.) são sem dúvida
os mais bem estudados e caracterizados, por possuírem diversas propriedades
favoráveis, incluindo facilidade de síntese, baixa viscosidade e boa estabilidade química
[3]. A natureza das cadeias laterais presentes no anel imidazólio conduz a interacções
hidrofóbicas ou hidrofílicas que afectam a solubilidade do LI em solventes mais ou menos
polares. Por outro lado, os protões do anel imidazólio, em especial o que se situa na
posição 2 (R2=H), são capazes de formar pontes de hidrogénio. O anião tem uma grande
influência nas características de solubilidade, sendo os líquidos iónicos contendo os iões
159
Capítulo 6
PF6- e Tf2N- em geral pouco miscíveis com a água, ou mesmo insolúveis. Ao contrário,
aqueles contendo os iões TFA-, BF4- e outros iões mais propensos a formar pontes de
hidrogénio são mais hidrofílicos.
R
N+
3
N
R1
R2
Figura 6.1. Estrutura química do catião polialquil imidazólio dos líquidos iónicos orgânicos.
Estes solventes têm vindo a ser utilizados em procedimentos biocatalíticos, como
uma alternativa aos solventes orgânicos, uma vez que inúmeras enzimas mantêm a sua
actividade neste meio reaccional podendo, em alguns casos, até aumentá-la [4]. Neste
sentido, têm sido efectuados estudos de avaliação da eficiência, estabilidade e
selectividade enzimáticas que atribuem aos LIs o papel de classe de solventes mediadora
de reacções enzimáticas [4-9] . A capacidade adicional de permitir a solubilização de uma
variedade ampla de substratos com baixa solubilidade em água apresentada pelos LIs,
reforça esta classe como uma alternativa aos solventes orgânicos, e por outro lado
conduz ao aparecimento de novas aplicações para procedimentos enzimáticos operados
neste meio reaccional. Neste sentido, é importante conhecer o comportamento das
enzimas no meio constituído por LIs para poder explorar todas as potencialidades das
aplicações das enzimas neste ambiente. Têm sido reportados na literatura alguns
estudos cinéticos em modo discreto para o estudo da catálise enzimática usando LIs
como meio reaccional [10-14] quer avaliando a forma como os LIs influenciam a
velocidade da reacção quer apurando de que forma modificam os mecanismos da própria
reacção [15].
A implementação destes ensaios enzimáticos em meios constituídos por LI em
sistemas de fluxo baseados na técnica SIA mostrou ser vantajosa [16], uma vez que
assegura um consumo reduzido de solvente e dos diferentes reagentes envolvidos e
possibilita a mecanização destes ensaios em sistemas aquosos contendo LI com uma
elevada versatilidade. Adicionalmente, as metodologias de fluxo representam uma fonte
constante de informação cinética, uma vez que os gradientes de concentração gerados
nos diversos instantes do transporte convectivo comportam consigo informação dinâmica
através dos inúmeros elementos com diferentes valores de dispersão [17].
Deste modo, o desenvolvimento de metodologias SIA para estudos cinéticos de
biocatálise de substratos com baixa solubilidade em água em sistemas aquosos contendo
160
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
LIs constitui assim uma ferramenta importante para aferir as potencialidades deste novo
meio reaccional.
No presente trabalho, a avaliação da actividade enzimática no meio reaccional
contendo LI foi efectuada com a enzima tirosinase e um substrato com baixa solubilidade
em água, o ácido caféico, através da determinação dos parâmetros cinéticos,
designadamente os valores das constantes aparentes de Michaelis-Menten (KMap) e de
velocidade de reacção máxima (Vmaxap).
A tirosinase é uma das enzimas pertencente ao grupo das oxidoredutases de
maior interesse na síntese orgânica [18], que intervém na formação de vários produtos
importantes em áreas como as indústrias farmacêutica e da química fina [19]. Este grupo
de enzimas catalisa efectivamente reacções selectivas de oxidação-redução de
compostos orgânicos em sistemas reaccionais constituídos por LIs e a sua aplicação em
processos de biotransformação é de elevada importância no campo ambiental [20]. A
tirosinase catalisa a oxidação dos o-difenóis a o-quinonas na presença de oxigénio
molecular [21] e encontra-se referido na literatura que esta enzima apresenta maior
actividade em meio orgânico que em meio aquoso [22]. Adicionalmente, devido à baixa
solubilidade em água dos derivados fenólicos, estes substratos são normalmente
dissolvidos em solventes orgânicos alcoólicos [23, 24]. Por outro lado, tem sido reportado
que a eficiência de extracção dos ácidos fenólicos das plantas e fruta aumenta com o
aumento da proporção de metanol no solvente [25] e que os extractos metanólicos
obtidos são utilizados directamente para a análise do teor fenólico total.
Na
presente
aplicação,
utilizou-se
o
LI
tetrafluoroborato
de
1-butil-3-
metilimidazólio ([bmim][BF4]) e procurou-se avaliar a adequabilidade deste LI como
alternativa aos solventes orgânicos convencionais na dissolução do ácido caféico e como
ambiente reaccional para a oxidação do substrato catalisada pela tirosinase. Neste
sentido, foi avaliada a influência do metanol e de diferentes concentrações de
[bmim][BF4] na actividade da tirosinase sobre o ácido caféico. Paralelamente, o
comportamento de potenciais inibidores da tirosinase em ambiente de LIs foi igualmente
averiguado.
161
Capítulo 6
6.2. Material e métodos
6.2.1. Reagentes e soluções
A solução de transporte empregue na avaliação da cinética da oxidação do ácido
caféico pela tirosinase em ambiente de LI era a solução tampão universal de Britton e
Welford, obtida por dissolução do ácido bórico (Sigma-Aldrich), ácido cítrico (SigmaAldrich), ácido 5,5´-dietilbarbitúrico (Merck) e diidrogenofosfato de potássio (Riedel-deHaën), numa concentração de 0,0286 mol L-1. O pH desta solução era ajustado a 6,5
unidades com uma solução de hidróxido de sódio 0,1 mol L-1 (Pronalab).
A solução padrão concentrada de ácido caféico (Sigma-Aldrich) era diariamente
preparada dissolvendo a quantidade apropriada em misturas de LI ([bmim][BF4],
Sigma)/tampão (1:1, 1,5:1 e 1:2). As soluções padrão de trabalho correspondentes eram
então preparadas por diluição rigorosa desta solução padrão concentrada nas referidas
misturas de LI/tampão.
Para o estudo comparativo do efeito dos solventes orgânicos na actividade da
tirosinase, foram preparadas soluções padrão de trabalho de ácido caféico de forma
similar, substituindo o LI por metanol (Fisher Scientific).
Para a estimação do efeito inibitório sobre a actividade difenolase da tirosinase, as
soluções de ácido trans-cinâmico (Sigma) e de ácido 3,4-dihidroxibenzóico (Fluka) eram
igualmente preparadas em misturas de LI/tampão.
A solução de tirosinase (EC 1.14.18.1, de cogumelo da espécie Agaricus bisporus,
com actividade específica de 5370 U mg-1 de sólido, Sigma Aldrich) de 54 U mL-1 era
igualmente preparada na solução tampão sendo congelada a uma temperatura de -20ºC
e descongelada a 25ºC aquando do seu uso.
Todas estas soluções eram protegidas da luz no decorrer dos ensaios.
Uma solução de verde de bromocresol (Fluka), sal sódico, foi usada para a
determinação dos factores de diluição e subsequentemente as concentrações de
reagentes na célula de fluxo através da medida da absorvância a 614 nm.
162
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
6.2.2. Aparelhagem
O sistema de injecção sequencial apresentava na unidade propulsora um tubo de
impulsão de PVC com 1,30 mm de diâmetro interno. O tubo de armazenamento e o
reactor apresentavam comprimentos de 150 e 50 cm, respectivamente, ambos com
configuração em figuras de oito.
Todos os outros componentes constantes da montagem (Figura 6.2.),
designadamente, bomba peristáltica, válvula selectora de fluidos, banho termostatizado,
espectrofotómetro e registador, foram previamente descritos no Capítulo 2.
(A)
E
VS
BP
TA
T
2
3
4
5
RE
1 10
9
6
D
311 nm
E
8
7
Enzima
S
(B)
Figura 6.2. (A) Esquema do módulo analítico desenvolvido para a avaliação da cinética da
reacção de oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase em meio de LI: T – Solução
transportadora de tampão Britton e Welford pH 6,5; BP – Bomba peristáltica bidireccional; TA –
Tubo de armazenamento; VS – Válvula selectora de fluidos; S – Solução padrão de ácido caféico
ou da mistura ácido caféico-inibidor; RE – Reactor; D – Detector espectrofotométrico (λ = 311 nm);
E – Esgoto. (B) Fotografia da montagem desenvolvida.
163
Capítulo 6
6.2.3. Procedimento experimental
O ciclo analítico proposto para o estudo da cinética da reacção de oxidação do
ácido caféico catalisada pela tirosinase era composto por 5 etapas (Tabela 6.1.). Assim,
no início de cada ciclo 10 µL da solução de ácido caféico (ou mistura do ácido caféico e
inibidor) e 20 µL da solução de tirosinase eram aspirados para o tubo de armazenamento
(etapas a-b). Após a inversão do sentido de fluxo, a zona composta era propulsionada
através do tubo de reacção até ao detector (etapa c), seguido de um período de paragem
de 60 segundos com aquisição do sinal analítico (etapa d). O ciclo terminava com a
limpeza da célula de fluxo por propulsão da solução tampão transportadora (etapa e).
Tabela 6.1. Protocolo analítico para o estudo da cinética de oxidação do ácido caféico pela
tirosinase e sua inibição em sistemas aquosos contendo LI/solvente orgânico
Etapa
Volume (µ
µL)
Descrição
0,8
10
Aspiração do ácido caféico/mistura
1,50
0,8
20
Aspiração da enzima para o TA
18
2
600
Propulsão do conteúdo do TA até ao
Posição da
Tempo de
válvula
operação (s)
a
7
0,75
b
8
c
9
Caudal
-1
(mL min )
de ácido caféico e inibidor para o TA
detector
d
9
60
-
-
Período de paragem com aquisição
e
9
75
3
3750
Propulsão do líquido transportador
do sinal
para lavar a célula de fluxo
6.2.3.1. Determinação das velocidades de reacção
Os segmentos de solução de ácido caféico e de enzima eram transportados até
ao detector (etapa c) para a monitorização da degradação do ácido caféico no
comprimento de onda correspondente à absorção máxima (311 nm). Esta monitorização
(Figura 6.3.) ocorria durante o período de paragem de fluxo de 60 segundos (etapa d),
com leituras de absorvância contínuas (4 leituras por segundo). Após o término do tempo
de paragem, a bomba peristáltica era reactivada e por propulsão do transportador o
conteúdo da célula de fluxo era enviado para o esgoto, dando início a um novo ciclo
analítico. No período de paragem de fluxo, foi escolhido um intervalo fixo de aquisição de
164
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
dados (20-60 segundos), para o qual o declive da recta era calculado, avaliando-se assim
a velocidade de reacção (-dA/dt).
As velocidades de reacção (expressas em unidades de ∆UA s-1) eram calculadas
segundo uma cinética de ordem zero pela regressão linear simples aplicando o método
dos mínimos quadrados sobre os dados obtidos durante esse período. Esta relação era
considerada linear após uma inspecção visual dos gráficos, para um número de pontos
superior a 50, e quando o coeficiente de correlação era superior a 0,995.
Os parâmetros cinéticos, constante aparente de Michaelis-Menten (KMap) e a
velocidade máxima (Vmaxap) foram obtidos através de uma regressão não linear do gráfico
das velocidades iniciais (V0 - ∆UA s-1) versus a concentração de substrato ([S]), utilizando
o programa GraphPad Prism 4 para Windows. Aquando da monitorização da degradação
do ácido caféico, os valores de V0 eram determinados a tempos de reacção curtos em
quadruplicado para cada [S].
Absorvância
1,000
período de determinação cinética
0,800
tempo de espera
0,600
cálculo do declive
Branco
0,400
Padrão de ácido
caféico
0,200
0,000
0
20
40
60
80
100
Tempo / s
Figura 6.3. Registo obtido da oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase em sistemas
aquosos contendo LI durante os ensaios. Os brancos são realizados na ausência da enzima. A
-1
concentração de substrato é igual a 0,053 mmol L .
165
Capítulo 6
6.3. Resultados e sua discussão
A adequabilidade dos líquidos iónicos como meio reaccional das reacções
catalisadas pela tirosinase foi avaliada na oxidação de um substrato com baixa
solubilidade em água, o ácido caféico (Figura 6.4.). Recorrendo a um LI miscível com a
água, [bmim][BF4], como componente não aquoso do meio reaccional, conseguia-se a
solubilização do ácido caféico.
O
O
OH
HO
Tirosinase + O2
Sistema [bmim][BF4]/tampão
OH
OH
O
O
Figura 6.4. Oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase com formação da o-quinona
correspondente.
Antes da optimização do sistema SIA, efectuou-se um ensaio discreto que
consistiu na incubação do ácido caféico, dissolvido numa mistura de LI/tampão 1:1, com
a tirosinase por um período de 10 minutos. Da incubação resultaram mudanças
características no espectro de ultravioleta-visível (Figura 6.5.), as quais não ocorrem na
ausência de enzima ou do ácido caféico. Foram observados dois pontos isosbéticos nos
comprimentos de onda de 267 e 339 nm, com uma diminuição acentuada da absorvãncia
a 311 nm e um aumento ligeiro da mesma no intervalo de 400-450 nm. Este último
aumento é devido à formação das o-quinonas características [26]. No entanto, a
aplicabilidade de métodos baseados na determinação das o-quinonas é limitada dada a
instabilidade química das o-quinonas e a interferência da absorção de intermediários ou
de produtos formados [27]. Desta forma, optou-se por acompanhar o decurso desta
reacção através da monitorização da degradação do substrato no comprimento de onda
de absorção máxima (λmax) [24]. Para a presente aplicação foi então seleccionado 311 nm
para efectuar a avaliação da oxidação biocatalítica do ácido caféico no sistema SIA.
166
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
2,5
Absorvância
2
1,5
1
0,5
0
200
300
400
500
600
Comprimento de onda (nm)
-1
Figura 6.5. Espectro de ultravioleta-visível do ácido caféico (0,55 mmol L ) dissolvido na mistura
[bmim][BF4]/tampão 1:1 antes (linha tracejada) e após (linha contínua) a adição da tirosinase (200
-1
U mL ). Todos os ensaios foram efectuados a 25ºC usando uma cuvete termostatizada, com
agitação magnética e com um percurso óptico de 1 cm. Os varrimentos foram efectuados no
intervalo de comprimento de onda de 200-600nm. As setas ilustram o aumento ou a diminuição da
absorvância.
6.3.1. Optimização do sistema
O intervalo estudado das diferentes variáveis bem como os valores seleccionados
para a avaliação da cinética de degradação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas
aquosos contendo LI encontram-se sumarizados na Tabela 6.2.
Para determinar a concentração de cada reagente na célula de fluxo, foram
conduzidos ensaios de dispersão com corantes [28] para determinar os factores de
diluição dos reagentes, usando o protocolo definido na Tabela 6.1. Desta forma, todas as
concentrações apresentadas neste trabalho referem-se às concentrações na célula de
fluxo. Estes ensaios mostraram uma completa sobreposição das zonas correspondentes
ao substrato ácido caféico e à enzima tirosinase na célula de fluxo, o que confirmou a
mistura eficiente destes dois reagentes [29].
167
Capítulo 6
Tabela 6.2. Intervalos de valores estudados na optimização dos diferentes parâmetros do sistema
e os valores escolhidos para a sua operação
Parâmetro
Intervalo
Valor seleccionado
Intervalo de tempo de propulsão da zona
15 – 22
18
Concentração da enzima (U mL )
11 – 217
54
pH da solução tampão transportadora
5,5 – 7,5
6,5
Temperatura (ºC)
25 – 50
30
Período de tempo de aquisição do sinal (s)
0 – 120
20 – 60
reaccional em direcção ao detector
-1
6.3.1.1. Ordem de aspiração e volume de solução enviado para o detector
Em relação ao protocolo analítico, as soluções foram aspiradas para o TA na
seguinte ordem: substrato, dissolvido em misturas [bmim][BF4]/tampão em diferentes
proporções, e a enzima. A enzima deve ser o último reagente a ser aspirado para o TA
de forma a minimizar a sua diluição. Por outro lado, a alíquota de ácido caféico em
misturas [bmim][BF4]/tampão devido à sua viscosidade deve apresentar volume reduzido,
de forma a permitir uma mistura efectiva das alíquotas aspiradas. Adicionalmente, foi
utilizado um tubo de reacção de 50 cm, com configuração em figuras de oito, para
promover a mistura eficiente das duas alíquotas e desta forma evitar a formação de uma
zona de reacção não homogénea. Assim, o ciclo analítico adoptado envolvia a aspiração
de 10 µL do substrato dissolvido numa mistura [bmim][BF4]/tampão e 20 µL de enzima,
uma vez que esta sequência possibilitava a obtenção de sinais analíticos repetíveis com
a forma de picos únicos.
Posteriormente, foram efectuados estudos preliminares de forma a averiguar a
influência do volume de solução propulsionado para o detector (etapa c, Tabela 6.1)
sobre a velocidade da reacção. Para o efeito, foram aspirados 10 µL de uma solução
padrão de ácido caféico (0,311 mmol L-1) e 20 µL de solução de tirosinase (109 U mL-1)
para o TA. Estas zonas eram depois enviadas para o detector durante intervalos de
tempo diferentes, entre 15 e 22 segundos, com o objectivo de garantir que a zona
composta ficasse aprisionada dentro da célula de fluxo. Em cada um destes ensaios, a
168
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
zona composta era mantida dentro da célula de fluxo por um período de 60 segundos e o
intervalo 20-60 segundos era considerado para o cálculo do declive (Figura 6.3.). Os
resultados obtidos para os tempos estudados estão ilustrados na Figura 6.6. Para os
ensaios seguintes, o tempo de propulsão da zona reaccional em direcção ao detector foi
fixado em 18 segundos (correspondente a um volume de 600 µL), já que este
proporcionava o declive mais acentuado.
0,0070
V0 / ∆A s-1
0,0060
0,0050
0,0040
0,0030
0,0020
0,0010
15
16
17
18
19
20
21
22
Tempo (s)
-1
Figura 6.6. Velocidades de reacção (∆UA s ) (n=3; RSD < 3,0%) obtidas com uma solução
-1
padrão de ácido caféico 0,311 mmol L para diferentes intervalos de tempo de propulsão da zona
reaccional para o detector antes da aquisição do sinal.
6.3.1.2. Concentração de enzima
A concentração de enzima foi estudada entre 11 e 217 U mL-1, mantendo as
condições experimentais descritas anteriormente. Os resultados obtidos para a solução
padrão de ácido caféico 0,053 mmol L-1 estão apresentados na Figura 6.7. A velocidade
de reacção aumentava proporcionalmente com o aumento da concentração de enzima
até 54 U mL-1 e para concentrações superiores era atingida uma estabilização. Para a
concentração de enzima mais elevada (217 U mL-1), a relação absorvância/tempo não
era linear durante o intervalo de tempo de monitorização do sinal analítico. Os resultados
obtidos para as restantes soluções padrão de ácido caféico foram similares. Neste
sentido e, tendo como pressuposto que uma cinética de ordem zero é atingida quando a
concentração de enzima é limitante e que a velocidade de reacção deve ser proporcional
169
Capítulo 6
à concentração enzimática para a estimação da cinética de Michaelis-Menten [30], foi
seleccionada a concentração de enzima igual a 54 U mL-1.
0,0018
0,0016
V0 / ∆A s-1
0,0014
0,0012
0,0010
0,0008
0,0006
0,0004
0,0002
10
40
70
100
130
160
190
220
-1
Concentração de tirosinase (U mL )
-1
Figura 6.7. Velocidades de reacção (∆UA s ) (n=3; RSD < 3,9%) obtidas com uma solução
-1
padrão de ácido caféico 0,053 mmol L utilizando diferentes concentrações de enzima.
6.3.1.3. pH e temperatura reaccional
Outros factores que influenciam a actividade enzimática são o pH do meio
reaccional e a temperatura.
Relativamente ao primeiro, foram efectuados estudos no intervalo 5,5 – 7,5
(Figura 6.8.), uma vez que o pH óptimo da tirosinase é entre 6 e 7 (Sigma, Informação do
Produto). Foram adoptadas como condições experimentais: concentrações de ácido
caféico entre 0,026 e 0,158 mmol L-1, concentração de enzima 54 U mL-1 e uma
temperatura igual a 25ºC. Verificou-se um aumento da velocidade de reacção até um pH
igual a 6,5 unidades e o seu decréscimo para valores de pH superiores. Deste modo,
uma solução tampão com pH igual a 6,5 unidades foi usada para os ensaios seguintes.
170
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
0,0045
V0 / ∆A s-1
0,0040
0,0035
0,0030
0,0025
0,0020
0,0015
0,0010
0,0005
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
-1
Concentração de ácido caféico (mmol L )
-1
Figura 6.8. Velocidades de reacção (∆UA s ) obtidas no intervalo de concentrações de ácido
-1
caféico 0,026 – 0,158 mmol L a pH igual a 5,5 ( ); 6,0 ( ); 6,5 ( ); 7,0 ( x ) e 7,5 (
) unidades.
Relativamente ao segundo factor, variou-se a temperatura do suporte da célula de
fluxo entre 25 e 50ºC (Figura 6.9.) e mantiveram-se as condições experimentais
anteriores. Neste caso, foram tomados em atenção dois aspectos: 1) a existência de uma
relação linear entre a absorvância e o tempo durante o período de aquisição do sinal
analítico e 2) a influência da temperatura na velocidade de reacção. Para temperaturas
superiores a 30ºC, não havia linearidade entre a absorvância e o tempo para o intervalo
de aquisição de sinal usado nos ensaios de optimização anteriores (20-60s) e como tal,
para este estudo, foi considerado o intervalo de tempo de aquisição 20-40s. Verificou-se
que um aumento da temperatura até 30ºC conduzia a um aumento acentuado da
velocidade de reacção enzimática. O aumento das velocidades de reacção obtido a uma
temperatura igual a 40ºC para as soluções padrão de ácido caféico de concentrações
0,105 e 0,158 mmol L-1, comparativamente ao de 30ºC, não justificava o seu uso. Acima
dos 40ºC, reportou-se um decréscimo da actividade enzimática, provavelmente devido a
algum grau de desnaturação da enzima. Desta forma, seleccionou-se a temperatura de
30ºC para prosseguir os ensaios.
171
Capítulo 6
0,0060
V0 / ∆A s-1
0,0050
0,0040
0,0030
0,0020
0,0010
0,0000
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
Concentração de ácido caféico (mmol L-1)
-1
Figura 6.9. Velocidades de reacção (∆UA s ) obtidas no intervalo de concentrações de ácido
-1
caféico 0,026 – 0,158 mmol L à temperatura de 25 ( ); 30 ( ); 40 ( ); 50 ºC ( x ).
6.3.2. Determinação dos parâmetros cinéticos da reacção de oxidação do ácido
caféico catalisada pela tirosinase em sistemas aquosos contendo LI/solvente
orgânico
Nas condições optimizadas, foram determinadas as constantes cinéticas da
oxidação biocatalítica do ácido caféico. Para estudar a influência da concentração do LI
usado no comportamento cinético da tirosinase, a reacção ocorreu na presença de
concentrações crescentes de [bmim][BF4] (Tabela 6.3.).
Tabela 6.3. Constantes cinéticas obtidas na oxidação biocatalítica do ácido caféico pela tirosinase
em sistemas aquosos contendo LI/solvente orgânico
Meio de reacção
LI:tampão (1:1)
LI:tampão (1,5:1) LI:tampão (2:1)
Metanol:tampão (1:1)
KM ap (mmol L-1)
0,13 ± 0,02
0,24 ± 0,03
0,29 ± 0,04
0,15 ± 0,02
Vmax ap (∆A s-1)
0,0064 ± 0,0004
0,0077 ± 0,0006
0,0069 ± 0,0005
0,0040 ± 0,0003
Vmax ap / KM ap
0,05
0,03
0,02
0,03
172
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
A relação entre a velocidade de reacção e a concentração de ácido caféico ([S])
foi determinada variando a concentração de substrato entre 0,026 e 0,368 mmol L-1, com
uma concentração de tirosinase igual a 54 U mL-1. Os gráficos correspondentes são
exibidos na Figura 6.10.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
Figura 6.10. Gráficos de Michaelis-Menten em sistemas aquosos contendo LI/solvente orgânico:
LI:tampão 1:1 (
); LI:tampão 1,5:1 (
); LI:tampão 2:1 (
) e metanol:tampão 1:1 (
).
Os valores de KMap representam a afinidade do substrato para a enzima e como tal
quanto menor for o KMap, maior será a afinidade. Assim, constatou-se que o ácido caféico
exibiu uma maior afinidade para a tirosinase no meio reaccional composto pela mistura
[bmim][BF4]/tampão
1:1
quando
comparado
com
os
que
apresentavam
uma
concentração superior de LI, de acordo com os valores de KMap de 0,13, 0,24 e 0,29 mmol
L-1 para as misturas [bmim][BF4]/tampão 1:1, 1,5:1 e 2:1, respectivamente (Tabela 6.3.).
Por outro lado, a eficiência catalítica, dada pela razão entre o Vmaxap / KMap, foi também
estimada, constituindo um indicador da capacidade da enzima para converter o substrato
nos produtos finais correspondentes. Uma vez mais, a eficiência catalítica da tirosinase
no meio reaccional constituído pela mistura [bmim][BF4]/tampão 1:1 foi superior à obtida
nos meios com maior teor de LI. É importante salientar que a Vmaxap manteve-se
aproximadamente constante (Tabela 6.3.).
Estes resultados evidenciam que a tirosinase é activa neste LI e que
concentrações crescentes de [bmim][BF4] conduzem a uma redução da sua actividade.
173
Capítulo 6
Diversas propriedades dos LIs, tais como, polaridade, basicidade da ligação de
hidrogénio, nucleofilicidade do anião influem em grande extensão na actividade e
estabilidade das enzimas [31]. Neste caso, designadamente para a tirosinase, a
polaridade da ligação B-F no anião BF4- pode em parte contribuir para o decréscimo da
sua actividade, já que sendo a tirosinase uma enzima que contém cobre [32], existe a
possibilidade de ligação entre o ião flúor e o cobre no local activo enzima [14].
Adicionalmente, de acordo com a literatura, uma grande porção da energia de ligação ao
substrato envolve interacções com os grupos polares da cadeia lateral, longe do local de
reacção no núcleo fenólico ou difenólico, sendo estas interacções polares particularmente
responsáveis pela catálise enzimática [33]. Neste sentido, o LI usado, sendo miscível
com água, pode interferir com estas interacções polares. Por outro lado, dada a elevada
hidrofilicidade do líquido iónico, é provável que este penetre o microambiente aquoso que
rodeia as moléculas de enzima, podendo estabelecer interacções directas com a enzima
e conduzindo à sua inactivação. Este pressuposto vai ao encontro do reconhecimento da
existência de uma camada de água, designada de camada de hidratação, essencial à
actividade enzimática [34].
Assim, os resultados obtidos demonstraram uma eficiência máxima de catálise
enzimática
no
sistema
[bmim][BF4]/tampão
1:1,
seguidos
dos
sistemas
[bmim][BF4]/tampão 1,5:1 e [bmim][BF4]/tampão 2:1. De facto, tem sido reportado na
literatura o decréscimo da actividade da tirosinase e de outras enzimas com o aumento
do teor de LI [14, 35, 36].
Com o objectivo de se efectuar um estudo comparativo da actividade catalítica da
tirosinase nos sistemas aquosos contendo LI, foi avaliado o seu comportamento cinético
em meio de metanol, utilizando o mesmo módulo analítico e as mesmas condições
reaccionais quando o LI era empregue. Os resultados obtidos denotaram uma diminuição
da eficiência catalítica com uma redução efectiva da Vmaxap quando comparado com o
meio reaccional constituído pela mistura [bmim][BF4]/tampão 1:1 (Tabela 6.3.). Sabe-se
que a estrutura da enzima e a actividade catalítica depende do papel directo e indirecto
exercido pelas moléculas de água sobre todas as interacções, incluindo pontes de
hidrogénio, ligações iónicas, hidrofóbicas e forças de van der Waals [37]. Neste sentido, o
solvente orgânico utilizado pode modificar a estrutura proteica nativa e destruir a
actividade enzimática numa extensão maior que o LI usado. Deste modo, estes ensaios
reforçaram a utilização dos LIs como meio reaccional para o estudo da biocatálise da
tirosinase em substituição dos solventes orgânicos convencionais.
174
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
6.3.3. Avaliação do efeito dos inibidores sobre a actividade difenolase da tirosinase
em sistemas aquosos contendo LI
Os estudos de inibição podem fornecer informações mecanísticas dos processos
bioquímicos catalisados por enzimas.
O ácido trans-cinâmico e os derivados do ácido benzóico têm sido reportados
como inibidores da tirosinase usando L-3,4-dihidroxifenilalanina como substrato, em meio
tamponado de fosfatos [38, 39]. Neste sentido, pretendeu-se avaliar a eficácia de inibição
destes compostos usando o ácido caféico como substrato nos sistemas aquosos
contendo o LI utilizado. Deste modo, considerando o ácido trans-cinâmico e o ácido 3,4dihidroxibenzóico como efectores, foi avaliado o impacto destes compostos sobre a
actividade da tirosinase na oxidação do ácido caféico.
Os inibidores dissolvidos na mistura [bmim][BF4]/tampão 1:1 foram previamente
ensaiados na ausência do ácido caféico para aferir a possibilidade de interferência no
comprimento de onda da determinação (311 nm). Os resultados obtidos mostraram que
os compostos não interferiam na determinação do ácido caféico, pois apresentavam um
valor de absorvância baixo que permanecia constante ao longo do período de paragem
no detector (Figura 6.11.).
0,200
0,200
B
A
0,150
Absorvância
Absorvância
0,150
0,100
0,050
0,100
0,050
0,000
0,000
0
10
20
30
Tempo (s)
40
50
60
0
10
20
30
Tempo(s)
40
50
60
Figura 6.11. Monitorização da absorvância ao longo do tempo da reacção da tirosinase com os
-1
inibidores (0,263 mmol L ) testados (A – ácido trans-cinâmico; B - ácido 3,4-dihidroxibenzóico) na
ausência do ácido caféico. Os ensaios foram realizados em triplicado.
175
Capítulo 6
Seguidamente, diferentes concentrações de inibidores eram misturadas com
diferentes concentrações de substrato. As soluções resultantes eram aspiradas através
da válvula selectora de fluidos (etapa a, Tabela 6.1.) e o ciclo analítico prosseguia
conforme descrito anteriormente.
As actividades medidas com as misturas de ácido caféico e inibidores eram
consideradas como uma percentagem relativa da actividade de tirosinase obtida na
ausência dos inibidores, correspondente a 0 % de inibição. Assim, a eficiência de inibição
da tirosinase era expressa como a percentagem de inibição da acção da tirosinase sobre
o ácido caféico. Os resultados obtidos para os compostos testados estão representados
na Figura 6.12.
Ambos os inibidores exibiram uma maior eficiência de inibição com o aumento da
sua concentração (até 0,395 mmol L-1) para cada concentração de ácido caféico testada.
Porém, o comportamento dos compostos foi diferente. No que respeita ao ácido transcinâmico, os resultados demonstraram um aumento concomitante da eficiência de
inibição com o aumento da concentração de ácido caféico. Na realidade, estes resultados
apontam para uma inibição acompetitiva, que ocorre quando a concentração de substrato
é elevada [30]. Neste caso, o ácido trans-cinâmico apenas exerceu efeito inibitório sobre
a tirosinase para concentrações de ácido de caféico iguais ou superiores a 0,105 mmol L. Com o aumento da concentração do ácido trans-cinâmico, os valores de KMap e Vmaxap
1
diminuíam, mas a razão entre o KMap / Vmaxap era constante e a constante de inibição (Ki)
obtida foi igual a 0,230 mmol L-1.
No caso do ácido 3,4-dihidroxibenzóico, foi observada uma reposta distinta com o
aumento da concentração do ácido caféico. A eficiência de inibição do ácido 3,4dihidroxibenzóico diminuía com o aumento da concentração de ácido caféico.
B
Inibição da tirosinase (%)
Inibição da tirosinase (% )
A
Ácido trans-cinâmico (mmol L-1)
Ácido caféico (mmol L-1)
Ácido 3,4-dihidroxibenzóico (mmol L-1)
Ácido caféico (mmol L-1)
Figura 6.12. Avaliação da eficiência de inibição da tirosinase (%) apresentada pelo ácido transcinâmico (A) e pelo ácido 3,4-dihidroxibenzóico (B).
176
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
Adicionalmente, o efeito dos inibidores foi estudado para uma concentração fixa
de ácido caféico (0,105 mmol L-1). À medida que se aumentava a concentração de
inibidor (até 0,789 mmol L-1), a actividade enzimática decaía gradualmente (Figura 6.13.).
O IC25, que corresponde à concentração de inibidor que produz uma eficiência de inibição
de 25%, foi de 0,514 e 0,560 mmol L-1 para o ácido trans-cinâmico e ácido 3,4dihidroxibenzóico, respectivamente, ilustrando uma maior capacidade de inibição para o
derivado do ácido cinâmico.
% actividade da tirosinase
100,00
90,00
80,00
70,00
60,00
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
-1
Inibidor (mmol L )
Figura 6.13. Influência da concentração dos inibidores na actividade da tirosinase: ( ) ácido transcinâmico; ( ) ácido 3,4-dihidroxibenzóico.
177
Capítulo 6
6.4. Conclusões
Os resultados obtidos substanciam a utilidade e a fiabilidade do procedimento
automático desenvolvido como uma alternativa robusta aos procedimentos discretos
habitualmente utilizados, para efectuar estudos cinéticos de reacções enzimáticas
envolvendo substratos com pouca solubilidade em água e avaliar o efeito de potenciais
inbidores em meios reaccionais constituídos por misturas de LI/tampão.
A abordagem apresentada exibe vantagens em termos de aplicabilidade em rotina
e segurança humana e ambiental já que exigem uma intervenção limitada do operador e
envolvem um consumo reduzido de LI e dos restantes reagentes e a produção de
pequenas quantidades de efluente. Os volumes reduzidos e o controlo exímio da
dispersão com a metodologia SIA permitiram eliminar a interferência da viscosidade do LI
no grau de mistura das soluções aspiradas bem como na detecção espectrofotométrica.
Adicionalmente, o controlo estrito das condições reaccionais com uma elevada
reprodutibilidade e precisão, em oposição às metodologias discretas, permite que as
condições do ensaio sejam iguais ao longo das análises, o que se reveste de extrema
importância em ensaios cinéticos.
O procedimento desenvolvido foi aplicado na determinação de parâmetros
cinéticos da reacção de oxidação do ácido caféico catalisada pela tirosinase em misturas
de [bmim][BF4]/tampão. Os resultados obtidos demonstraram uma eficiência catalítica
superior no meio de LI comparativamente ao meio metanólico, que confirmou o LI em
estudo como uma alternativa vantajosa ao uso do metanol. Por outro lado, verificou-se
um decréscimo da actividade da tirosinase com o aumento da concentração de
[bmim][BF4], decorrente de eventuais alterações na conformação da enzima ou
modificações no ambiente catalítico induzidas pelo LI. Adicionalmente, os análogos
testados do substrato ácido caféico, ácido trans-cinâmico e ácido 3,4-dihidroxibenzóico,
demonstraram ser inibidores efectivos da tirosinase no meio aquoso contendo LI.
Os resultados obtidos confirmam os líquidos iónicos como meio reaccional
alternativo aos solventes orgânicos, geralmente tóxicos e inflamáveis, para estudos de
biocatálise envolvendo oxidoredutases, ao permitirem uma maior actividade enzimática e
por outro lado reforçam a sua capacidade de dissolver uma variedade ampla de
compostos com baixa solubilidade em água.
A metodologia proposta constitui assim uma ferramenta importante para a
automatização de procedimentos enzimáticos em LIs, sendo menos nociva para o meio
ambiente e mais eficiente que as metodologias discretas, as quais dispõem de um menor
grau de automatização e consequentemente com maior probabilidade de introdução de
erros com a intervenção do operador.
178
Cinética da oxidação do ácido caféico pela tirosinase em sistemas com LI
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Capítulo 6
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182
CAPÍTULO 7
Avaliação do efeito de diferentes
derivados fenólicos no sistema de QL
luminol-H2O2-peroxidase
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
7.1. Introdução
O presente trabalho envolve a avaliação do efeito de diferentes derivados
fenólicos no sistema de quimiluminescência (QL) composto por luminol e peróxido de
hidrogénio utilizando a enzima peroxidase em solução como biocatalisador da reacção.
Para o efeito foi desenvolvida uma montagem com base nas técnicas SIA-MSFIA, para
implementar a reacção em linha do derivado fenólico com o peróxido de hidrogénio e a
peroxidase,
seguida
da
mistura
por
confluência
de
zonas
com
o
reagente
quimiluminogénico. Após optimização e avaliação do efeito indutor/inibidor sobre o
sistema de QL descrito de cada subgrupo fenólico estudado, procedeu-se à determinação
dos teores de polifenóis e de fenol em vinhos e águas, respectivamente.
7.1.1. Desenvolvimento de uma metodologia automática para a avaliação do efeito
de diferentes derivados fenólicos no sistema de quimiluminescência composto por
luminol, peróxido de hidrogénio e peroxidase
O sistema de quimiluminescência (QL) luminol-peróxido de hidrogénio (H2O2)peroxidase (POD) tem despertado um interesse continuo em métodos analíticos com
vista à descoberta de compostos que possam actuar como indutores ou inibidores deste
sistema [1]. Os compostos fenólicos têm sido largamente explorados como substratos
deste sistema de QL em metodologias discretas e tem sido associado o efeito de
indução/inibição de vários derivados fenólicos a diferenças estruturais existentes [2]. Por
outro lado, o mesmo composto pode apresentar um efeito de indução ou de inibição
dependendo das condições reaccionais, como é o caso do asulam [3, 4].
Apesar de se obter uma maior selectividade e sensibilidade nas metodologias
baseadas em QL, a sua implementação em modo discreto carece de repetibilidade e
reprodutibilidade devido à necessidade de se realizar uma rápida mistura com uma
detecção imediata. Neste sentido, o estudo do efeito de compostos sobre o sistema
descrito poderá beneficiar com o controlo estrito e preciso na manipulação fluídica e da
facilidade de promover diferentes condições reaccionais no mesmo módulo analítico, com
a sua implementação em metodologias automáticas de fluxo.
O efeito dos compostos fenólicos sobre o sistema luminol-H2O2-POD nunca foi
averiguado recorrendo a metodologias automáticas de fluxo. Os derivados polifenólicos
encontram-se em abundância em várias plantas, frutas e outros alimentos e apresentam
propriedades antioxidantes, podendo intervir na prevenção de doenças derivadas do
stress oxidativo [5]. Por outro lado, estes compostos constituem um importante grupo de
185
Capítulo 7
poluentes, podendo ser encontrados nas águas residuais de diferentes ramos da
indústria química e petroquímica e da indústria farmacêutica [6].
Encontram-se descritas na literatura metodologias FIA, baseadas no sistema de
QL luminol-H2O2-POD, mas para a determinação da capacidade antioxidante de azeites
[7], de pesticidas como o asulam [3, 4] e o primicarb [8].
Assim, para a implementação da avaliação do efeito dos compostos fenólicos
sobre o sistema QL descrito em metodologias de fluxo, foi desenvolvido um sistema
hifenizado SIA-MSFIA (análise por injecção em fluxo baseada em multisseringa, do inglês
“Multisyringe
flow
injection
analysis”).
As
características
da
técnica
MSFIA,
nomeadamente a operação multi-canal da multisseringa com um intervalo amplo de
caudais, permitem preencher os requisitos das reacções quimiluminimétricas, ao permitir
a detecção imediata do sinal analítico após adição do reagente de QL. A combinação da
técnica MSFIA com a detecção quimiluminimétrica [9, 10], caracterizada por elevada
sensibilidade e selectividade, amplos intervalos de zona linear, simplicidade e com
instrumentação de baixo custo, apresenta um potencial analítico elevado num leque
alargado de aplicações [11].
A montagem desenvolvida permitia a implementação da reacção em linha do
H2O2, do derivado fenólico e da POD, por intermédio da válvula selectora de fluidos, e a
subsequente reacção quimiluminimétrica com o luminol, graças à multisseringa.
O procedimento automático proposto, baseado na acção indutora ou inibidora
sobre o sistema de QL, foi aplicado para além do fenol aos subgrupos dos clorofenóis,
nitrofenóis, metilfenóis e polifenóis. O método desenvolvido foi depois aplicado à
determinação da capacidade antioxidante em vinhos e do teor de fenol em águas de
origens diferentes.
186
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
7.2. Material e métodos
7.2.1. Reagentes e soluções
A solução de transporte empregue era uma solução tampão preparada com
cloridrato de Tris-(hidroximetil)-aminometano (Tris HCl, Sigma-Aldrich) 100 mmol L-1 e o
pH desta solução era ajustado a 8,5 unidades com uma solução de hidróxido de sódio 2
mol L-1 (Pronalab).
A solução de POD (EC 1.11.1.7, HRP da espécie Amoracia rusticana, do tipo VIA, com actividade específica de 1280 U mg-1 de sólido, Sigma-Aldrich) 10 U mL-1 era
preparada diariamente na solução tampão por diluição apropriada da respectiva solução
mãe, a qual era estável ao longo de 1 mês quando armazenada a 4ºC.
A solução mãe do reagente quimiluminogénico 3-aminoftalhidrazida (luminol,
Sigma) de concentração 10 mmol L-1 era preparada dissolvendo a quantidade apropriada
na solução tampão e armazenada a 4ºC. A solução de trabalho de luminol (0,1 mmol L-1)
era preparada diariamente por diluição apropriada da solução mãe na solução tampão.
A solução de peróxido de hidrogénio (2,0 mmol L-1) era preparada diariamente por
diluição apropriada da solução comercial 30% (v/v) (Panreac) na solução tampão.
As soluções padrão de fenol (Sigma) e dos derivados fenólicos (2-clorofenol, 4clorofenol, 2,4-diclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, pentaclorofenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol,
2,4-dinitrofenol, 2,3-dimetilfenol, 3,4-dimetilfenol, ácido gálhico e ácido tânico, Sigma)
eram preparadas diariamente na solução tampão ou numa solução aquosa de
dimetilsulfóxido (DMSO) 25% (v/v) para os compostos com baixa solubilidade em água.
Todas estas soluções eram protegidas da luz no decorrer dos ensaios.
Para a determinação do teor de polifenóis em vinhos, foram utilizadas como
amostras diferentes tipos de vinho espanhóis (branco, tinto e rosé) e um extracto
alcoólico (50% (v/v)) de grainhas de uvas.
Para a determinação do teor de fenol em águas, foram utilizadas águas de origens
diferentes: água da torneira, de poço e lixiviados. A água da torneira foi colhida na
Universidade das Ilhas Baleares (Espanha). As águas de poço e lixiviados foram colhidas
nas imediações de diferentes estações de tratamento de resíduos sólidos urbanos (Ilhas
Baleares).
187
Capítulo 7
7.2.2. Aparelhagem
O sistema automático de fluxo desenvolvido para a avaliação do efeito de
diferentes derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-POD encontra-se
representado na Figura 7.1.
O tubo de armazenamento, ligado à seringa 2 (S2, Figura 7.2.), apresentava um
comprimento de 2,5 m com diâmetro interno de 1,5 mm. A tubagem entre os frascos dos
reagentes e as seringas apresentavam também um diâmetro interno de 1,5 mm, para
evitar contrapressão ou vácuo para caudais elevados. O reactor apresentava um
comprimento de 100 cm com configuração em figuras de oito. O tubo de reacção para a
reacção de QL antes da sua detecção apresentava um comprimento de 4 cm.
Todos os outros componentes constantes da montagem (Figura 7.1.),
designadamente multisseringa, válvula selectora de fluidos, luminómetro e sistema de
aquisição, foram previamente descritos no Capítulo 2.
VS
E
(A)
5
6
TA
4
3
7
8
1
2
L1
A
R3
C1
On
Off
V1
V2
V3
V4
S1
S1
S1
S2
S3
S4
188
T
R1
R2
C2
L2
PM
E
MS
T
Célula de fluxo
RE
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
(B)
Figura 7.1. (A) Representação esquemática do módulo analítico desenvolvido para a avaliação do
efeito de diferentes derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-POD: MS – Módulo de
multisseringa; S1-S4 – Seringas (S1 = 10 mL, S2 = S3 = 5 mL, S4 = 1 mL); V1-V4 – Válvulas
solenóides de três vias; C1 e C2 – Confluências; VS – Válvula selectora de fluidos; TA – Tubo de
armazenamento; RE – Reactor; L1 e L2 – Tubagem de ligação (20 e 4 cm); PM –
−1
Fotomultiplicador; T – Solução transportadora de tampão Tris HCl 100 mmol L
−1
pH 8,5; R1 –
-1
Solução de luminol 0,1 mmol L ; R2 – Solução de POD 10 U mL ; R3 – Solução de H2O2 2,0
−1
mmol L ; A – Amostra; E – Esgoto. As opções de comutação das válvulas solenóides foram
classificadas com as linhas “On/Off”. A linha “Off” correspondia ao reservatório das soluções e a
linha “On” dizia respeito à rede de fluxo. As setas indicam o movimento do pistão. (B) Fotografia
da montagem desenvolvida.
7.2.3. Metodologias convencionais de comparação
Para a avaliação da exactidão dos resultados fornecidos pela metodologia SIAMSFIA, determinou-se o teor de polifenóis e de fenol em amostras de índole alimentar e
ambiental recorrendo às metodologias de referência, método de Folin-Ciocalteu (FC) [12]
e da 4-aminoantipirina [13], respectivamente.
O método de FC adoptado incluía um período de incubação de 30 minutos da
amostra de vinho e do reagente de FC em meio carbonatado antes da leitura
espectrofotométrica a 750 nm [12]. Para a quantificação foi utilizada uma curva de
calibração com uma solução de ácido tânico nas seguintes concentrações: 100, 200, 300,
189
Capítulo 7
400, 500 e 600 mg L-1 (Abs (U.A.) = 0,00086 (±0,00004) CÁcido
tânico
(mg L-1) + 0,015
(±0,016), R2=0,9988). O teor de polifenóis totais foi expresso em mg de ácido tânico/L.
No caso do método da 4-aminoantipirina era efectuada uma destilação prévia da
amostra de água para eliminação de interferentes, seguido do método fotométrico directo.
Este último consistia na reacção do fenol com a 4-aminoantipirina, a pH alcalino, na
presença do hexacianoferrato(III) de potássio e, após um período de incubação de 15
minutos, fazia-se a leitura espectrofotométrica a 500 nm [13]. Para a quantificação foi
utilizada uma curva de calibração com uma solução de fenol nas seguintes
concentrações: 1, 2, 3, 4 e 5 mg L-1 (Abs (U.A.) = 0,151 (±0,005) CFenol (mg L-1) + 0,002
(±0,016), R2=0,9997).
7.2.4. Procedimento experimental
O procedimento analítico efectuado no sistema SIA-MSFIA para a determinação
quimiluminimétrica do efeito dos diferentes compostos fenólicos no sistema luminol-H2O2POD encontra-se representado na Tabela 7.1. Assim, no início de cada ciclo eram
aspirados sequencialmente segmentos de amostra e de H2O2 para o TA através da
válvula de selecção (etapas 3-8). Após inversão do sentido de fluxo, o conjunto destas
zonas era propulsionado até ao reactor, com preenchimento do tubo L1 (etapa 10)
seguido da limpeza do sistema por propulsão do transportador (etapa 11). Depois a zona
de amostra e H2O2 (200 µL) e a enzima POD (40 µL) eram dispensadas simultaneamente
para o reactor (RE, Figura 7.1. A), ocorrendo a reacção em linha favorecida por um
período de paragem de 30 segundos (etapa 13). Posteriormente, esta zona reaccional
era misturada na confluência C2 com a solução de luminol, a um caudal total de 45 mL
min-1, com consequente aquisição do sinal de QL obtido (etapas 14-17). O ciclo terminava
com a limpeza das diferentes linhas da montagem e o enchimento das seringas com os
reagentes respectivos com V1-V4 off. Este ciclo era repetido 4 vezes para cada amostra.
O sinal de branco era obtido pela aspiração de água (ou DMSO:água 25:75 (v/v),
no caso dos compostos fenólicos menos solúveis em água) em substituição da amostra.
O potencial efeito exibido pelos diferentes compostos fenólicos testados no sistema de
QL descrito era então estimado através do aumento ou da diminuição da intensidade de
QL emitida relativamente ao sinal de branco, tendo por base de comparação o composto
fenólico mais simples, o fenol.
190
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
Tabela 7.1. Procedimento analítico efectuado na montagem SIA-MSFIA para a avaliação do efeito
de diferentes derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-POD
Etapa
Instrumento
1
2
a
Descrição
Iniciar loop: amostra
Multisseringa
3
-1
Dispensar 2000 µL a 5 ml min com V1
off, V2 off, V3 off e V4 off
Ajuste da posição da bomba de
pistão
Iniciar loop: inserção da amostra
4
Válvula de selecção
Válvula na posição 1
5
Multisseringa
Carregar 100 µL a 2 mL min com V1 off,
V2 on, V3 off e V4 off
6
Válvula de selecção
Válvula na posição 2
7
Multisseringa
Carregar 100 µL a 2 mL min com V1 off,
V2 on, V3 off e V4 off
8
-1
Aspiração de uma alíquota de
amostra (50 µL) para o TA
-1
Aspiração de uma alíquota de H2O2
(50 µL) para o TA
Repetir 4 vezes o loop: inserção da
amostra
9
Válvula de selecção
Válvula na posição 3
10
Multisseringa
Dispensar 300 µL a 5 mL min com V1
off, V2 on, V3 off e V4 off
11
Multisseringa
Dispensar 1000 µL a 5 mL min com V1
on, V2 off, V3 off e V4 off
12
Multisseringa
Dispensar 400 µL a 5 mL min com V1
off, V2 on, V3 off e V4 on
Mistura da amostra e do H2O2 (200
µL) com a peroxidase (40 µL) no
reactor
13
-
Tempo de espera de 30 s
Período de paragem de 30 s
14
Detector de QL
Aquisição do sinal analítico (Ganho=1000)
Medir a cada 0,10 s
15
Multisseringa
Dispensar 1000 µL a 30 mL min com V1
on, V2 off, V3 on e V4 off
16
Multisseringa
Dispensar 1000 µL a 5 mL min com V1
off, V2 on, V3 on e V4 off
17
Detector de QL
Parar a aquisição do sinal analítico
18
Multisseringa
Dispensar 1000 µL a 5 mL min com V1
on, V2 off, V3 off e V4 off
19
Multisseringa
Carregar as seringas a 15 mL min
V1 off, V2 off, V3 off e V4 off
20
a
Protocolo
-1
-1
-1
-1
Preenchimento do tubo L1
Lavagem do sistema com o
transportador
Mistura do segmento amostra, H2O2
e peroxidase com o luminol e
consequente reacção de QL
-1
-1
-1
com
Lavagem do sistema com o
transportador
Ajuste da posição da bomba de
pistão
Repetir 4 vezes do loop: amostra
Os caudais e os volumes indicados referem-se à seringa 1 (10 mL)
191
Capítulo 7
7.3. Resultados e sua discussão
7.3.1. Optimização do sistema
A reacção de emissão de luz pelo luminol [14] envolve a oxidação do luminol em
meio alcalino, produzindo 3-aminoftalato no estado excitado o qual emite radiação. Na
reacção de QL do luminol o oxidante mais utilizado é o H2O2, no entanto oxidantes como
o permanganato, hipoclorito ou iodo também podem ser usados. A reacção é catalisada
por iões metálicos como Fe (II), Cu (II), Co (II), ferrocianeto, alguns metalocomplexos
(hemina, hemoglobina) e enzimas (peroxidases) [15].
O módulo analítico com vista ao estudo do comportamento dos derivados
fenólicos no sistema luminol-H2O2-POD foi desenvolvido tendo em conta dois aspectos
importantes: a reacção em linha do derivado fenólico com o oxidante H2O2 e o catalisador
peroxidase e a subsequente reacção com o luminol na etapa de detecção. Encontra-se
descrito que os intermediários de POD oxidada formados na reacção com o derivado
fenólico e o substrato H2O2 catalisam a oxidação do luminol e a consequente produção
de radicais de luminol com um tempo de vida curto [16]. Desta forma, um indutor irá
acelerar a formação destes radicais de luminol através da sua reacção com os
intermediários de POD [17].
O procedimento analítico adoptado envolveu a optimização de diferentes
parâmetros que influenciam o desempenho do sistema, tais como o volume de amostra, a
estratégia de amostragem, o caudal durante a etapa de detecção, o período de paragem
no tubo de reacção bem como as concentrações dos reagentes. O principal objectivo
consistiu no estabelecimento de condições que conduzissem a um compromisso entre a
magnitude do sinal analítico de branco (na ausência do derivado fenólico) e a diferença
de intensidade de QL obtida com o branco e o derivado fenólico, uma vez que com o
método proposto pode haver uma potenciação ou uma inibição da resposta de QL.
7.3.1.1. Parâmetros físicos
Nas reacções de QL desenvolvidas em sistemas de fluxo, o caudal é um
parâmetro crítico, uma vez que afecta não só o tempo de reacção mas também o tempo
de residência da zona de reacção na célula de fluxo. As reacções de QL derivadas da
oxidação do luminol exibem uma velocidade de reacção elevada e como tal devem ser
efectuadas a caudais muitos elevados para permitirem uma aquisição adequada da
resposta quimiluminescente pelo fotomultiplicador, o qual deve estar o mais junto
possível da confluência C2, como demonstra a Figura 7.2. A. Assim, os caudais totais
192
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
empregues na etapa de detecção (Tabela 7.1, etapa 15) variaram entre 3,75 e 45 mL
min-1, sendo que um caudal total de propulsão de 45 mL min-1 (correspondente ao caudal
máximo resultante da activação simultânea de S1/V1 e S3/V3) foi escolhido para as
experiências posteriores. Verificou-se que caudais baixos conduziam a uma diminuição
drástica da sensibilidade.
O volume total de amostra, peróxido de hidrogénio e POD propulsionados para o
reactor (RE, Figura 7.1. A) foi estudado entre 60 e 480 µL (Figura 7.2. B). Este volume
era definido pela activação simultânea de S2/V2 e S4/V4 e como tal, por exemplo, um
volume total igual a 60 µL correspondia a 50 µL da mistura incubada de amostra e H2O2 e
10 µL da enzima POD. A intensidade de QL emitida aumentou com o volume até 240 µL.
Para volume superiores, os picos eram mais largos mas a intensidade de QL máxima era
similar dado que a diluição desta mistura devido ao fenómeno de dispersão era
desprezável. Desta forma, foi adoptado um volume de 240 µL para este segmento de
Intensidade de QL
mistura reaccional no reactor para os ensaios seguintes.
A
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0,0
7,5
15,0
22,5
Caudal (mL
37,5
45,0
B
3500
Intensidade de QL
30,0
min-1)
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
60
120
180
240
300
360
420
480
Volume do segmento de amostra, H2O2 e POD (µ
µ L)
Figura 7.2. Estudo da influência do caudal durante a etapa de detecção (A) e do volume de
amostra, H2O2 e POD injectado no reactor (B) no sinal analítico obtido (intensidade de QL).
−1
−1
−1
Condições experimentais: H2O2 1,0 mmol L , luminol 0,1 mmol L e POD 10 U mL .
193
Capítulo 7
Uma estratégia de paragem de fluxo no RE foi também estudada para promover a
reacção entre o derivado fenólico, o H2O2 e a POD, induzindo a formação de
intermediários de POD oxidada que irão reagir com o luminol. Com um período de
paragem de 30 segundos, a diferença de intensidade de QL emitida entre o branco e o
derivado fenólico aumentou cerca de 3,5 vezes e manteve-se constante para tempos de
paragem superiores (Figura 7.3.). Assim, foi implementada uma paragem de fluxo de 30
Diferença da
intensidade de QL
segundos.
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
30
60
90
120
Tempo de paragem no reactor (s)
Figura 7.3. Estudo da influência do tempo de paragem de fluxo no reactor no sinal analítico obtido.
−1
−1
−1
Condições experimentais: H2O2 1,0 mmol L , luminol 0,1 mmol L , POD 10 U mL
e fenol 1 mg
−1
L .
7.3.1.2. Parâmetros químicos
A influência da concentração dos diferentes reagentes envolvidos na diferença de
intensidade de QL obtida (Figura 7.4.) foi estudada nos intervalos de concentração de 1,0
x 10-2 - 1,0 mmol L-1 para a 3-aminoftalhidrazida (A), 0,1 - 5,0 mmol L-1 para o H2O2 (B) e
1 - 15 U mL-1 para a POD (C). Em todos os casos, a diferença de intensidade de QL
emitida aumentava com o aumento da concentração dos reagentes até que era atingida
uma estabilização. Desta forma, foram escolhidas como concentrações óptimas 0,1 e 2,0
mmol L-1 de luminol e H2O2, respectivamente, que proporcionavam melhores coeficientes
de variação e o mínimo consumo de reagentes. No caso do H2O2, o aumento da
intensidade de QL registado para concentrações superiores a 2 mmol L-1 não justificava o
seu uso (Figura 7.4. B). No caso da POD, a qual constitui um dos catalisadores mais
poderosos das reacções de QL [18], foi adoptada a concentração igual a 10 U mL-1 como
194
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
um compromisso entre a diferença de intensidade de QL dos sinais de branco e de
Diferença da
intensidade de QL
amostra e a própria magnitude do sinal de branco.
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
A
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
Diferença da
intensidade de QL
Concentração de luminol (mmol L-1)
B
2400
2100
1800
1500
1200
900
600
300
0
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
Diferença da
intensidade de QL
Concentração de H2O2 (mmol L-1)
C
3200
2800
2400
2000
1600
1200
800
400
0
0,0
2,5
5,0
7,5
Concentração de POD (U
10,0
12,5
15,0
mL-1)
Figura 7.4. Estudo da influência da concentração dos reagentes na diferença da intensidade de
QL: (A) luminol; (B) H2O2 e (C) POD.
195
Capítulo 7
7.3.2. Aplicação da metodologia SIA-MSFIA desenvolvida à avaliação do efeito dos
derivados fenólicos sobre o sistema luminol-H2O2-POD
O procedimento SIA-MSFIA desenvolvido foi aplicado ao fenol e aos seus
derivados, tais como clorofenóis, nitrofenóis, metilfenóis e polifenóis (Tabela 7.2.).
Os diferentes compostos fenólicos foram testados no intervalo de 1 a 100 mg L-1.
Os resultados obtidos demonstraram que o fenol e os clorofenóis exibem um efeito
indutor da resposta de QL (Figura 7.5.), como reportado anteriormente com metodologias
discretas [1, 2, 19]. O efeito do fenol no mesmo sistema de QL potenciado pelo piodofenol foi estudado e da pré-incubação da POD com o fenol em baixas concentrações
resultou igualmente uma potenciação da resposta QL [19]. Adicionalmente, o
pentaclorofenol não exerceu qualquer efeito no sistema de QL (Figura 7.5.). De facto,
geralmente os halogéneos diminuem a intensidade de QL [20]. O 4-clorofenol foi o
derivado fenólico que apresentou uma maior eficiência de potenciação. Por outro lado,
alguns clorofenóis apresentam baixa solubilidade em água e desse modo o uso de
solventes orgânicos como metanol ou DMSO é aconselhado. Deste modo, foi avaliada a
influência de diferentes misturas (v/v) de metanol ou DMSO na performance da reacção
de QL. Assim, com o procedimento descrito e nas condições optimizadas, o sinal de
branco obtido com água foi relacionado com o atingido com diferentes concentrações de
metanol e DMSO desde 25 a 100% (v/v). A taxa de inibição foi maior para o metanol
comparativamente ao DMSO, resultando por exemplo numa diminuição da resposta de
QL de 94% para uma solução de metanol 100% (v/v) contra 68% para DMSO 100% (v/v).
Neste sentido, como compromisso entre a solubilidade dos compostos ensaiados e a
interferência na metodologia, a concentração máxima de DMSO usada para a
solubilização do 2,4,6-triclorofenol e do pentaclorofenol foi igual a 25% (v/v). Neste
contexto, é de realçar a actividade enzimática remanescente da peroxidase neste
ambiente misto aquoso-orgânico, mesmo não se encontrando imobilizada, o que reforça
o facto de esta enzima apresentar uma capacidade intrínseca para manter-se numa
conformação cataliticamente activa em meios reaccionais adversos [21].
196
Intensidade de QL
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
12000
2900
2700
2500
2300
2100
1900
1700
1500
1300
1100
900
700
500
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Intensidade de QL
Concentração do derivado fenólico (µ
µmol L-1)
Fenol
10000
4-clorofenol
8000
2-clorofenol
6000
2,4-diclorofenol
2,4,6-triclorofenol
4000
pentaclorofenol
2000
0
0
200
400
600
800
Concentração do derivado fenólico (µ
µ mol L-1 )
Figura 7.5. Avaliação do efeito de potenciação do fenol e dos clorofenóis sobre o sistema luminolH2O2-POD.
Relativamente aos nitrofenóis, dimetilfenóis e polifenóis, estes actuam como
inibidores da resposta de QL (Figura 7.6.). O derivado fenólico 3,4-dimetilfenol, aqui
descrito como inibidor, foi apontado como indutor num trabalho em modo discreto [2]. Por
outro lado, os ácidos gálhico e tânico apresentaram um efeito de potenciação no sistema
de QL luminol-H2O2 catalisado pelo cobalto [22]. O subgrupo dos polifenóis apresentou a
maior eficiência de inibição seguido do subgrupo dos metilfenóis. Adicionalmente, o 2nitrofenol e o 4-nitrofenol apenas exerceram efeito inibitório para concentrações iguais ou
superiores a 100 mg L-1.
197
Capítulo 7
Intensidade de QL
3000
2500
2000
1500
1000
500
3000
0
0
20
40
60
80
100
Concentração do derivado fenólico (µ
µmol L )
Intensidade de QL
-1
2500
2-nitrofenol
4-nitrofenol
2000
2,4-nitrofenol
1500
2,3-dimetilfenol
3,4-dimetilfenol
1000
ácido gálhico
ácido tânico
500
0
0
200
400
600
Concentração do derivado fenólico
800
1000
(µ
µ mol L-1)
Figura 7.6. Avaliação do efeito de inibição dos nitrofenóis, dimetilfenóis e polifenóis sobre o
sistema luminol-H2O2-POD.
198
b
a
NO2
CH3
Cl
Cl
Cl
NO2
Cl
C2
Estrutura
CH3
CH3
Cl
C3
Dissolvidos em DMSO:água (25:75)
Para concentrações iguais ou superiores a 100 mg L-1
Ácido gálhico
Ácido tânico
Fenol
2-Clorofenol
4-Clorofenol
2,4-Diclorofenol
2,4,6-Triclorofenola
Pentaclorofenola
2-Nitrofenol
4-Nitrofenol
2,4-Dinitrofenol
2,3-Dimetilfenol
3,4-Dimetilfenol
Composto fenólico
CH3
NO2
NO2
Cl
Cl
Cl
Cl
C4
Cl
C5
Cl
Cl
C6
Tabela 7.2. Avaliação do comportamento de diversos compostos fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-POD
4
3
2
Inibidor
Inibidor
Indutor
Indutor
Indutor
Indutor
Indutor
Sem efeito
Inibidorb
Inibidorb
Inibidor
Inibidor
Inibidor
Efeito quimiluminescente
5
6
OH
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
199
Capítulo 7
7.3.3. Determinação do teor de compostos fenólicos em matrizes alimentar e
ambiental
O efeito exibido pelo conjunto de compostos fenólicos testados sobre o sistema de
QL estudado permitiu aplicar a metodologia na análise de amostras de natureza alimentar
(vinhos) e ambiental (águas).
A determinação dos polifenóis totais é uma prática analítica comum e é
normalmente apresentada como um índex, em vez da análise individual dos diferentes
compostos polifenólicos recorrendo ao HPLC [23]. De facto, o estudo de grupos de
compostos heterogéneos quer em termos de estrutura química quer em termos de
concentração e reactividade tem merecido especial ênfase em relação à análise
individual [24]. Na realidade, do primeiro resulta um conhecimento rápido e eficiente
quanto ao controlo de qualidade alimentar na monitorização de compostos prevalecentes
bem como quanto à ocorrência de contaminantes no campo ambiental, como é o caso do
grupo dos compostos fenólicos.
Nos últimos anos têm sido reportados métodos baseados em técnicas de fluxo,
com diferentes tipos de detecção, para a determinação do teor de polifenóis totais em
vinhos [25]. Estes métodos baseiam-se normalmente numa reacção de oxidação-redução
entre os compostos redutores presentes nos vinhos e um reagente oxidante, como
permanganato de potássio em meio ácido, complexos de tungstato-molibdato ou o catião
radical ABTS. Também têm sido descritos métodos amperométricos. A Tabela 7.3.
apresenta uma selecção de métodos de fluxo com vista à determinação da capacidade
antioxidante em vinhos.
200
Sistema de detecção
QL
QL
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Electroquímica
(amperometria)
Electroquímica
(amperometria)
Electroquímica
(amperometria)
Electroquímica
(amperometria)
Metodologia de fluxo
FIA
FIA
SIA
FIA
MSFIA
FIA
FIA
FIA
FIA
Biosensor de lacase
Reacção bienzimática (GOD e
POD) e formação do catião radical
ABTS
Reacção electroquímica
Reacção electroquímica
Reacção de Folin-Ciocalteu
Reacção com o catião radical
ABTS
Reacção de Folin-Ciocalteu
Sistema luminol-H2O2-cobalto
Oxidação com permanganato de
potássio em meio ácido
Ensaio
-
-
-
-
12
120
-
-
120
Ritmo de
-1
determinação (h )
Tabela 7.3. Métodos automáticos para a determinação do teor de polifenóis totais/capacidade antioxidante em vinhos
-
-
<7,0
-
<1,3 ; < 4,0
<5,0
<5,6
<2,4
<0,8
RSD (%)
[35]
[34]
[33]
[32]
[30, 31]
[29]
[28]
[27]
[26]
Ref.
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
201
Capítulo 7
No presente estudo, os polifenóis demonstraram um efeito inibidor da resposta de
QL inequívoco (Figura 7.7. A), cujo comportamento no sistema de QL utilizado foi descrito
pela primeira vez, que permite que o teor de polifenóis em amostras alimentares possa
ser determinado. A curva de calibração típica foi 1/QL = 0,00176 (±0,00002) CÁcido
-1
tânico
2
(mg L ) + 0,00062 (±0,00003), R =0,9997, com intervalo de resposta linear entre 0,01-5
mg L-1 de ácido tânico. As amostras eram então diluídas para ajustar as concentrações
reais de polifenóis presentes nas amostras ao intervalo de resposta linear do método. De
forma a avaliar a exactidão do método desenvolvido, os resultados obtidos por análise de
quatro amostras de vinhos e uma de grainhas de uvas no sistema SIA-MSFIA foram
comparados com os fornecidos pela metodologia de referência (método de FC) [12]. Os
desvios relativos entre os resultados obtidos pela metodologia de fluxo e de comparação
situaram-se entre 2,63 e 6,64 % (Tabela 7.4.).
Tabela 7.4. Resultados obtidos pela metodologia de fluxo e pela metodologia de referência para a
determinação de ácido tânico em vinhos e grainhas de uva
Amostras
Metodologia proposta
-1
Desvio
relativo (%)
-1
Ácido tânico (mg L )
Ácido tânico (mg L )
Vinho branco 1
349,8 (± 8,5)
362,2 (± 10,9)
- 3,42
Vinho branco 2
344,2 (± 32,9)
353,5 (± 1,3)
- 2,63
Vinho tinto
1937,3 (± 77,7)
1816,6 (± 47,6)
+ 6,64
Vinho rosé
439,0 (± 23,3)
457,0 (± 40,1)
- 3,94
1222,4 (± 95,8)
1272,3 (± 156,3)
- 3,92
a
Grainhas de uva
a
Método de referência
Extracto alcoólico (50% (v/v)) de grainhas de uva [36]
Os resultados obtidos por aplicação das metodologias a amostras alimentares
foram ainda confirmados pelo estabelecimento de uma regressão linear entre as duas
metodologias, do tipo CSIA-MSFIA (mg L-1) = – 48,896 (±144,817) + 1,065 (±0,140) CMétodo de
referência
202
(mg L-1), r=0,9975 e por aplicação do teste t de Student (t
calculado
0,21; t
tabelado
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
2,78). Ambos os testes confirmaram a concordância entre os dois métodos, para um nível
de confiança de 95 %.
Por outro lado, o efeito indutor da resposta de QL apresentado pelo derivado
fenólico mais simples (Figura 7.7. B) foi também explorado para a monitorização de
contaminantes e avaliação de risco no campo ambiental. Os fenóis são poluentes
comuns em efluentes aquosos resultantes de descargas ilegais de processos industriais
e também como produtos de degradação de pesticidas [37] e nesse sentido a
monitorização deste tipo de analito reveste-se de extrema importância. Deste modo, foi
efectuada a determinação do teor de fenol em amostras de água fortificadas.
Nas condições optimizadas, o logaritmo da intensidade de QL emitida foi relacionado com
o logaritmo da concentração de fenol (log QL = 0,2348 (±0,0051) log CFenol (mg L-1) +
3,7069 (±0,0023), R2=0,9981) com intervalo de resposta linear até 5 mg L-1 de fenol.
Finalmente, de forma a averiguar a exactidão do método desenvolvido, submeteram-se 6
amostras de água de diferente origem (águas corrente, de poço e lixiviado) à análise
paralela pelo método proposto e pela metodologia de referência (método da 4aminoantipirina) [13]. Os resultados encontram-se na Tabela 7.5. e como se pode
observar os desvios relativos entre os resultados obtidos pela metodologia de fluxo e de
comparação foram inferiores a 4%.
Tabela 7.5. Resultados obtidos pela metodologia de fluxo e pela metodologia de referência para a
determinação de fenol em amostras de água fortificadas
Amostras
Metodologia proposta
-1
Método de referência
Desvio
relativo (%)
-1
Fenol (mg L )
Fenol (mg L )
Água da torneira
1,80 (± 0,22)
1,87 (± 0,08)
- 3,72
Água de poço 1
0,49 (± 0,04)
0,51 (± 0,01)
- 2,62
Água de poço 2
1,56 (± 0,10)
1,53 (± 0,07)
+ 1,84
Água de poço 3
1,40 (± 0,12)
1,40 (± 0,04)
- 0,09
Lixiviado 1
1,25 (± 0,08)
1,27 (± 0,01)
- 1,61
Lixiviado 2
1,05 (± 0,19)
1,03 (± 0,04)
+ 2,18
203
Capítulo 7
Neste caso, os resultados obtidos por aplicação das metodologias a amostras de
água foram também confirmados pelo estabelecimento de uma regressão linear entre as
duas metodologias, do tipo CSIA-MSFIA (mg L-1) = 0,026 (±0,131) + 0,972 (±0,098) CMétodo de
referência
(mg L-1), r=0,9974 e por aplicação do teste t de Student (t
calculado
0,62; t
tabelado
2,57). Ambos os testes confirmaram a concordância entre os dois métodos, para um nível
de confiança de 95 %.
Quando as amostras de água contiverem uma variedade de compostos fenólicos
(por exemplo, no caso de águas residuais), o método desenvolvido deve ser acoplado a
uma técnica de separação (por exemplo, HPLC) devido ao comportamento dualístico
(indutor ou inibidor) dos diferentes derivados fenólicos no sistema de QL estudado.
A
Branco
Intensidade de QL
3500
0,01 mg L-1
0,10mg L-1
3000
0,5 mg L-1
2500
2000
1,0 mg L-1
1500
1000
2,0 mg L-1
500
5,0 mg L-1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Tempo de medição do detector (s)
Intensidade de QL
B
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
2,0 mg L-1
3,0 mg L-1
5,0 mg L-1
1,0 mg L-1
0,50mg L-1
Branco
0
50
0,25 mg L-1
100
150
200
250
300
350
400
450
Tempo de medição do detector (s)
Figura 7.7. Registo dos sinais analíticos obtidos para a solução de branco e soluções
padrão de ácido tânico (A) e fenol (B) e respectivas concentrações.
Relativamente à repetibilidade do procedimento SIA-MSFIA, foram determinados
valores de RSD de 3,4 e 5,2% para padrões de fenol com concentração igual a 0,25 mg
L-1 e de ácido tânico 2 mg L-1.
204
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
O tempo requerido para completar um ciclo analítico foi de 400 segundos, o que
corresponde a cerca de 9 determinações por hora, e representa uma notável melhoria na
eficiência e rapidez quando comparado com os métodos de referências respectivos [12,
13]. Na verdade, o método de FC inclui um período de incubação de 30 minutos antes da
leitura no espectrofotómetro [12] e no método da 4-aminoantipirina é necessário um
procedimento de pré-tratamento da amostra (destilação), seguido de um período de
incubação de 15 minutos e da subsequente medição espectrofotométrica, resultante da
condensação oxidativa da 4-aminoantipirina com o fenol catalisada pelo hexacianoferrato
(III) de potássio em meio alcalino [13].
No que respeita à determinação do teor de polifenóis totais em vinhos, os
sistemas de fluxo baseados em FIA [26, 27, 29, 32-35] permitem a sua análise de modo
automático e rápido, mas apresentam como desvantagem o consumo elevado de
reagentes. Dois dos sistemas FIA, baseados na oxidação com permanganato de potássio
em meio ácido (pH 2) [26] e na “captação” do catião radical ABTS [29] permitiram um
ritmo de determinação de 120 amostras por hora, mas os reagentes fluem em contínuo.
Adicionalmente, os sistemas baseados nas metodologias de gestão de fluidos mais
recentes [28, 30, 31] foram desenhados para a automatização do método discreto de FC
e resultaram no desenvolvimento de sistemas mais versáteis e com redução efectiva no
consumo de amostra e reagentes, apesar de proporcionarem baixos ritmos de
amostragem. No caso dos sistemas MSFIA desenvolvidos para o efeito [30, 31], a
frequência analítica era de 12 amostras por hora.
No que respeita à determinação do teor de fenol em águas, têm sido propostos
igualmente sistemas de fluxo baseados em diferentes técnicas, acoplados a diferentes
sistemas de detecção (Tabela 7.6.). A maioria dos métodos foram desenhados para
permitir a automatização do método discreto da 4-aminoantipirina [38-40] e nalguns foi
implementada uma etapa de extracção em fase sólida prévia à própria determinação [41],
que permitiu um aumento notável da sensibilidade e da selectividade, com uma inevitável
redução do ritmo de determinação. Têm sido igualmente propostos métodos
quimiluminimétricos, baseados na oxidação do luminol [42, 43] e na oxidação com
permanganato de potássio em meio ácido [44]. Recentemente, foi reportado um sistema
hifenizado MSFIA-cromatografia líquida (CL) [45] que permitia a discriminação de vários
derivados fenólicos, com ritmos de determinação entre 4 (volume de amostra igual a 100
mL) e 10 (volume de amostra igual a 25 mL) amostras por hora. Também têm sido
descritos métodos amperométricos, caracterizados por elevados ritmos de amostragem
[46, 47].
205
206
Sistema de detecção
QL
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Visível)
Espectrofotometria
(Ultravioleta)
Electroquímica
(amperometria)
Electroquímica
(amperometria)
Metodologia de
fluxo
FIA
FIA
FIA
SIA
Multicomutação
Multicomutação
MSFIA-CL
FIA
FIA
Reacção electroquímica
Reacção electroquímica
Extracção em fase sólida e separação
cromatográfica
Reacção de Berthelot (nitroprussiato de
sódio/cloridrato de hidroxilamina)
Reacção da 4-aminoantipirina
Reacção da 4-aminoantipirina
Extracção em fase sólida e reacção da 4aminoantipirina
Reacção da 4-aminoantipirina e da 3-metil2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH)
Extracção em fase sólida e reacção com
luminol- hexacianoferrato (III) de potássio
Ensaio
Tabela 7.6. Métodos automáticos para a determinação do teor de fenol em águas
180
70
4 ou 10
65
90
12
12
60
<6
Ritmo de
-1
determinação (h )
2,1
2,8
≤8,0
0,5
0,6
2,1
2,4
<3,0
1,5
RSD (%)
[47]
[46]
[45]
[48]
[40]
[39]
[41]
[38]
[43]
Ref.
Capítulo 7
Efeito dos derivados fenólicos no sistema de QL luminol-H2O2-peroxidase
7.4. Conclusões
A metodologia SIA-MSFIA desenvolvida constitui uma estratégia valiosa para a
avaliação do comportamento dos compostos fenólicos sobre o sistema de QL luminolH2O2-POD.
Esta metodologia combina o uso da válvula selectora de fluidos para a aspiração
do composto fenólico e da solução oxidante e subsequente incubação desta mistura com
o catalisador peroxidase, para a geração em linha de espécies oxidadas, e do módulo de
multisseringa como ferramenta de gestão de fluidos nas operações de MSFIA-QL.
Os diferentes subgrupos de compostos fenólicos exibiram uma resposta
diferenciada perante o sistema de QL estudado, exercendo um efeito indutor ou inibidor
sobre este. Deste modo, a metodologia proposta pode ser uma escolha para a avaliação
de potenciais activadores ou inibidores das reacções de QL baseadas na oxidação do
luminol, biocatalisada pela POD.
O método SIA-MSFIA proposto foi depois aplicado à determinação do índex de
polifenóis e do teor de fenol em amostras de vinhos e águas, respectivamente, e os
resultados obtidos demonstraram que este procedimento pode constituir uma alternativa
face aos métodos existentes. Neste sentido, a metodologia de fluxo proposta representa
uma ferramenta para a determinação do teor polifenólico em amostras alimentares como
monitorização do controlo de qualidade, bem como na estimação do risco/contaminação
na análise de águas.
207
Capítulo 7
7.5. Referências bibliográficas
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209
Capítulo 7
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Capítulo 7
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212
CAPÍTULO 8
Conclusões gerais
Conclusões gerais
Os sistemas de análise por injecção sequencial desenvolvidos permitiram a
automatização de determinações enzimáticas de diferentes parâmetros de interesse em
matrizes de índole diversa como clínico, farmacêutico, alimentar e ambiental.
Em qualquer dos casos foram obtidas montagens de configuração simples, que
permitiram a redução efectiva dos volumes de enzima(s), amostra e outros reagentes
envolvidos com subsequente minimização dos efluentes gerados e uma diminuição do
tempo de análise e da intervenção do operador. Isto tornou as determinações mais
económicas, rápidas e menos sujeitas a erros induzidos pelo operador. Adicionalmente, o
controlo
computorizado
dos
sistemas
de
fluxo
desenvolvidos
acrescenta-lhes
flexibilidade, permitindo a fácil alteração das condições de análise sem reconfiguração
física dos sistemas. Assim, sistemas com estas características podem ser aplicados na
análise de diferentes espécies e distintos tipos de amostra, com base em reacções
diversas e envolvendo uma gama ampla de intervenções sobre a zona de amostra, sem
que para isso seja necessário alterar a configuração do sistema analítico, bastando uma
simples alteração no teclado do computador.
A aplicação analítica das montagens apresentadas permitiu confirmar a
adequabilidade da técnica SIA à automatização de métodos baseados em reacções
enzimáticas, desde a determinação do substrato, produto ou de efectores, a
implementação de um esquema de amplificação da resposta enzimática, estudos de
indução e inibição enzimática até à avaliação da actividade enzimática através da
determinação dos parâmetros cinéticos. O modo de funcionamento dos sistemas SIA
facilita a gestão e direccionamento das soluções, abrindo inúmeras possibilidades em
termos de manipulação das zonas de enzima(s), substrato(s) e dos outros reagentes e na
detecção do produto final das reacções envolvidas. Por outro lado, a elevada
versatilidade e robustez inerente à técnica SIA permitiu a incorporação de diversos
dispositivos para a realização de procedimentos complexos de manipulação e de prétratamento da amostra dentro do sistema, que conduziram a um aumento expressivo das
potencialidades analíticas das montagens.
O elevado grau de especificidade e selectividade com que as enzimas exercem a
catálise foi evidenciado na determinação da GSH e da GSSG em amostras de sangue
total, com a utilização da enzima GR dada a complexidade inerente a esta amostra
biológica. Por outro lado, o ensaio de regeneração DTNB-GR empregue, que permitiu
uma amplificação da resposta à glutationa, confirmou a exequibilidade dos sistemas SIA
para a automatização de reacções enzimáticas envolvendo mais de três reagentes. O
modo de funcionamento da válvula selectora de fluidos, elemento central dos sistemas
SIA desenvolvidos, tornou possível a implementação de um procedimento de diluição em
linha, com a colocação de um tubo de diluição numa das portas da válvula, que permitiu a
215
Capítulo 8
aplicação da metodologia à determinação das concentrações de GSH e GSSG presentes
em intervalos distintos nas amostras de sangue humano.
A associação de uma válvula de injecção ao sistema SIA viabilizou o
desenvolvimento de uma estratégia de amostragem directa das amostras de biodiesel,
sem qualquer tratamento prévio. Com a incorporação de uma unidade de extracção
membranar e a conjugação com um período de paragem do escoamento, foi possível
efectuar de forma simples a extracção do metanol das amostras de biodiesel para o canal
aceitador da unidade e permitir a sua determinação em meio aquoso. Esta estratégia de
extracção e a utilização de um sistema SIA híbrido permitiu uma redução efectiva no
consumo de solventes orgânicos e, consequentemente, uma diminuição da geração de
efluentes, o que constitui uma alternativa ambientalmente amigável no âmbito da Química
Verde.
Na automatização da reacção enzimática da determinação do metanol, apresentou-se
uma configuração que empregava enzimas livres em solução e imobilizadas e dispostas
em reactores empacotados. A opção da forma de utilização da enzima esteve
relacionada com as características da própria enzima e com o tipo de estabilidade que
esta apresenta nas duas situações. A imobilização enzimática da AOD conduziu a um
aumento da sua estabilidade operacional, permitindo a sua reutilização contínua.
Adicionalmente demonstra-se no mesmo sistema o emprego de uma enzima livre em
solução, a POD, de baixo custo.
A estratégia adoptada de confluência de zonas garantiu a mistura completa do peróxido
de hidrogénio obtido na reacção catalisada pela AOD e do reagente de desenvolvimento
de cor. Com a introdução de uma válvula solenóide, antes do ponto de confluência, num
canal secundário da bomba peristáltica, conseguiu-se coordenar o escoamento nos
canais principal e secundário e simplificar o sistema de fluxo.
O desenvolvimento e estudo da reacção da PLA2 foram possíveis com a
incorporação de duas câmaras de mistura num sistema SIA. A acção mecânica exercida
pela movimentação da barra magnética e o período de paragem de escoamento
permitiram a mistura efectiva da solução de lipossomas de natureza viscosa bem como a
criação de condições favoráveis ao desenvolvimento da reacção catalítica seleccionada.
O modo de funcionamento da válvula selectora facilitou a gestão das soluções envolvidas
nas reacções ao permitir a aspiração faseada das diferentes zonas e a sua introdução
nas câmaras de mistura na altura propícia. O posicionamento da câmara, apoiada numa
entrada lateral da válvula, facilitou a optimização do volume de envio para o detector e
permitiu controlar de forma eficaz a razão sinal /sinal de branco bem como a limpeza da
própria câmara, evitando qualquer contaminação do canal principal. Por outro lado, o
modo de funcionamento dos sistemas SIA possibilitou o controlo independente de duas
216
Conclusões gerais
câmaras de mistura e, desta forma, permitiu a automatização de todo o procedimento
analítico com vista à avaliação do efeito dos AINEs sobre a actividade da PLA2 e a sua
rentabilização, uma vez que a incubação dos lipossomas com a sonda ANS na câmara
de mistura principal era efectuada enquanto a incubação do AINE com a enzima decorria
na outra câmara.
O sistema desenvolvido permitiu a realização de estudos de modulação da actividade
enzimática sobre os lipossomas na interface água-fosfolípido e evidenciou este sistema
microheterogéneo como sendo um potencial meio reaccional de biocatálise para a
avaliação de novos agentes anti-inflamatórios.
A manipulação fluídica estrita e o controlo preciso das condições reaccionais com
a metodologia SIA, assegurando a reprodutibilidade dos períodos de tempo de envio para
o detector e de monitorização do sinal analítico, foram testados com sucesso na
avaliação da actividade da enzima tirosinase, no meio reaccional contendo LI, através da
determinação dos parâmetros cinéticos (KM ap e Vmax ap). A interferência da viscosidade do
LI no grau de mistura das soluções aspiradas bem como na detecção espectrofotométrica
foi eliminada graças aos volumes reduzidos empregues e ao controlo exímio da
dispersão conseguido com a metodologia SIA. A utilidade dos LIs como meio reaccional
de biocatálise alternativo aos solventes orgânicos foi confirmada com o emprego de um
substrato com baixa solubilidade em água. Adicionalmente, os estudos de inibição
enzimática efectuados parecem fornecer informações sobre o mecanismo da reacção
catalisada pela tirosinase, nomeadamente apontando para modificações no ambiente
reaccional induzidas pelo LI.
A utilização da multisseringa como dispositivo de propulsão num sistema SIA
permitiu confirmar as vantagens desta combinação aquando da implementação da
reacção quimiluminimétrica à base de luminol, ao possibilitar uma mistura rápida e
reprodutível entre a amostra e o reagente quimiluminogénico numa zona imediatamente
anterior à célula de fluxo. A configuração do sistema de fluxo permitiu a criação de
condições favoráveis para a formação de intermediários de POD oxidada, catalisadores
da produção de radicais de luminol, após a mistura em confluência da zona da POD com
a zona de amostra e peróxido de hidrogénio. O facto de ter sida obtida uma resposta
diferenciada, de indução ou de inibição, perante o sistema de QL dos diferentes
compostos fenólicos testados, permite antever a sua aplicação na avaliação de outros
potenciais activadores ou inibidores deste tipo de reacções de QL biocatalisadas, mesmo
apresentando baixa solubilidade em água.
Os ensaios de precisão efectuados revelaram valores de desvio padrão relativo
sempre inferiores a 5,2 %, demonstrando um comportamento satisfatório em todas as
situações analíticas estudadas. De facto, a associação dos diferentes dispositivos à
217
Capítulo 8
válvula selectora e a utilização da bomba peristáltica ou da multisseringa como unidade
de propulsão não afectaram a repetibilidade dos volumes aspirados bem como o
comportamento geral dos sistemas resultantes.
Os resultados obtidos, por aplicação das metodologias desenvolvidas às matrizes
respectivas, foram em todos os casos estatisticamente concordantes com os fornecidos
pelo método de referência aplicável ou pelo convencional de comparação adoptado,
quando estes existiam.
As metodologias desenvolvidas demonstraram ser alternativas vantajosas às
metodologias de referência ou de comparação, as quais são geralmente laboriosas e
demoradas, com um elevado grau de dependência do operador e envolvendo por vezes a
utilização de produtos químicos tóxicos. Pelo contrário, de um modo geral os sistemas
desenvolvidos são dotados de grande simplicidade, versatilidade, flexibilidade e grau de
automatização,
possibilitando
a
adaptação
a
diversas
situações
analíticas
e
procedimentos de manipulação da amostra, bem como a associação a diferentes
sistemas de detecção.
Os trabalhos desenvolvidos, no âmbito desta dissertação, ilustraram as vantagens
recíprocas entre a utilização das enzimas e a metodologia SIA, quer em ensaios de rotina
quer em estudos sistemáticos. Destacou-se, neste contexto, a extrema importância da
incorporação de processos biocatalíticos em módulos analíticos SIA, com vista ao
desenvolvimento de metodologias enzimáticas automáticas que constituíam alternativas
válidas, economicamente viáveis e com ritmos de amostragem adequados à rotina
laboratorial das diferentes áreas a que se aplicaram as metodologias. Para cada situação
analítica, foram optimizadas as condições de operação para as diferentes enzimas,
incluindo a escolha do meio reaccional adequado, que permitissem a execução dos
ensaios enzimáticos com elevados graus de eficiência, reprodutibilidade e precisão. Da
associação da biocatálise com a estratégia de fluidos da técnica SIA utilizadas resultou a
extensão dos campos de aplicação, para além do meio aquoso. Assim, foram exploradas
a biocatálise em sistemas microheterogéneos, nomeadamente em estudos enzimáticos
na interface lípido-água usando lipossomas como modelos membranares, e em meios
não-aquosos, como sendo os meios mistos envolvendo solventes orgânicos ou líquidos
iónicos.
De facto, um dos mais recentes desenvolvimentos prende-se com o estudo do
comportamento das enzimas em meios aquo-restritos, designadamente nos líquidos
iónicos, como ambiente reaccional de biocatálise promissor face aos solventes orgânicos.
Por outro lado, antevê-se que a adopção de sistemas miniaturizados aliados a novas
tecnologias
enzimáticas
(como
as
aplicações
com
nanopartículas
ou
filmes
microfluídicos) se traduzirá numa enorme rentabilização das metodologias, ao permitir
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Conclusões gerais
uma redução acentuada das quantidades de substrato(s), enzima(s) e outros reagentes
(cofactores, activadores, inibidores, etc) e de solventes empregues e desta forma
oferecer um ambiente reaccional confinado favorável à catálise enzimática, além de
conduzir a um aumento da rapidez do processo analítico.
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