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14, 15 Y 16 DE NOVIEMBRE DE 2012
Córdoba - Argentina
Libro de trabajos completos
Conservación y almacenamiento | Biotecnología | Inocuidad
Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Córdoba
Universidad Nacional de Córdoba
IV Congreso Internacional
Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Noviembre de 2012
Córdoba - Argentina
Libro de trabajos completos
Conservación y almacenamiento | Biotecnología | Inocuidad
Dra. Alicia Aguirre (Coordinadora), Dra. Cecilia Álvarez Igarzábal,
MSc. Andrea Marín, Dra. María Angélica Perillo, Dra. Miriam Strumia
IV Congreso Internacional Ciencia y Tecnología de los Alimentos : libro de trabajos completos :
conservación y almacenamiento, biotecnología, inocuidad / Alicia Aguirre ... [et.al.] ; edición
literaria a cargo de Miriam Strumia ... [et.al.]. - 1a ed. - Córdoba : Universidad Nacional de
Córdoba, 2013.
E-Book.
ISBN 978-950-33-1072-4
1. Ingeniería de Alimentos. 2. Tecnología de Alimentos. 3. Actas de Congresos. I. Aguirre,
Alicia II. Strumia, Miriam, ed. lit.
CDD 664.028
Fecha de catalogación: 25/09/2013
Editores:
Dra. Alicia Aguirre, ICYTAC, UNC-CONICET, FCEFyN-Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
Dra. Cecilia Álvarez Igarzábal, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina
MSc. Andrea Marín, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina
Dra. María Angélica Perillo, IIBYT (CONICET-UNC)- ICTA, FCEFyN, UNC. Dra. Miriam Strumia,
Universidad Nacional de Córdoba, Argentina
Autoridades
GOBIERNO DE LA PROVINCIA DE
CÓRDOBA
Dr. José Manuel de La Sota
Gobernador
Cra. Alicia Pregno
Vicegobernadora
Ing. Roger Illanes
Ministro de Ciencia y Tecnología
UNIVERSIDAD NACIONAL DE
CÓRDOBA
Dra. S. Carolina Scotto
Rectora
Dra. Hebe S. Goldenhersch
Vicerrectora
Dr. Alberto Edel León
Secretario de Ciencia y Tecnología
PRESIDENCIA de CICyTAC 2012
Ing. Hugo Dellavedova
Secretario de Innovación y Vinculación
Tecnológica
Ministerio de Ciencia y Tecnología de la
Provincia de Córdoba
COMITÉ ORGANIZADOR
Coordinadora
Dra. Victoria Rosati
Direccion de Vinculación Tecnológica,
MinCyT Córdoba
Ing. Jorge Bertozzi
Ministerio de Ciencia y Tecnología,
Córdoba
Ing. Rubén Baccifava
Ministerio de Ciencia y Tecnología,
Córdoba
Mgter. Natalia Paola Masferrer
Dirección de Vinculación Tecnológica,
MinCyT Córdoba
Dr. Alberto Edel León
SECyT-Universidad Nacional de Córdoba
Dra. Mirtha Nassetta
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Dr. Pablo Daniel Ribotta
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Dr. Daniel Wunderlin
ISIDSA-Universidad Nacional de Córdoba
Dr. Rafael Borneo
CEPROCOR, MinCyT Córdoba
Dr. Marcelo Rosmini
Secretaría de Vinculación, Universidad
Católica de Córdoba
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ISIDSA-Universidad Nacional de Córdoba,
Córdoba
Bioq. Nancy Passalacqua
CEPROCOR, MinCyT
Lic. Vanesa Scarlatta
Secretaria de Alimentos, MAGAyPAF
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Universidad Tecnológica Nacional,
Facultad Regional Villa María
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Univerisdad Tecnológica Nacional,
Facultad Regional San Francisco
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Universidad Nacional Villa María
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Universidad Nacional de Río Cuarto
COMITÉ CIENTÍFICO
Coordinador
Dr. Alberto Edel León
Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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Universidad Nacional de Córdoba,
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ENITIAA, Nantes, Francia
Dr. Carlos Guzmán
ICTA, Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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Universidade de São Paulo, Brazil
Dr. Daniel Wunderlin
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María, Argentina
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Jersey, USA
Dr. João Batista de Almeida e Silva
Universidade de São Paulo, Brazil
Dra. María Eugenia Steffolani
Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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Universidad de Bío Bío-Chile
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Dr. Paul Singh
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Dr. Rafael Borneo
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Tecnología, Córdoba, Argentina
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Dr. Rolando Pécora
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Argentina
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Israel
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Universidad Tecnológica Nacional, San
Francisco, Argentina
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Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
Dra. Cecilia Puppo
CIDCA, La Plata. Argentina
Bioq. Nancy Passalacqua
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Tecnología, Córdoba, Argentina
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Argentina
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ISIDSA, Universidad Nacional de
Córdoba, Argentina
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Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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Utah State University, USA
Dra. María Angélica Perillo
Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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María, Argentina.
Dra. Susana Bettera
Universidad Nacional de Río Cuarto,
Argentina
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Argentina
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CIDAF, Valparaíso, Chile.
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Universidad Tecnológica Nacional, San
Francisco, Argentina
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Universidad Nacional de Río Cuarto,
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Argentina
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Francisco, Argentina
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Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina.
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Argentina
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ENITIAA, Nantes, Francia
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Córdoba, Argentina
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Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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Argentina
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Universidad Tecnológica Nacional, Villa
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Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina
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MinCyT Córdoba
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Ministerio de Ciencia y Tecnología
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Producción Agropecuaria Familiar
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UCC - Sección Contaduría - Contabilidad
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Emilce Fabiani
MinCyT Cba.
INDICE
Conservación y almacenamiento
Agazzi L. ................................................................................................................................................. 2
Aguirre, A................................................................................................................................................ 8
Arrieta M.P. ........................................................................................................................................... 16
Boiero L................................................................................................................................................. 22
Bonafede M.. ......................................................................................................................................... 31
Busch V. M.,*......................................................................................................................................... 36
Céliz G................................................................................................................................................... 44
Fernandez V.. ........................................................................................................................................ 51
Guiotto E.N. .......................................................................................................................................... 59
López O. ................................................................................................................................................ 67
López Córdoba A.F. .............................................................................................................................. 76
Magariño M.. ......................................................................................................................................... 83
Maldonado S. ........................................................................................................................................ 92
Márquez A.L. ........................................................................................................................................ 98
Michaluk, A. ........................................................................................................................................ 105
Musso Y.S. .......................................................................................................................................... 112
Olivares M.L. ...................................................................................................................................... 121
Ollé Resa, C. P .................................................................................................................................... 126
Pérez C.D. ........................................................................................................................................... 133
Rubinstein A. ....................................................................................................................................... 139
Trela V.D. ............................................................................................................................................ 147
Vasco M.F.1 ........................................................................................................................................ 156
Villarruel S. Rivero ............................................................................................................................. 165
Biotecnología
Apesteguía A ....................................................................................................................................... 173
Brousse M.M ....................................................................................................................................... 181
Estela-Escalante, WD. ......................................................................................................................... 188
Ferreira S.P. ......................................................................................................................................... 198
Ferreira S.P. ......................................................................................................................................... 204
Lupi G. J .............................................................................................................................................. 210
Machado .............................................................................................................................................. 221
Machado. ............................................................................................................................................. 228
Miletti A. E. ......................................................................................................................................... 235
Ledesma D.,......................................................................................................................................... 241
Pacheco C. ........................................................................................................................................... 249
Paludo M.P.. ....................................................................................................................................... 259
Reis D.F............................................................................................................................................... 265
Reis D.F............................................................................................................................................... 272
Ribeiro VA, ....................................................................................................................................... 279
Rodríguez De Marco ME ................................................................................................................... 284
Zubreski E.R........................................................................................................................................ 290
Inocuidad
Mercedes Montserrat .......................................................................................................................... 298
Nigro J.A. ............................................................................................................................................ 305
Silveira M.F ......................................................................................................................................... 312
Conservación y almacenamiento
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Influencia de las propiedades del envase en el desarrollo de colores anómalos en carnes
Agazzi L.1, Strumia M.1,2, Toselli R.1, 3
1. Departamento de Química Orgánica. Facultad de Ciencias Químicas - UNC, Argentina.
2. IMBIV-CONICET
3. Centro de Química Aplicada (CEQUIMAP). Facultad de Ciencias Químicas-UNC, Argentina.
Resumen: En el presente trabajo se presentan los estudios comparativos de dos películas comerciales
multicapa, identificadas como “I” y “II” usadas para la envoltura y conservación de carnes al vacío. Se
realizaron diferentes estudios físico-químicos y microbiológicos con el objetivo de analizar el
comportamiento de las mismas en función del tiempo. En la muestra I se lograron identificar los siguientes
materiales: Polietileno (PE), Policloruro de Vinilo (PVC) y Copolímero de Etileno:Vinil acetato (EVA); en
la muestra II se encontraron dos capas de PE y Polietilentereftalato (PET). La carne envasada con la película
II mostró elevadas poblaciones de microorganismos a partir del día 30 de control y un pronunciado
pardeamiento antes del día 60 de almacenamiento. Ambos materiales son de alta barrera a oxigeno (O2) y
vapor de agua, pero la película I mostró menor permeabilidad al vapor de agua y mayor permeabilidad al O2;
inverso a los valores de permeabilidad encontrados en la muestra II. La menor presión parcial de oxígeno
dentro de la película II, generaría condiciones favorables a la formación de metamioglobina con el
consiguiente pardeamiento de la carne, lo cual fue observado en forma más temprana en la muestra envasada
en dicha película. Como conclusión, la película multicapa I resultó mejor para este tipo de envasado que la
película II. Este hecho se puede atribuir a que el envase I reúne las propiedades barreras óptimas para tal fin,
probablemente conferidas por la presencia de PVC.
Palabras Claves: envases multicapa, propiedades barrera, vacío, carnes.
Abstract: In this work we present comparative studies of two multilayer films, identified as “I” and “II”.
Different studies were carried out like as physicochemical and microbiological parameters with the aim to
know the efficiency of these with the time. In sample I, following materials were identified: polyethylene,
polyvinyl chloride and ethylenevinyl acetate copolymer (EVA); in sample II, polyethylene and polyethylene
terephthalate (PET). The meat packaged with the film II showed high populations of microorganisms from
the 30th day of control and a pronounced browning before day 60 of storage. This darkening was not
observed in samples packaged with the film I in the aforementioned control times. A decisive role played the
barrier properties to oxygen and water vapor of the polymers that make up each container. Both materials are
of high barrier to the gases, but film II showed lower permeability to oxygen and a bigger permeability to
vapor water in relation to material I. The lower partial oxygen pressure inside the package with the film II,
would generate favorable conditions to the formation of metamyoglobine with a consequent browning of the
meat packaged with it, 60 days before the darkening was observed in the sample wrapped with the film I. As
conclusion, the multilayer film I is a better option for this type of packaging that film II. This can be
attributed to the fact, that container I satisfied the optimum barrier properties for the purpose.
Keywords: multilayer packaging, barrier properties, vacuum packaging, meat.
INTRODUCCION
La carne es un producto alimenticio que suele almacenarse y comercializarse envasada y el material del
envase juega un rol sumamente importante cuando se trata de productos de exportación. Los materiales de
envasado más comúnmente usados por la industria alimentaria varían desde los muy impermeables,
empleados para el envasado al vacío, a los muy permeables, y desde los opacos a los trasparentes (Scheichl
R., et al. 2005). Su materia prima está constituida por compuestos simples, como el polietileno (PE) y el poli
cloruro de vinilo (PVC), o por componentes múltiples (mezcla de varios polímeros). Las carnes frescas se
envasan generalmente en películas permeables al oxígeno con el fin de conservar el color rojo brillante
característico de la carne fresca.
El color de la carne depende fundamentalmente del estado de oxidorreducción (OR) del átomo de hierro del
grupo hemo de la mioglobina y de la fijación de O2. A elevadas presiones parciales de oxígeno se favorece la
formación de la oximioglobina (color rojo) y a bajas presiones se favorece la oxidación del átomo de Fe,
2
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
formándose metamioglobina (color pardo). Este último caso se suele presentar en el envasado de carnes al
vacío ya que se utilizan envases muy poco permeables al oxígeno. Este hecho puede producir problemas de
comercialización, debido a que el consumidor asocia este color con el producido en la carne durante un largo
período de almacenamiento (Mancini R.A., Hunt M.C., 2005).
La disponibilidad de oxígeno en el interior del envase ejerce una marcada influencia en la flora microbiana.
Por lo tanto, el color de la carne envasada es el resultado de una compleja interacción de factores que
incluyen, el estado de óxido-reducción de sus pigmentos propios, la actividad metabólica de la flora
microbiana asociada, los cambios en la composición predominante de dicha flora, las características de los
materiales empleados en el envasado, la composición de la atmósfera en el interior del envase y las
condiciones de almacenamiento del producto, entre otros.
La carne fresca es a menudo presentada en bandejas de poliestireno y envasada con películas permeables al
oxígeno. Este envase permite la oxigenación rápida del pigmento y el desarrollo de un color rojo deseable,
pero la decoloración se produce dentro de los primeros 7 días (Madhavi D. L., Carpenter, C. E., 1993) o
después de 6 a 9 días de almacenamiento en dicho material (Albertí P. et al., 2005; Ripoll G. et al., 2007;
Sanz, A. et al., 2011). Altas concentraciones de oxigeno atmosférico promueven la formación de
oximioglobina, la forma de color rojo cereza de la mioglobina, sin embargo, pueden repercutir
negativamente sobre la oxidación de lípidos y la decoloración del músculo (Jeremiah, 2001). Films anóxicos
mantienen la mioglobina en su forma reducida y aumentan la vida útil de la carne, sin embargo, el color
púrpura es menos conveniente para los consumidores, debido a que da la impresión de deterioro, que el color
rojo de la oximioglobina. Debido a que los consumidores están menos familiarizados con este color, la carne
suele estar expuesta al oxígeno antes de ser colocadas en las estanterías del local de venta al público (Ripoll
G. et al., 2013).
El objetivo general planteado en el presente trabajo, es realizar un estudio comparativo de dos envases
plásticos multicapa de origen comercial, analizando las principales causas que generan el desarrollo de
colores anómalos en carnes envasadas al vacío. En este caso particular, se propuso identificar los aspectos
más relevantes que afectan el grado de conservación y las características organolépticas de la carne
envasada, estudiando los parámetros de calidad microbiológica y fisicoquímicos de las carnes envasadas y
las propiedades barrera y mecánicas del material del envase.
MATERIALES Y METODOS
Las muestras de carnes fueron adquiridas en un frigorífico de la ciudad de La Pampa, los materiales plásticos
(identificados como I y II) fueron donados por una empresa del medio local y usados para envasar al vacío
los bloques de carne. A partir del día de envasado (D0), las muestras se conservaron a una temperatura de
(2,0 ± 0,5) ºC. Los diferentes parámetros de estudio fueron evaluados a intervalos regulares de 30 días (D0,
D30, D60, D90 y D120)
Los parámetros fisicoquímicos estudiados en la carne fueron: pH, acidez, actividad de agua (aw), potencial
redox y humedad, empleando las siguientes técnicas de trabajos:
Se determinó la humedad de las muestras de carne envasada por el método informado en la AOAC, para lo
cual se secó una porción de muestra en la estufa durante 16 a 18 horas a 100 – 102 ºC. (AOAC Official
Method 950.46)
La actividad de agua (aw), se determinó con el método de la celulosa microcristalina (Vos P.T. y Labuza
T.P., 1974). Este se basa en calcular la cantidad de agua adsorbida por una cantidad de celulosa
microcristalina (compuesto higroscópico) en equilibrio con el vapor del alimento, en un recipiente cerrado a
una determinada temperatura.
La acidez de la carne, expresada como ácido láctico, se midió mediante una adaptación de los métodos
propuestos por la AOAC para determinar la acidez de los alimentos. Todos estos métodos se basan en una
titulación potenciométrica (ácido base) con una solución alcalina de hidróxido de sodio sobre una solución
preparada a partir del macerado de trozos de la muestra de carne y diluida en agua destilada. (AOAC Official
Method 920.174 y 920.43. 2005)
El pH de la carne se determinó a través de una medición potenciométrica sobre la muestra, utilizando un pHmetro Sartorius (Professional Meter PP-20) y un electrodo de pH de membrana de vidrio (PYP11 Sartorius
A102111013).
El potencial de oxidación-reducción de la carne se estudió utilizando un electrodo de medida de potencial
redox de platino, marca Hanna.
3
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tanto el potencial redox como el pH se midieron directamente sobre el bloque de carne sin ningún
tratamiento previo.
La evolución de la flora microbiana se evaluó a través de la determinación, en cada punto de control, es decir
para los días: 0, 30, 60, 90 y 120, del recuento del siguiente grupo de bacterias: Bacterias heterótrofas
mesófilas, Enterobacterias, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Anaerobios sulfitorreductores,
Pseudomonas sp.; flora psicrótrofa, flora láctica y mohos y levaduras (Forsythe S.J., Hayes P.R. 2007). Para
todas estas determinaciones se utilizó como metodología de referencia la establecida por la FDA-BAM
(AOAC) (Bacteriological Analytical Manual, FDA-BAM) y el CMMEF (APHA) (Downes F. P., Ito K.
2001).
En las muestras de material plástico se realizó la identificación química estructural, se midió el espesor,
propiedades mecánicas y permeabilidad a oxígeno y vapor de agua, usando las siguientes técnicas y equipos:
La identificación estructural de cada una de las capas que formaban las películas plásticas se realizó por
espectroscopía de Reflectancia Total Atenuada (ATR), empleando un espectrómetro Nicolet 5-5X C FTIR.
Las capas que formaban parte del envase fueron separadas luego de sumergir el material 24 horas en acetato
de etilo.
El espesor de las películas se midió con un micrómetro Schwyz modelo ESP1-0001PLA.
Las propiedades mecánicas de los plásticos utilizados como envases fueron determinadas de acuerdo a una
norma ASTM (ASTM (D882-02)), usando un equipo Instron Universal Testing Machine (model 3342,
Norwood, MA, USA) equipado con una celda de 500 N de capacidad. Se ensayaron 8 probetas (9 x 111 mm)
de cada film utilizando una separación de agarre inicial de 110 mm y una velocidad del cabezal de 0,5 mm/s
(Alvarez Igarzabal C.I., et al. 2011).
La permeabilidad al vapor de agua se midió siguiendo una norma ASTM (ASTM (E96M-10)) mediante del
método del desecante. Los ensayos fueron realizados a una temperatura constante de 25ºC durante un tiempo
de contacto de 22 días. (Alvarez Igarzabal C.I., et al. 2011).
La permeabilidad al oxígeno se midió en el equipo PLASTIMET S.A.I.C (Modelo PPG 2, Ind. Arg.).
RESULTADOS Y DISCUSION
Con relación a los parámetros fisicoquímicos considerados (aw, humedad, pH, potencial redox y acidez)
puede decirse en base a los resultados obtenidos que, independientemente del material de envasado utilizado,
el potencial redox tiende a hacerse más negativo, es decir que se generan condiciones reductoras por el
consumo de oxígeno, y la acidez aumenta a lo largo del período de almacenamiento. Este aumento puede
estar vinculado a la acumulación de CO2, que conlleva a la formación de ácido carbónico, y/o a la
acumulación de ácidos orgánicos, todos productos del metabolismo aerobio, microaerófilo y anaerobio
facultativo de la flora microbiana asociada a la carne envasada.
En cuanto a los ensayos microbiológicos realizados, se obtuvo que las poblaciones microbianas en las carnes
envasadas, aun cuando éstas se conservaron a una temperatura muy baja de refrigeración ((2,0 ± 0,5) ºC), en
el envase I tendieron a experimentar un marcado incremento hacia el día 60 de almacenamiento, éste se
desaceleró hacia el día 90 de control, y a partir de ese momento las curvas poblacionales evidencian que los
microorganismos entraron en un proceso de autolimitación. Para el envase II, se observó al día 30 de control,
un marcado incremento de población y los 60 días se evidencio el proceso de autolimitación. En ambos
envases el orden de unidades formadoras de colonias (U.F.C) fue el mismo.
La identificación estructural de las diferentes capas de los envases y sus propiedades mecánicas más
importantes se muestra en la Tabla 1 y 2.
Tabla 1: identificación estructural de los envases.
Envase
I
Espesor
nominal (µm)
55
Espesor
promedio (µm)
56,1
II
50
55,3
Componentes estructurales (Capas)
Polietileno de alta densidad (HDPE)/Poli cloruro de vinilo
(PVC)/Polietileno de alta densidad
Polietileno de alta densidad/Poli etilen tereftalato (PET)
Del análisis de las propiedades mecánicas resumidas en la Tabla 2, se puede observar que la película
correspondiente a la muestra I es más flexible y mientras que la muestra II es más resistente y rígida. Estos
comportamientos se le atribuyen a que el primero presenta la mayor deformación al quiebre (D) y el segundo
4
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
posee la mayor resistencia a la tracción (>Ts). Por otra parte, se pudo comprobar por espectroscopía FT-IR,
que las películas no sufrieron cambios significativos en la estructura química a lo largo del periodo de
almacenamiento.
Tabla 2: propiedades mecánicas de los films sin envasar.
Propiedades mecánicas de los films sin envasar
Muestra
Extensión al
corte (mm)
Deformación
quiebre (x 10-2)
I
II
101 ± 4
84 ± 1
95 ± 3
76 ± 1
al
Carga
al
corte (N)
Resistencia a la
(Ts)[x 10+6 N/m2]
28 ± 1
37 ± 2
55 ± 3
75 ± 3
tracción
Tiempo de
corte (s)
195 ± 8
159 ± 4
El comportamiento obtenido para cada una de las muestras con respecto a la masa de agua absorbida en el
ensayo de permeabilidad al vapor de agua en función del tiempo, se muestra en la Figura 1. Como se puede
observar la velocidad de absorción al vapor de agua de la muestra I es notablemente inferior a la de muestra
II.
Cálculo de la permeabilidad
0,1400
Masa de agua (g)
0,1200
y = 0,0056x + 0,0051
R² = 0,9919
0,1000
0,0800
I
II
Lineal (I)
Lineal (II)
0,0600
0,0400
y = 0,0021x + 0,003
R² = 0,9566
0,0200
0,0000
0
5
10
15
Días
20
25
Figura 1: masa de agua absorbida por las películas utilizadas en el envasado de la carne en función del
tiempo.
Del gráfico anterior (Figura 1), se utilizaron luego las pendientes de cada regresión lineal correspondiente a
cada uno de los envases, con el fin de calcular, en primer lugar la transmisión de vapor de agua (WVT) y la
permeabilidad del film al vapor de agua (WVP) que se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: valores de permeabilidad de vapor de agua de cada film.
Envase
I
II
WVT (ڒ  )
1,09
2,88
Espesor del film ( − )
54 ± 2
61 ± 3
WVP ( − ⁄  )
3,00
9,03
Como se observa en la Tabla 3, la muestra II es tres veces más permeable al vapor de agua que la I.
En la Tabla 4 se resumen las permeabilidades al oxigeno de cada película a los distintos días de envasado:
5
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Tabla 4: valores de permeabilidad al oxigeno para los distintos films en los diferentes días de
almacenamiento.

Permeabilidad al oxigeno ( ⁄
)
(í  )
Muestra
I
II
Sin envasar
22,9 ± 0,5
7,1 ± 0,8
Día 30
12,9 ± 0,6
4,1 ± 0,9
Día 60
15 ± 3
3,1 ± 0,3
Día 90
15,8 ± 0,5
7±1
Día 120
18,1 ± 0,3
-
Claramente, se observa que en ambos casos, las muestras varían poco la permeabilidad al oxigeno con el
tiempo, pero que la muestra I es más permeable que la II.
Por antecedentes bibliográficos (Gonzáles M.L, Riande E. 2006) se conoce que el PET posee menor
permeabilidad al oxigeno que el PVC y mayor permeabilidad al vapor de agua que el PE. Es por esta razón,
que la muestra I que tiene PVC como uno de los componentes de sus capas posee mayor permeabilidad al
oxigeno, a diferencia de la muestra II que tiene PET. Por otro lado, en cuanto a la permeabilidad al vapor de
agua, la muestra I es menos permeable, ya que poseen polietileno de alta densidad (HDPE) en ambas capas
superficiales; mientras que la muestra II tiene PET.
El conjunto de resultados obtenidos con relación a los indicadores microbiológicos, los parámetros
fisicoquímicos considerados y los estudios llevados a cabo con los materiales de envasado, parecen indicar
que el factor crítico son las propiedades barreras de los materiales usados para el envase multicapa.
CONCLUSIONES
Los distintos ensayos microbiológicos y físico-químicos en bloques de carne, que junto a los estudios de los
films usados para el envasado permitieron obtener conclusiones importantes acerca de la interacción entre
los materiales de envasado y las muestras de carne. Entre ellas vale destacar que el envase correspondiente a
la muestra I fue la que demostró mejores resultados para el envasado de carnes al vacío, ya que reúne las
propiedades físico-químicas (flexibilidad, resistencia, multicapa de materiales barrera de uso reconocido)
óptimas para tal fin. Sin lugar a dudas, una cierta permeabilidad al oxigeno es necesaria para regular la
reacción redox que da origen a la metaglobina que da origen al color pardo en carnes.
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ASTM international, 2010, (E96M-10).
AGRADECIMIENTOS
Los autores de este trabajo agradecen a los responsables del programa Córdoba Innovadora de la ADEC
(Agencia para el Desarrollo Económico de Córdoba), por el apoyo brindado para la concreción de este
proyecto. Este proyecto formó parte del practicanato profesional del Lic. Agazzi.
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Películas de proteínas de triticale con actividad antimicrobiana
Aguirre, A.1,2; Borneo, R.1,2; Colombo, A.1,2, Passalaqua, N.3; León A.E.1,4
1. ICYTAC, Universidad Nacional de Córdoba – CONICET
2. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales, Universidad Nacional de Córdoba.
3. CEPROCOR, Córdoba.
4. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba.
aaguirre@efn.uncor.edu
Resumen: Se prepararon películas en base a proteínas de triticale con actividad antimicrobiana por el
agregado de aceite esencial de orégano (AEO) y se evaluó su efecto sobre las propiedades mecánicas,
antimicrobianas y de barrera. El agregado de AEO no afectó la permeabilidad al vapor de agua de las
películas, pero aumentó su solubilidad en agua y el porcentaje de elongación (%E), mientras que redujo la
fuerza máxima de ruptura (TS) y el módulo elástico de Young. Las películas con AEO mostraron mayor
actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus que contra Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa. El efecto antimicrobiano del AEO fue incorporado y expresado en las películas de triticale, lo
cual ofrece una potencial alternativa para su uso en el embalado y conservación de alimentos.
Palabras clave: triticale, películas antimicrobianas, propiedades mecánicas, aceite esencial de orégano,
permeabilidad
Abstract: Antimicrobial triticale protein films were prepared by incorporating oregano esential oil (OEO).
The effect of different concentrations of OEO on antimicrobial activity and on mechanical and barrier
properties of films plasticized with glycerol were evaluated and compared with films without antimicrobial
agent. The addition of OEO did not affect the water vapor permeability of films, increased water solubility
and the percent elongation of the films, and reduced tensile strength and Young's modulus. Films with OEO
showed higher antimicrobial activity against the Gram positive bacterium S. aureus, and lower for Gram
negative (E. coli and P. aeruginosa). The obtained results proved the permanence of OEO in the polymer
matrix after processing, making them able to be used as active additives in film formulation.
Keywords. Triticale, antimicrobial film, mechanical properties, oregano essential oil, permeability
INTRODUCCION
En los últimos años se ha visto un interés creciente en desarrollar materiales con capacidad de formar
películas y con propiedades antimicrobianas, lo que ayudaría a mejorar la seguridad alimentaria y la vida
media de los alimentos (Dutta et al., 2009). En la preservación de los alimentos, una de las maneras de
introducir agentes activos es la incorporación de antimicrobianos en las películas de recubrimiento. La
aplicación directa de la sustancia activa por rociado, fumigación o inmersión no es efectiva, ya que dichas
sustancias pueden reaccionar con los componentes del alimento (incluso modificando las propiedades del
mismo), pueden evaporarse o difundir en los alimentos reduciendo su actividad antimicrobial, lo que resulta
en la necesidad de aplicar grandes concentraciones de antimicrobiano (Han y Floros, 1998, Kristo et al.,
2008).
En cambio, la incorporación de un biocida en el material de recubrimiento tiene varias ventajas, tales como
mantener la concentración del agente activo directamente en la superficie del alimento, disminuir las
posibilidades de que la sustancia activa se inactive por algún componente del alimento, todo ello sin
incorporar directamente el antimicrobiano como un aditivo (Comma, 2008).
Los antimicrobianos adecuados para incorporarlos en películas biodegradables en contacto con alimentos
pueden ser agrupados en varias categorías que incluyen: ácidos orgánicos (acético, benzoico, láctico,
propiónico y sórbico), ésteres de ácidos grasos (gliceril monolaurato), polipéptidos (lisozima, peroxidasa,
lactoferrina y nisina), aceites esenciales de plantas (canela, orégano, etc), nitritos y sulfitos (Rojas-Grau et
al., 2009).
Los aceites esenciales son líquidos aceitosos aromáticos obtenidos de plantas (de flores, brotes, semillas,
hojas, ramas, corteza, hierbas, maderas, frutas o raíces) y se pueden obtener por diferentes métodos. Se
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piensa que el término “aceite esencial” deriva del nombre acuñado en el siglo XVI por el médico suizo
Paracelsus von Hohenheim, que llamó así al componente efectivo de una droga Quinta essentia (Burt, 2004).
De los aproximadamente 3000 aceites esenciales que se conocen, son cerca de 300 los comercialmente
importantes y se destinan principalmente al mercado de las fragancias y aromatizantes. También se les
reconoce a los aceites esenciales propiedades antimicrobianas (Mourey y Canillac, 2002), antivirales
(Bishop, 1995), antimicóticas (Mari et al, 2003; Lucini, 2004; Lucini et al., 2006), antiparasitarias (Pandey et
al., 2000) e insecticidas (Konstantopoulou et al., 1992). Los aceites esenciales comprenden un gran número
de componentes y es probable que su modo de acción involucre varios objetivos en la pared celular. La
hidrofobicidad de los aceites esenciales los hace capaces de intercalarse entre los lípidos de la membrana
celular y de la mitocondria volviéndolas permeables y provocando así la pérdida de material celular (Burt,
2004).
Estudios de la actividad antimicrobiana de varios aceites esenciales han demostrado que el orégano
(Origanum vulgare) es uno de los agentes antibacterianos más efectivos (Friedman et al., 2002). El aceite
esencial de orégano (AEO) tiene actividad antimicrobiana contra varias especies de bacterias, tales como
Salmonella (Helander et al., 1998) y Escherichia coli O157:H7 (Burt y Reinders, 2003). Pelissari et al.,
(2009) han mostrado que películas de almidón y quitosano combinadas con AEO son efectivas contra
Bacillus cereus y Staphylococcus aureus.
En la literatura podemos encontrar numerosos trabajos que nos presentan datos sobre la composición de los
aceites esenciales (Delaquis et al., 2002; Burt, 2004) que pueden incluir hasta más de 60 componentes
individuales. Los componentes principales constituyen hasta un 85% del total mientras los demás están
presentes como trazas (Tabla 1).
Tabla 1. Componentes principales del aceite esencial de orégano que exhiben propiedades antibacterianas
Nombre
Componente
Composición
Referencias
principal
aproximada (%)
Origanum vulgare
Carvacrol
Trazas-80%
Prudent et al. (1995)
Timol
Trazas-64%
Charai et al. (1996);
Sivropoulou et al., (1996)
γ-Terpineno
2 –52%
Kokkini et al., (1997)
p-Cimeno
Trazas-52%
Marino et al. (2001)
Los componentes fenólicos tales como carvacrol, eugenol (2-metoxi-4-(2-propenil) fenol), y timol son los
responsables principales de las propiedades antibacterianas de los aceites esenciales (Cosentino et al., 1999;
Burt, 2004). El modo de acción es generalmente considerado la ruptura de la membrana plasmática,
interrumpiendo el flujo de electrones, el transporte activo, y/o la coagulación del contenido celular (Buró,
2004). También hay evidencias de que otros componentes que están en menor proporción tienen un papel
muy importante en la actividad antibacteriana, posiblemente produciendo un efecto sinérgico con otros
(Marino et al., 2001).
Los objetivos del presente trabajo fueron: incorporar aceite esencial de orégano a películas elaboradas con
proteínas de triticale, estudiar el efecto del agregado de aceite esencial de orégano sobre las propiedades
físicas, mecánicas, de barrera al vapor de agua de dichas películas y evaluar las propiedades antimicrobianas
de las películas de triticale.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las proteínas se extrajeron de harina de triticale según Aguirre et al., (2011). Las albúminas y globulinas se
extrajeron a partir de harina de triticale con una solución de NaCl al 5% con agitación durante una hora. Se
centrifugó a 10000xg durante 15 minutos y se descartó el sobrenadante. Al precipitado se lo dispersó en una
solución de etanol al 70% (v/v), con agitación durante una hora. Se centrifugó a 10000xg durante 15 minutos
y se descartó el precipitado. El sobrenadante constituye la fracción SI de proteínas de triticale. La obtención
de aceites esenciales (AE) a partir de hojas de orégano se realizó con la técnica de hidrodestilación utilizando
un aparato tipo Clevenger. Se usaron 200 g de hojas secas y la duración de hidrodestilación fue de 1 hora. El
estudio de los aceites esenciales se realizó por cromatografía gaseosa (GC) y cromatografía gaseosa acoplada
a espectrometría de masa (GC-MS). Las películas se realizaron según la técnica de evaporación del
9
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disolvente (“casting”). La solución formadora del film se preparó con 7,5% de proteínas de la fracción SI
(gramos por 100 mL de solución), 20% de glicerol (gramos por 100 gramos de proteína) y etanol al 70%
(v/v). A las soluciones formadoras de film se les agregaron distintas concentraciones de aceite esencial de
orégano (AEO): 0, 1 y 2 % (p/v). Se agitó 15 min y se colocaron 20 mL de las suspensiones en moldes
siliconados (12 cm de diámetro) que se secaron a 40 ºC en horno con circulación de aire. Las
concentraciones utilizadas en este estudio fueron un compromiso para obtener efectiva actividad
antimicrobiana sin afectar adversamente la aceptabilidad organoléptica de las películas. Las películas se
acondicionaron previamente a las mediciones durante 72 h en cámara adecuada a 32,78% de humedad
relativa (RH) con solución saturada de MgCl2 a 25 ºC. El espesor de las películas se midió con un
micrómetro (en 5 posiciones al azar) y el valor medio se utilizó para las mediciones de permeabilidad y
propiedades mecánicas. El contenido de agua, la solubilidad y la permeabilidad al vapor de agua de los films
se determinaron según Aguirre et al. (2011). Las propiedades mecánicas (fuerza máxima de ruptura,
porcentaje de elongación en la ruptura, módulo elástico de Young y fuerza máxima de punción al punto de
ruptura) se evaluaron con un texturómetro TA.XT2i-Stable Micro System (Surrey, Gran Bretaña). Se
determinó la actividad antimicrobiana de las películas con AEO por el método de difusión en disco, mediante
la medición de los halos de inhibición por análisis digital de imágenes con el programa Image J
(http://rsbweb.nih.gov/ij/). Se evaluaron las siguientes cepas patógenas Staphylococcus aureus (ATCC
29737), Escherichia coli (ATCC 25923) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Los datos obtenidos se
trataron estadísticamente mediante un análisis de varianza (Microsoft Excel 2000) y los resultados fueron
comparados por el Student’s t-test a un nivel de significación de p<0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El contenido de aceite esencial en nuestra muestra de orégano fue de 3,90 ± 0,25 mg/g hoja seca de orégano.
Los componentes principales encontrados fueron los monoterpenos hidrato de trans-sabineno (34,30%),
timol (17,93%) y carvacrol (3,8%). La estructura química de los componentes del aceite esencial afecta su
modo de acción y su actividad antibacteriana (Dorman y Deans, 2000). En general, los aceites esenciales que
poseen más actividad antibacteriana contienen un alto porcentaje de carvacrol y/o timol (Gutierrez et al.,
2008). La importancia de la presencia de grupos oxhidrilo en dichos compuestos fenólicos ha sido
confirmada por Dorman y Deans (2000). También es importante la presencia de estos dos compuestos
fenólicos juntos, ya que el trabajo de Lambert et al., (2001) mostró que la combinación de carvacrol y timol
eran aditivas contra S. aureus y P. aeruginosa. El compuesto β cariofileno, también presente en el aceite
esencial utilizado, tiene actividad antimicrobiana contra las bacterias Gram-positivas, según el trabajo
publicado por Longaray Delamar et al. (2005).
El agregado de aceite esencial de orégano no produjo diferencias significativas en los valores de espesor de
las películas. La Tabla 2 muestra que la incorporación de AEO no afectó significativamente el contenido de
humedad de los films de triticale excepto para aquellos con 2% de concentración de AEO, en los cuales se
observó un incremento del 28%. La adición de AEO en las concentraciones de 0,5, 1 y 1,5% (p/p) tampoco
afectó significativamente el contenido de agua de films de proteínas de suero de leche (Zinoviadou et al.,
2009)
Tabla 2. Efecto de la concentración de aceite esencial de orégano sobre el contenido de humedad,
solubilidad en agua y permeabilidad al vapor de agua (WVP) de las películas de proteínas de triticale
de Contenido
de Solubilidad
WVP x 1010
humedad
(%)
(g m-1 s-1 Pa-1)
(%)
0
11,83 ±1,03a
41,22±0,09 a
0,33±0,04 a
1
11,43±1,02 a
45,91±0,36 b
0,35±0,05 a
b
b
2
15,15±0,82
46,48±0,49
0,40±0,05 a
Cada valor es el promedio ±desviación estándar de los resultados obtenidos. Diferentes letras en la
misma columna indica diferencias significativas (p<0,05)
Aceite esencial
orégano (%)
La incorporación de AEO aumentó la solubilidad en agua de las películas de triticale (Tabla 2) con respecto
al control (sin AEO) pero no hubo diferencias significativas entre las dos concentraciones de aceite esencial
incorporado. Este aumento en la materia soluble podría ser debido a una menor densidad de interacción de la
10
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red polimérica por la presencia de AEO, ya que la interacción entre glicerol y polifenoles afecta las
propiedades de solubilidad de los films debido a las similitudes en su estructura (por ej. grupos OH).
Se midió la permeabilidad al vapor de agua de las películas de proteínas de triticale adicionadas con aceite
esencial de orégano a una diferencia de presión de vapor de 0-60% HR a través del film. La Tabla 2 muestra
que la incorporación de aceite esencial de orégano no afectó significativamente la permeabilidad al vapor de
agua de las películas de proteínas de triticale. La hidrofobicidad de la compleja mezcla que es el AEO a las
concentraciones usadas en este estudio no fue suficiente para neutralizar el carácter hidrofílico de las
proteínas de triticale y del glicerol usado en la formulación del film, ya que la permeabilidad al vapor de
agua depende de la relación hidrofílico/hidrofóbico de los constituyentes del film (Pelissari, 2009).
Resultados similares a los presentes fueron encontrados para películas de proteínas de suero de leche, en las
cuales la incorporación de AEO no afectó la permeabilidad al vapor de agua en ninguna de las
concentraciones utilizadas (Zinoviadou et al., 2009).
Las propiedades mecánicas de las películas estudiadas se muestran en la Tabla 3. La fuerza máxima de
ruptura (TS) fue afectada por la incorporación de AEO: a mayor concentración de aceite esencial, menor TS.
La adición de AEO disminuyó significativamente el módulo elástico de Young (EM) y por lo tanto produjo
films menos rígidos.
Tabla 3. Efecto de la concentración de aceite esencial de orégano sobre las propiedades mecánicas y ensayo
de punción de las películas de proteínas de triticale
Aceite esencial de Fuerza
Módulo
Elongación a Fuerza
orégano (%)
máxima
de elástico
de la
ruptura máxima
de
ruptura (MPa) Young (MPa)
(%)
punción (N)
0
2,90 ±0,03a
147,59±0,71 a
9,67±1,25a
1,17±0,17a
a
b
b
1
2,08±0,19
82,53±11,22
12,10±0,26
1,04±0,43 a
b
c
c
2
0,85±0,16
21,75±10,58
84,56±5,18
0,98±0,29a
Cada valor es el promedio ±desviación estándar de los resultados obtenidos. Diferentes letras en la
misma columna indica diferencias significativas (p<0,05)
Similar tendencia fue encontrada en películas de almidón de mandioca y quitosano con AEO (Pelissari et al.,
2009) y en películas de proteínas de suero de leche (Zinoviadou et al., 2009). La incorporación de AEO al
2% afectó significativamente la Elongación a la ruptura (%E) de las películas de triticale que aumentó desde
9,67% (sin AEO) a 84,56% (2% AEO). Zivanovic et al. (2005) observaron una disminución en TS y un
incremento en %E en films de quitosano combinado con aceites esenciales, mientras que Pelissari et al.,
(2009) observaron la misma tendencia en películas de almidón de mandioca y quitosano con AEO. En
películas de proteínas de suero de leche (Zinoviadou et al., 2009) la incorporación de AEO produjo un
incremento en %E cuando su concentración fue hasta 1% (p/p) de la solución formadora de film. El agregado
de AEO a las películas de proteínas de triticale produjo que la matriz de los films fuera menos densa, lo que
facilitó el movimiento de las cadenas poliméricas de proteínas, mejoró la flexibilidad de los films y produjo
películas menos rígidas, el comportamiento típico de pequeñas moléculas que causan plastificación en un
biopolímero. La incorporación de AEO no afectó significativamente la fuerza máxima de punción (FP) de las
películas de proteínas de triticale.
Las películas preparadas con AEO fueron evaluadas contra microorganismos para determinar la actividad
antimicrobiana de las mismas (Figura 1 y Tabla 4). Las películas de proteínas de harina de triticale sin AEO
no inhiben el crecimiento de los microorganismos estudiados. El efecto inhibitorio de los AEO fue
incorporado y expresado en las películas de triticale, ya que las zonas de inhibición aumentaron
significativamente con el incremento de la concentración de AEO.
11
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
2%
1%
Figura 1. Zonas de inhibición de las películas de proteínas de triticale con aceite esencial de orégano contra
E. coli, S. aureus y P. aeruginosa. C: control
Los mayores halos de inhibición se observaron para la bacteria Gram positiva S. aureus, mientras los
menores para las Gram negativo (E. coli y P. aeruginosa). La concentración de 1% AEO no fue efectiva
contra P. aeruginosa. Numerosos estudios coinciden en que los aceites esenciales son más efectivos contra
las bacterias Gram-positivas que contra las Gram-negativas (Burt, 2004; Pelissari et al., 2009). Este resultado
podría deberse a la presencia de una membrana externa adicional alrededor de la pared celular en las
bacterias Gram-negativas, la que restringe la difusión de compuestos hidrofóbicos a través de su cubierta
lipopolisacárida (Burt, 2004).
El mecanismo propuesto por Zivanovic et al., (2005) para la actividad antimicrobiana de los compuestos
fenólicos de los aceites esenciales es su ataque a los fosfolípidos de la membrana celular, lo que causa un
incremento en la permeabilidad y pérdida de citoplasma, o su interacción con enzimas localizadas en la pared
celular. Así, la resistencia de las bacterias Gram-negativas a los aceites esenciales residiría en el rol de
protección de los lipopolisacáridos de su pared celular o en las proteínas extrínsecas de membrana.
Dadalioglu y Evrendilek (2004) atribuyen la actividad antimicrobiana del AEO a dos componentes: el
carvacrol (compuesto fenólico) y p-cimeno (monoterpeno). Buró (2004) describe la acción del carvacrol
como de desintegración de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas seguido de la liberación de
los lipopolisacáridos presentes, lo que resulta en un incremento en la permeabilidad de la membrana
citoplasmática al ATP. Aunque el aceite esencial usado en este estudio no tenía como uno de sus
componentes de mayor concentración al carvacrol, la presencia de los componentes que están en menor
concentración tienen gran importancia también, ya que pueden tener un efecto sinérgico que potencie su
influencia en la actividad del aceite esencial (Burt, 2004; Gutierrez et al., 2008). La concentración de pcimeno en nuestra muestra fue de 0,93%, pero se ha descripto sinergismo entre ellos. El componente pcimeno en sí es un débil antibacteriano, pero produce hinchamiento de la membrana celular de las bacterias y
así probablemente permita que el carvacrol ingrese más fácilmente a la célula bacteriana (Ultee et al., 2000).
12
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tabla 4. Actividad antimicrobial de películas de proteínas de triticale enriquecidas con aceite esencial de
orégano.
Zona de inhibición (mm)
Concentración de aceite esencial de orégano
Microorganismo
0%
1%
2%
E. coli
0
10,81±1,59
21,53±2,05
S. aureus
0
166,90±4,07
342,36±10,63
P. aeruginosa
0
0
9,70±1,07
Diferentes letras en la misma columna indica diferencias significativas (p<0,05)
Entre las bacterias Gram-negativas, P. aeruginosa, presenta la característica particular de ser la menos
sensible a la acción de los aceites esenciales (Cosentino et al., 1999; Dorman y Deans, 2000; Wilkinson et
al., 2003, Gutiérrez et al., 2008). Dicha resistencia intrínseca es debida a la barrera de la membrana exterior
de la bacteria (Mann et al., 2000). Los presentes resultados mostraron que dicha tendencia se da también
cuando el aceite esencial es vehiculizado en una película biodegradable como en este estudio.
La incorporación de AEO al 1% a películas de proteínas de suero de leche fue efectiva contra E. coli
O157:H7 y Pseudomonas spp (Oussallah et al., 2004). La actividad antimicrobiana del aceite esencial de
orégano también fue expresada en películas de proteínas de suero de leche (Seydim y Sarikus, 2006). En
estas películas la mínima cantidad de AEO efectiva contra los organismos estudiados (L. plantarum, S.
enteritidis, E. coli, L. monocytogenes y S.aureus) fue del 2% (p/v de solución formadora de film) (Seydim y
Sarikus, 2006). En películas de soja, un aumento en la concentración de AEO resultó en mayor actividad
antimicrobiana (medida como diámetro de inhibición) contra S. aureus hasta una concentración de 3%
(Emiroglu et al., 2010). Estas películas también mostraron actividad antimicrobiana contra E.coli y P.
aeruginosa. Se puede concluir que la fuente, la composición y la concentración de compuestos activos del
extracto usado tuvieron un efecto crucial sobre la actividad biológica de las películas.
En algunos casos la actividad del aceite esencial disminuye considerablemente cuando se lo incorpora a un
sistema complejo (Gutiérrez et al., 2008). Es por ello que un aspecto importante de la aplicación de aceites
esenciales de plantas es la evaluación de su eficacia en el sistema a utilizar. El trabajo de Baranauskiene et
al. (2006) muestra que las proteínas usualmente poseen una alta capacidad de unirse a compuestos volátiles
aromáticos. Otros estudios han mostrado que las proteínas de leche son factores limitantes en el poder
biocida (Devlieghere et al., 2004), aunque en la literatura es posible encontrar películas elaboradas con
proteínas que poseen actividad antimicrobiana (Zivanovic et al., 2005; Oussallah et al., 2004; Kristo et al.,
2008). El presente trabajo mostró que la actividad antimicrobiana de los AEO pudo ser expresada en las
películas de proteínas de triticale.
La aplicación de AE a películas está limitada por los cambios organolépticos que pueden ocurrir y la calidad
de los films obtenidos. Como la actividad antimicrobiana depende no sólo de la composición química, sino
también de las propiedades lipofílicas, la potencialidad de los grupos funcionales o la solubilidad en agua
(Dorman y Deans, 2000), la mezcla de componentes con diferentes propiedades bioquímicas pueden
modificar la eficacia de los aceites esenciales. Pero los resultados obtenidos en este estudio mostraron que las
películas de proteínas de triticale pueden ser portadoras eficaces de las propiedades antimicrobianas del
aceite esencial de orégano.
13
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Films biodegradables de PLA plastificados con tres plastificantes diferentes para su aplicación en el
envasado de alimentos
Arrieta M.P.1,2, Aleu G.2, Zogbi A.P.2, López J.1
1: Instituto de Tecnología de Materiales- Universidad Politécnica de Valencia, Alcoy, España.
2: Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Católica de Córdoba, Córdoba, Argentina.
marrieta@itm.upv.es
Resumen: El poli(ácido láctico) (PLA) es uno de los polímeros biodegradables más prometedores para films
para el envasado de alimentos debido a su biodegradabilidad, transparencia, origen renovable, bajo precio y
disponibilidad en el mercado. Sin embargo, en la producción de films, el PLA presenta algunas desventajas,
en sus propiedades mecánicas que hacen necesaria la adición de plastificantes. Así, el PLA plastificado con
acetil-tri-n-butil citrato (ATBC) y poli(etilenglicol) (PEG) ha sido reportado. Recientemente se ha propuesto
al limoneno como un monómero nuevo. El limoneno es el componente principal de los aceites de cítricos,
siendo el residuo más importante en la industria de cítricos.
En este trabajo se ha plastificado PLA con ATBC, PEG y limoneno. La estructura superficial se evaluó por
microscopía electrónica de barrido (SEM) observándose superficies homogéneas en todos los casos. La
influencia del proceso de plastificación fue determinada mediante ensayos de tracción según la norma
ASTM-D882. El efecto del plastificante en los films de PLA se caracterizó por un aumento en el
alargamiento a la rotura, y una disminución en el módulo elástico y la resistencia a la tracción. Las
propiedades ópticas se determinaron mediante el espacio colorimétrico CIELAB. No se observaron grandes
diferencias entre PLA-plastificado y PLA puro.
Palabras clave: films biodegradables, PLA, plastificantes, envases alimentarios.
Abstract: Poly(lactic acid) (PLA) seems to be the most promising biodegradable polymer for film food
packaging applications due to its biodegradation, superior transparency, being obtained from renewable
resources, low price and its availability in the market. However, in film production, PLA presents some
disadvantages, such as their poor mechanical properties which make necessary the addition of plasticizing
compounds. In this sense, it has been reported PLA plasticized with acetyl tri-n-butyl citrate (ATBC) and
poly(ethylene glycol). Alternatively, recent studies have been conducted on the use of limonene as new novel
monomer. Limonene is the main component of citrus oils, being the most important residue in the citrus
industry.
In this work PLA was plasticized with ATBC, PEG and limonene. The surface structure of films was
evaluated by scanning electron microscopy (SEM). Homogeneous surfaces were observed in all cases. The
influence of plasticization process was determinate by tensile testing according to ASTM-D882 Standard.
The effect of plasticizer in PLA films was characterized by an increase in the elongation at break and a
decrease in the elastic modulus and tensile strength. Optical properties were determined by using CIELab
colour space. There were no big differences between plasticized-PLA and the pure PLA films colour
properties.
Keywords: biodegradable films, PLA, plasticizer, food packaging.
INTRODUCCIÓN
La actitud de la sociedad cada vez más proactiva hacia una reducción en el impacto ambiental ha centrado la
atención de numerosos investigadores con la finalidad de encontrar soluciones rentables y compatibles con la
minimización y/o reutilización de residuos. En este sentido, no se puede ignorar el creciente problema
referido a la gran cantidad de residuos plásticos derivados de los envases alimentarios que se acumulan y el
impacto que éstos producen sobre el medio ambiente. La necesidad de ahorrar recursos y de minimizar
residuos conduce a la demanda del desarrollo de nuevos materiales para la industria alimentaria. La
revalorización de materiales plásticos a través del reciclado está ampliamente extendida. Sin embargo,
presenta algunas limitaciones relacionadas con las dificultades para encontrar salidas precisas y
económicamente viables (Averous 2004). Por otra parte, los sistemas de reciclaje exigen un cierto grado de
pureza y una clasificación de alta precisión. Además, los costos de recogida son bastante altos, y el reciclado
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
tiene un impacto negativo en la calidad de los materiales, tales como un aumento de la fragilidad (Koller et
al. 2010). En este sentido, los envases de materiales biodegradables han cobrado especial interés en la
industria debido a que representan una alternativa para remplazar a los polímeros convencionales derivados
del petróleo comúnmente utilizados (Arrieta et al. 2012). De entre todos los polímeros biodegradables
estudiados, el poli(ácido láctico) (PLA) se ha posicionado en el mercado como el polímero biodegradable
más prometedor para su aplicaciones de envasado de alimentos debido a una serie de propiedades ventajosas
que presenta. El PLA es un biopoliéster obtenido de la polimerización del ácido láctico, donde los
monómeros de partida son producidos por fermentación o síntesis química (Jamshidian et al. 2010). Es un
polímero termoplástico, que puede obtenerse a partir de fuentes renovables, productos agrícolas simples,
como el maíz (Auras et al. 2004; Martino et al. 2009). Además, el PLA es un material biodegradable
(Fortunati et al. 2012), presenta una eleva transparencia (Auras et al. 2004), bajo costo (Badía et al. 2011) y
se encuentra disponible en el mercado (Auras et al. 2004). Por otra parte, el PLA está reconocido como
material seguro en aplicaciones de envasado de alimentos, clasificado como GRAS (de sus siglas en inglés
Generally Recognized As Safe) por la FDA (Food and Drug Administration) (FDA, 2005). Uno de los
campos de aplicación más desarrollados para el PLA en la industria de envasado de alimentos es como film.
Sin embargo, en la producción de films, se ha encontrado que el PLA presenta algunas desventajas, tales
como sus pobres propiedades mecánicas que hacen necesaria la adición de plastificantes. Para poder
adicionar un plastificante a la matriz de PLA, se debe tener en cuenta que la selección de los plastificantes
está limitada por los requisitos de buena miscibilidad con la matriz polimérica y que no deben presentar
toxicidad para la aplicación final. Se ha sugerido al poli(etilen glicol) (PEG) y citrato de acetil tri-n-butilo
(ATBC) como buenos candidatos para la plastificación de polímeros destinados al envasado de productos
alimenticios debido a que estos plastificantes se encuentran aprobados para el contacto con los alimentos por
la legislación Europea (Corgneau et al. 2011). Por otra parte, estudios recientes han propuesto el uso de
limoneno como un nuevo monómero. El limoneno es el componente principal de los aceites de cítricos
siendo además el residuo más importante en la industria de los cítricos (Singh & Kamal, 2012), por lo que
resulta interesante en términos medioambientales revalorizar este subproducto al usarlo como plastificante.
El principal objetivo de este trabajo es desarrollar films biodegradables de PLA-plastificado con tres
diferentes plastificantes para el envasado alimentario. Se realizó las mezclas de los materiales a 170ºC y se
obtuvieron en formato de films por moldeo por compresión. Posteriormente se realizó una caracterización
mecánica y superficial para evaluar su posible aplicación en el envasado de alimentos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Polímeros y plastificantes
El PLA en formato de pellet (PLA 4032D, Mn=217000 Da, 2 wt% D-isomero) fue suministrado por
NatureWorks (USA). El ATBC (Mw= 402 g/mol, 98% de pureza) y PEG (Mn= 300) fueron suministrados
por Sigma Aldrich (Móstoles, Madrid España). El limoneno (Mw= 136,24 g/mol, 97% de pureza) fue
suministrado por Acros Organic (USA).
Preparación de las muestras de films
Los plastificantes, ATBC, PEG y limoneno, fueron añadidos en concentraciones de 15% en peso. Las
mezclas de PLA y los distintos plastificantes se realizaron en una mezcladora Haake PolyLab QC (Thermo
Fischer Scientific Inc., Waltham, USA) a 170 ºC a una velocidad de rotación constante de 50 rpm durante 8
min. Una vez obtenidas las mezclas homogéneas, los films se prepararon por moldeo por compresión en una
prensa de platos calientes (Mini C 3850, Caver, Inc. USA) a 170 ºC y aplicando un ciclo de presión de (5
min sin aplicar presión, seguido de 1 min a 2 MPa, 1min a 3,5 MPa y finalmente mantenido 5 min a 3,5
MPa).
Caracterización de las nuevas formulaciones
El estudio de la morfología de la superficie de las muestras se realizó mediante microscopía electrónica de
barrido (SEM). Para ello, se utilizó un microscopio Phenom (FEI Company, Eindhoven
The Netherlands) con una aceleración electrónica de 10kV. Las micrografías se obtuvieron a
magnificaciones de 1000x. Las muestras fueron previamente metalizadas con un metalizador EMITECH
SC7620 (EMITECH, UK) con una fina capa de oro, con la finalidad de poder hacerlas conductoras.
Las propiedades mecánicas a tracción se llevaron a cabo con una máquina de ensayos universales Single
Column System Instron Instrument Modelo 3344 (Fareham Hants, UK) equipada con una célula de carga de
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5 kN. Las probetas (10 x 100 mm) se colocaron a una distancia entre mordazas de 50 mm, sometidas a una
velocidad de elongación de 25 mm min-1 y se estudiaron de acuerdo a la norma ASTM D882-91-01 (ASTM,
2001).
El estudio colorimétrico se realizó mediante el uso de un espectrofotómetro visible COLORFLEX-DIFF2
45º/0º HunterLab, (Hunter Associates Laboratory, Inc., Reston, Virginia, USA) y se evaluaron los
parámetros L*, a* y b* del espacio colorimétrico CIELab.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la Figura 1 se muestran las micrografías 1000x de la superficie de PLA y PLA-plastificado con los tres
plastificantes utilizados, obtenidas por microscopía electrónica de barrido. Todas las formulaciones
mostraron una superficie homogénea sin separación de fases ni formación de aglomerados, lo que indica una
correcta incorporación del plastificante a la matriz polimérica durante el procesado.
Figura 1. Micrografía SEM (1000x) de la superficie de los films: a) PLA, b) PLA-ATBC, c) PLA-PEG y d)
PLA-limoneno.
Los resultados obtenidos a partir del ensayo de tracción tanto de módulo elástico de Young, E, como de
resistencia a la tracción, TS (Figura 2), brindaron información sobre las propiedades de resistencia y de
ductilidad de los nuevos materiales. La adición de plastificantes a la matriz polimérica tiene la finalidad de
disminuir la fragilidad del PLA. De esta manera, todas las formulaciones plastificadas obtenidas presentaron
menor fragilidad que el film de PLA puro, revelando valores menores tanto de E como de TS para los tres
plastificantes. El ATBC y limoneno fueron los plastificantes que generaron una mayor reducción de E (775
± 207 MPa y 839 ± 161 MPa, respectivamente), presentando un comportamiento muy similar entre ellos. Así
mismo, estos dos plastificantes exhibieron valores similares de TS (23,4 ± 6,2 MPa y 24,6 ± 2 MPa,
respectivamente), generando materiales con mayor ductilidad que el PLA puro. En el caso de PEG, la
reducción de E con respecto al film de PLA puro es menor que para los otros dos plastificantes. Por lo tanto
PEG, prácticamente no consigue disminuir la rigidez del PLA. Sin embargo, PLA-PEG es el film que
presentó menor valor de TS demostrando que PEG es capaz de aumentar la ductilidad del PLA.
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Figura 2. Resultados de E y TS de los films de PLA y PLA-Plastificado (n=5)
Como era de esperar, la adición de plastificantes generó materiales más extensibles que el film de PLA puro
en todos los casos. En la Figura 3 se muestran los resultados obtenidos mediante el ensayo de tracción de
porcentaje de deformación a la rotura. Se puede observar que el aumento en la flexibilidad de los materiales
plastificados es muy bajo en el caso de PEG, siendo el porcentaje de deformación a la rotura de 1,5% para el
film de PLA puro y el film de PLA-PEG alcanza valores de tan sólo un 10%, mientras que PLA-ATBC y
PLA-limoneno alcanzan valores de 240% y 200%, respectivamente. Este efecto destaca la eficiencia de
ATBC y limoneno para plastificar al PLA.
Figura 3. Resultados de deformación a la rotura de los films de PLA y PLA-Plastificado (n=5).
En un film destinado al envasado de alimentos la transparencia y el color resultan propiedades claves, dado
que los consumidores prefieren aquellos envases que les permitan observar el alimento que contiene. Por lo
tanto para obtener una medida cuantitativa de las propiedades ópticas de los nuevos materiales se llevó a
cabo un análisis de medición de color mediante espectrofotometría visible utilizando el espacio colorimétrico
CIELab. Los parámetros obtenidos fueron la luminosidad (coordenada L*) y cromaticidad (a* y b*). Para
poder comparar los films plastificados con el film de PLA puro, se utilizó el parámetro diferencia de color,
∆E*, para lo cual se tomo el film de PLA puro como muestra de referencia. La diferencia de color existente
entre una muestra de referencia y una muestra de ensayo, viene dado por la Ecuación 1.
Donde:
∗
∆
= √(∆∗ )2 + (∆∗ )2 + (∆ ∗ )2
(1)
∆∗ = ∗ − ∗
(2)
∗
∗
∆∗ = 
− 
(3)
∗
∗
∆ ∗ = 
− 
(4)
En la Tabla 1 se expresan los valores de las coordenadas L*, a* y b* como un promedio de 5 medidas
tomadas en distintas partes de cada uno de los film seleccionadas al azar y el valor calculado de ∆E*, para
todas las formulaciones ensayadas.
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Tabla 1. Resultados de las coordenadas CIELab y ∆E* obtenidos para PLA y PLA-Plastificado (n=5)
Films ensayados
L*
PLAa
94,08 ± 0,07
PLA-ATBC
93, 46 ± 0,06
PLA-PEG
91,03 ± 0,15
PLA-limoneno
93,86 ± 0,09
a
Coordenadas cromáticas de referencia.
a*
-1,03 ± 0,01
-0,77 ± 0,14
-0,81 ± 0,17
-0,99 ± 0,01
b*
1,33 ± 0,05
1,36 ± 0,06
1,58 ± 0,04
1,27 ± 0,06
∆E*
0,67 ± 0,01
3,07 ± 0,08
0,24 ± 0,04
Debido a su elevada transparencia, el film de PLA puro presentó mayor valor de L*. La adición de
plastificante disminuye ligeramente los valores de la coordenada L*. Sin embargo esta disminución es tan
pequeña que no altera la elevada transparencia de las muestras. La coordenada a* mide la saturación,
definiendo el eje rojo/verde como la desviación del punto acromático correspondiente a la luminosidad L*,
hacia el rojo si a* > 0 o hacia el verde si a* < 0. Los valores de a* resultaron negativos en todos los casos
indicando una ligera desviación de la coordenada L* hacia el color verde. Por su parte, la coordenada b*
define el eje amarillo/azul. Si b* > 0 desvía L* hacia el amarillo y si b* < 0 desvía L* hacia el azul (Arrieta et
al. 2011). Los valores de b* obtenidos indican una ligera desviación de L* hacia el amarillo. Sin embargo,
cabe destacar que los valores de a* y b* resultaron muy próximos a cero en todos los films ensayados,
indicando que las muestras de PLA y PLA-plastificadas carecen prácticamente de coloración perceptible
para el ojo humano. Durante la inspección visual, no se observa diferencia aparente entre PLA, PLA-ATBC
y PLA-limoneno. Sin embargo al comparar PLA con PLA-PEG, se observa que este último presenta una
ligera coloración blanquecina prácticamente despreciable.
CONCLUSIONES
Se han desarrollado materiales para su aplicación en el envasado de alimentos a partir de materiales
biodegradables y autorizados para el contacto con alimentos. Se ensayaron tres plastificantes, dos de ellos
frecuentemente utilizados para plastificar el PLA, ATBC y PEG. Se propone como alternativa al limoneno
como un plastificante innovador, que cumple con los requisitos necesarios para la aplicación final:
autorizado para el contacto con alimentos, biodegradable y compatible con la matriz polimérica. Además,
otra ventaja del uso del limoneno como plastificante es la revalorización de un subproducto de la industria
cítrica. La microscopía electrónica permitió observar que los plastificantes ATBC, PEG y Limoneno
mostraron buena compatibilidad con la matriz polimérica del PLA, formando films homogéneos y sin
separación de fases en todos los casos. Para evaluar la eficiencia de la plastificación de las nuevas
formulaciones se realizaron ensayos mecánicos de tracción. Se observó un excelente equilibrio de
propiedades mecánicas al plastificar PLA con ATBC, PEG y limoneno. La adición de los diferentes
plastificantes en cada una de las formulaciones se caracterizó por una mejora en las propiedades dúctiles del
material con un aumento en la elongación en el punto de rotura, además de a una reducción en el módulo
elástico de Young y resistencia a la tracción. El PEG resultó el plastificante que menores cambios produjo en
las propiedades mecánicas del material. Por su parte, ATBC resultó el plastificante más eficaz dado que
produjo el mayor aumento de la ductilidad del PLA. Por su parte el limoneno aumentó significativamente las
propiedades extensibles del PLA revelando valores comparables a los obtenidos con ATBC. Así mismo, se
obtuvieron formulaciones con una elevada transparencia y prácticamente incoloras, siendo este un factor
muy importante para un envase alimentario a la hora de ser elegido por el consumidor. Se puede concluir que
el limoneno puede considerarse con un plastificante alternativo para la plastificación del PLA en la industria
del envasado de alimentos.
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AGRADECIMIENTOS
Marina P. Arrieta agradece a la Generalitat Valenciana por la beca otorgada para la formación del personal
investigador en centros de investigación de la Comunitat Valenciana a través del programa Santiago Grisolía
(GRISOLIA/2011/007). Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia de España
a través del proyecto MAT2011-28468-C02-02.
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Efecto protector de β-caroteno microencapsuado en goma arábiga sobre la fotooxidación de lípidos en
leche
Boiero L.1, Rodriguez-Estrada M.2, Mandrioli M.2, Montenegro M.1,3, García N.4
1. Dpto. de Química, Facultad Regional Villa María, UTN, Villa María, Córdoba, Argentina.
2. Dpto de Ciencias de Alimentos. Universidad de Bologna, Bologna, Italia.
3. Inst. de Ciencias Básicas y Aplicadas, UNVM, Villa María, Córdoba, Argentina.
4. Dpto. de Química, UNRC, Río Cuarto, Córdoba, Argentina.
lboiero@frvm.utn.edu.ar
Resumen La leche es almacenada expuesta a luz fluorescente, para atraer la atención del consumidor. Esto
puede desencadenar un proceso de fotosensibilización, afectando la calidad del alimento. En este trabajo, se
estudió el efecto protector de β-caroteno microencapsulado en goma arábiga (Bc-GA) y el material de pared
de la cápsula (GA), sobre las alteraciones nutricionales (oxidación de lípidos) y organolépticas (desarrollo de
off-flavor), fotoinducidas en leche.
Los resultados obtenidos demuestran un % Inhibición en la formación de Sustancia Reactivas con Ácido
Tiobarbitúrico (TBARs) máximo del 60% y del 50% por la adición de GA y Bc-GA, respectivamente, la
Inhibición del Número de Peróxidos en Lípidos (POVs) fue del 35% por acción de la GA. Tanto GA como
Bc-GA ejercen un efecto de inhibición sobre la producción de los volátiles mayoritarios con valores
máximos entre 36 y 57%.
Este efecto protector de GA y Bc-GA puede deberse a la capacidad de desactivación de oxígeno molecular
singulete (1O2), y especies Reactivas de Oxígeno (EROS) como el OH, además de un efecto de filtro interno.
Lo que indica que la adición de pequeñas cantidades de Bc-GA ejercerá un efecto protector sobre la
fotooxidación de lípidos y el desarrollo de off-flavor en leche.
Palabras claves: Fotooxidación, carotenoides, fotoprotección, lípido, leche.
Abstract Milk it’s stored exposed to fluorescent light, at the supermarket, to take attention from consumers.
This can generate a photosensiblization process, affecting food’s quality.
In this work, we studied the protective effect of β-carotene microencapsulated in gum arabic (Bc-GA) and
the wall material (GA) on the nutritional alterations (lipid oxidation) and organoleptic (development of offflavor), photoinduced in milk.
The results obtained show a maximum inhibition in the formation of thiobarbituric acid reactive substance
(TBARS) % of 60% and 50% by the addition of GA and Bc-GA, respectively, the Inhibition of Number of
Lipid Peroxides (POVs) was 35% by GA adding. Both GA and Bc-GA exert an inhibitory effect on volatiles
production with higher values between 36 and 57%.
The protective effect of GA and Bc-GA capacity may be due to deactivation of singlet molecular oxygen
(1O2), and reactive oxygen species (ROS) such as HO, plus an internal filter effect. This indicate that the
addition of small amounts of Bc-GA exert a protective effect on the photooxidation of lipids and the
development of off-flavor in milk.
Keywords: Photooxidation, carotenoids, photoprotection, lipids, milk.
INTRODUCCIÓN
La oxidación de lípidos es un proceso complejo, que lleva a la formación de diferentes compuestos. En
estadíos tempranos, ocurre una oxidación primaria, formando hidroperóxidos alquílicos como productos. Sin
embargo, estos hidroperóxidos son inestables, por lo que se descomponen en una variedad de productos de
oxidación secundarios, tales como hidrocarburos, alcoholes, aldehídos, cetonas, alguno de los cuales sufren
reacciones como ruptura, generando compuestos de menor peso molecular (Gunstone et al. 2007). Esta es
promovida por iniciadores como, elevadas temperaturas, irradiación UV-Visible, oxígeno y metales. En el
proceso de fotooxidación, está involucrado un sensibilizador (S), el cual es un compuesto que posee la
capacidad de absorber radiación UV cercana y luz visible azul ( < 500 nm) generando un estado singulete
excitado (1S) (Skibsted 2010). En la leche, está involucrada la Riboflavina (Rf) como un sensibilizador, la
cual absorbe luz, para formar el estado triplete excitado (3Rf), que reacciona con componentes de la leche en
22
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
presencia de oxígeno, generando especies reactivas de oxigeno (EROS), tales como: radicales hidroxilo
(HO), peroxilo (HOO), anión superóxido (O2) y oxígeno molecular singulete (1O2). Estas especies pueden
causar oxidación de vitaminas y lípidos, con producción de compuestos volátiles de bajo peso molecular,
responsables de off-flavour, generando alteración de la calidad nutricional y flavor de la leche, haciéndola
menos aceptable para los consumidores.
El efecto perjudicial de las EROS en alimentos, y seres vivos es balanceado por un sistema de defensa
antioxidante, endógeno o exógeno, que por desactivación de radicales libres, previene el daño oxidativo y en
consecuencia, el desarrollo de enfermedades tales como cáncer, arteriosclerosis y artritis, entre otras
(Halliwell 1999). La leche y los productos lácteos, poseen protección natural contra las degradaciones
oxidativas, desarrollada por componentes minoritarios con actividad biológica tales como enzimas,
carotenoides y vitaminas. Sin embargo, en muchos casos, estos componentes ¨protectores¨ son perdidos
durante el procesamiento y almacenamiento. Por esta razón, una manera de prevenir el deterioro en la
calidad de los alimentos, es la adición exógena de compuestos con actividad antioxidante.
La tendencia actual es la de emplear antioxidantes (AOx) de origen natural, debido a los posibles efectos
perjudiciales presentados por los AOx sintéticos tradicionalmente utilizados en la industria de alimentos. En
tal sentido, los carotenoides son importantes AOx naturales, ya que son eficientes desactivadores de EROS,
protegiendo a compuestos biológicos de la acción dañina de las mismas (Liebler 1993, Montenegro et al.
2001, Montenegro et al. 2004, Palozza 1992). Sin embargo, debido a la estructura química altamente reactiva
e hidrofóbica de los carotenoides, una manera de estabilizarlos y solubilizarlos en matrices acuosas para su
empleo como AOx en medios biológicos, es la microencapsulación con biopolímeros. Comúnmente, para su
adición en alimentos, se utilizan polisacáridos comestibles, tales como goma arábica, maltodextrinas, etc.
generando una pared que recubre y protege al carotenoide (Barbosa et al. 2005, Shu et al. 2006, Borgogna et
al. 2010).
El objetivo del trabajo fue evaluar el efecto protector de β-caroteno microencapsulado en goma arábiga (BcGA) y el material de pared de la cápsula (GA), sobre las alteraciones nutricionales (oxidación de lípidos) y
organolépticas (desarrollo de off-flavor), fotoinducidas en leche.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras de leche
Se realizaron ensayos de fotodegradación de muestra de leche en polvo entera, reconstituida según
indicación del fabricante, colocando fracciones medidas (500 mL) en frascos de vidrio (corte en λ  310
nm), con y sin adición Bc-GA y GA, almacenadas a temperatura de 4°C bajo iluminación con lámparas
fluorescentes, en ciclos discontinuos de luz y oscuridad, durante 7 días, simulando las condiciones de
almacenamiento en góndola. En las mismas condiciones se realizó un control, manteniéndolo en oscuridad.
Todos los ensayos fueron realizados por duplicado.
Determinación de oxidación lipídica en leche.
Determinación de sustancia reactivas con ácido tiobarbitúrico (TBARs)
La metodología aplicada se basa en la medida espectrofotométrica del pigmento rosado generado por la
reacción producida entre ácido tiobarbitúrico (TBA) y productos de oxidación de ácidos grasos insaturados,
tales como malonaldehído, de acuerdo al método descripto por Tarladgis et al. 1960.
La concentración de TBARs, se expresa en mg de malonaldehído (MDA) por Kg de muestra, calculado a
través de la ec. 1.
mg
MDA/Kg
 Abs + a  10
=
.
b 

-10
× 72,06 × 106 × 10
Wmuestra
(1)
Donde Abs corresponde a la absorbancia obtenida de la muestra, a es la intersección de la curva de
calibración, y b es la pendiente de la misma. Wmuestra corresponde al peso de la muestra, 72,06 es el peso
molecular de MDA, 10 el volumen final adicionado y 106 es el factor de conversión.
Determinación del número de peróxidos en lípidos (POVs)
La determinación se llevó a cabo a través del método propuesto por Shantha y Decker 1994, basado en la
capacidad de los peróxidos de oxidar el ión ferroso a ión férrico, el cual forma un complejo coloreado con
23
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tiocianato de amonio, cuyo máximo de absorción se mide espectrofotométricamente a 500 nm, comparando
con un blanco. El valor de peróxidos se calcula a través de la ec.2. Este valor es un útil indicador de la
peroxidación lipídica.
POVs 
 As -
Ab   1/ m 
(2)
55, 4  m0  2
Determinación de compuestos volátiles en leche:
Los compuestos volátiles que contribuyen al desarrollo de sabores indeseables en leche bajo reacciones
fotoinducidas, fueron determinados por microextracción en fase sólida (SPME) y detectados por
cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría masa (GC-MS), según el método propuesto por Marsilli
1999, levemente modificado.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La degradación de ácidos grasos poliinsaturados contribuye a la disminución de la vida media de los
productos alimenticios, formando una gran variedad de compuestos (Allen 1987). Algunos de los efectos
perjudiciales incluyen, desarrollo de off-flavours y aromas indeseables, cambios en la textura y pérdida del
valor nutricional. Además, los productos de la peroxidación lipídica parecen estar directamente relacionados
con el desarrollo de enfermedades como aterosclerosis, cáncer y procesos de envejecimiento (Rice-Evans y
Burdon 1993).
Determinación de sustancia reactivas con ácido tiobarbitúrico (TBARs).
Los resultados de la cuantificación de las sustancias reactivas con TBA, expresados como mg MDA/Kg
muestra de leche, con y sin adición de GA y Bc-GA, a diferentes intervalos de tiempo de exposición a
condiciones de luz y oscuridad a 4 °C durante 7 días, se muestran en la Figura 1.
A
0.04
mgMDA/Kg leche
0.040
L+GA Luz
L luz
L Osc
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0
20
40
60
80
100
120
mg MDA/Kg Leche
0.045
B
0.03
0.02
0.01
L Luz
L Osc
L+BCGA Luz
0.00
-0.01
0
20
40
60
80
100
120
t (hs)
t (h)
Figura 1. Concentración de TBARs, (mg MDA/Kg muestra) en leche con y sin adición de GA (A) y Bc-GA
(B), a diferentes intervalos de tiempo de exposición a condiciones de luz y oscuridad a 4 °C.
Como se puede observar, la formación de TBARs en leche en oscuridad fue prácticamente nula. En leche
expuesta a condiciones de iluminación a 4 °C durante 120 h, sin adición de GA o Bc-GA se observó un
incremento en la concentración de los productos de oxidación TBARs, mientras que con la adición de GA o
Bc-GA, hubo una disminución de la misma, siendo mayor para el caso de GA. Esto nos indica un efecto
benéfico de la GA y de Bc-GA sobre la oxidación de lípidos de la leche. Para evaluar el grado de dicha
acción, se determinó el porcentaje de inhibición de la formación de TBARs (% ITBARs), empleando la ec. 3
 TBAR L -TBAR L+AOx
% I TBARs = 
TBAR L

24

 ×100

(3)
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Donde TBARL es la concentración de TBARs formada en leche expuesta a iluminación sin adición de AOx,
y TBARL+AOx es la concentración de TBARs formada en leche expuesta a la luz, con adición de Bc-GA o
GA.
Los valores de % ITBARs indican que la GA adicionada a la leche, sometida a condiciones de iluminación,
ejerce una inhibición máxima sobre la formación de TBARs aproximadamente del 60% a partir de las 25 hs
de exposición, y dicho efecto se mantiene constante a mayores tiempos de fotodegradación. Mientras que
para el caso de Bc-GA, se observa una disminución en la formación de TBARs, aunque principalmente a
tiempos más prolongados de exposición a la luz, con un porcentaje de inhibición máximo cercano al 50% a
las 120 hs.
El efecto fotoprotector de GA y Bc-GA sobre la formación de TBARs en leche puede deberse a la capacidad
de inhibir la EROS, en particular HO, el cual es uno de los principales radicales involucrados en la
oxidación lipídica, actuando como iniciador (Faria et al. 2010, Boiero et al. 2012). Además, el biopolímero
GA por su composición aminoacídica, tiene la capacidad de desactivar especies radicalarias oxidantes
(Montenegro et al. 2012).
Determinación del número de peróxidos en lípidos.
A través de mediciones espectrofotométricas, se determinó el número de peróxidos, expresados como meq
de O2/Kg lípido, en leche con y sin adición de GA, almacenada a 4 °C durante 7 días, bajo condiciones de
luz y oscuridad, Figura 2 (A). El tratamiento de leche con adición de GA mantenido al resguardo de la luz a
4 °C (L+GA Osc), permitió comprobar que en la formación de POVs no está involucrada la temperatura,
sino que su desarrollo se debe principalmente a la fotoinducción (Resultados no mostrados). Se empleó leche
sin adición de GA como control en oscuridad.
3.5
3.0
35
2.5
25
2.0
20
1.5
1.0
15
10
5
0.5
0.0
B
30
% I POVs
meq O2/ kg Lipido
40
L Luz
L Osc
L+GA Luz
A
0
0
20
40
60
80
t (h)
INDUCCION CONSUMO DE O
2
100
120
-5
0
20
40
60
80
100
120
t (h)
RANCIDEZ
Figura 2. (A) Número de peróxidos, expresados como meq de O2/Kg lípido, extraídos de leche con y sin
adición de GA, almacenada a 4 °C, bajo condiciones de luz y oscuridad. (B) Porcentaje de inhibición de
formación de POVs en lípidos extraído de leche con GA adicionada, respecto de leche sin adición, en
condiciones de iluminación.
En la Figura 2A, se puede observar que la formación de peróxidos transcurre básicamente por tres etapas.
Siendo la primera una inducción, con formación de los radicales iniciadores. Seguido de un consumo
bimolecular de O2, observándose la máxima formación de POVs durante esta etapa de propagación. Se
observa claramente una reducción en la formación de peróxidos en la fracción lipídica obtenida de leche en
presencia de GA. Inmediatamente posterior, se produce una marcada disminución del número de POVs, lo
que es justificado por la inestabilidad y rápida degradación de los hidroperóxidos primarios formados, para
dar origen a una amplia variedad de productos de oxidación secundarios, indicando el comienzo de la
rancidez oxidativa. Se puede observar que la formación de POVs se ve disminuida en leche expuesta a
iluminación con la adición de GA. A partir de dichos resultados, se calculó el porcentaje de inhibición de la
formación de peróxidos en lípidos de leche con GA (% IPOVs GA), en función POVs formados en lípidos de
leche sin adición de GA, a cada intervalo de exposición a la luz, según la ec. 4.
25
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%I
POVs
 POVL -POVL+AOx 
=
 ×100
POVL


(4)
Donde POVL es la concentración de peróxidos, expresados como meq de O2/Kg lípido, formados en leche sin
GA durante exposición a iluminación a 4 °C, y POV L+GA es la concentración de peróxidos, expresados como
meq de O2/Kg lípido, formados en leche con GA durante exposición a iluminación a 4 °C.
En la Figura 2B se observa claramente un máximo efecto de inhibición de la peroxidación lipídica por la GA,
entre las 20 y 40 hs de iluminación de la leche, de alrededor del 35%.
Numerosos estudios han demostrado que la aplicación de GA está relacionada con una disminución del
estrés oxidativo, lo que estaría sustentado principalmente por su capacidad de desactivar EROS. Las
propiedades antioxidantes de GA pueden estar asociadas a la fracción proteica que la compone,
principalmente a residuos de aminoácidos tales como, histidina, tirosina y lisina, los cuales son considerados
generalmente como antioxidantes (Marcuse 1960, Marcuse 1962, Park et al. 2005).
Determinación de compuestos volátiles en leche.
El desarrollo de off-flavors inducido por la luz, está estrechamente relacionado con procesos de
fotosensitización. La presencia de fotosensitizadores acelera las reacciones de oxidación de constituyentes
como aminoácidos, y ácidos grasos insaturados (Choe y Min 2005). Los ácidos grasos de cadena corta y
mediana (C4 a C12) son responsables del desarrollo de ciertos sabores, tales como jabón, rancidez,
astringencia. Además, estos ácidos grasos son precursores de reacciones de oxidación, generando aldehídos y
cetonas, que son los responsables de sabores desagradables en la leche en polvo (IDF 1991).
En la determinación de los compuestos volátiles presentes en leche entera durante el almacenamiento en las
condiciones antes mencionadas, con y sin adición de GA y Bc-GA, una gran variedad de volátiles fueron
detectados, incluyendo entre ellos hidrocarburos, aldehídos, cetonas y alcoholes. En la Tabla 1, se informa el
contenido porcentual de los compuestos volátiles detectados en muestras de leche con la adición de GA y
Bc-GA a un tiempo de 50 h de exposición a la luz, en el cual se observó el máximo porcentaje.
Entre los compuestos volátiles más abundantes generados en leche se encuentran hexanal, propanal,
pentanal, y heptanal. Usualmente estos compuestos son utilizados como indicadores para la oxidación
lipídica avanzada.
35
30
35
A
B
6
30
C
5
25
15
10
L luz
L osc
L +GA luz
5
20
L luz
L osc
L + GA luz
15
% Heptanal
20
% Hexanal
% Pentanal
25
4
L luz
L osc
L + GA luz
3
2
10
1
0
0
20
40
60
t(h)
80 100 120
5
0
20
40
60
t (h)
80 100 120
0
20
40
60
80 100 120
t (h)
Figura 3. % de volátiles, producidos en leche con y sin adición de GA, expuesta a 4 °C. (A) pentanal, (B)
hexanal, (C) heptanal.
En la Figura 3 se representa el % de los principales volátiles formados en leche, con y sin adición de GA,
durante el almacenamiento en las condiciones antes mencionadas.
Como se puede observar en la Figura 3, el control en oscuridad prácticamente no presenta formación de
volátiles comparado a los tratamientos expuestos a la luz. Además a 50 hs de exposición a luz, se observan
porcentajes de inhibición en los volátiles que oscilan entre 5-36 % por la adición de GA, Tabla 1. Este efecto
se puede deber a la capacidad de la GA de desactivar el estado triplete excitado de 3Rf*, el 1O2, y la
capacidad antiradicalaria frente a otras EROS como es el HO, lo que reduce el ataque de dichas especies
oxidantes a los altamente eletrofílicos ácidos grasos insaturados, y en consecuencia, se reduce la formación
de volátiles causantes de off-flavor en la leche.
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Tabla 1. % de volátiles generados y % de Inhibición en la generación de los mismos durante el
almacenamiento a 4°C bajo 50 h de iluminación en leche con la adición de GA y Bc-GA.
COMPUESTOS
Acetone
2-Butanone
3-methyl- Butanal
2-Pentanone
Pentanal
Hexanal
2-Heptanone
Heptanal
2-Hexenal
1-Pentanol
Octanal
1-Octen-3-one
(Z)-2-Heptenal
2,3-Octanedione
1-Hexanol
2-Nonanone
Nonanal
2-methyl-1-Butanol
L+GA LUZ
%
Volátiles
% Inh
3,25
NI
23,61
1,17
26,46
16,36
21,75
3,29
NI
36,37
33,60
NI
NI
5,70
2,70
5,25
10,08
2,00
3,91
0,85
1,42
L+BCGA LUZ
%
Volátiles
% Inh
1,01
57,44
0,31
54,28
0,43
NI
2,88
NI
16,44
33,96
42,78
NI
12,20
12,35
14,31
NI
0,59
44,86
2,44
40,93
1,33
48,17
1,04
20,94
6,41
8,15
2,03
0,34
0,72
2,42
5,67
Estudios recientes mostraron que los compuestos volátiles son detectados en muestras de leches almacenadas
solo bajo condiciones de iluminación, mientras que no hubo desarrollo en aquellas almacenadas en oscuridad
durante 8 hs (Lee y Min 2009). Dicho incremento de volátiles en leche bajo la exposición a la luz, implica la
presencia de un mecanismo fotosensibilizado, que causa la oxidación.
La bibliografía indica que el orden de formación de volátiles en leche fotosensibilizada sería hexanal,
pentanal, heptanal, y dimetil sulfuro, respecto al tiempo de almacenamiento y concentración.
Los principales ácidos grasos que componen la grasa de la leche son: ácido mirístico (C 14:0) 12%,
palmítico (C 16:0) 43,7%, esteárico (C 18:0) 11,3%, oleico (C 18:1) 11,3%, y linoleico (C 18:2) 1,5%. El
hexanal y el pentanal son volátiles productos de oxidación de ácidos grasos poliinsaturados n – 6. Yang et al.
2007, demostraron que pentanal, hexanal y heptanal fueron detectados en sistemas modelos de ácido
linoleico, tratados por autooxidación y oxidación fotosensitizada de Rf. En otro estudio realizado, se
demostró que heptanal fue uno de los volátiles más importantes obtenido de lípidos estructurados,
conteniendo ácido linoleico conjugado y ácido oleico (Timm-Heinrich et al. 2004).
La Figura 4, muestra los % de principales volátiles generados en muestras de leche en presencia de Bc-GA.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
25
A
60
L luz
L+Bc-GA luz
B
16
10
40
30
20
L luz
L+Bc-GA luz
% Hepatanal
% Hexanal
% Pentanal
20
15
C
14
50
12
10
8
L luz
L+Bc-GA luz
6
10
4
0
20
40
60
t (h)
80 100 120
0
0
20
60
40
t (h)
80 100 120
0
20
40
60
80 100 120
t (h)
Figura 4. % de volátiles, producidos en leche con y sin adición de Bc-GA, expuesta a luz a 4 °C. (A)
pentanal, (B) hexanal, (C) heptanal,
Para el caso de Bc-GA se observa que hay efecto de inhibición sobre la formación de algunos compuestos
volátiles con % de inhibición entre 1-57 %, mientras que para otros el efecto de la adición de Bc-GA es
negativo, generándose una mayor cantidad de los mismos, Tabla 1. Este efecto negativo podría deberse a la
generación de compuestos volátiles a partir de la oxidación, tanto de -caroteno como de GA.
La función del β-caroteno en el off-flavor de leche y productos lácteos oxidados aún no se ha dilucidado. Sin
embargo, estudios realizados informan la formación de compuestos volátiles cuando se produce la
autooxidación de β-caroteno. Chiva 1966, analizó los compuestos volátiles producidos de la autooxidación
de β-caroteno, identificando volátiles como n-pentano, etil éter, acetaldehído, acetona, propanal, tolueno,
isobutanal, 2-octanona, 2-pentanona, 4-methil-3-pentan-2-ona, 1, 1, 3-trimetil-2-n-propilciclohexano, 2metil-3-noneno y 3, 5, 5-trimetil-4-(4'-butil- 3'-en-2'-onil)ciclohexa-1, 3-diene. Una fracción que posee un
fuerte aroma a nueces fue presuntamente identificada como 2-metil-2-heptenal. Todos estos compuestos
volátiles identificados pueden ser predichos como productos de degradación de la oxidación de β-caroteno.
CONCLUSIONES
Frente a la oxidación lipídica fotoinducida de leche, la cual genera productos de oxidación y off-flavors, se
determinó el efecto fotoprotector de GA y Bc-GA por la inhibición de la formación de TBARs en leche de
alrededor de 55%, y la inhibición de la formación de peróxidos por la GA del 35%, lo que puede deberse a la
capacidad de ambos en desactivar EROS, en particular HO, el cual es uno de los principales radicales
involucrados en la oxidación lipídica, actuando como iniciador de la misma. Con respecto a la generación de
compuestos volátiles, se observa que tanto GA como Bc-GA ejercen un efecto de inhibición sobre la
producción de algunos volátiles con valores máximos entre 36 y 57%, mientras que para otros se observan
contenidos mayores. Cabe destacar que el efecto inhibitorio es máximo en los compuestos de mayor
importancia en cuanto a la generación de off-flavors en la leche.
Tales efectos también pueden ser explicados por la capacidad de desactivación de 1O2 mostrada tanto por BcGA como por GA, (mayor en Bc-GA, ya que -caroteno es un excelente desactivante de 1O2) ya que ésta
especie es altamente electrofílica, capaz de reaccionar con moléculas ricas en electrones, tales como las
dobles ligaduras de los lípidos insaturados, vitaminas y proteínas. Además, la desactivación del 3Rf causada
por GA aun en presencia de oxígeno, reduciendo la concentración de EROS generadas. Un mecanismo de
fotoprotección adicional que podría estar involucrado, por un efecto de filtro interno que ejercería, tanto GA
como Bc-GA, por la absorción de parte de la radiación emitida por la lámpara fluorescente, evitando de este
modo la formación del estado triplete excitado de 3Rf*.
En base a todo los resultados obtenidos, se puede concluir que los carotenoides, y en particular -caroteno
microencapsulados en GA, poseen un efecto protector sobre las alteraciones nutricionales (oxidación de
lípidos) y organolépticas (desarrollo de off-flavor) en leche durante el almacenamiento inducidas por
iluminación.
BIBLIOGRAFÍA
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
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volatiles in linoleic acid model systems with sodium azide or D2O. Food Chemistry, 105:1375–81.
AGRADECIMIENTOS
Al apoyo económico del CONICET, SCyT-UTN, SCyT-UNSE, SCyT-UNRC, todos de Argentina, y el
apoyo económico de Alma Mater Studiorum-Università di Bologna, RFO Proyecto 2010.
30
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Protocolo de elaboración y conservación artesanal de cuajo de Cabrito
Bonafede M.1, Aimar B.1, Nieto I.1, Picotti J.1, Molina Ortiz S.E2.
1: INTI Lácteos Rafaela
2: INTI UE sede Cruz del Eje, Centro regional Córdoba
bonafede@inti.gob.ar
Resumen: Según lo observado, en las prácticas tradicionales de los elaboradores artesanales de quesos
localizados al noroeste de la provincia de Córdoba, se detectó la necesidad de redactar un protocolo que
contenga la preparación del cuajo natural de cabra. Éste protocolo tiene en cuenta todos los aspectos
tradicionales que han sido transmitidos entre las diferentes generaciones como receta típica para la
elaboración de “quesillo”. En éste estudio fueron evaluados aspectos tecnológicos y microbiológicos con el
fin de introducir en los procedimientos típicos el mejoramiento de la calidad y garantizar la seguridad en la
producción de los quesos artesanales. Durante éste estudio se llevaron adelante investigaciones para
determinar la composición físico-química y propiedades microbiológicas del cuajo natural de cabra. Los
resultados obtenidos nos permiten confeccionar un protocolo con doce pasos básicos como una guía para la
elaboración típica del “quesillo”.
Palabras clave: cuajo, conservación, salado
Abstract: According to the evidence of the traditional practice of handcrafted cheeses producers located in
Northwest of Cordoba province it was detected the necessity to redact a protocol which include the
preparation of natural goat rennet. This protocol considers some traditional aspects which were transmitted
between different generations as typical recipes to make “quesillo”. In this study we evaluated technological
and microbiological aspect in order to introduce them in the typical recipes to improve it quality and to
guarantee the safety production of handcrafted cheeses. During this study laboratory probe were carried out
to determinate the physicochemical composition and the microbiological properties of the natural goat
rennet. The results obtained allow us to prepare a specific protocol considering twelve basic steps as a guide
to make typical recipes of “quesillo”.
Key words: rennet; conservation; salty.
INTRODUCCIÓN
La cabra es una especie productora de leche, aunque también productora de carne, cuero y fibra y se destaca
por ser un animal rústico, precoz, de gran adaptabilidad y docilidad para su manejo. El ganado caprino se
encuentra donde las demás especies no son factibles para su explotación, transformando recursos de baja
calidad y cantidad, en carne, cuero, pelo y leche. Es una producción muy asociada a economías regionales y
en algunos casos podría llamarse marginales, ya que la actividad caprina se desarrolla bajo un modelo de
producción que es el de subsistencia de las familias productoras.Estas producciones se encuentran
distribuidas en el centro-oeste, sur y al norte del territorio nacional. Las majadas de los pequeños productores
familiares están compuestas generalmente, por unas 80 a 100 cabras por productor. La producción tiene un
destino predominante a carne, produciendo cabrito mamón hasta unos 8 a 10 kilos vivo, que tiene un
rendimiento al gancho de un 53% con una edad que va de 30 a 90 días. (Trezeguet 2010). Sin embargo la
cabra, una vez faenado el cabrito mamón, queda con leche, que en ocasiones es aprovechada para la
elaboración del subproducto típico del NOA Argentino, como así también del noroeste Cordobés, “el
quesillo”.
En éste tipo de producciones a escalas artesanales como lo es la elaboración de quesillo, generalmente se
utilizan insumos caseros como es el caso del cuajo de cabrito utilizado como cuajo fermento. Todos estos
procedimientos que han sido transmitidos de generación en generación y que hoy en día, van perdiendo su
utilización, porque va siendo reemplazado por el uso de cuajos elaborados a escala industrial, ya sean de
origen animal, vegetal o de origen recombinante. En la práctica no solo supone el reemplazo de un insumo
por otro, sino que se van dejando de lado saberes ancestrales, propios de cada una de las regiones antes
mencionadas y que hacen a la cultura de éstas y a los productos típicos encontrados en ellas, propios de esos
conocimientos logrados a través de tantos años de interacción del hombre con su medio.31
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
El objetivo de nuestro trabajo fue determinar los parámetros físico-químicos y microbiológicos óptimos para
la elaboración de cuajo – fermento natural de cabrito, estableciendo un protocolo de elaboración que respete
las tradiciones de usar insumos naturales regionales, en condiciones de inocuidad alimentaria, en la
elaboración del quesillo elaborado en el Noroeste Cordobés.
MATERIALES Y MÉTODOS
Encuestas
Se efectuó una encuesta a campo a unos 20 productores, de distintas localidades del noroeste de la provincia
de Córdoba, donde se pregunto sobre la forma de producción que cada uno lleva adelante en lo que hace a
producción caprina, y si es que elaboran el cuajo como insumo básico para la elaboración del quesillo. Se
analizaron las distintas metodologías de elaboración de cuajo artesanal y a partir de éstas se definieron pautas
mínimas para mantener la inocuidad del cuajo.
Muestras
Sobre dos muestras de cuajo, provenientes del norte Córdoba que fueron rehidratadas en suero de quesería,
se realizaron ensayos fisicoquímicos y microbiológicos. Al suero dulce de quesería se le realizaron las
siguientes determinaciones: Materia grasa: FIL/IDF 22B:1987 Röse Gottliebe; Proteínas ISO 8968-2 IDF 202 Kjeldahl; Sólidos Totales IDF 21B:1987; Cenizas AOAC 945.46; Lactosa calculada por diferencia.
Determinaciones
Investigadores de la UNNE, Corrientes, trabajaron sobre la caracterización del agente coagulante, de quesos
artesanales de Corrientes (Coronel G y otros). Se rehidrataron dos muestras de cuajo en suero dulce de
quesería de conocida composición, y se efectuaron análisis fisicoquímicos de pH, Acidez titulable en función
del tiempo y se midió el poder coagulante de los mismos.Por otro lado se realizaron ensayos microbiológicos Recuento de coliformes y Escherichia coli: Método de
film seco rehidratable - PETRIFILM TM Tiempo y temperatura de incubación: 48 ± 2 hs / 35 ± 1ºC (según
AOAC) Recuento de microorganismos a 30ºC : Norma ISO 4833: 2003- Método horizontal para la
enumeración de microorganismos- Técnica de recuento a 30ºC, Recuento de bacterias lácticas ( Lactobacilos
y Streptococcos ) según Norma ISO 7889/ FIL 117: 2003 Técnica de recuento de colonias a 37°C. Recuento
de Enterobacteriaceae . Norma ISO 21528-2: 2004 – Método horizontal para la detección y enumeración
método de recuento de colonias, recuento de estafilococos coagulasa positiva: Norma ISO 6888 -1: 1999 –
Método horizontal para la enumeración de estafilococos coagulasa positiva –Técnica de recuento -l
Amendment 2003, para determinar la calidad de los mismos como insumo básico en la elaboración de un
alimento, como lo es el quesillo elaborado en la región del noroeste Argentino.
Muestra 1
La muestra uno pertenece a Lola Pacheco y es cuajo de cabrito mamón disecado a la sal, dicha muestra es
proveniente de la cuenca productiva caprina San Pedro Gutenberg, provincia de Córdoba. La muestra de
cuajo fue rehidratado en suero dulce de quesería y fue pasterizado 20 min/65°C, se guardo una relación del 5
% masa en volumen, pesando 24,8 g de cuajo/ 500 ml de suero.
Muestra 2
La muestra dos, pertenece a Patricia Galván y es de cuajo de cabrito mamón disecado a la sal, dicha muestra
es proveniente de la cuenca productiva caprina San Pedro Gutenberg, provincia de Córdoba. La muestra de
cuajo fue rehidratado en suero dulce de quesería y fue pasterizado 20 min/65, se guardo una relación del 5%
masa en volumen, pesando 45 g de cuajo /900 ml de suero.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A partir de la intervención territorial de INTI y observar las prácticas tradicionales de elaboración de quesos
a escala artesanal de productores ubicados al noroeste de la provincia de Córdoba, se detecta la necesidad de
obtener un “protocolo” de elaboración de cuajo natural de cabra, ajustando las practicas de elaboración del
quesillo de cabra de dicha región, respetando las tradiciones de usar insumos naturales regionales en
condiciones de inocuidad alimentaria.
La encuesta arrojo los siguientes datos: el 81% de los productores utiliza una metodología en común, donde
al cuajo del animal una vez seco en sal es agregado en el suero fresco del quesillo recientemente elaborado,
32
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
y a ésta mezcla (cuajo – fermento) se la utiliza como liquido coagulante. Otros productores (19%) utilizan
agua con sal en lugar de suero fresco.
Para esto se aborda desde dos perspectivas: El tecnológico, donde el protocolo aportará a la producción de
quesillo, condiciones de elaboración de cuajo que se puedan repetir en el tiempo, buscando obtener
propiedades físico-químicas homogéneas, para lograr cuajos con buena aptitud tecnológica. El
microbiológico, donde las características de éste producto deben cuidarse por cuestiones de inocuidad
alimentaria. Por ello es fundamental buenas condiciones del suero donde se rehidratan los cuajos. Los
resultados permitieron diseñar el siguiente protocolo: Faenar cabritos lactantes en condiciones de limpieza e
higiene. Evitar la ruptura de órganos para evitar contaminar el cuajo al extraer vísceras, evitando que caigan
al suelo. Obtener el cuajo sin mezclarlo con el resto de las vísceras. Cortar el cuajo y abrirlo. Lavar el cuajo
con abundante agua limpia y de consumo familiar, en lo posible hacerlo con agua corriente, evitar lavar en
un recipiente con agua estancada. El cuajo debe quedar limpio, en su totalidad. Utilizar sal gruesa, en
cantidad suficiente como para cubrirlo de ambos lados. Una vez salado colgar en lugar seco y protegido del
sol, evitar la presencia de insectos. Dejar por tres días o hasta que este seco. Utilizar dos frascos de 1 litro (de
vidrio y boca ancha), lavarlo con poca cantidad de detergente y enjuagarlo bien. No utilizar lavandina. Usar
inmediatamente el suero de la última elaboración de quesos en recipiente limpio y tapado. Es recomendable
que, cuando se vaya a utilizar para el cuajo, calentar hasta antes de hervir. Si dispone de termómetro llevar a
65º durante 20 minutos. Dejar enfriar tapado hasta temperatura ambiente. Cortar el cuajo seco en dos
mitades, poner cada una de ellas dentro de los frascos, agregar suero hasta completar los mismos. Agregar 1
cucharada sopera de sal gruesa. Tapar el frasco con tapa limpia. La cantidad de líquido a utilizar
recomendable es de 1 o 2 cucharadas soperas por cada 20 litros de leche. No completar el frasco con suero
nuevamente, se debe consumir en su totalidad. Luego se puede guardar en algún lugar oscuro, dejar las
primeras 24 hs a temperatura ambiente y luego conservar en heladera por un periodo de hasta 1 mes. Es
recomendable comenzar a utilizarlo 3 a 4 días después de la preparación. Este protocolo ha sido diseñado
para ser entregado a los pequeños productores elaboradores de quesos artesanales.
Para la experiencia en laboratorio se utilizó suero dulce de quesería, entendiendo al suero como la fracción
de la leche que no precipita frente a la acción del cuajo (quimosina) y que está formada por los componentes
solubles de la leche (lactosa, sales y proteínas del suero). Éste ha sido estandarizado por nanofiltración, para
rehidratar las muestras de cuajo, cuya composición química se presenta en la Tabla1.
Tabla 1. Composición fisicoquímica del suero dulce de quesería
Materia Grasa: 0,21 % p/v
Proteína: 0,66 % p/v
Ceniza: 0,52 % p/v
Lactosa: 3,71 % p/v
Sólidos totales: 5,10 %p/v
Densidad: 1,020 g/ml
pH 5,78
Acidez 18 °D
Se estudio la evolución del pH y de la acidez titulable en función de los días muestreados. Midiendo la
acidez titulable podemos observar el desarrollo de bacterias acidolacticas que generan acido láctico a partir
del consumo de lactosa; midiendo el pH podemos observar la capacidad buffer de las proteínas del suero.
Todos los valores obtenidos se hicieron por duplicado.
Se midió el poder coagulante de las muestras de cuajo 1 y 2, a los días 12 y 14 desde la preparación de los
mismos, se consideraron estos días dentro del estudio por ser los que presentaron mayor acidez en ambas
muestras. Los valores obtenidos fueron similares para ambos días, siendo de 15 y 95 IMCU/ml para las
muestras 1 y 2, respectivamente siguiendo la técnica IDF 157 A / ISO 11815. 2007. Milk – determination of
total milk clotting activity of bovine rennets.
El proceso se inicia con un pH cercano a 6 propio del suero dulce proveniente de quesería y éste disminuye
con el tiempo transcurrido desde la preparación del cuajo hasta estabilizarse alrrededor de pH 4, en ambas
muestras se observa lo mismo, debido a que hay una alta migración de iones en las primeras horas y luego
con el transcurrir del tiempo se estabiliza debido a la capacidad buffer de ciertos componentes como lo son
las proteínas del suero dulce de quesería.
En cambio se observa en las Figuras 1 y 2 que la evolución de la acidez titulable presenta un aumento hasta
alcanzar un máximo entre los días 12 y 14, disminuyendo posteriormente, ambas muestras presentan el
mismo comportamiento esto indicaría que se debe al desarrollo de bacterias acidolacticas, donde se produce
esta curva de acidez presentando un máximo para luego estabilizarse y posteriormente descender, siendo los
valores máximos alcanzados de 74 y 106 oD para las muestras 1 y 2 respectivamente, indicando la inhibición
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
y posterior reducción del número de recuento de bacterias acidolacticas, producido por la falta de lactosa del
suero dulce de quesería, ya consumida por dichos microorganismos.-
Figura1. Efecto del pH en la conservación de las muestras 1 y 2. Figura2. Efecto de la acidez y poder coagulante en el tiempo
de conservación de las muestras 1 y 2.-
Estos resultados se reflejan en el protocolo ya que se puede observar que desde el punto microbiológico no
existen tantos microorganismos contaminantes, ayudando a que haya una correcta fermentación del medio,
logrando así un buen cuajo-fermento. A continuación se muestran en la Tabla 2 los resultados del análisis
microbiológico de ambas muestras en función del tiempo de conservación de los cuajos, se puede observar
que los recuentos microbiológicos de bacterias patógenas presentan un marcado descenso y prácticamente
desaparecen del medio con el correr de los días, dando una buena calidad microbiológica del cuajo fermento.
Por otra parte se observa un marcado crecimiento de las bacterias acido lácticas, que mejoran la acidez del
medio inhibiendo la competencia a través de esto, ayudando así a una correcta fermentación en la
elaboración de quesillo como estárter de la misma.Tabla 2. Recuentos microbiológicos en función del tiempo
Se realizo una combinación de parámetros entre la acidez y los resultados microbiológicos analizados en el
suero obtenido de la preparación del cuajo. Para el recuento de Coliformes y E. Coli se muestra un recuento
considerable desde el inicio de la experiencia, y a lo largo de los días de conservación el recuento desciende
hasta desaparecer del medio producto de la acidez del mismo. El recuento de Estreptococos muestra en un
alto recuento desde un principio igualándose en número con los lactobacilos en el día 8, hasta el día 20 de la
experiencia. En general podemos mencionar que acidificado el medio (suero) no hay supervivencia de
patógenos como es el caso de enterobacterias, solo los recuentos de hongos y levaduras son los que
sobreviven al medio acido. A su vez se puede observar que presenta un alto valor de Streptococos al 2° día
de haberse colocado el cuajo en suero, luego los recuentos se igualan desde el día 8 hasta el día 20.
Podemos concluir que:
Por lo tanto, el pH como la acidez titulable aumentan en las primeras 72 a 96 hs de preparado el cuajo en
suero para luego estabilizarse lo que nos sugiere que ni bien se prepara el cuajo – fermento, éste necesita un
tiempo de estacionado para alcanzar buenas aptitudes tecnológicas, como ser el poder coagulante del mismo
que se ve optimizado por el rango acido que obtiene el suero con el correr de los días.
Por otro lado los recuentos microbiológicos obtenidos, nos muestran que una vez acidificado el medio
aproximadamente 50 a 60 grados dornic, el índice de sobrevida de bacterias patógenas como Coliformes, E
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
coli, Enterobacterias y Estafilococo es nulo, solo hay supervivencia de hongos y levaduras lo que podría
representar un potencial defecto tecnológico en el queso si dichos recuentos aumentaran significativamente.
En cuanto a las bacterias acido lácticas, a partir del cuarto o quinto día cuando se alcanzan los 60 grados
dornic y donde se igualan el recuento de bacterias lácticas como estreptococos termófilos y lactobacilos,
dando así una relación ideal desde el punto de vista tecnológico como fermento iniciador en el proceso de
elaboración del quesillo elaborado en el Noroeste Cordobés.
A partir de las encuestas y los resultados de laboratorio, basados en las mejores condiciones fisicoquímicas y
microbiológicas, se ha podido elaborar un protocolo para la elaboración y conservación de cuajo de cabrito.
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AGRADECIMIENTOS
Los datos y las muestras del presente trabajo fueron cedidos por productores caprinos de la cuenca láctea
caprina de la Comuna de San Pedro Gutenberg: Mirta Moya – de la cuenca caprina de Santo Domingo;
Josefina Quevedo – Serrezuela; Dominga Veas – de la localidad de San José de la Dormida; Sofía Teodora
Castillo – Alto Flores, del Departamento de Tulumba; Juan Carrizo – del departamento de Ischillin; Mario
Lopez – Sto Domingo, Rafael Martinez – de la localidad de Copacabana.-Sebastian Riera – del paraje de Los
Leones (cuajo en agua, bórico y glicerina); Fabián Ramírez – de Villa del Soto (cuajo en agua c/sal); Patricia
Galván – El Molle, de la comuna de Gutenberg (salados y ahumados); Erica Alvelo – de la comuna de
Gutenberg; Lola Pacheco – Gutenberg ; Maria Mansilla – Ancas Mayo; Aguirre E – de Quilino; Jorge Luna
– Las Chacras (queso duro de cabra); Iris Rodriguez – de la localidad San Carlos Minas.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Time-dependent crystallisation behaviour of freeze-dried amorphous lactose and trehalose systems
modified by Prosopis ruscifolia and guar gums
Busch V. M.1, Santagapita P. R. 1, 2, Buera M. P. 1, 2,*
1. Departamentos de Industrias y Química Orgánica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad
de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.
2. CONICET, Argentina.
pilar@di.fcen.uba.ar
Resumen La cristalización de azúcares en sistemas amorfos es de gran importancia práctica y económica en
las industrias alimentaria y farmacéutica. Las semillas del árbol de vinal (Prosopis ruscifolia) tienen un
interesante polímero o goma (VG) que podría ser utilizado como emulsionante, espesante o estabilizante para
sustituir las gomas importadas como la goma guar (GG). Se realizó un análisis del comportamiento de las
gomas VG y GG respecto a su efecto en la cinética de cristalización de lactosa y trehalosa en sistemas
liofilizados expuestos a humedad relativa (HR) crítica. Las transiciones térmicas se determinaron por
calorimetría diferencial de barrido (DSC) en corridas isotérmicas y dinámicas. La cinética de cristalización se
evaluó a través de la ecuación de Avrami. La cristalización de lactosa y trehalosa en los sistemas expuestos
a HR críticas se redujo por el agregado de VG y GG. Sin embargo, se observó una cinética de cristalización
de la lactosa más rápida en los sistemas que contenían polímeros, además de presentar diferencias en los
parámetros n y k de Avrami. Este trabajo muestra en sistemas modelo una prometedora aplicación potencial
de un polímero proveniente de fuentes autóctonas como agente modificador de la cristalización de azúcares.
Palabras claves: cristalización, lactosa, trehalosa, DSC, goma guar, goma de vinal.
Abstract Crystallisation of amorphous sugars is of practical and economical importance in food and
pharmaceutical industries. The seeds of vinal tree (Prosopis ruscifolia) have an interesting galactomannan
gum that could be used as emulsifier, thickening or stabilizing agent to replace the actually imported guar
gum (GG) and locust bean gum. The behaviour of vinal gum (VG) and GG to affect the crystallisation
kinetics of lactose or trehalose freeze-dried systems subjected to humidification to critical relative humidity
(RH) was analysed. Lactose and trehalose systems were exposed over saturated salt solution of 33% and
43% of RH, respectively. Thermal transitions (glass transition temperature -Tg-, sugar crystallisation and
crystal melting) were determined by differential scanning calorimetry (DSC) in isothermal and dynamic
runs. Avrami equation was used for kinetic crystallisation analysis. The amount of lactose and trehalose
crystals in freeze-dried systems humidified at their critical RH was reduced by the presence of VG and GG.
Nevertheless, the lactose-gum systems showed a faster kinetics of lactose crystallisation with changes in n
and k Avrami parameters. The potential application of a novel gum obtained from local sources as a sugar
crystallisation-modifier agent was promising.
Key words: crystallisation, lactose, trehalose, DSC, guar gum, vinal gum.
INTRODUCTION
Crystallisation of amorphous sugars is of practical and economical importance in food and pharmaceutical
industries. The quality of dairy powders and dried products (in general basis) is affected by both processing
methods and storage conditions. (Haque and Roos, 2006). Dehydrated lactose and dairy powders are
hygroscopic and water sorption often promotes/unleashes reactions resulting in quality lost. Trehalose is
worldwide used as excipient for dried pharmaceutical formulations and is increasingly used in food bakery
products, in sports beverages as well as in a good variety of products for diabetics (Richards et al. 2002).
Crystallisation of amorphous sugars in foods may enhance both physical and chemical deterioration. Then,
the presence of a second excipient is generally required to avoid/ delay crystallisation and increase the
overall stability (Buera et al. 2005). Several authors have indicated that the presence of a polymer changed
the crystallisation process of sugars: sucrose crystallisation was inhibited by starch (Roos and Karel, 1991)
and by corn syrup polymers (Gabarra and Hartel, 1998) and trehalose crystallisation was delayed by
polymers, salts, biopolymers and other sugars (Santagapita and Buera, 2008, Santagapita et al., 2008, Miao
and Roos, 2005). The presence of proteins caused a delay of lactose crystallisation in comparison with pure
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lactose systems in skim milk powder (Jouppila and Roos, 1994; Senoussi et al., 1995) and modified-whey
powders (Burin et al. 2004).
Biopolymers (like guar and locust bean gums) are often used as emulsifiers, thickening and stabilizing agents
(Roman-Guerrero et al. 2009, Beristain et al. 2001). The seeds of the vinal tree (Prosopis ruscifolia) have an
interesting galactomannan gum of similar structure of guar gum (Busch et al., 2011) and can be used as local
product to substitute the latter, avoiding the necessity of its importation and allowing to improve local
production and overall economy.
The aim of this work was to analyze the effect of vinal gum (VG) obtained from Prosopis ruscifolia on the
crystallisation kinetics of lactose or trehalose in freeze-dried systems subjected to humidification to their
critical relative humidity (RH). A comparison of a similar and commercially available gum (guar gum) was
conducted.
MATERIALS AND METHODS
Separation of seeds and extraction of vinal (Prosopis ruscifolia) gum
Vinal pods were collected in province of Formosa, Argentina, in 2010. The separation of the seeds from the
pods was performed in a rice mill and then passing the product through sieves (Sonytest) of 3360 and 1410
µm (where seeds are retained).
The VG extraction was done by a basic treatment of the seeds (Chaires Martinez et al. 2008) and by
flocculation in ethanol. Briefly, 20 g of seeds were treated at 25°C in 200 mL of 1 M NaOH for 24 h with
stirring. Subsequently, the different fractions were manually separated: tegument (dark skin), endosperm
(having the consistency of a gel after NaOH treatment) and germ. The VG was extracted from the endosperm
obtained by placing it in 100 mL of distilled water under stirring for 24 h., then was centrifuged for 3 min at
4500 rpm and the supernatant solution was poured into 200 mL of absolute ethanol (Biopack). Flocculation
of the polymer occurred during the storage in the refrigerator (8ºC) for 3 h. Purification was done by
solubilization in 50 mL of bidistilled water and another precipitation in ethanol. The obtained VG was dried
in a vacuum oven at 25°C (300 mbar).
Preparation of freeze-dried systems
Amorphous samples were prepared by freeze-drying. Aqueous solutions 20% (w/v) of lactose (Anedra) or
trehalose (Hayashibara) with or without 0.1 or 0.5% (w/v) of the polymers GG (Cordis) or VG. Aliquots of 2
mL of each system were placed in 5-mL vials, frozen at -26ºC and immersed in liquid nitrogen (-196ºC)
before freeze-drying.
A freeze drier (ALPHA 1-4 LD2 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany) was operated
at −55 °C, at a chamber pressure of 0.04 mbar. The freeze-drying process lasted 48 h. The main drying was
performed without shelf temperature control and the secondary drying was performed at 25 °C.
After freeze drying, trehalose systems were exposed for 1 day over a saturated salt solution of K 2CO3 (43%
RH) at 25°C in an open aluminum pan for DSC (Greenspan, 1977).
Lactose systems were exposed for 15 days over a saturated salt (MgCl2) solution at 33% RH (25ºC).
Differential scanning calorimetry (DSC)
DSC was used to determine glass transition temperature (Tg), both sugar crystallisation (exothermic peak)
and melting (endothermic peak) temperatures and enthalpies, onset and endset times of crystallisation. A
Mettler Toledo 822 DSC (Mettler Toledo AG, Switzerland) with STARe Thermal Analysis System version
3.1 software (Mettler Toledo AG) was used for all the measurements. The melting of crystalline trehalose
present in a sample was observed as an endothermic peak at around 97°C (Santagapita and Buera, 2008). The
instrument was calibrated using standard compounds of defined melting point (cyclopentane and indium) and
heat of melting (indium). All measurements were made with 5-10 mg sample mass, using hermetically sealed
aluminium pans of 40 μL inner volume (Mettler); an empty pan was used as a reference. DSC dynamic
curves were obtained by heating samples from 0 to 130 °C with a heating rate of 10 °C min− 1. The
confidence intervals estimated for temperature and enthalpy values were 2 °C and 10 mJ, respectively.
In systems containing trehalose, the degree of trehalose dihydrate crystallisation () was calculated from the
ratio of the area of the endothermic melting peak in the sample thermogram (ΔHm) and the melting enthalpy
of pure trehalose dihydrate (ΔHmT, 139 J g-1) measured by DSC in the same conditions, as shown in Equation
1.
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
H m
H m
100
(1)
T
Also, in order to analyse de crystallisation during humidification and before the DSC run, the degree of
trehalose crystallisation during humidification (h) was studied. h was calculated from the ratio of the
difference of areas of the endothermic melting peak (ΔHm) and the exothermic crystallisation peak (ΔHc),
and the melting enthalpy of pure trehalose dehydrate, as shown in Equation 2.
h 
[H m  (H c ]
100
H mT
(2)
Moisture content determination
The moisture contents of the equilibrated samples were determined by difference in weight before and after
drying in vacuum oven at 80°C and 300 mbar for 48 h. This condition had been proved to be adequate to
assess constant weight in each case.
Crystallisation kinetics: the Avrami equation
In order to evaluate lactose crystallisation, isothermal DSC runs, at lactose with and without gums systems,
at 50, 55, 60 and 65ºC and during 130 minutes were done. Crystallisation time was defined as the time when
ends crystallisation (endset of exothermic peak) minus the induction time (onset time of the same peak).
From the isothermal DSC runs sugar crystallisation kinetic was calculated by integrating the exothermal
peak with respect to time to determine the area related to heat of crystallisation and thus the crystalline
fraction (α). α was plotted against time and analysed using the Avrami equation (Avrami et al. 1939):
1    exp(  Kt n )
(3)
Where α represents the fraction of the sugar crystallized at time t (α=1 corresponds to the total peak area);
K is the rate constant of isothermal crystallisation [(time)−n] which depends primarily on the crystallisation
temperature, and n is known as the Avrami index, a parameter characteristic of nucleation and growth
mechanisms of the crystals. The Avrami equation is particularly valuable because it provides important
information about the crystallisation mechanisms when crystals form from a relatively pure melt
(Arvanitoyanis and Blanshard 1994)
In the present work, the Avrami model was used as a tool for the kinetic analysis. Time t was taken as the
time of the experiment minus the induction time. The induction time normally corresponds to the time until a
stable crystal nucleus starts to grow.
RESULTS AND DISCUSSION
Freeze-dried trehalose formulations humidified at 43% RH
The dynamic thermograms of trehalose systems equilibrated at 43% RH are shown in Figure 1. The T g
values were similar for all three systems (onset temperatures between 15°C and 17°C) showing that the
addition of gums did not affect Tg (which is 18°C at 43% RH, according to Mazzobre and Buera, 1999). T g
values are lower than humidification temperature and the water content of the samples (higher than 10%)
was enough to form trehalose dihydrate crystals, which are the main crystalline form of trehalose. Thus, at
25°C the systems were at the super-cooled state and crystallisation could occur during humidification.
Enthalpies values of crystallisation were smaller than the melting ones for all systems. As a result, trehalose
crystallized during storage at 43% RH, before the DSC run. The highest value of melting enthalpy was
obtained for trehalose system and the smallest one for trehalose-VG.
Table 1 shows the degrees of total trehalose crystallisation () and of trehalose crystallisation during
humidification (h). Both highest h and  were obtained for trehalose system (without gum). VG system
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showed the lowest h as well as the lowest . GG-trehalose system had intermediate values. These results
show that the inhibition of trehalose crystallisation was achieved by both gums and especially by VG.
Heat flow (W/g), exo >
crystallization
trehalose+ VG
trehalose+ GG
melting
33.8 J/g
13.2 J/g
38.0 J/g
89.6 J/g
trehalose
119.6 J/g
15.8 J/g
2 W/g
25
50
75
100
Temperature (ºC)
Figure 1: DSC thermograms of freeze dried trehalose systems with 0.1% w/v guar or vinal gums 0.1% (GG
and VG, respectively) or without gums equilibrated in DSC pans at 43 % RH for one day. Arrows show glass
transition (Tg) and crystallisation and melting enthalpies values are indicated.
Table 1: Degree of total trehalose dihydrate crystallisation () and degree of trehalose dihydrate
crystallisation during humidification (h) of freeze dried trehalose systems with 0.1% w/v guar or vinal gums
(GG and VG, respectively) or without gums equilibrated in DSC pans at 43 % RH for one day.

86.1
64.5
24.3
trehalose
trehalose + GG
trehalose + VG
h
74.7
37.1
14.9
Freeze-dried lactose formulations humidified at 33% RH
Lactose samples (with or without gums) equilibrated at 33% HR have a T g value around 40°C. Lactose
crystallizes as monohydrate but the crystallisation of the anhydrous form is also possible. In both cases, the
water content of the systems at 33% RH allows lactose crystallisation when the temperature exceeds the T g.
Then, isothermal DSC runs were conducted at several temperatures between 50 and 65°C in order to evaluate
lactose crystallisation. As an example of the obtained thermograms, Figure 2 shows those obtained at 55°C.
Earlier and sharper peaks related to lactose crystallisation appeared in lactose-gum termograms. GG-lactose
system showed the earliest and smaller exothermic peak. The VG-lactose system presented a peak at
intermediate times between lactose and GG-lactose systems. The shape of the peak and the crystallisation
enthalpy for the systems containing VG and GG were similar between them. Instead, lactose system without
gum had wider peak of crystallisation for all the temperatures studied. This difference in shape for the
crystallisation peak could be related to a variation of the lactose crystallisation mechanism as a consequence
of the gum presence (Kedward et al, 1998). The same trend was obtained at 60 and 65°C for the three
systems (data not shown) respect to the thermograms showed in Figure 2. At 50°C, only the GG- lactose
system showed crystallisation during 130 minutes-DSC runs.
Figure 3a shows the crystallisation enthalpy as a function of temperature for all studied systems. Lactose
system showed the highest crystallisation enthalpies, which increased for higher temperatures. Both gumlactose systems had lower enthalpy values than lactose systems, with similar values between them, which
also remained steady when temperature was increased. The fact that the gum free system presented the
highest crystallisation enthalpy showed that lactose crystallisation thermodynamics is affected in the
presence of both gums.
Fig 3b shows the crystallisation time (the time difference between endset and onset crystallisation, or
induction time). The gum-free system showed the slowest lactose crystallisation rate at all analysed
temperatures. VG and GG systems showed shorter and similar crystallisation times, which decreased slightly
as increasing temperature of the isothermal run at DSC.
39
Heat flow (W/g), exo >
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
lac+ GG
13.9 J/g
lac+ VG
15.6 J/g
0.1 W/g
lactose
46.6 J/g
0
10
20
30
40
Time (min)
10 J/g
Crystallization time (min)
Crystallization enthaply
(J/g)
Figure 2: isothermal DSC thermograms of lactose and lactose with 0.5% vinal gum (VG) or guar gum (GG)
equilibrated at 33% HR for 15 days. Crystallisation enthalpies values are indicated.
LACTOSE
LAC+VG
LAC+GG
50
55
60
65
70
9
8
7
6
5
1
LACTOSE
LAC+GG
LAC+VG
0
45
50
55
60
65
70
Temperature (ºC)
Temperature (ºC)
Figure 3: Isothermal DSC crystallisation enthalpies (a) and times (b) of lactose and lactose with vinal gum
(VG) or guar gum (GG) 0.5% as a function of temperature. Crystallisation time is the time when ends the
crystallisation minus the induction time.
In order to deeply understand the crystallisation results, the kinetic of crystallisation was analysed by using
Avrami equation (Mazzobre et al. 2001). When applied for use with DSC, it is assumed that the differential
area under the crystallisation curve with time corresponds to the dynamic changes in the conversion of mass
from the amorphous phase to the solid phase. Fig 4 shows the Avrami equation fit for lactose crystallisation
at 55, 60 and 65ºC in a VG-lactose system. The lactose and GG-lactose systems (data not shown) had similar
shapes and trends. (all fits had R2 higher than 0.98). The curves showed a shift to lower times of
crystallisation as increasing temperature. The k value from the Avrami equation is related to the rate of
crystallisation. Table 2 shows k and n values for the three systems at different temperatures of crystallisation.
Lactose crystallisation rate is lower in lactose system (with smaller k values) than at gum-lactose ones. k
value increased with temperature for all systems analysed, as expected from the results of times of
crystallisation. These increments in crystallisation rate when increasing temperature has been reported by
several authors and has been modelled using Williams-Landel-Ferry model. (Mazzobre et al. 2001, Das and
Langrish 2012). These results of k confirmed the results seen in Figure 3b of crystallisation times, the lactose
crystallisation is faster and its kinetic is in certain way modify in a polymer environment.
40
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Crystalline fraction
1.00
65ºC
0.75
60ºC
55ºC
0.50
Lactose + vinal
gum 0.5%
0.25
0.00
0
1
2
3
4
Time (min)
Figure 4: Avrami equation (lines) of isothermal crystallisation of lactose in the lactose system with vinal
gum 0.5%. Symbols show experimental DSC values.
Table 2: Values of k and n from Avrami equation for isothermal crystallisation of lactose, and lactose with
vinal gum (VG) or guar gum (GG) 0.5% as a function of temperature.
Lactose
Lactose + GG
Lactose + VG
T (°C)
N
k
n
k
n
k
50
3.4 ±0.2
0.028
-5
55
3.7 ±0.1
2.4*10
0.867
4.7 ±0.4
0.019
-4
60
3.5 ±0.1
1.9*10
3.7 ±0.5
1.361
4.7 ±0.4
0.217
-4
65
3.0 ±0.1
6.2*10
2.7 ±0.2
0.559
4.2 ±0.3
0.931
Lactose and lactose with GG systems presented n values close to 3 (between 2.6 and 3.7). An n value of 3
indicates spherulitic growth from sporadic nuclei (Christian, 1975). VG- Lactose system showed a higher n
value (between 4.2 and 4.7) for all temperatures analysed. This increase in n value could be attributed to
geometric factors associated to the modification of molecular environment that facilitate nucleation. n value
was found to decrease by increasing temperature for all the systems. This trend in n value by increasing
temperature had already been reported by Kedward et al. (1998) and may indicate a different crystallisation
mechanism at higher temperature. The results obtained for n and k to lactose system were similar to those
reported by Mazzobre et al. (2001).
It is important to consider both thermodynamic and kinetic aspects regarding lactose crystallisation in
presence of gums. Gums appeared to accelerate the kinetics by decreasing the time and increasing the rate of
lactose crystallisation but on the other hand the amount of lactose crystals (evaluated from the crystallisation
enthalpy values) is much lower in the presence of polymers or they were more imperfect.
CONCLUSIONS
The study of lactose crystallisation in presence of gums allowed separating thermodynamical and kinetic
aspects.
Trehalose and lactose crystallisation occurred at a lower degree in presence of both guar and vinal gums,
considering the enthalpies of crystallisation peaks obtained by DSC.
On the other hand, the Avrami equation analysis showed a slower rate of crystallisation for the lactose
system, in comparison with the gum containing systems. The higher n value for VG- lactose system indicates
a different mechanism of crystallisation that could be related to geometric, thermodynamic or kinetics
factors.
The presence of gums promoted a faster lactose crystallisation, with more imperfect crystals formation, but
the degree of crystallisation occurred at a lower extent, especially in vinal gum systems. Besides the
academic consequences of the analysed phenomena, the studied gum obtained from local sources
demonstrated potential application as a sugar crystallisation-modifier agent.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
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42
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Santagapita, P. R., Gómez Brizuela, L., Mazzobre, M. F., Ramirez, H., Corti, H. R., Villalonga Santana, R.,
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Williams ML, Landel RF, Ferry JD. 1955. The temperature dependence of relaxation mechanisms in
amorphous polymers and other glass-forming liquids. Journal of the American Chemical Society, 77: 37013707
ACKNOWLEDGMENTS
The authors acknowledge CONICET (PIP 100846), ANPYCT (PICT 0928) and UBA (2002100100397) for
financial support.
43
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Derivados de hesperidina como antioxidantes para grasas empleadas en alimentos
Céliz G.1,2, Campos F.1 y Daz M. 1,2
1: Universidad Nacional de Salta (UNSa), Salta, Argentina.
2: Instituto de Investigaciones para la Industria Química (INIQUI), Salta, Argentina.
gceliz@unsa.edu.ar
Resumen: Los antioxidantes tradicionales en alimentos (TBHQ, BHT y BHA) son potenciales
carcinogénicos en humanos. Con el fin de proponer antioxidantes alternativos, se investigó la actividad
antirradicalaria y la capacidad de retardar la autoxidación lipídica de grasa de dos flavonoides: glucósido de
hesperetina (GH) y laurato de glucósido de hesperetina (LGH). La actividad antirradicalaria se ensayó por el
método del DPPH y la capacidad de retardar la autooxidación se evaluó mediante Índice de Peróxidos.
Ambos compuestos tuvieron actividades antirradicalarias comparables aunque menores que las de BHT y
BHA. En cuanto a la autooxidación de grasas, se determinó que las muestras de grasa adicionadas con GH
(140 ppm) o LGH (200 ppm) alcanzaron 10 meq/kg (máximo permitido por el Código Alimentario
Argentino) luego de 220 días de incubación a 50 ºC, lo cual representa una mejora del 900 % respecto a las
muestras de grasa sin aditivos. Puede concluirse que ambos derivados son aptos como antioxidantes para
matrices grasas. LGH, además, es soluble en matrices grasas y se presume que tendrá actividad
antibacteriana, lo que le permitirá conservar alimentos tanto de la oxidación como de las contaminaciones
bacterianas más frecuentes.
Palabras claves: Flavonoides cítricos, ésteres alquílicos de flavonoides cítricos, antioxidantes, aditivos.
Abstract: Common food antioxidants (TBHQ, BHT and BHA) are potential human carcinogens. In order to
propose alternative food antioxidants, it was investigated the antiradical activity and ability to retard lipid
peroxidation of hesperetin glucoside (GH) and its lauroyl ester (LGH). Antiradical activity was tested by the
DPPH method and Peroxide Value was used to evaluate the ability to retard the autoxidation of fat. Results
showed that both compounds have similar activities as radical scavengers and that these values were lower
than those determined for BHT and BHA. With regard to autoxidation of fats, it was determined that the
samples with GH (140 ppm) or LGH (200 ppm) reached 10 meq/kg after 220 days of incubation at 50 °C,
which represented a 900 % improvement over the control. It was concluded that both derivatives can be used
as antioxidants in fatty matrixes. LGH also is fat-soluble and is presumed that it has antibacterial activity,
wich it would allow to preserve foods against both the lipid peroxidation and the food contaminations by
bacterias.
Key words: Citrus flavonoids, alkyl esters of Citrus flavonoids, antioxidants, food preservatives.
INTRODUCCIÓN
Los flavonoides protegen a los organismos del daño causado por agentes ambientales como los rayos UV, la
polución ambiental y diversos químicos exógenos. Actúan en plantas como antioxidantes, antimicrobianos,
fotorreceptores, repelentes de insectos, atrayentes de polinizadores o presas, entre otras funciones (Iwashina,
2003). Poseen un esqueleto del tipo difenilpirano (C6-C3-C6): dos anillos de fenilos (A y B) unidos a través
de un anillo heterocíclico (C), de tres carbonos (Figura 1). Las subclases de flavonoides más frecuentes en
frutas cítricas son flavanonas y están presentes en las formas de glicósidos o de agliconas (Horowitz y
Gentili, 1977). Las formas glicosídicas más frecuentes son: rutinósidos y neohesperidósidos. Las flavanonas
naringina y neohesperidina poseen el azúcar neohesperidosa (ramnosil-α-1,2 glucosa). A partir de estos
flavonoides es posible obtener ramnosa por hidrólisis enzimática. Este carbohidrato es de gran interés en la
industria cosmética ya que se utiliza en diversas formulaciones (Vichy Laboratoires, 2012). La potencial
producción de ramnosa a partir de neohesperidina daría como subproducto el glucósido de hesperetina
(GH). El aprovechamiento de este glucósido mejoraría el balance económico de la reacción. Más aún, el
estudio de las propiedades del glucósido, como así también de las sustancias que puedan derivarse a partir de
éste, puede convertirlo de subproducto al producto de la hidrólisis con mayor interés económico. En este
sentido es interesante mencionar que existen publicaciones recientes que indican que la biodisponibilidad de
hesperidina en humanos se incrementa por la conversión del diglicósido a GH (Nielsen y cols., 2006).
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Figura 1. Obtención de ramnosa, glucósido de hesperetina y su éster de laurato a partir de neohesperidina
mediante catálisis enzimática.
Por otra parte se ha determinado que los flavonoides cítricos poseen acción antirradicalaria (Bors y cols.,
1990; Cook y Samman, 1996) la cual es atribuida a que pueden donar hidrógenos. De hecho, los grupos
fenólicos (principalmente los del anillo B) sirven como una fuente de átomos de hidrógeno de fácil acceso y
el radical que resulta de la entrega de hidrógeno puede estabilizarse deslocalizando la carga.
A pesar de que existen varios métodos para medir la actividad antirradicalaria (Prior y cols., 2005), el
método que emplea 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH), es el más usado para cuantificar la capacidad de una
molécula de capturar radicales libres. La molécula DPPH (Figura 2) es un radical libre estable que
deslocaliza el electrón desapareado que posee en toda su estructura, de modo tal que las moléculas no pueden
formar dímeros, como sucede con la mayoría de los radicales libres (Molyneux, 2004). Esta deslocalización
también es la responsable del intenso color violeta del sólido y se caracteriza por una banda de absorción
centrada alrededor de 520 nm.
Cuando una solución de DPPH (DPPH*) se mezcla con una sustancia que puede donar un átomo de
hidrógeno, la molécula reacciona sustrayendo un hidrógeno atómico y genera una molécula de DPPH
reducida (DPPH-H) con la consecuente pérdida de color (en realidad las soluciones de DPPH reducidas
tienen color amarillo pálido que se debe al grupo picrilo todavía presente). Si representamos la molécula del
agente antirradicalario como AH, la reacción es:
DPPH* + AH = DPPH-H + A*
Donde A* es otro radical que, dependiendo de qué molécula se trate, puede donar otro hidrógeno a otra
molécula de DPPH* generando una molécula más oxidada y estable. Este es el caso, por ejemplo, de la
vitamina C. Los radicales A* deben ser lo suficientemente estables como para mantenerse inertes y no
propagar reacciones radicalarias.
Radical DPPH (DPPH*)
Forma reducida del radical DPPH (DPPH-H)
NO2
NO2
*
N
O2N
N
H
N
O2N
N
NO2
NO2
Tenue color amarillo pálido
Intenso color violéta con pico en 520 nm
Figura 2. Formas oxidadas y reducidas del radical 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH).
El aprovechamiento de la propiedad antirradicalaria de los flavonoides está severamente restringido por la
baja solubilidad que presentan en matrices lipídicas. Para superar esta limitación muchos autores han
estudiado la modificación estructural de flavonoides para aumentarles sus solubilidades en matrices
lipofílicas . Se ha observado que es conveniente realizar transformaciones por vías enzimáticas debido al
elevado grado de regioselectividad (Figura 1), las condiciones suaves de las reacciones así como los altos
rendimientos logrados (Chebil y cols., 2007).
Los antioxidantes, tanto sintéticos como naturales, se emplean en aceites y grasas para prevenir el avance de
la oxidación lipídica, la cual produce compuestos que otorgan a la matriz donde se encuentran colores, olores
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y/o sabores no deseables. En general la oxidación de los lípidos en los alimentos se debe a la reacción del
oxígeno con los lípidos insaturados. La oxidación lipídica de ácidos grasos insaturados consta de tres etapas:
iniciación, propagación y terminación. Las reacciones de iniciación más importantes involucran la
sustracción de un hidrógeno atómico de un carbono vecino a un doble enlace (hidrógeno α) por parte de
radicales hidroxilo (HO●) o hidroperóxido (HOO●). Luego, la etapa de propagación involucra el ataque del
radical centrado en carbono con oxígeno para formar un radical peroxilipídico, el cual puede sustraer un
hidrógeno α de otro ácido graso para formar un hidroperóxido y otro radical lipídico que continuará la
reacción en cadena (Figura 3 A). En la fase de terminación, los radicales pueden combinarse entre sí y los
peróxidos pueden consumirse en numerosas y complicadas reacciones secundarias cuyos productos son los
responsables de alterar las propiedades organolépticas de las grasas. Un antioxidante efectivo debe
interrumpir la reacción en cadena capturando el radical iniciador, el lípido radical o el lípido peroxilradical.
Una forma de seguir las reacciones de autoxidación es a través del Índice de Peróxidos que es una
determinación volumétrica de los grupos peróxidos e hidroperóxidos (Figura 3B).
Ter
min
ació
n
pag
ació
n
Pro
Inic
iaci
ón
B
Indice de peróxidos
(milieq. peróxido kg de grasa -1)
A
Tiempo
Figura 3. A) Esquema de las reacciones de iniciación y propagación sobre ácidos grasos insaturados
B) Variación del Índice de Peróxidos en las distintas etapas de la autooxidación lipídica.
Los antioxidantes más empleados en alimentos (TBHQ, BHT y BHA) son sintéticos y el empleo de los
mismos presenta controversias porque son aceptados por la FDA a pesar de ser potenciales agentes
carcinogénicos de humanos (Health and Human Services Secretary, 2011).
Con el fin de proponer aditivos antioxidantes alternativos, en este trabajo se investigaron las capacidades de
capturar radicales libres y de retardar la autoxidación de grasa bovina de dos derivados de neohesperidina:
glucósido de hesperetina (GH), que se obtiene por hidrólisis de hesperidina o neohesperidina catalizada por
α-ramnosidasa de Aspergillus niger; y de laurato de glucósido de hesperetina (LGH), que resulta de
esterificar GH con laurato de vinilo empleando lipasa B de Candida antarctica (Novozym 435) en acetona.
MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción de neohesperidina
El flavonoide neohesperidina fue obtenido previamente en la Facultad de Ciencias Exactas de la UNSa a
partir de naranjas variedad Citrus aurantium de la región Noroeste de Argentina. El proceso de extracción
consistió en triturar frutos de entre 1 y 3 cm de diámetro y luego someterlos a extracción con etanol:agua
25:50 (v/v) a 25 ºC. El extracto se enfrió, lo que produjo la precipitación de los flavonoides. El sólido,
filtrado y lavado, se secó en estufa a 50 ºC (Macoritto y cols., 2004). Una etapa posterior de purificación
consistió en recristalizar en agua y en etanol absoluto. La neohesperidina obtenida tuvo una pureza superior
al 99% determinada por HPLC por comparación con un estándar de Extrasynthese (Francia).
Obtención de glucósido de hesperetina
GH se obtuvo por hidrólisis enzimática a partir de neohesperidina empleando una α-L-ramnosidasa
comercial de Aspergillus niger de Amano (Japón) (Ellenrieder y cols., 1998) en solución reguladora acetato
de sodio 20 mM pH 5 a 50 °C siendo los productos de la hidrólisis ramnosa (25 g/l) y GH, el cual fue
purificado por sucesivas precipitaciones en frío y se obtuvo con una pureza superior al 99% medida por
HPLC.
Síntesis de laurato de glucósido de hesperetina
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LGH se sintetizó en base a investigaciones previas (Céliz y Daz, 2011), empleando GH y laurato de vinilo.
Como solventes se empleó acetona y la reacción fue catalizada por el derivado inmovilizado de lipasa B de
Candida antárctica, Novozym 435, donado por Novozymes Latin America Limited (Brasil).
Estudio del poder antirradicalario
El método del DPPH para determinar actividad antirradicalaria consiste en emplear una solución metanólica
de DPPH de concentración conocida a la cual se le agrega el antioxidante disuelto en metanol. Luego se
registra la disminución de la absorbancia con el tiempo a 520 nm. Las variaciones posibles en la técnica y las
formas de informar los resultados son muchas y no existe aún consenso en este sentido (Prior y cols., 2005),
por ende suele ser difícil contrastar resultados de diferentes autores. En este trabajo se siguió la metodología
descripta por Brand-Williams y cols. (1995).
Curva de Calibración de DPPH: Se preparó una disolución patrón de DPPH (Sigma, Estados Unidos)
próxima a 1 10-4 mol L-1 en metanol (Sintorgan, Argentina). Luego, se determinó la longitud de onda de
máxima absorbancia del DPPH (518 nm) en un espectrofotómetro GBC Cintra 101 (GBC, Australia). A
partir de esta solución, se preparan diluciones 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 y 1/6 (v/v) que se emplearon para construir
una curva de calibrado. Como blanco se utilizó metanol puro.
Determinación del poder antirradicalario: Se preparó una solución de DPPH aproximadamente 6,0 10-5 M a
la cual se le determinó la concentración exacta empleando la curva de calibración. Para la reacción se
colocaron en tubos plásticos con tapas, 50 µL de cada solución del antioxidante de interés en metanol y 950
µL de la solución stock de DPPH. Los tubos se conservaron tapados en la oscuridad y a 4 ºC. Como blanco
se utilizó un tubo conteniendo 50 µL de metanol y 950 µL de la solución de DPPH. Se siguió la
concentración de DPPH remanente en función del tiempo y se transformó en porcentaje según:
DPPH (%) 
[ DPPH ]t
*100
[ DPPH ]0
(1)
Donde [DPPH]t es la concentración de DPPH a un determinado tiempo y [DPPH]0 es la inicial. De éstos
gráficos, se determinó el porcentaje de DPPH remanente cuando la variación de la absorbancia con el tiempo
fue prácticamente constante (estado estacionario) y estos valores fueron transferidos a otra gráfica que
muestra el porcentaje de DPPH remanente en el estado estacionario como una función de la relación molar
antioxidante/DPPH. La actividad antirradicalaria fue definida por Brand-Williams y cols. como la cantidad
de antioxidante por mol de DPPH necesaria para disminuir la concentración inicial de DPPH en un 50 % en
el estado estacionario (EC50).
Efecto protector de GH y LGH frente a la peroxidación lipídica de grasa bovina
Debido a que los aceites del reino vegetal contienen naturalmente grandes cantidades de antioxidantes, se
eligió trabajar empleando grasa bovina cuya composición promedio es 25 % de ácido palmítico (C16:0), 15
% de ácido esteárico (C18:0) y 47 % de ácido oleico (C18:1) y naturalmente no posee ningún antioxidante
(Grompone, 1991). La grasa empleada se obtuvo de tejidos grasos frescos de vacas para consumo.
Los tejidos grasos se fundieron en balón cerrado a temperaturas no mayores a 100 ºC. Luego se descartó el
tejido sólido en caliente y la grasa fundida se purificó precipitando proteínas con sal (NaCl), filtrando y
eliminando la sal mediante lavados con agua. Finalmente la grasa se secó con cloruro de calcio.
La grasa fundida se enriqueció con GH y LGH a una concentración 0,3 mM, disolviendo previamente los
compuestos en etanol. Luego, se distribuyó en porciones de 4-5 g. La grasa sin aditivos (control) y las
enriquecidas se colocaron en estufa a 50 ºC con circulación forzada de aire.
Entre las exigencias que las grasas deben cumplir en el C.A.A. está fijado un valor máximo de Índice de
Peróxidos de 10 meq kg-1 (Artículos 540 y 543). Por este motivo se cuantificó el avance de la oxidación
determinando el Índice de Peróxidos hasta que se superó el valor permitido.
Técnica para la determinación del Índice de Peróxidos:Se siguió la metodología analítica oficial del C.A.A.
(Horwitz, 2005). La técnica del Índice de Peróxidos es una determinación volumétrica de los grupos
peróxidos e hidroperóxidos. La cuantificación se basa en la reacción de yoduro de potasio con los peróxidos
de la muestra para liberar yodo, el cual es titulado con tiosulfato de sodio, empleando almidón como
indicador (Nielsen, 1998).
Cada determinación consistió en pesar la masa de cada poción de grasa en un erlenmeyer de 250 ml, agregar
25 ml de solución ácido acético-cloroformo (3:2, v/v) y agitar hasta comprobar la disolución total de la grasa.
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Luego se agregaron 0,5 ml de solución saturada de KI, se agitó vigorosamente 10 segundos, se mantuvo el
sistema en reposo en la oscuridad durante 1 minuto y se añadieron 75 ml de agua destilada hervida y fría.
Acto seguido, se tituló con Na2S2O3 0,01 N hasta que se obtuvo un color amarillo pálido. En este punto se
adicionaron 0,5 ml de solución indicadora de almidón (1 % en agua) y se continuó la titulación hasta la
desaparición del color azul. El Índice de Peróxidos se obtuvo calculando los miliequivalentes de tiosulfato
utilizados en la titulación por kg de muestra.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Actividad antirradicalaria de GH y LGH
La Figura 4 B presenta la curva de calibrado obtenida, con la cual se transformaron absorbancias en
concentraciones. La Figura 4 B muestra, como ejemplo, los perfiles cinéticos de la reacción del DPPH con
dos compuestos, a una relación molar antioxidante/DPPH de 10. De esta gráfica puede verse que el tiempo
necesario para alcanzar el estado estacionario está próximo a las 6 h.
100
A
DPPH remanente (%)
Absorbancia a 518 nm (UA)
0.90
0.65
0.40
0.15
0
2.0×10 -5
4.0×10 -5
6.0×10 -5
B
80
60
40
20
0
8.0×10 -5
0
[DPPH] (M)
2
4
Tiempo (h)
6
8
Figura 4. A) Curva de calibración obtenida de DPPH por espectrofotometría a 520 nm, B) Perfil de reacción
de DPPH (6.5 10-5 M) con GH (negro) y LGH (bordó). Relación molar antioxidante/DPPH 10.
La Figura 5 muestra los porcentajes de DPPH remanentes en el estado estacionario a diferentes relaciones
molares iniciales para todos los compuestos ensayados.
El valor de EC50 determinado para GH y LGH (1.6±0.2 mol de antioxidante/mol de DPPH), pone en
evidencia que si bien el valor es interesante, la capacidad antirradicalaria es menor a la de BHT o BHA
(0.24±0.02 mol de antioxidante/mol de DPPH). La Figura 5 también muestra claramente que no existen
diferencias importantes en el poder antirradicalario frente a DPPH entre ambos compuestos. Este resultado
contradice los obtenidos por Salem y cols. (2010), quienes afirmaron que la actividad antirradicalaria frente a
DPPH disminuyó a medida que se incrementó la longitud de la cadena de ésteres alquílicos de isoquercitrina.
Sin embargo, están de acuerdo con otras investigaciones en las que se concluyó que la actividad
antirradicalaria es independiente de la acilación (Figueroa-Espinoza y Villeneuve, 2005; Viskupicova y cols.,
2010) ya que la modificación estructural se encuentra en un sector de poca importancia en relación a la
actividad antirradicalaria (Pietta, 2000; Williams y cols., 2004).
100
% DPPH Remanente
90
GH
Laurato de GH
BHA
BHT
80
70
60
50
40
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
mol de Antioxidante / mol de DPPH
Figura 5. Porcentaje de DPPH remanente en el estado estacionario (6 h) en función de la relación molar
antioxidante/DPPH inicial.
Efecto de GH y LGH frente a la peroxidación de grasa bovina
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Indice de peróxidos
(milieq. peroxido kg de grasa -1)
El Artículo 549 (Res 2012, 19.10.84) del C.A.A. permite el agregado de antioxidantes autorizados en las
proporciones listadas en el Artículo 523 bis, cuyo máximo valor es 200 mg por kg de grasa. Este máximo
será el mismo cuando los antioxidantes se utilicen solos o en mezclas. Con el fin de comparar la efectividad
del glucósido de hesperetina con su éster laurato en cuanto a capacidad de retardar la oxidación lipídica se
trabajó a una concentración molar (0.3 mM) igual al máximo permitido respecto a LGH (200 ppm).
Se determinó el perfil de oxidación de grasa bovina pura (control) y adicionada con GH y LGH (0.3 mM) a
50 ºC en una estufa con circulación forzada de aire. La Figura 6 presenta los resultados obtenidos.
Puede verse que el control tuvo un período de iniciación bastante corto que no se diferenció de la fase de
propagación radicalaria. A partir del día 25 de incubación superó el Índice de Peróxidos de 10 meq kg-1. Por
su parte las muestras de grasa adicionadas con GH (140 ppm) o LGH (200 ppm) tuvieron un comportamiento
claramente diferente al control. Estas muestras alcanzaron el valor máximo permitido (10 meq kg-1) luego de
220 días de incubación a 50 ºC con circulación forzada de aire. Esto representa una mejora en la vida útil de
la grasa del orden de 900 %. Luego, se observó un salto pronunciado, lo que significa la propagación de la
autooxidación lipídica.
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
300
Tiempo (dias)
Figura 6. Índice de peróxidos en grasa bovina en función del tiempo a 50 ºC. Control (rojo), adicionada con
glucósido de hesperetina 140 ppm (verde) y laurato de glucósido de hesperetina 200 ppm (azul).
CONCLUSIONES
Los compuestos GH y LGH tuvieron la misma eficiencia tanto en la actividad antirradicalaria como en la
capacidad de proteger grasa bovina de la oxidación. Esto significa que la incorporación de la cadena alquílica
al glucósido de hesperetina no modificó las propiedades antioxidantes de la aglicona.
Los compuestos GH y LGH protegieron la grasa bovina de la oxidación a una concentración permitida por el
C.A.A., otorgándole una estabilidad 9 veces mayor que la del control.
Se concluye que ambos derivados pueden emplearse como antioxidantes en matrices grasas, supeditado a la
inocuidad de los mismos. Sin embargo LGH, parecería ser más adecuado ya que además de ser antioxidante,
es más soluble que GH en matrices grasas y se presume, por similitud estructural con su análogo de prunina
(Céliz y cols., 2010), que tendrá actividad antibacteriana principalmente frente a bacterias patógenas Grampositivas, lo que le permitirá conservar alimentos tanto de la oxidación como de las contaminaciones
bacterianas más frecuentes.
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AGRADECIMIENTOS
Al Consejo de Investigación de la Universidad Nacional de Salta por el financiamiento (PI 2009). G. Céliz
agradece al CONICET por su beca postdoctoral.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Estudio de ricotas con diferentes métodos de elaboración y efectividad de nisina para su preservación
Fernandez V., Mugliaroli S.L., Jagus R.J.
Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ingeniería, Laboratorio de Microbiología Industrial: Tecnología
de Alimentos. Argentina.
rjagus@di.fcen.uba.ar
Resumen: La ricota es obtenida a partir del suero de queso por desnaturalización de las proteínas solubles de
leche. Es un alimento susceptible a la alteración microbiana que requiere la aplicación de métodos de
preservación para asegurar una adecuada vida útil. Actualmente existe interés en sustituir los conservadores
químicos sintéticos por antimicrobianos naturales como la nisina, un bacteriocina considerada GRAS. Este
trabajo estudió las características de ricotas obtenidas por diferentes métodos y evaluó la eficacia de la nisina
para controlar el desarrollo de coliformes y bacterias psiscrótrofas en ricota envasada al vacío y almacenada
en refrigeración (6º C). Las ricotas fueron elaboradas con ácido acético (A) y sin ácido acético (SA) y con
ácido acético y nisina (500UI/g de suero, AN). Posteriormente, se envasaron al vacío y almacenaron a 6°C
durante 18 días. La ricota A presentó mayor contenido de grasa y menor pérdida de agua durante el
almacenamiento que la ricota SA. En base a estos resultados, se seleccionó el método de elaboración con
ácido para preparar ricota con nisina y evaluar su eficacia antimicrobiana. La nisina fue efectiva para
controlar el desarrollo de bacterias psictrótrofas y coliformes por debajo de los límites aceptables hasta los
14 días de almacenamiento en refrigeración (6ºC).
Palabras clave: ricota, nisina, antimicrobianos naturales
Abstract: Ricotta is obtained from cheese whey by denaturation of the water soluble milk proteins present
in whey. The product is susceptible to microbial alteration and needs the application of preservation methods
to guarantee an appropriate shelf- life. Nowadays there exists interest to replace antimicrobial synthetic
chemists for natural antimicrobials such as nisin, a GRAS bacteriocin. The present work studied the
characteristics of ricottas obtained by different methods of production and evaluated the effectiveness of
nisin to control the development of coliforms and psychrotrophs in vacuum sealed ricotta during storage
under refrigeration at 6ºC. Ricottas were elaborated with acetic acid (A) and without acetic acid (SA) and,
later, with acetic acid and nisina (500UI/g of whey, AN). Afterwards, ricottas were vacuum packed and
stored under refrigeration (6°C) for 18 days. Ricotta A turned out to be of major content of fat and minor loss
of water during storage in comparison with ricotta SA. On this basis, method A was selected to elaborate
ricotta with nisin (AN) in order to evaluate its antimicrobial efficiency. Nisin proved to be effective to
control psychrotrophs and coliforms growth below acceptable limits up to 14 days of storage in refrigeration
(6°C).
Keywords: ricotta, nisin, natural antimicrobials.
INTRODUCCIÓN
La ricota es un queso de suero de origen italiano muy popular en Italia e Iberoamérica, incluida la Argentina.
Se produce a partir del suero remanente de la elaboración de quesos y su manufactura se basa en la
desnaturalización y coagulación de las proteínas solubles de la leche (principalmente de α- lactoalbúmina y
β-lactoglobulina), por calentamiento a elevadas temperaturas (>85°C) y recolección de los flóculos formados
en la superficie. Las proteínas del suero de queso tienen excelentes propiedades funcionales y un alto valor
nutritivo debido a su excepcional contenido en lisina, triptofano y aminoácidos azufrados; además de
presentar importantes contenidos de grasa, lactosa y calcio (Abrams et al. 2002, Miranda-Miranda et al.
2009). La recuperación de los nutrientes del suero y las características de los productos dependen de los
métodos de elaboración de ricota empleados en cada caso, siendo las condiciones de calentamiento, el grado
de acidez del suero, el agregado de leche, iones Ca2+ y sal, algunos de los factores de mayor importancia
(Scott 1991).
Dada su elevada humedad, baja concentración de sal y pH alto (>6.0), la ricota es un alimento susceptible de
alteración microbiana, por lo cual es comercializado refrigerado y, en algunos casos, envasado al vacío, en
atmósferas modificadas o con agregado de conservadores. Actualmente existe interés en remplazar los
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conservadores químicos sintéticos por antimicrobianos naturales como la nisina y otras bacteriocinas. La
nisina es un péptido catiónico de peso molecular 3.5 kDa y está descripta como miembro de la Clase IA, el
grupo que contiene a los lantibióticos (Klaenhammer 1993). Los lantibióticos de tipo A, como la nisina, son
moléculas flexibles, elongadas y anfipáticas que actúan básicamente mediante la formación de poros en la
membrana citoplasmática de las bacterias (Brotz y Sahl 2000). Su empleo como antimicrobiano en alimentos
fue aprobado en 1969 por el Comité Experto de Aditivos de Alimentos de FAO / WHO (Thomas et al.
2000). En 1988 fue aprobada como aditivo de alimentos por la FDA, y aceptada como un compuesto GRAS.
Desde entonces ha sido muy estudiada su aplicación en una gran variedad de alimentos frescos y procesados,
principalmente en productos cárnicos y lácteos (Gallo et al. 2007, Sobrino-López y Martín-Belloso 2008).
Los objetivos de este trabajo fueron estudiar las características de ricotas obtenidas por diferentes
procedimientos y la efectividad de nisina para controlar el desarrollo de bacterias coliformes y bacterias
psicrótrofas en ricotas envasadas al vacío y almacenadas a 6°C.
MATERIALES Y METODOS
Queso ricota
La ricota fue elaborada en la Planta Piloto de Alimentos (U.B.A.). Se elaboraron ricotas con ácido acético
(A), sin ácido acético (SA) y ricota con ácido acético y nisina (AN).
Los procedimientos empleados para cada elaboración se indican en la Figura 1. Se utilizaron para cada
partida entre 80 y 100 l de suero lácteo provenientes de la elaboración de queso cuartirolo, que fueron
procesados inmediatamente después de su recolección, a la salida de la desueradora.
Para la elaboración de la ricota A se siguió el procedimiento esquematizado en la Figura 1, El suero fue
volcado en una tina de acero inoxidable y se ajustó el pH a un valor de aproximadamente de 6,5 - 6,6 con
hidróxido de sodio 10%m/v. El calentamiento se efectuó con vapor de agua. El suero se mezcló con leche
entera (provista por La Serenísima, leche:suero 5:100) y, posteriormente, se fueron incorporando los otros
aditivos. Se agregaron, sal (0,7 kg cada 100 l de suero), cloruro de calcio (en escamas de uso industrial,
EFICE S.A., Uruguay, 25 g cada 100 l de suero) y ácido acético (Cicarelli®, 17,5 ml cada 100 l de suero).
Una vez formados los flóculos, se retiraron cuidadosamente con una pala de extracción, se colocaron en
canastos para permitir el desuerado y se cubrieron con lienzos. Se almacenaron en refrigeración durante 24 h
y, posteriormente, se fraccionaron y almacenaron al vacío en bolsas (donada por Sealed Air, permeabilidad
al oxígeno: 3.000/5.000 cm3/m2 por atmósfera por día) con envasadora de vacío (Ehrlich, New, Argentina).
Las muestras se almacenaron a 6ºC durante 18 días y se realizaron análisis microbiológicos a diferentes
intervalos de tiempo.
Las ricotas SA y AN se prepararon de acuerdo a procedimientos similares al anteriormente descripto. En la
Figura 1 se muestran las modificaciones para cada una de las elaboraciones. En el caso de la ricota AN, se
incorporó nisina (Delvo®PlusNisin, donada por DSM- Netherlands; 500UI/g de suero) durante la
elaboración.
Análisis físico-químicos
La preparación de las muestras de ricota se llevó a cabo según el procedimiento establecido en AOAC
(1995). Se determinaron pH (pHmetro digital Hanna, HI99163 y electrodo FC232D) que fue insertado
directamente en la ricota para efectuar la medición, humedad (secado en estufa de vacío a 100±2ºC hasta
peso constante), proteínas (Kjeldahl) y grasas (Roese-Gottlieb) de acuerdo a AOAC (1995). Todas las
determinaciones se realizaron por triplicado.
El desuerado durante el almacenamiento se midió como la pérdida de agua a los 18 días de almacenamiento
y se determinó según el siguiente procedimiento. Se pesaron 10 g de ricota, se centrifugó 10 minutos a
10.000 rpm (Eppendorf 5804 R), se midió el volumen de agua separada. La determinación se realizó por
triplicado y el resultado se calculó como volumen de agua separada cada 100 g de ricota.
El rendimiento de las elaboraciones se calculó teniendo en cuenta la masa total de materias primas
empleadas y la masa de ricota obtenida en cada elaboración.
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Suero de queso
Nisina  55°C
Leche entera  65°C
Leche entera 65°C
Sal (NaCl) 86°C
Sal (NaCl)  86°C
CaCl2 88°C
CaCl2 88°C
Ácido acético 90°C
Ácido acético90°C
Leche entera 65°C
Sal (NaCl)  80°C
CaCl2 86°C
Calentamiento
hasta 92ºC
Retención sin calentamiento ( 15 min)
Extracción
Refrigeración (24 h)
Fraccionamiento y envasado al vacío
Suero
de
ricota
Almacenamiento en refrigeración
AN: ricota con
ácido y nisina
A: ricota con ácido
SA: ricota sin
ácido
Figura 1: Procedimientos de elaboración de ricota con ácido (A), ricota con ácido y nisina (AN) y ricota sin
ácido (SA)
Análisis microbiológicos
A cada tiempo evaluado, se transfirieron asépticamente 10g de muestra a bolsas de stomacher estériles, se
agregaron 90 ml de agua peptonada 0,1% estéril y se homogeneizaron en stomacher (Interscience
Laboratories Inc. Bagmixer® 400 P,Francia) por 60 segundos. Se prepararon diluciones decimales con agua
peptonada 0,1% estéril y se sembraron por duplicado en los medios de crecimiento para realizar los
recuentos microbianos.
El recuento de bacterias psicrótrofas se determinó en agar para recuento total (Biokar Diagnostics Francia,
20ºC, 5 días) (Wehr 1992, Jay JM 2002); recuento de bacterias coliformes totales en agar bilis rojo neutro
cristal violeta lactosa (Merck, 35°C, 24h) (Wehr 1992); recuento de bacterias coliformes totales por la
técnica del número más probable (NMP) en caldo lactosa Verde Brillante 2% sales biliares (Biokar
Diagnostics Francia, 30°C, 24-48h) (FIL- IDF 1985); recuento de coliformes a 44°C por la técnica del
número más probable (NMP) en caldo lactosa Verde Brillante 2% sales biliares (Biokar Diagnostics Francia,
45°C, 24h)( FIL-IDF 1985); recuento de mohos y levaduras en agar extracto de levadura-glucosacloramfenicol (Biokar Diagnostics Francia, 28°C, 3 a 5 días) (FIL-IDF 1990); Staphylococcus aureus
coagulasa positiva (FIL-IDF 1990) y Salmonella spp. (FIL-IDF 1985). Los resultados fueron expresados
como log de unidades formadoras de colonia por gramo de ricota (log UFC/g).
Tratamiento de datos
Se empleó el test de Student de dos poblaciones (software Origin 6.0) para la comparación de los promedios
de los datos de humedad, grasa, proteínas, pH, pérdida de agua de las ricotas A y SA y se determinaron las
diferencias significativas a p<0,05.
Los datos de análisis microbiológicos se informan en las figuras como promedio y desviación estandard de
log N, siendo N el número de unidades formadoras de colonias por gramo.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la Tabla 1 se presentan los valores correspondientes a los análisis físico-químicos de las ricotas
elaboradas con y sin agregado de ácido acético.
Tabla 1: Caracterización de las ricotas con agregado de ácido (A) y sin agregado de ácido (SA).
Cada valor es el promedio ± la Desviación Standard de los resultados obtenidos.
Componente
Ricota A*
Ricota SA*
% Grasa
17,2 ± 0.3a
14,0 ± 0.1 b
% Humedad
69,5 ± 0.5
72,1 ± 0.2
% Proteínas
8,6 ± 0,5
8,3 ± 0,4
% Pérdida de agua
5±0c
13 ± 3 d
Rendimiento (%)
3,06
3,13
pH inicial
6,57 ± 0,01 e
6,74 ±0,04 f
Los datos señalados con letras diferentes presentan
diferencias significativas (p<0,05)
Ambos procedimientos permitieron obtener productos de elevado valor nutricional con una buena
recuperación de proteínas. En relación a la importancia de las condiciones del procedimiento de elaboración
respecto de la recuperación de proteínas y rendimiento del proceso, Vázquez Puente et al. (2010) estudiaron
la influencia de las condiciones de calentamiento y de la acidez inicial del suero de leche. Estos
investigadores evaluaron el efecto de diferentes temperaturas de calentamiento (73, 83 y 93ºC) y observaron
que los mejores resultados se obtenían aplicando la mayor temperatura durante 15 minutos.
Si bien ambas ricotas resultaron similares, el procedimiento con ácido (ricota A) presentó mayor contenido
de grasa y menor desuerado, que la ricota obtenida por el método sin ácido acético (ricota SA). Dado que
estas características fueron consideradas de importancia, fundamentalmente desde el punto de vista de
aceptabilidad sensorial, se eligió el procedimiento con ácido para estudiar la efectividad de la nisina en la
conservación de la ricota.
La ricota con nisina (AN) no presentó diferencias en cuanto al rendimiento, contenido de proteínas, grasa,
humedad, pH ni pérdida de agua respecto a la ricota elaborada con ácido acético (A).
En cuanto al aspecto microbiológico, todas las ricotas recién elaboradas fueron analizadas para comprobar su
aceptabilidad microbiológica según Código Alimentario Argentino (CAA) (Código Alimentario Argentino
2006). Dado que el CAA no fija límites microbiológicos específicos para ricota, se tuvieron en cuenta los
correspondientes al art. 605 para quesos de muy alta humedad (humedad > 55%) sin bacterias lácticas en
forma viable y abundante. En todas las muestras de ricota los resultados obtenidos estuvieron dentro de los
límites permitidos y resultaron NMP coliformes a 30°C <0,03/g; NMP coliformes a 45°C <0,03/g; mohos y
levaduras <10 UFC/g; Staphylococcus aureus coagulasa positiva <100 UFC/g y ausencia de Salmonella
spp.en 25 g.
Durante el almacenamiento de las ricotas elaboradas con ácido (A) y con ácido y nisina (AN) se evaluó el
desarrollo de la flora psicrótrofa y coliforme como indicadores de vida útil del producto. Distintos
investigadores han utilizado diferentes parámetros para determinar la vida útil en quesos. Papaioannou et al.
(2007) estudiaron la vida útil de queso de suero envasado al vacío y en dos atmósferas modificadas
analizando el desarrollo de las bacterias mesófilas totales, bacterias lácticas, enterobacterias, pseudomonas, y
levaduras/ hongos durante el almacenamiento. Paralelamente evaluaron la calidad sensorial (aroma y sabor)
de los quesos en ese período y concluyeron que los valores sensoriales correlacionaban bien con los
microbiológicos. Hough et al. (1999) analizaron la vida útil sensorial y microbiológica de ricotas argentinas
y encontraron que existía una buena correlación entre el crecimiento de las bacterias mesófilas totales y los
cambios en sabor y acidez. Estos autores destacan que los valores de corte de vida útil deben considerar
varios factores, particularmente las características sensoriales y las especificaciones legales fijadas por el
CAA a las que el producto debe ajustarse durante toda su vida comercial.
En lo que respecta a nuestro trabajo, se realizaron algunos ensayos previos para decidir qué determinaciones
se emplearían en el análisis de vida útil. Se llevaron a cabo análisis de varios grupos microbianos en ricota
almacenada en refrigeración (resultados no mostrados). Se estudiaron bacterias psicrotrofas, mesófilas
proteolíticas, lácticas, coliformes y mohos y levaduras y se comprobó que las bacterias mesófilas
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proteolíticas y las psicrótrofas mostraban comportamientos similares y eran los grupos que presentaban
mayor velocidad de crecimiento alcanzando la densidad máxima poblacional antes que los otros
microorganismos. Estos resultados fueron coincidentes con los observados por Schmidt et al. (1992) y
Dermiki et al. (2008), quienes evaluaron la vida útil de quesos de características similares a la ricota a través
de análisis sensoriales y microbiológicos. Comprobaron que el desarrollo de la flora mesófila se debía al
aumento de bacterias psicrótrofas y, a su vez, que este grupo microbiano era el responsable de la producción
de metabolitos causantes de olores y sabores desagradables en el producto. Si bien el CAA no fija límites
para bacterias psicrótrofas en quesos, en este trabajo se tomó 5 log UFC/g. ya que es el estipulado por este
código para bacterias mesófilas en productos relacionados (crema, leche y helados), mientras que otros
autores emplean como límite valores aún superiores, 5 log UFC/g (ICMSF 1986).
En la Figura 2 se muestra la evolución de la flora psicrótrofa en ambos productos. La contaminación inicial
detectada fue baja, 1,4 -1,9 log UFC/g para AN y A respectivamente, evidenciando buenas condiciones de
trabajo en cuanto a la higiene y a la refrigeración durante la estabilización del producto desde su producción
hasta el envasado.
12,00
10,00
log UFC/g
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0
3
5
7
tiempo (días)
Figura 2: Evolución de la flora psicrótrofa en ricota A
10
14
18
y ricota AN
Como se desprende de la Figura 2, la ricota A superó el límite fijado al séptimo día (9,9±0,1 log UFC/g)
mientras que la incorporación del antimicrobiano permitió que AN recién alcanzara el límite máximo
(5,0±0,6 log UFC/g) el día 14 del almacenamiento. Resultados similares fueron observados por Samelis et al.
(2003) quienes estudiaron el efecto antimicrobiano de distintos tratamientos de nisina sobre Listeria
monocytógenes y la flora mesófila en queso de suero griego Anthotyros almacenado en refrigeración.
Durante el almacenamiento la flora total aumentó en todos los tratamientos y llegó a exceder los 8 logUFC/g
excepto en quesos elaborados con 500UI nisina/g de suero.
La Figura 3 muestra los recuentos de las bacterias coliformes en las ricotas con y sin nisina durante el
almacenamiento a 6°C.
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6,00
log UFC/g
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0
3
7
10
tiempo (días)
Figura 3: Evolución de la flora coliforme en ricota A
14
18
y ricota AN
La investigación de bacterias coliformes en quesos y productos lácteos es de interés dada su relevancia como
grupo de indicadores de prácticas higiénicas en la elaboración y de abuso de temperatura durante el
almacenamiento. En base al criterio microbiológico establecido por el CAA para este tipo de alimentos y al
considerado por otros autores (Hough et al. 1999) se tomó 3,00 log UFC /g como valor límite de bacterias
coliformes.
La ricota A alcanzó un recuento de coliformes de 3,5± 1,0 logUFC/g el séptimo día de almacenamiento a
6°C. El agregado de nisina en la elaboración permitió demorar el desarrollo de bacterias coliformes y AN
mostró una contaminación de 2,5±1,2 log UFC/g al día catorce y de 4,1±1,5 log UFC/g al día dieciocho.
La nisina demostró cierta efectividad contra este grupo microbiano ya que demoró su desarrollo durante el
almacenamiento. Varios autores, entre ellos Blackburn et al. (1989), Kalchayanand et al. (1992) y DelvesBroughton et al. (1992) han hecho referencia a mecanismos por los cuales la nisina puede resultar activa
frente a microrganismos naturalmente resistentes a ella. En el caso de las bacterias gram negativas, la nisina
debería atravesar la membrana externa y la pared celular, normalmente impermeables a ella, para tener
acceso a la estructura blanco de su acción antimicrobiana: la membrana citoplasmática. En este sentido
tratamientos que empleen agentes quelantes, ácidos orgánicos congelación ó procesos térmicos subletales
podrían resultar efectivos al favorecer la desorganización de la membrana externa. En este caso se puede
pensar que el tratamiento térmico favoreció la actividad de la nisina sobre las bacterias coliformes.
El desarrollo microbiano puede influir en la variación de la acidez o del pH del producto. Dermiki et al.
(2008) observaron que la variación del pH de quesos Myzithra Kalathaki almacenados en atmósferas de
diferente composición de CO2/N2 dependía del tipo de flora microbiana que se desarrollaba en el producto.
Por ejemplo, las muestras con atmósferas de envasado con mayor proporción de CO2 mostraron recuentos
más altos de bacterias lácticas y menores valores de pH. En nuestro estudio, se estudió el pH de las ricotas A
y AN durante el almacenamiento y su posible correlación con el desarrollo de algún grupo microbiano
durante este periodo. Los valores se mantuvieron prácticamente sin cambios, cercanos a los iniciales (6,57
(A) y 6,69 (AN)). Este hecho puede explicarse teniendo en cuenta que durante el almacenamiento hubo
desarrollo simultáneo de bacterias proteolíticas (productoras de compuestos nitrogenados, muchos de ellos
de características básicas) y bacterias lácticas (productoras de metabolitos ácidos).
CONCLUSIONES
Los resultados de este estudio demostraron que la elaboración de ricota a partir de suero de queso por los
métodos ensayados permitió la obtención de un producto de alto valor nutritivo con buena recuperación de
las proteínas del lactosuero. Se comprobó que la incorporación de nisina al suero en la elaboración no afectó
al producto en cuanto a su composición de nutrientes y le confirió estabilidad microbiológica, demorando el
desarrollo microbiano. El empleo de nisina en la elaboración permitió extender la vida útil controlando el
crecimiento de las bacterias psicrótrofas y coliformes dentro de los valores de aceptabilidad establecidos
durante 14 días en la ricota envasada al vacío y almacenada en refrigeración.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo económico de la Universidad de Buenos Aires y de la Agencia Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas
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Estabilidad oxidativa de aceites mezcla girasol-chía con adición de antioxidantes
(extracto de romero y palmitato de ascorbilo) durante su almacenamiento
Guiotto E.N. 1,2, Ixtaina V.Y. 1,2, Nolasco S.M. 2, Tomás M.C. 1
1: Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA) - CONICET- (FCEUNLP)
2: TECSE. Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires.
esnagui@hotmail.com
Resumen: A fin de evaluar la estabilidad de aceites mezcla girasol-chía (90:10 y 80:20) frente a la
oxidación, se llevó a cabo un ensayo de almacenamiento a dos niveles de temperatura habitualmente
empleadas, de refrigeración (T=4±1ºC) y ambiente (T=20±2ºC), con el agregado de antioxidantes tales como
palmitato de ascorbilo (AP, 2000 ppm), extracto de romero (ER, 5000 ppm) y su mezcla (AP:ER 2000:2000
ppm). Periódicamente se determinaron los índices de peróxido (PV), p-anisidina (p-AV) y valor total de
oxidación (Totox). Los aceites mezcla girasol-chía con antioxidantes almacenados a 4±1ºC, presentaron PV
≤ 10,0 meq O2/kg aceite; los menores valores de PV se evidenciaron en las mezclas con AP:ER. Durante el
almacenamiento a 20±2ºC, el límite máximo legislado de PV fue alcanzado entre los 120 y 240 días de
almacenamiento en el siguiente orden: control, con agregado de ER, AP y AP:ER para ambas mezclas de
aceite. Los valores de p-AV de los aceites almacenados a 4±1ºC se mantuvieron en niveles bajos mientras
que a 20±2ºC se registraron los mayores incrementos de este parámetro. Con respecto a la oxidación total de
los aceites almacenados a 4±1ºC con agregado de antioxidantes, los mismos presentaron valores Totox <
28,0; mientras que a 20±2ºC se alcanzaron niveles de 85,0.
Palabras clave: Aceites mezcla, antioxidantes, estabilidad oxidativa, almacenamiento
Abstract: Storage of sunflower-chia oil blends (90:10 and 80:20) was carried out to assess the oxidative
stability at two temperature levels normally used, cooling (T = 4±1°C) and room temperature (T = 20±2 °C),
with the addition of antioxidants such as ascorbyl palmitate (AP, 2000 ppm), rosemary extract (ER, 5000
ppm), and their mixtures (AP:ER, 2000:2000 ppm). Then, peroxide (PV), p-anisidine (p-AV) and Totox
values were determined. Sunflower- chia oil blends with antioxidants stored at 4 ± 1 º C showed PV ≤ 10.0
meq O2/kg oil, the lowest values of PV were found in blends with AP:ER. During storage at 20±2 °C, the
maximum level of PV legislated was reached between 120 and 240 days of storage in the following order:
control oil blends, with ER, AP, AP:ER. The p-AV values of oils stored at 4±1 °C presented low levels,
while at 20±2 °C an important increase was recorded for this parameter. Total oxidation of oils stored at 4±1
°C with the addition of antioxidants showed Totox < 28.0 whereas at 20±2 °C reached levels of 85.0.
Keywords: oil blends, antioxidants, oxidative stability, storage
INTRODUCCIÓN
El aspecto nutricional de los aceites comestibles y el impacto que sus constituyentes mayoritarios y/o
minoritarios pueden ejercer sobre la salud reciben cada día mayor interés de parte de los consumidores, para
lo cual es importante formular nuevas composiciones de aceite vegetal mejorando la estabilidad y valor
nutritivo (Frankel y Huang 1994). Estudios de la FAO-OMS (1997) han determinado una carencia y/o
deficiencia de los ácidos grasos esenciales linoleico y ácido α-linolénico debido a la alimentación
desbalanceada que caracteriza las dietas occidentales. Así, por cada unidad de ácidos grasos ω-3 deberían
consumirse de 5 a 10 unidades de ω-6.
El aceite de girasol (Helianthus annuus L.) es uno de los aceites vegetales habitualmente consumidos en
nuestro país, el cual contiene entre 65-70% de ácido linoleico -obtenido a partir de las variedades
tradicionales- (Gunstone 2002). El aceite extraído a partir de la semilla de chía (Salvia hispanica L.) exhibe
un elevado contenido de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), especialmente ácido α-linolénico (~ 60%)
(Ayerza 1995). Su incorporación en la dieta a través de aceites mezclas con aceite de girasol sería una
alternativa para aumentar su consumo y mejorar la relación ω-6/ω-3 en la dieta. La composición de ácidos
grasos es tal que puede obtenerse un aceite para ensaladas de excelente valor nutricional para un aceite
comercial (Taga et al. 1984).
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La estabilidad de los aceites vegetales está principalmente determinada por su grado de insaturación y por el
balance en las sustancias prooxidantes y antioxidantes presentes en los mismos. Los ácidos grasos son más
susceptibles a la oxidación a medida que aumenta el grado de insaturación o número de dobles enlaces en su
cadena hidrocarbonada. La oxidación de los ácidos grasos insaturados es uno de los principales procesos de
deterioro de origen químico que pueden afectar la calidad de los alimentos. Este tipo de proceso puede
producir pérdidas del valor nutricional así como también cambios en las características organolépticas y
propiedades funcionales (Ixtaina et al. 2011). La oxidación de los aceites es uno de los procesos de deterioro
más importantes, ya que además de modificarse las propiedades funcionales del aceite, genera la formación
de compuestos volátiles que imparten olores y sabores indeseables, lo que limita su vida útil. Además, los
productos formados en este proceso han sido asociados con desórdenes fisiológicos tales como el
envejecimiento y enfermedades como la arterosclerosis y carcinogénesis (Ortega Nieblas et al. 2001).
Las semillas oleaginosas producen de forma natural sustancias con propiedades antioxidantes, dentro de las
que se destacan los tocoferoles. Existen en la naturaleza cuatro formas diferentes de tocoferoles ( α-, β-, - y
δ-tocoferol) los que difieren entre sí por el número y posición de grupos metilo (Me) en el anillo cromano. Se
han encontrado diferencias entre los cuatro tipos de tocoferoles en relación con su actividad antioxidante in
vitro e in vivo. Así, α-tocoferol se caracteriza por poseer la máxima eficacia como antioxidante in vivo o
vitamina E, pero su actividad in vitro es baja en comparación con la de otros tocoferoles mientras que la
mayor actividad antioxidante in vitro corresponde a γ- tocoferol (Velasco Varo et al. 2010).
En el mercado hay disponible diversos antioxidantes de origen sintético o natural que pueden mejorar la
estabilidad oxidativa de los alimentos grasos retrasando el proceso de oxidación. Así, el extracto de romero
(ER) contiene un gran número de compuestos tales como el ácido carnósico, carnosol y ácido rosmarínico,
los cuales representan una importante fuente de antioxidantes naturales utilizados comercialmente en
alimentos (Ixtaina et al. 2011). El palmitato de ascorbilo (AP) es un derivado sintético, soluble en aceite. Los
mecanismos por los que estos antioxidantes están implicados en el control del proceso de autooxidación son
diferentes. El ER actúa como atrapante de radicales libres, mientras que el AP actúa como secuestrador de
oxígeno (Shahidi 1997).
Teniendo en cuenta estos antecedentes, el presente estudio se realizó a fin de lograr un producto con un
adecuado balance de ácidos grasos -6/-3 y estabilidad oxidativa a través de mezclas con distinta
proporción de aceite de girasol y chía, con adición de antioxidantes (ER, AP y AP:ER (1:1)).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la influencia de la temperatura, el tiempo de almacenamiento y la
efectividad de los antioxidantes sobre los aceites mezcla girasol-chía mediante la determinación de la
evolución de los compuestos primarios y secundarios de oxidación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
En el presente estudio se utilizaron aceites de semilla de chía (Nutracéutica Sturla S.R.L., Argentina) y de
girasol (Molinos Río de la Plata, Argentina). El extracto de romero (GuardianTM 201) y el palmitato de
ascorbilo (GrindoxTM 562) fueron suministrados por Danisco. El extracto de romero utilizado (oleosoluble)
está compuesto por 4% (p/p) de diterpenos fenólicos y un vehículo constituido por mono- y diacilgliceroles;
ésteres de ácido acético de mono y diacilgliceroles y propilenglicol. Grindox TM 562 es un antioxidante
soluble en grasas y aceites constituido por una mezcla de 10% de palmitato de ascorbilo y 90% de un
“carrier” compuesto por propilen glicol y monoleato de sorbitán como agente emulsificante.
Preparación de la muestras
Se prepararon mezclas de aceite girasol-chía (90:10, 80:20 p/p) agitando adecuadamente para homogeneizar
los aceites. Luego se adicionaron el extracto de romero (ER), palmitato de ascorbilo (AP) y su mezcla
(AP:ER 1:1) en las siguientes concentraciones: 5000, 2000 y 2000:2000 ppm, respectivamente. Todas las
muestras fueron almacenadas en frascos de vidrio color ámbar de 30 mL de capacidad, para evitar la
incidencia directa de la luz, en atmósfera de nitrógeno a 4±1 y 20±2ºC durante un periodo de 12 meses,
realizándose periódicamente las respectivas tomas de muestra por duplicado para su posterior análisis.
Composición acídica
El perfil de ácidos grasos fue determinado mediante cromatografía gaseosa (CG) utilizando un cromátografo
Hewlett Packard modelo 6890 con detector de ionización de llama (FID detector) de acuerdo a los métodos
IUPAC 2.301 y 2.302 (IUPAC 1992). Los ésteres metílicos de los ácidos grasos fueron obtenidos por
60
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
derivatización de los triglicéridos por metanólisis alcalina y posterior esterificación de los ácidos grasos
libres en medio ácido.
Contenido de tocoferoles
El contenido de tocoferoles fue determinado mediante una técnica cromatográfica basada en las normas
AOCS Ce 8-89 (AOCS 1998). Las muestras de aceite fueron disueltas en hexano para su posterior
cuantificación por HPLC con detector de fluorescencia (λ excitación: 290 nm, λ emisión: 330 nm).
Se utilizó un cromatógrafo HPLC Hewlett Packard Serie 1050, columna fase normal Lichrosob Si-60 (25 x
0,4 cm; 5 μm de tamaño de partícula); fase móvil: n-hexano:isopropanol (99,5:05 v/v); velocidad de flujo de
1,5 ml/min; 20 μl de volumen de inyección.
Indice de Peróxido (PV)
Los productos primarios de oxidación (hidroperóxidos) contenidos en el aceite fueron determinados
mediante el índice de PV de acuerdo a las normas AOCS Cd 8-53 (AOCS 1998) y expresados como
miliequivalentes de peróxidos por kilogramo de aceite.
Valor de p-anisidina (p-AV)
La formación de los productos secundarios de la oxidación, principalmente 2- alquenal, fueron determinados
por p-AV, basada en la reacción de color entre el reactivo anisidina y los compuestos secundarios de la
oxidación según el método AOCS Cd 18-90 (AOCS 1998).
Valor total de oxidación (Totox)
Este valor brinda información sobre la historia pasada de un aceite (a través del valor de p-AV) con su
estado presente (mediante el PV). Así, la determinación del valor Totox ha sido llevada a cabo para estimar
el deterioro oxidativo de diversos alimentos grasos (Rossell 1983). El Totox se define según la siguiente
ecuación: Totox = 2PV + p −AV
(1)
Todos los análisis se realizaron por duplicado.
Análisis estadístico
Las determinaciones fueron realizadas por triplicado. Se aplicó el análisis de la varianza (ANOVA) y test de
Tukey (p ≤ 0,05) para la comparación de medias. Se utilizó el programa informático Statgraphics Plus 4.0.
Manugistics Inc., USA (1999).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Figura 1 muestra el perfil de ácidos grasos de los diferentes aceites ensayados. El aceite de girasol
presenta un perfil constituido principalmente por los ácidos linoleico (C 18:2) y oleico (C 18:1), mientras que
el aceite de chía tiene un elevado contenido de ácido α-linolénico (C 18:3, ω-3), el cual representa el 65% de
los ácidos grasos totales. Las mezclas girasol-chía 80:20 y 90:10 contienen alrededor del 17,0 y 8,5% de
C18:3 respectivamente, correspondiéndose con relaciones ω-6/ω-3 de 5,3:1 y 2,7:1. respectivamente.
En la Tabla 1, se observa el perfil de tocoferoles correspondientes a los aceites vegetales estudiados. El
aceite de girasol posee mayoritariamente α-tocoferol (99,2%) por tanto, se trata de un aceite con alto poder
vitamínico pero muy susceptible al enranciamiento oxidativo. El aceite de chía presenta un alto contenido de
-tocoferol representando 98,3% de los tocoferoles totales. Los aceites mezcla girasol-chía 80:20,
presentaron un contenido del 14 a 16% de -tocoferol y más del 81% de α-tocoferol respecto a los
tocoferoles totales, mientras que los aceites mezcla 90:10 presentaron < 6% de -tocoferol y > 94% de αtocoferol.
61
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Composición de Ácidos Grasos (%)
16:0
70
18:0
18:1 n9
18:2 n6
18:3 n3
60
50
40
30
20
10
90:10
AP:ER
90:10
ER
90:10 AP
90:10
Control
80:20
AP:ER
80:20
ER
80:20 AP
80:20
Control
Chía
Girasol
0
Figura 1. Composición de ácidos grasos de los diferentes aceites: girasol, chía y sus mezclas (90:10 y 80:20)
con el agregado de antioxidantes (ER, AP y AP:ER)
Tabla 1. Contenido de tocoferoles de los aceites mezclas
Muestra
[α] μg/g
[β] μg/g
[]μg/g
[] μg/g Totales μg/g
d
ab
Girasol
498,44
4,03
nd
nd
502,47d
c
b
Chía
nd
nd
403,81
7,11
410,92a
80:20 Control 376,28a
5,87bc
71,85b
nd
454,00bc
80:20 AP
399,44ab
7,33c
78,05b
3,11a
487,93cd
a
bc
b
a
80:20 ER
376,42
6,27
62,25
2,22
447,16abc
80:20 AP:ER
375,52a
5,33bc
65,32b
nd
446,16ab
bc
a
a
90:10 control
422,38
1,62
9,55
nd
433,55ab
90:10 AP
432,43c
4,67bc
21,85a
nd
458,96bc
90:10 ER
436,77c
6,79bc
27,34a
nd
470,89bcd
c
ab
a
90:10 AP:ER
434,77
3,88
19,18
nd
457,83bc
Valores promedio (n=2). Letras distintas en cada columna indican diferencias significativas (p ≤ 0,05) entre
las muestras. nd: no detectado
En las Figuras 2 a 4 se muestran los valores correspondientes a la evolución de los parámetros estudiados en
relación al seguimiento de la oxidación durante el periodo de almacenamiento, en los diferentes sistemas
estudiados.
Los aceites mezcla girasol-chía con adición de diferentes antioxidantes, almacenados a 4±1ºC, presentaron
valores promedio de PV ≤ 10,0 meq O2/kg aceite, nivel establecido por el Código Alimentario Argentino
como el límite máximo apto para el consumo humano. A dicha temperatura las mezclas girasol-chía con
AP:ER evidenciaron los menores PV, los cuales resultaron significativamente menores (p ≤ 0,05) a lo largo
del almacenamiento. Resultados similares se obtuvieron con el agregado de AP los cuales no mostraron
diferencias significativas (p > 0,05) con respecto a las muestras con AP:ER hasta los 180 días (mezclas
girasol-chía 90:10) y a partir de los 270 días en las mezclas 80:20. Además, se observó un aumento en la
velocidad de la oxidación primaria de los aceites mezcla control (sin agregado de antioxidantes) a partir de
los 90 días de almacenamiento, registrando diferencias significativas (p ≤ 0,05) con respecto a las mezclas
girasol-chía con la incorporación de antioxidantes (Figura 2a).
Los aceites mezclas girasol-chía control no presentaron una marcada diferencia entre sí en todos los tiempos
ensayados a pesar de su diferente composición en ácidos grasos y contenido de tocoferoles. Este hecho puede
atribuirse al contenido de tocoferoles naturales, principalmente -tocoferol el cual posee un elevado poder
antioxidante in vitro, y así los aceites con mayores proporciones de aceite de chía y -tocoferol presenten un
comportamiento similar a los que contienen un mayor tenor de aceite de girasol (Tabla1).
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Durante el almacenamiento a 20±2ºC, el límite máximo legislado fue alcanzado entre 120 y 240 días de
almacenamiento en el siguiente orden: aceites mezcla control (120 días), con agregado de ER (150 días), AP
(180 días para 90:10, 210 días en girasol-chía 80:20), AP:ER a partir de 240 días en ambos aceites mezcla
(Figura 2b). El PV correspondiente a los aceites mezcla 80:20 y 90:10 con agregado de AP:ER fueron los
que registraron el menor aumento de este parámetro al cabo de 360 días de almacenamiento, resultando ser la
mezcla de antioxidantes más eficiente para retardar la formación de hidroperóxidos a temperatura ambiente.
60
PV (meq O2/Kg aceite)
50
40
Girasol
Chia
90:10 Control
90:10 AP
90:10 ER
90:10 AP:ER
80:20 Control
80:20 AP
80:20 ER
80:20 AP:ER
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
tiempo (meses)
(a)
60
PV (meq O2/kg aceite)
50
40
Girasol
Chia
90:10 Control
90:10 AP
90:10 ER
90:10 AP:ER
80:20 Control
80:20 ER
80:20 AP
80:20 AP:ER
(b)
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
tiempo (meses)
Figura 2. Evolución del índice de peróxido durante el almacenamiento de aceite de chía (a) T=4±1ºC, (b)
T=20±2ºC. Valores promedio de dos lotes independientes (n = 2); las barras verticales indican la desviación
estándar
Con respecto al índice de p-AV, en la etapa inicial del almacenamiento el aceite de girasol presentó el mayor
valor (p-AV: 5,25), mientras que el menor valor estuvo asociado al aceite de chía (p-AV: 0,70), presentando
los aceites mezcla valores intermedios según el porcentaje de cada aceite. Resultados previos (Grompone
1991) han demostrado que el periodo de inducción depende notoriamente del p-AV del aceite de partida.
Los valores de p-AV se mantuvieron en niveles bajos durante el almacenamiento a 4±1ºC (Figura 3a),
mientras que a T=20±2ºC todos los sistemas ensayados presentaron aumentos considerables de este
parámetro. El aceite de chía evidenció la mayor formación de los productos secundarios de oxidación para
ambas temperaturas de almacenamiento, lo cual puede deberse a su elevado contenido de PUFAs. Por otra
parte, los aceites mezcla girasol-chía 90:10 y 80:20 con AP:ER registraron los menores p-AV para ambas
temperaturas estudiadas. Las mezclas girasol-chía control presentaron diferencias significativas (p  0,05)
entre sí, registrando las mezclas 80:20 una menor formación de compuestos secundarios de oxidación.
La evolución del valor Totox brinda una información útil con respecto al progreso de la formación de los
productos primarios y secundarios de la oxidación. Este parámetro mostró una tendencia similar a la
observada para el PV, presentando los aceites mezcla control y el aceite de chía a 4±1ºC los mayores valores
63
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de oxidación total (Figura 4a). Estas diferencias estarían asociadas principalmente a la formación de los
productos primarios de oxidación (hidroperóxidos), determinada a través del PV.
La oxidación total de los aceites mezcla almacenados a 4±1ºC con agregado de antioxidantes presentaron
niveles Totox < 25,0; las mezclas girasol-chía control y el aceite de chía mostraron elevados valores de este
parámetro a dicha temperatura. En contraste, a 20±2ºC todos los aceites estudiados mostraron altos niveles
de oxidación total alcanzando niveles de 63,0 hasta 85,0. Los resultados obtenidos reflejan la influencia de la
temperatura en la conservación de los aceites mezcla girasol-chía.
(a)
9
Girasol
Chia
90:10 Control
90:10 AP
7
90:10 ER
90:10 AP:ER
6
80:20 Control
80:20 AP
80:20 ER
80:20 AP:ER
p -anisidina
8
5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
tiempo (meses)
(b)
9
p -anisidina
8
Girasol
Chia
90:10 Control
90:10 AP
7
90:10 ER
90:10 AP:ER
6
80:20 Control
80:20 AP
80:20 ER
80:20 AP:ER
5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
tiempo (meses)
Figura 3. Evolución del valor de p-anisidina durante el almacenamiento de aceite de chía (a) T=4±1ºC, (b)
T=20±2ºC. Valores promedio de dos lotes independientes (n = 2); las barras verticales indican la desviación
estándar.
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(a)
100
80
Girasol
Chia
90:10 Control
90:10 AP
90:10 ER
90:10 AP:ER
80:20 Control
80:20 AP
80:20 ER
80:20 AP:ER
Totox
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
tiempo (meses)
(b)
100
80
Girasol
Chia
90:10 Control
90:10 AP
90:10 ER
90:10 AP:ER
80:20 Control
80:20 AP
80:20 ER
80:20 AP:ER
Totox
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
tiempo (meses)
Figura 4. Evolución del valor Totox durante el almacenamiento de aceite de chía (a) T=4±1ºC, (b)
T=20±2ºC. Valores promedio de dos lotes independientes (n = 2); las barras verticales indican la desviación
estándar
CONCLUSIONES
La composición de ácidos grasos correspondiente a los aceites mezcla girasol-chía, indica que puede lograrse
una óptima relación de ácidos grasos ω-6/ω-3 incorporando al aceite de girasol una proporción baja de aceite
de chía (10 y 20%). El ensayo de almacenamiento evidenció la importancia de la temperatura de
almacenamiento en la evolución del proceso oxidativo. Así, los PV de los aceites mezclas almacenados a
4±1ºC con o sin la adición de antioxidantes registraron menores valores de PV que el límite legal de 10 meq
O2/kg de aceite. En contraste, todas las muestras almacenadas a 20±2ºC alcanzaron el límite máximo legal
entre los 120 y 240 días. El tiempo de almacenamiento y la adición de antioxidantes también influyeron en la
estabilidad oxidativa, resultando la mezcla de antioxidantes AP:ER la más eficiente para la conservación de
los aceites mezcla estudiados.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
BIBLIOGRAFÍA
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termoestabilidad. Patente Española número 2: 325 516.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a Danisco por la provisión de los antioxidantes y a la profesora Carmen M. Mateo por
la cuantificación de tocoferoles.
El presente trabajo fue financiado con el apoyo de la Agencia Nacional de Promoción Científica y
Tecnológica (ANPCyT, PICT 1085), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIP 1735
CONICET) y la Universidad Nacional de La Plata (11/X502 UNLP).
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Películas de almidón de maíz obtenidas por termocompresión: influencia del agregado de
nanopartículas de talco sobre su estructura y propiedades
López O.1,2, Castillo L.2, López C.3, Zaritzky N.1,Villar M.2, Barbosa S.2, García M.A.1
1: Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA), Facultad de Ciencias
Exactas, UNLP, CONICET. La Plata, Argentina.
2: Planta Piloto de Ingeniería Química (PLAPIQUI), Departamento de Ingeniería Química, UNS, CONICET.
Bahía Blanca, Argentina.
3: Departamento de Ingeniería Química, UNS, CONICET. Bahía Blanca, Argentina.
magarcia@quimica.unlp.edu.ar
Palabras clave: almidón termoplástico, nanopartículas de talco, termocompresión, estructura y propiedades.
Resumen: Se evaluó el efecto de talco sobre la estructura y las propiedades de películas de almidón de maíz
termoplástico (TPS). Mezclas de almidón, glicerol, agua y nanopartículas de talco (0, 1, 3 y 5 % p/p) se
procesaron en fundido y se obtuvieron películas por termocompresión. Mediante Microscopía Electrónica de
Barrido se observó una buena distribución, dispersión y adhesión del relleno. El talco afectó levemente la
estructura cristalina de la matriz debido a la inducción de cristales más pequeños y defectuosos. El grado de
cristalinidad del TPS no varió con la adición de talco y no se evidenciaron nuevas fases cristalinas. Mediante
Calorimetría Diferencial de Barrido se determinó que las temperaturas de inicio y de fusión de la fase
cristalina del TPS disminuyeron con el talco. Todas las películas presentaron capacidad de absorción de
radiación UV y su opacidad aumentó con el contenido de talco. El relleno modificó la luminosidad y el color
de las películas. Los nanocompuestos TPS-talco presentaron mayor módulo elástico debido a la rigidez de
las partículas mientras que su elongación a la ruptura no varió significativamente. Las películas con
nanopartículas presentaron menores valores de permeabilidad al vapor de agua debido a la disposición de la
carga.
Keywords: thermoplastic starch, talc nanoparticles, thermocompression, structure and properties.
Abstract: Talc influence on thermoplastic starch (TPS) films structure and properties was evaluated.
Mixtures of corn starch, glycerol, water and talc nanoparticles (0, 1, 3 and 5% w/w) were melt-processed and
films were obtained by thermocompression. By Scanning Electron Microscopy it was observed a good
distribution, dispersion and adhesion of the filler to the matrix. Talc affected slightly TPS crystalline
structure due to the induction of smaller and more imperfect crystals. Crystallinity degree of TPS matrix was
not affected by talc addition and there was no evidence of new crystalline phases. From Differential
Scanning Calorimetry assays it was determined that onset and melting temperatures of TPS crystalline phase
decreased with talc addition. All films showed UV radiation absorption capacity and their opacity values
increased with talc content. The filler incorporation modified films luminosity and their color. The
nanocomposites TPS-talc presented higher elastic modulus values compared with TPS films due to the
particles rigidity, while their elongation at break did not change significantly. Films with talc showed lower
values of water vapor permeability due to the filler disposition within TPS matrix.
INTRODUCCIÓN
La mayoría de los materiales empleados para el envasado de alimentos no son biodegradables, ocasionando
un serio problema ambiental. Actualmente, el interés en el desarrollo de biomateriales para este fin permitiría
extender la vida útil y mejorar la calidad de los alimentos, reduciendo el impacto ambiental. Se ha reportado
el uso de almidones de diferentes fuentes como materia prima para el desarrollo de películas y
recubrimientos biodegradables, demostrando así la potencialidad de este carbohidrato en este campo de
aplicación (López et al. 2010, Müller et al. 2009). Cuando el almidón nativo es procesado a altas
temperaturas y elevados esfuerzos de corte, su estructura granular se destruye, convirtiéndose así en almidón
termoplástico (TPS). Este material presenta la ventaja de que puede ser procesado empleando la tecnología
desarrollada para polímeros sintéticos tales como extrusión y soplado, moldeo por termocompresión o por
inyección. Debido a la naturaleza hidrofílica del almidón, los materiales a base de TPS presentan ciertas
limitaciones relacionadas con el desempeño mecánico y la permeabilidad al vapor de agua. Con el propósito
67
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
de mejorar las propiedades mecánicas y de barrera de estas películas se está estudiando la incorporación de
diferentes rellenos naturales o minerales (Müller et al. 2009, Wilhem et al. 2003). Por otra parte, el empleo
de materiales de relleno modifica también las propiedades ópticas de las películas así como la morfología de
las mismas, condicionando las aplicaciones finales.
El objetivo de este trabajo consistió en evaluar el efecto de la adición de nanopartículas de talco sobre la
morfología, las propiedades térmicas, ópticas, de barrera al vapor de agua y mecánicas de películas de
almidón de maíz termoplástico.
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos utilizados
Se utilizó almidón de maíz (Arcor, Argentina) y glicerol (Anedra). Las nanopartículas de talco fueron
provistas por la empresa Dolomita SAIC (Argentina).
Preparación de las mezclas
Se procesaron mezclas de almidón de maíz, glicerol (30 %), agua (45 %) y nanopartículas de talco (0; 1,7;
5,2 y 15,7 %). La composición se expresó en porcentaje de almidón, lo que implica que se usó 1, 3 y 5 % p/p
de talco respecto de la mezcla TPS. Los compuestos se procesaron en fundido en una mezcladora batch
(Brabender Plastograph) durante 15 min, a 140 ºC y 50 rpm. Las mezclas procesadas se trituraron y
acondicionaron a 25 ºC y una humedad relativa (HR) del 60 %.
Obtención de las películas
Las películas se obtuvieron por moldeo por compresión en una prensa hidráulica, empleando una relación de
moldeo de 3 gmuestra/cm3. Las mezclas se prensaron a 140 ºC y 150 Kg/cm2 durante 6 min. Las películas se
enfriaron bajo presión y luego se retiraron de los moldes. Posteriormente, fueron acondicionadas a 25 ºC y
60 % HR.
Caracterización de las películas
La distribución y dispersión de las nanopartículas de talco en la matriz de TPS se estudiaron mediante
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM), evaluándose además la homogeneidad y apariencia de las
películas desarrolladas. Por otra parte, se realizó un análisis elemental cuali y cuantitativo. Se empleó un
microscopio electrónico JEOL JSM-35 CF, con detector de electrones secundarios y acoplado al sistema de
microanálisis EDAX 2000. Las películas fueron criofracturadas por inmersión en nitrógeno líquido. Las
muestras se montaron en tacos de bronce y se recubrieron con una capa de oro (300 Å), utilizando un
metalizador por plasma de Argón (sputter coater PELCO 91000). De esta manera, fue posible la
visualización tanto de las superficies como de las secciones transversales de las películas.
La identificación de la estructura cristalina y el grado de cristalinidad de las mezclas de TPS-talco fueron
estudiadas por Difracción de Rayos X (XRD). Los difractogramas de las películas acondicionadas se
obtuvieron usando un difractómetro Philips PW1710, provisto de un tubo y ánodo de cobre, operando a 45
KV, 30 mA y 2θ variando desde 3 hasta 60°. El grado de cristalinidad (GC) se calculó como la relación entre
las áreas de los picos de absorción del TPS (sin considerar los correspondientes al talco) y el área total del
difractograma, expresado como porcentaje (%). A partir de los valores obtenidos del espaciado entre las
láminas de talco (calculado según la ecuación de Bragg), se estimó el grado de exfoliación de las mismas en
la matriz de TPS (Mbey et al. 2012).
Las propiedades térmicas de las películas se determinaron usando Calorimetría Diferencial de Barrido
(DSC). Se empleó un calorímetro Perkin Elmer Pyris I. Aproximadamente 10 mg de película previamente
acondicionada, fueron pesados en cápsulas herméticas para evitar la pérdida de agua. Una cápsula vacía se
usó como referencia. Las muestras fueron calentadas desde 20 a 250 ºC a una velocidad de 10 ºC/min, bajo
atmósfera de nitrógeno. A partir de los termogramas obtenidos, se determinaron los siguientes parámetros
térmicos: temperatura de inicio (To), temperatura de fusión (Tf) y entalpía de fusión (Hf).
Las propiedades de barrera a la luz UV y la opacidad de las películas desarrolladas se determinaron por
Espectroscopía UV-vis. Para ello se obtuvieron los espectros de absorción entre 200 y 700 nm en un
espectrofotómetro SHIMADZU UV-160A. La opacidad de las películas se calculó a partir del área de
integración bajo la curva registrada entre 400 y 700 nm y se expresó en unidades de absorbancia por
nanómetros (AU x nm). El efecto bloqueante de las nanopartículas se calculó mediante la ecuación propuesta
por Sanchez-García et al. (2010):
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Efecto bloqueante = (Tcontrol-Tcompuesto)/mf
donde Tcontrol y Tcompuesto corresponden al porcentaje de transmitancia de las películas de TPS y TPS con talco,
respectivamente y mf es el porcentaje de talco con respecto a la masa de almidón en la formulación. El efecto
bloqueante se calculó para tres longitudes de onda: 300 nm, 350 nm y 750 nm en las zonas UV-B, UV-A y
visible respectivamente (Mbey 2012).
Las medidas de color de las películas se realizaron en un colorímetro Hunterlab UltraScan XE. Se registraron
las coordenadas L, a y b de la escala Hunter. En este sistema, el parámetro a representa la variación rojoverde, b la variación amarillo-azul, mientras que L (luminosidad) varía entre 0, para el negro mate y 100 para
el blanco.
El desempeño mecánico se estudió a partir de ensayos de tracción realizados en una máquina universal
Instron 3369 a 25 ºC. De cada muestra se ensayaron al menos 10 probetas rectangulares de 13 x 100 mm. Las
películas se acondicionaron previamente hasta alcanzar el equilibrio. Se registraron las curvas tensióndeformación y a partir de las mismas se calculó el módulo elástico (E), el esfuerzo de tensión máximo () y
la elongación a la ruptura (ε).
La permeabilidad al vapor de agua (WVP) de las películas se midió usando el método del disecante según la
norma ASTM E96 (1995). Las determinaciones se realizaron a 25 ºC empleando un gradiente de humedad
relativa del 75 %. Las medidas se realizaron al menos por duplicado y el valor reportado corresponde al
promedio de las mismas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las micrografías SEM de las superficies de fractura de las películas de TPS se presentan en la Figura 1. En el
caso de la formulación de TPS sin talco, la apariencia homogénea en toda la sección transversal indicó la
efectividad del proceso de termocompresión debido a la ausencia de gránulos de almidón (Figura 1A). Las
películas obtenidas resultaron transparentes, siendo esta propiedad útil para el desarrollo de envases para
alimentos donde se requiera que el producto sea visible. La pérdida de glicerol durante el procesamiento de
las mezclas resultó despreciable, ya que la temperatura se mantuvo por debajo del punto de ebullición del
plastificante. Además, en todas las formulaciones no se observó migración de glicerol luego del mezclado.
A
B
C
D
Figura 1. Micrografías SEM (540x) de películas de TPS con A) 0, B) 1, C) 3 y D) 5 % p/p de talco.
Por otra parte, las películas obtenidas a partir de las formulaciones de TPS con talco resultaron homogéneas
con una buena distribución y dispersión de las partículas en la matriz (Figuras 1B, 1C y 1D). Una dispersión
uniforme de nanopartículas favorece el desarrollo de un gran área superficial matriz-relleno, lo que modifica
la movilidad de las cadenas poliméricas, el comportamiento de relajación y consecuentemente las
propiedades térmicas y mecánicas del material (Azeredo 2009). No se observaron agregados de partículas en
las micrografías SEM, evidenciando a esta escala, una dispersión uniforme del relleno en la matriz. Una
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adecuada adhesión en la interfase talco-TPS muestra una buena compatibilidad entre las partículas y la
matriz, a pesar de utilizar nanopartículas sin modificar superficialmente. Se observó una orientación
preferencial del relleno en la matriz para todas las concentraciones, atribuyéndose a la morfología laminar de
las partículas que favorece la alineación de las mismas durante la termocompresión. Por otra parte, la
incorporación de talco modificó la superficie de fractura de las películas, incrementando la irregularidad con
el aumento de la concentración de partículas (Figuras 1B, 1C y 1D). Este resultado es esperable debido a que
la adición de talco al TPS incrementa la cantidad de fase rígida en estos materiales.
La Figura 2 muestra los espectros EDS del TPS, talco, como así también de los nanocompuestos con 1% p/p
de relleno. Para el espectro del TPS (Figura 2A), se detectó la presencia de picos de C y O. En la muestra de
talco, se observaron los elementos Si, Mg y O (Figura 2B). Para el nanocompuesto, se evidenció la presencia
de las partículas de talco debido a que se identificaron los elementos constituyentes del relleno, como así
también los correspondientes a la matriz de TPS (Figura 2C). El perfil de Si en el nanocompuesto se
determinó por un espectro EDS de línea. Puede observarse que la concentración de este elemento aumentó al
detectar una partícula de talco en la matriz de TPS (Figura 2C).
Figura 2. Espectros EDS de A) TPS, B) talco y C) TPS con 1 % p/p de talco junto con el espectro de línea
de Si.
A partir de los espectros XRD pudo obtenerse información cualitativa acerca de la orientación y la forma de
los cristales. La Figura 3 muestra los difractogramas del talco puro, de las películas de TPS y de los
nanocompuestos. El talco exhibe una estructura cristalina, con reflexiones (00l) bien definidas, tal como se
muestra en la Figura 3. El espectro de TPS presenta picos anchos y de baja intensidad y una gran zona de
contribución amorfa. Estas características corresponden a un polímero semicristalino con una baja
cristalinidad (Figura 3). Los principales picos que contribuyen a la cristalinidad del TPS se detectan a 12.8 y
19.6º (Shi et al., 2007) reportaron que los picos agudos en 13.5 y 20.9º para el almidón termoplástico
corresponden a la estructura tipo V. Esta estructura cristalina está formada por la cristalización de amilosa en
hélices simples involucrando al glicerol o lípidos. Puede dividirse en dos subtipos: V a (anhidra) con picos en
13.2° y 20.6° y Vh (hidratada) con picos en 12.6 y 19.4° (Corradini et al. 2007). Yang et al. (2006)
encontraron que la cristalinidad Vh se debe a que la fuerte interacción entre los grupos hidroxilos de las
moléculas de almidón es sustituida por uniones puente hidrógeno formadas entre el plastificante y el almidón
durante el procesamiento. Además, la ausencia de los picos correspondientes a la estructura cristalina tipo A
(característica de los almidones provenientes de cereales) es una clara evidencia de que los gránulos de
almidón nativo fueron destruidos durante el procesamiento (Bader y Göritz 1994, López et al. 2010).
En los difractogramas de las películas de TPS-talco, pueden detectarse los picos correspondientes al talco y
al TPS (Figura 3). La estructura cristalina de las películas de los compuestos es similar a la de la matriz. Sin
embargo, una pequeña disminución en la intensidad y ensanchamiento de los picos correspondientes a los de
TPS se observaron en los difractogramas de los compuestos. Este cambio fue más notorio a bajos ángulos,
especialmente en los picos localizados en 12 y 19º, y para la formulación con 5% p/p de talco. Ungar (2004)
reportó que el ensanchamiento de los picos de XRD está relacionado con la presencia de cristales
imperfectos. De acuerdo a la teoría de dispersión cinemática, el ensanchamiento de los picos se debe a
cristales muy pequeños o a la presencia de una gran cantidad de defectos en los mismos. A pesar de los
cambios observados en el espectro del TPS, la adición de las nanopartículas no modificó el grado de
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cristalinidad de la matriz (Figura 3). Como era esperable, la intensidad de los picos de talco se incrementó
con el aumento de la concentración de partículas.
Figura 3. Espectros XRD de talco y de películas de TPS con 0, 1, 3 y 5 % p/p de talco (T).
Para las películas compuestas, la posición 2θ de los picos (00l) de talco es similar a la del espectro del talco
(Tabla 1). Como consecuencia, no se registraron cambios en el espaciado de las láminas de talco, aún para
las películas con menor contenido (1 % p/p). La modificación superficial del talco podría ser una alternativa
para favorecer la exfoliación de las láminas. Otra alternativa para permitir la intercalación y la exfoliación de
las partículas en los compuestos TPS-talco sería modificar la forma de preparación de las mezclas (Pandey y
Singh 2004).
En los difractogramas de los compuestos TPS-talco, se detectaron picos agudos de talco (00l), evidenciando
la alineación de las nanopartículas debido al proceso de termocompresión, previamente observado por SEM
(Figura 1). Esto conduce al desarrollo de una estructura ordenada dentro del compuesto. Chen y Evans
(2005), estudiando películas de TPS con diferentes arcillas, informaron resultados similares. Por otra parte,
McGlashan y Halley (2003) trabajando con películas de compuestos de almidón reportaron que los picos
(00l) de la arcilla aparecen más agudos con el incremento de la cantidad de glicerol incorporada.
Tabla 1. Espaciado basal (d) de las láminas de talco (T) en las películas de TPS.
Formulación
TPS + 1 % T
TPS + 3 % T
TPS + 5 % T
2 θ (˚)
9,49
18,96
19,73
28,60
48,60
9,48
18,97
19,87
28,58
48,58
9,47
18,94
19,77
28,57
48,56
71
d (Å)
9,32
4,68
4,50
3,12
1,87
9,33
4,68
4,49
3,12
1,87
9,34
4,69
4,49
3,12
1,87
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El análisis de las propiedades térmicas por DSC es importante ya que permite determinar el rango de
temperatura de procesamiento de los compuestos TPS-talco. Todas las películas obtenidas presentaron una
única transición endotérmica, correspondiente a la fusión de la fase cristalina de la matriz. Los parámetros
térmicos del TPS y de los nanocompuestos se muestran en la Tabla 2. Los valores de T o de las películas TPStalco conteniendo 3 y 5 % p/p resultaron menores que los del TPS. Respecto de la temperatura de fusión, se
observó un desplazamiento a menores valores con la incorporación de talco. Estos resultados están de
acuerdo con los obtenidos mediante XRD y pueden atribuirse a la presencia de cristales de TPS más
pequeños e irregulares en los materiales nanocompuestos. Los valores de la entalpía de fusión presentaron
una gran dispersión (Tabla 2), probablemente asociada a la presencia de dos nano-dominios (fase rica en
glicerol y fase rica en almidón). A pesar de la dispersión, no se observaron diferencias significativas entre los
valores de la entalpía. Esto concuerda con que el grado de cristalinidad de la matriz de TPS no varía con la
incorporación de talco, determinada previamente por XRD (Figura 3).
Tabla 2. Propiedades térmicas de películas TPS con talco (T).
Formulación
TPS + 0 % T
TPS + 1 % T
TPS + 3 % T
TPS + 5 % T
To (ºC)
133,1±1,3a
129,3±3,6a,b
128,7±2,6b
127,8±3,1b
Tf (ºC)
156,4±2,1a
148,2±3,2b
146,0±2,9b
144,3±0,8b
Hf (J/g TPS)
140,7±32,2a
138,0±20,2a
131,2±9,2a
115,8±17,3a
Los valores reportados corresponden al promedio ± desviación estándar. Los valores dentro de
una misma columna seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes entre sí (p<0,05).
La evaluación de las propiedades ópticas de las películas es relevante ya que las mismas restringen la
aplicación de estos materiales, principalmente en el desarrollo de envases. La Figura 4 muestra las
fotografías de las películas obtenidas a partir de las formulaciones estudiadas. No se observaron diferencias
significativas (p>0,05) entre los espesores de las muestras, variando entre 196 y 214 μm. El moldeo por
termocompresión permitió obtener películas con espesor controlado, siendo este parámetro muy importante
en el estudio de la estructura de las mismas y en el análisis de su relación con las propiedades de estos
materiales.
A
B
D
C
Figura 4. Fotografías de películas de TPS con: A) 0, B) 1, C) 3 y D) 5 % p/p de talco.
Los parámetros de color de las películas se presentan en la Tabla 3. Las nanopartículas de talco modificaron
la luminosidad (L), como así también, los parámetros de cromaticidad (a y b) de las películas de TPS. La
adición de talco en una concentración superior a 3 % p/p disminuyó significativamente (p<0,05) la
luminosidad de las películas. Además, los materiales con nanopartículas presentaron menores valores
(p<0,05) del parámetro a (rojo-verde), mientras que el b (amarillo-azul) resultó significativamente mayor,
comparados con los correspondientes a las películas de TPS. Los valores de diferencia de color (ΔE),
parámetro que muestra los efectos combinados de L, a y b, también se incluyen en la Tabla 3. La adición de
3 % p/p de nanopartículas de talco a la matriz de TPS modificó significativamente (p<0,05) los valores de
ΔE de las películas desarrolladas.
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Tabla 3. Parámetros de color y opacidad de películas de TPS con talco (T).
Formulación
TPS + 0 % T
TPS + 1 % T
TPS + 3 % T
TPS + 5 % T
L
(luminosidad)
85,4±0,2a
85,0±0,4a,b
84,5±0,4b
83,1±0,5c
Parámetros de color
a
b
(rojo-verde)
(amarillo-azul)
8,00±0,02a
1,6±0,1a
b
7,88±0,06
2,1±0,3b
b
7,88±0,05
2,4±0,3b
b
7,83±0,05
4,3±0,4c
E
Opacidad
(AU x nm)
85,8±0,2a
85,4±0,5a,b
84,9±0,5b
83,6±0,6c
31,8±6,4a
54,5±6,7b
71,6±2,1c
109,0±9,3d
Los valores reportados corresponden al promedio ± desviación estándar. Los valores dentro de una misma columna
seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes entre sí (p<0,05).
La Figura 5A corresponde a los espectros UV-vis de las películas de TPS con todas las concentraciones de
talco ensayadas. Las películas capaces de absorber en la zona UV podrían ser útiles para desarrollar envases
y extender la vida útil de alimentos susceptibles a la rancidez oxidativa catalizada por radiación UV. En
cambio, las películas que no absorben en esta región espectral, podrían utilizarse para envasar alimentos que
luego serán sanitizados por exposición a luz UV y disminuir así la carga microbiana. Los espectros que se
muestran en la Figura 5A presentan un pico de absorción localizado entre 270 y 300 nm, indicando que las
nanopartículas de talco no afectaron la capacidad de absorción de radiación UV de las películas de TPS.
Además, este estudio permitió analizar la dispersión de la carga en la matriz y obtener información adicional
sobre el efecto bloqueante del talco a la radiación UV y visible. El efecto bloqueante en función de la
concentración de talco se muestra en la Figura 5B. Un incremento en la concentración de talco de 1 a 3 %
p/p permitió una reducción significativa de la transmisión de la radiación UV, como así también, de la luz
visible. La adición de talco redujo la transmitancia, de acuerdo con el incremento del desarrollo de color
observado. Una tendencia similar fue informada por Mbey et al. (2012) para películas a base de almidón de
mandioca y kaolinita.
A
B
Figura 5. A) Espectro de absorción (200-700 nm) de películas de TPS con 0, 1, 3 y 5 % p/p de talco (T),
B) Efecto bloqueante.
La Tabla 3 muestra los valores de opacidad de los nanocompuestos calculados a partir de la región visible de
los espectros de absorción (Figura 5A). La opacidad de las películas aumentó significativamente (p<0,05)
con el incremento de la concentración de talco en las formulaciones. A pesar de este aumento, los valores
registrados para las películas de TPS-talco resultaron ser bajos debido a que las láminas de talco presentan
espesores nanométricos. Así, cuando estas nanopartículas se dispersan en la matriz polimérica, los
nanocompuestos resultan ópticamente transparentes a la luz visible (Sinha Ray y Okamoto 2003).
La influencia de la incorporación de talco sobre el módulo elástico (E) de las películas de TPS se presenta en
la Figura 6. La incorporación de hasta 3 % p/p de nanopartículas no afectó la rigidez del material ya que los
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valores de E no presentaron diferencias significativas entre sí (p>0,05). Cuando se adicionaron 5 % p/p de
talco a las formulaciones, las películas desarrolladas mostraron un incremento en el valor de E debido
principalmente a la rigidez del material de relleno. Con respecto a la elongación a la ruptura, se observó que
ninguna de las concentraciones de talco empleadas modificó significativamente dicha propiedad,
registrándose valores promedios de 67 % aproximadamente.
Figura 6. Módulo elástico de películas de TPS con 0, 1, 3 y 5 % p/p de talco (T).
La Figura 7 muestra la permeabilidad al vapor de agua de las películas desarrolladas en función del
contenido de talco. La adición de 1% p/p de nanopartículas no influyó notoriamente, debido a que los valores
obtenidos se encuentran dentro del error experimental. Sin embargo, a medida que aumentó la concentración
de talco en el compuesto, la permeabilidad de las películas disminuyó significativamente (p<0,05). Cuando
se adicionó tan sólo 3 % p/p de talco, la permeabilidad disminuyó un 30% respecto del valor para las
películas de TPS. Esta tendencia puede explicarse a través de la existencia de caminos difusivos más largos
para las moléculas que atraviesan las películas a medida que aumenta la concentración de las nanopartículas.
La causa de la reducción de WVP se debe al camino tortuoso que forman las partículas al alinearse dentro de
la matriz durante el proceso de termocompresión. Además, la buena dispersión de las partículas favoreció la
baja desviación de los valores obtenidos. Esto condice con lo reportado por otros autores (Slavutsky et al.
2012).
Figura 7. Permeabilidad al vapor de agua de películas de TPS con 0, 1, 3 y 5 % p/p de talco (T).
CONCLUSIÓN
La incorporación de nanopartículas de talco a formulaciones a base de almidón de maíz termoplástico (TPS)
permitió desarrollar películas homogéneas, con buena distribución, dispersión y adhesión de la carga en la
matriz. Además, se observó una orientación preferencial de las partículas dentro de la matriz debido a la
morfología laminar del talco y al proceso de termocompresión. La presencia de talco indujo la formación de
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cristales más pequeños e imperfectos afectando así la estructura cristalina de la matriz como así también las
temperaturas de inicio y fusión de la fase cristalina del TPS. Las nanopartículas de talco modificaron la
luminosidad y el color. La opacidad de las películas aumentó con la adición de talco, mientras que la
capacidad de absorción de radiación UV de estos materiales no se vio afectada. Los valores del módulo
elástico aumentaron significativamente con la incorporación de 5 % p/p de talco manteniendo la misma
elongación a la ruptura que las películas sin el relleno. La disposición de las partículas en la matriz permitió
disminuir la permeabilidad al vapor de agua de las películas de TPS. Los resultados obtenidos permiten
inferir que las películas desarrolladas tienen un futuro muy promisorio en el envasado de alimentos.
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Cinética de liberación de antioxidantes de yerba mate encapsulados en matrices de almidón-alginato
de calcio
López Córdoba A.F., Deladino L, Martino M
Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de los Alimentos (CIDCA), CONICET, Fac. Cs.
Exactas (UNLP), La Plata, Argentina
alexlcordoba@gmail.com
Resumen: La yerba mate (Ilex paraguariensis), constituye una fuente de antioxidantes naturales con vista a
la sustitución de compuestos sintético y a su utilización como ingredientes funcionales. Se encapsuló un
extracto acuoso de yerba mate en matrices de alginato de calcio con y sin agregado de almidón de maíz como
relleno. Las cápsulas fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), calorimetría
diferencial de barrido (DSC) y porosimetría de intrusión de mercurio. Se estudió la cinética y el mecanismo
de liberación de los polifenoles en Fluido Gástrico Simulado (FGS), HCl pH=2. La incorporación de almidón
mejoró la eficiencia de encapsulación, disminuyó la porosidad y favoreció la conservación de la morfología
de las cápsulas posterior al secado. Mediante DSC se observaron cambios en las propiedades del sistema
matriz-relleno y se obtuvieron temperaturas de transición vítrea (Tg) características de sistemas estables a
temperatura ambiente. El relleno de almidón moduló la velocidad de liberación en FGS, debido a la
habilidad de los gránulos de ocupar los espacios intersticiales de la matriz. El perfil de liberación de los
encapsulados se ajustó satisfactoriamente al modelo de Peppas y Sahlin (R2 = 0,96), indicando un
mecanismo de liberación gobernado por el acoplamiento entre fenómenos de difusión e hinchamiento.
Palabras clave: Ilex paraguariensis, antioxidantes naturales, encapsulación, liberación.
Abstract: Yerba mate (Ilex paraguariensis) is a source of natural antioxidants, promising as functional
ingredient and as substitute of synthetic additives. Aqueous extracts of yerba mate were encapsulated in a
calcium alginate matrix, with and without addition of corn starch as filler. The beads were characterized by
Scanning Electronic Microscopy (SEM), Differential Scanning Calorimetry (DSC) and mercury intrusion
porosimetry. The kinetic and release mechanism of polyphenols in Simulated Gastric Fluid (SGF), HCl
pH=2, were studied. The incorporation of starch as filler improved encapsulation efficiency, decreased
porosity and maintained the morphology of beads after drying process. Differences in the relationship
between matrix and filler were observed by DSC analysis. Glass transition temperatures (Tg) of both systems
were higher than room temperature, what could be associated with a high stability. The starch addition
modulated the release rate in SGF, this effect was attributed to the ability of starch granules to fill the
interstitials voids in the matrix. The release profile of both type of capsules exhibited a good fitting to Peppas
and Sahlin model (R2 =0.96), showing a release mechanism governed by both swelling and diffusion.
Keywords: Ilex paraguariensis, natural antioxidants, encapsulation, release.
INTRODUCCIÓN
La encapsulación ha sido definida como la tecnología mediante la cual se logra confinar compuestos activos
dentro de una matriz polimérica. Esta técnica crea un microambiente en la cápsula capaz de controlar las
interacciones entre el interior y el exterior (Borgogna et al. 2010). De acuerdo a Champagne y Fustier (2007)
algunos de los propósitos de aplicar una técnica de encapsulación en la industria de alimentos son: proteger
el compuesto activo de la degradación producida por el ambiente, liberación controlada bajo condiciones
específicas, modificar las características físicas del material original y hacer más fácil su manipuleo,
enmascarar sabores desagradables y separar componentes con el fin de que éstos no reaccionen entre sí. El
desarrollo de sistemas de vehiculización y liberación controlada de compuestos activos es una de las
estrategias de uso frecuente en la formulación de alimentos con propiedades funcionales. La liberación
controlada se define como el mecanismo mediante el cual uno o más compuestos pueden dirigirse a un sitio
específico, en un tiempo y velocidad modulada. Los mecanismos más importantes que regulan la velocidad
de liberación de un compuesto activo son: difusión, hinchamiento, biodegradación/ erosión y presión
osmótica (Mastromatteo et al. 2010; Pothakamury y Barbosa-Cánovas 1995). La relevancia de cada uno de
ellos dependerá en gran medida de la composición de la matriz polimérica y del medio circundante, por lo
76
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
que el agente activo puede ser liberado al medio por uno o por varios mecanismos actuando simultáneamente
(Barba et al. 2009).
La yerba mate es una planta nativa de la región subtropical de América del Sur, consumida y producida
principalmente en Argentina, el sur de Brasil, Uruguay y Paraguay. En estos países se ingiere como bebida
en proporciones de más de un litro por día por millones de personas, como mate, mate cocido o tereré. Esta
planta contiene una gran variedad de compuestos bioactivos capaces de actuar frente a reacciones de estrés
oxidativo, implicadas en el desarrollo de diversas enfermedades (Bracesco et al. 2011). Actualmente el uso
de antioxidantes naturales es de gran interés para el desarrollo de alimentos con propiedades especiales. Sin
embargo, debido a la inestabilidad química y física de estos compuestos su aplicación directa en alimentos es
limitada. A través de diferentes técnicas de encapsulación se ha logrado conservar antioxidantes de origen
natural como ingrediente funcional activo (Deladino et al. 2008; Fang y Bhandari 2010). Los objetivos de
este trabajo fueron encapsular un extracto acuoso de yerba mate en matrices de alginato de calcio y almidónalginato de calcio, estudiar el efecto del agregado de almidón sobre las características morfológicas y
analizar el mecanismo y la cinética liberación de los polifenoles en FGS.
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de las cápsulas
Para la obtención de las cápsulas de alginato de calcio se preparó un extracto acuoso de yerba mate al 3 %
p/v y se mezcló con alginato de sodio al 2% p/v (Sigma–Aldrich, EE.UU). Las cápsulas con relleno se
prepararon adicionando a la solución anterior almidón de maíz comercial (Maizena®) al 2% p/v. Ambos
sistemas se obtuvieron mediante gelificación iónica por goteo en una solución de CaCl 2 al 0,05 M usando
una bomba peristáltica Minipuls 3 (Gilson®, Francia). Los geles permanecieron en la solución de CaCl2 15
min, se filtraron y fueron lavados con solución buffer acético/acetato pH 5.5 para eliminar el exceso de iones
calcio (Deladino et al. 2008) y se secaron a 65 °C/ 3 h. Las cápsulas de alginato sin relleno se las denominó
SS y a las adicionadas de almidón al 2 %, SC.
La eficiencia de la encapsulación de los antioxidantes de yerba mate se determinó mediante la destrucción de
una cantidad conocida de cápsulas con citrato de sodio 5% p/v y la posterior determinación de polifenoles
totales mediante el método de Folin-Ciocalteau (Schlesier et al. 2002).
Caracterización de las cápsulas
El análisis morfológico de los encapsulados se realizó mediante microscopía SEM en un equipo FEI-Quanta
200 (Holanda). Las muestras se metalizaron con una capa de oro y se examinaron empleando un voltaje de
aceleración de 20 kV.
El estudio de las propiedades térmicas se realizó empleando un calorímetro diferencial de barrido (DSC
Q100, TA Instruments, E.E.U.U), a una velocidad de 10 °C/min, desde 25 ° hasta 300 °C. Las muestras (3-5
mg) se colocaron en cápsulas de aluminio y se cerraron herméticamente. Como referencia se empleó una
cápsula vacía.
La distribución de tamaño de poro en los sistemas encapsulados se analizó mediante porosimetría de
intrusión de mercurio (PIM) en un equipo Pascal 440 Thermo Fisher. La presión máxima de Hg aplicada a
las muestras fue de 400 MPa. El tratamiento de los datos experimentales fue realizado mediante la ecuación
de Wasburn (1921).
Cinética de liberación de polifenoles en FGS
Se estudió la liberación de los polifenoles de yerba mate empleando como fluido gástrico simulado HCl 0.1
M, pH 2. Una cantidad conocida de cápsulas se introdujo en un volumen de medio y permanecieron en un
agitador orbital (Lab-Line Instruments, EE.UU) a 37º C y 125 rpm durante 4h. Se tomaron alícuotas del
sobrenadante a diferentes tiempos. Se cuantificó la fracción de polifenoles liberada a cada tiempo t respecto
de la masa inicial de polifenoles encapsulada. La masa inicial de polifenoles se determinó desintegrando la
misma cantidad de cápsulas empleadas en el ensayo de liberación en una solución de citrato de sodio (5%
p/v). El contenido de polifenoles en todos los casos fue medido mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu.
Por otro lado, para el estudio de la cinética de cambio de masa de las cápsulas durante la inmersión en FGS
se llevó a cabo un ensayo equivalente al descripto anteriormente. Se prepararon varios tubos con igual masa
de cápsulas y volumen de medio. A diferentes tiempos se seleccionó un tubo al azar, las cápsulas se filtraron,
se secaron con papel Whatman Nº 1 y se pesaron. El porcentaje de cambio de masa (%
) fue calculado
mediante la siguiente ecuación:
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 W  W0 
 * 100
W (%)   t
 W0 
(1)
Donde Wt representa la masa (g) de las cápsulas en el tiempo t y W0 la masa (g) de cápsulas introducidas
inicialmente. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.
Análisis estadístico
El análisis estadístico fue realizado en el software Sigma Plot versión 11.0. Se realizaron análisis de
varianza, con un nivel de significancia del 95%.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se obtuvieron cápsulas de alginato de calcio conteniendo extracto de yerba mate con una eficiencia de carga
del 55%. La incorporación de almidón al 2% p/v mejoró significativamente la capacidad de carga alcanzando
valores de eficiencia del 65 %.
Las micrografías SEM obtenidas para las cápsulas de alginato con y sin agregado de almidón se muestran en
la Figura 1.
b
a
c
Figura 1: Micrografías SEM para cápsulas de alginato sin (a) y con (b-c) relleno de almidón
Se observó que ambos tipos de cápsulas perdieron cierta esfericidad luego del secado. Dicho efecto fue más
notorio en el cápsulas sin relleno, las cuales resultaron más aplanadas e irregulares (Figura 1a). Las cápsulas
con almidón al 2 % (Figura 1b-c), mantuvieron cierto grado de esfericidad, observándose la disposición de
los gránulos tanto en el exterior como en el interior de la matriz.
En el análisis de DSC el extracto de yerba mate mostró una única transición endotérmica cercana a los 85 °C.
El pico obtenido fue ancho posiblemente debido al efecto sinérgico de los compuestos presentes en el
extracto que tienen transiciones en este rango de temperatura. El alginato de sodio mostró un pico
exotérmico de descomposición a los 225 °C. Picos similares fueron obtenidos por Anbinder et al. (2011) y
Sarmento et al. (2006) a temperaturas de 240, y 247 °C respectivamente.
En los termogramas de los encapsulados, el pico característico del alginato de sodio no fue observado debido
a la formación de la estructura de “caja de huevo” con los iones calcio. Las cápsulas de alginato de calcio sin
y con extracto, mostraron endotermas anchas con temperaturas de pico de 194 y 198 °C, respectivamente.
Con la inclusión de almidón al sistema, las endotermas se desplazaron hacia temperaturas mayores a valores
de 209 y 201 °C para cápsulas sin y con extracto, respectivamente. Este desplazamiento podría atribuirse a
cambios en la matriz de alginato de calcio con la adición de almidón.
Se obtuvieron valores de temperatura de transición vítrea de alrededor de 55°C, para ambos tipos de
cápsulas, lo que indica de una buena estabilidad de los materiales a temperatura ambiente.
En la Figura 2 se observa la distribución de tamaño de poro para las cápsulas de alginato con y sin agregado
de rellleno.
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60
80
SC
70
50
60
40
50
30
40
dV /dlogD
Volumen de poro acumulado (mm3/g)
SS
30
20
20
10
10
0
1
10
100
1000
0
100000
10000
Tamaño de poro (nm)
Figura 2. Distribución de tamaños de poro para las cápsulas de alginato sin (SS) y con (SC) agregado de
almidón de relleno. Eje principal: Volumen acumulado de poros (Gráfico de líneas), Eje secundario: dV/d
Log D (Gráfico de barras).
Se obtuvo un tamaño de poro promedio de 100 nm para ambos sistemas. Las cápsulas de alginato de calcio
resultaron más porosas que las que contenían almidón al 2%. El agregado de relleno modificó el perfil de
distribución de poros generando una disminución del volumen acumulado de poros, principalmente entre los
5-50 nm. Este comportamiento fue atribuido a la distribución de almidón en el interior de la matriz como se
pudo observar en las fotografías SEM (Figura 1), el cual dificultaría el ingreso de mercurio en el ensayo
debido a que aumenta la tortuosidad del sistema.
La cinética de liberación de polifenoles en FGS para las cápsulas con y sin agregado de relleno se muestra en
la Figura 3.
100
90
% de Liberación de PT
80
70
60
50
40
30
SS
SC
20
10
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
tiempo (min)
Figura 3. Cinética de liberación de polifenoles en FGS para cápsulas secas SS y SC.
79
240
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
La velocidad de liberación inicial de los encapsulados en FGS fue rápida, liberándose más del 50% de
polifenoles totales (PT) en un tiempo de 5 y 25 min para las cápsulas sin y con almidón, respectivamente
(Figura 3). A tiempos mayores, la cantidad de PT liberada continuó en ascenso pero a menor velocidad,
siendo este efecto más notorio en las cápsulas con almidón, el cual moduló sustancialmente la cinética. Los
perfiles de liberación de ambas formulaciones secas resultaron significativamente diferentes (p<0.05), siendo
la velocidad de liberación de PT más lenta en el sistema con almidón adicionado al 2%.
El efecto modulador debido a la incorporación de almidón, puede explicarse teniendo en cuenta el estudio de
las características microestructurales discutidas anteriormente. En este sistema, el almidón actúa como
material de relleno reforzando la estructura y ocupando parcialmente los espacios internos de la matriz;
disminuyendo así la porosidad del sistema. Los gránulos de almidón dispersos en la matriz actúan como
barrera al flujo de solvente conduciendo sus moléculas a través de un camino tortuoso, que hace más lenta la
liberación de compuesto activo (Figura 3). El mismo efecto ha sido observado por otros autores con el
agregado de rellenos inertes como bentonita, silicatos, celulosa, entre otros (Gal y Nussinovitch 2007;
Puttipipatkhachorn et al. 2005; Rassis et al. 2002; Sultana et al. 2000).
Los perfiles de liberación de polifenoles en FGS de los sistemas encapsulados, se analizaron mediante el
ajuste del modelo de Peppas y Sahlin, (1989) (2):
mt
 k d  t m  k r  t 2m
m
(2)
Donde mt, corresponde a la masa de polifenoles liberada al tiempo t y m∞ la masa polifenoles inicialmente
encapsulada, esta última fue determinada introduciendo la misma cantidad de cápsulas utilizada en el ensayo
de liberación, en una solución de citrato de sodio (5% p/v) hasta disolución completa, en el agitador orbital a
37 º C y 125 rpm. La constante kd, representa la contribución difusional, mientras que el segundo término, kr,
representa la contribución de la relajación del caso II, del modelo de Korsmeyer y Peppas.
Los parámetros del modelo fueron calculados mediante el software DDSolver (Zhang et al. 2010). El nivel
de ajuste de los datos a cada ecuación, se evaluó tomando como referencia los valores R2 corregido y la
distribución de los residuos entre los valores medidos y los estimados en cada caso.
El modelo de Peppas y Sahlin ajustó satisfactoriamente la cinética de liberación de ambos tipos de cápsulas.
Se obtuvo una buena distribución de residuos y un valor de R2 corregido óptimo (Tabla 1). Este modelo
tiene en cuenta como mecanismos de liberación predominantes un acoplamiento de la difusión y la relajación
macromolecular (Peppas y Sahlin, 1989).
Tabla 1. Parámetros cinéticos obtenidos para cápsulas secas
Sistema
R2
corregido
Parámetros cinéticos
Distribución de
residuos
Modelo difusión-relajación (Peppas y Sahlin)
kd
kr
m
SS
45,74
0,60
0,18
0,98
Buena
SC
23,16
4,91
0,18
0,96
Buena
Si bien, para ambos sistemas se observa una contribución del mecanismo de relajación a la liberación, este
resultó insignificante en relación al aporte difusivo (kd >> kr) (Tabla 1). Así mismo, el valor de kd resultó
mayor para el sistema simple, indicando una velocidad de liberación mayor como se mencionó
anteriormente.
(Wang et al. 2010). Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 4.
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250
% Cambio de masa
200
150
100
SS
SC
50
0
5
20
35
50
65
80
95 110 125 140 155 170 185 200 215 230 245
tiempo (min)
Figura 4. Cinética de hinchamiento en FGS de cápsulas secas SS y SC.
En el caso de los encapsulados obtenidos, el mecanismo predominante durante la inmersión en FGS, fue el
hinchamiento (Figura 4). Ambos sistemas SS y SC, aumentaron su masa alrededor de un 150% con respecto
al valor inicial en un tiempo de inmersión en FGS de 240 min. El mayor hinchamiento se alcanzó en los
primeros tiempos de ensayo (0-10 min). Estos resultados correlacionan con lo observado en el perfil de
liberación de los sistemas (Figura 3), siendo el porcentaje liberado de PT mayor al 30% en este mismo
intervalo de tiempo.
De acuerdo a los resultados obtenidos, los encapsulados desarrollados en este trabajo, necesitan de una
hidratación previa para que el compuesto activo comience a difundir hacia el medio. Las cápsulas secas
poseen una matriz en estado vítreo (Tg= 55°C), condición en la cual existe muy baja movilidad de las
moléculas. Por lo tanto, es necesario la plastificación y/o relajación de las cadenas poliméricas para que el
compuesto activo pueda difundir dentro de la matriz (Brazel y Peppas 2000; Peppas y Khare 1993).
CONCLUSIONES
El agregado de almidón a la matriz de alginato de calcio mejoró la eficiencia de carga de polifenoles de la
yerba mate. La inmersión de las cápsulas en FGS no modificó el contenido de polifenoles encapsulado. En
ambos sistemas, la totalidad de compuestos fenólicos fue liberada en FGS tras un tiempo de inmersión de
240 min. La incorporación de almidón permitió obtener matrices menos porosas con respecto a las de
alginato de calcio. Como consecuencia, el perfil de liberación de los polifenoles de yerba mate se modificó
disminuyendo la velocidad, involucrando mecanismos de difusión e hinchamiento.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
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AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Nacional de la Yerba Mate por el financiamiento otorgado en el marco de los subsidios PRASY.
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Efecto de variables de almacenamiento del aceite sobre los tocoferoles de germen de trigo
Magariño M., Mateo C.M., Nolasco S.M.
TECSE, Facultad de Ingeniería, UNCPBA, Olavarría, Argentina.
mmagarinio@fio.unicen.edu.ar
Resumen: El aceite de germen de trigo es fuente de ácidos grasos poliinsaturados, por lo cual es propenso a
la oxidación, lo que puede ocasionar transformaciones en su calidad. Además tiene un alto contenido en
tocoferoles (> 2188 mg/kg), los cuales actúan en la inhibición de los procesos de oxidación de lípidos. El
objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de la temperatura y el tiempo de almacenamiento del
aceite de germen de trigo sobre la concentración de sus tocoferoles. Se trabajó con dos clases de germen:
estabilizado mediante secado (E) y sin estabilizar (SE). El aceite se extrajo (Soxhlet) y se almacenó a
diferentes temperaturas (-20°C, 5°C, 25°C y 47°C) durante 3 meses. La cuantificación de tocoferoles se
realizó por HPLC. La temperatura y duración del almacenamiento afectó la concentración de tocoferoles. A
temperaturas de 47°C y 25°C disminuyó significativamente la concentración de tocoferoles totales a lo largo
del almacenamiento siguiendo una cinética de primer orden, incrementando la velocidad de degradación con
el aumento de la temperatura. Las temperaturas de 5°C y -20°C afectaron de forma similar la concentración
de tocoferoles totales y cada uno de los isómeros presentes, favoreciendo además la preservación de los
ácidos grasos esenciales.
Palabras claves: aceite, almacenamiento, calidad, germen de trigo, tocoferoles.
Abstract: The wheat germ oil is a source of polyunsaturated fatty acids, being prone to oxidation, which
may cause changes in quality. It also has high tocopherol content (>2188 mg/kg), which act in the inhibition
of lipid oxidation. This work shows the effect of temperature and storage time of wheat germ oil on the
concentration of tocopherols. The oil was obtained from two kinds of germ: stabilized by drying (E) and
unstabilized (SE). The oil was extracted (Soxhlet) and stored at -20°C, 5°C, 25°C and 47°C for 3 months.
The quantification of tocopherols was performed by HPLC. The storage temperature and time affected the
concentration of tocopherols. At 47°C and 25°C, the concentration of total tocopherols, decreased
significantly along storage following first order kinetics. The rate of degradation increases with rising
temperature. Temperatures of 5°C and -20°C affected the concentration of total tocopherols similarly and the
isomers present, besides favoring the preservation of essential fatty acids.
Key words: oil, storage, tocopherols, quality, wheat germ.
INTRODUCCIÓN
El germen de trigo es un subproducto de la molienda industrial de trigo. Es una fuente de nutrientes
altamente concentrados y una de las más ricas en tocoferoles. Tiene un alto valor nutritivo, por tanto es muy
bueno para fortificar productos alimenticios (Hemery et al. 2007).
El aceite de germen de trigo posee altos efectos beneficiosos para la salud como la reducción de los niveles
de colesterol del hígado y del plasma, aumento de la resistencia física y posiblemente disminución de los
efectos del envejecimiento, lo que se debe a la alta concentración de nutrientes que posee; es rico en vitamina
E, fitoesteroles, policosanoles, tiamina, riboflavina y niacina (Eisenmenger y Dunford 2008).
El aceite de germen de trigo tiene el más alto contenido en tocoferoles de todos los aceites vegetales, por
encima de 2188 mg/kg que consisten en α-tocoferol (53,9%), β-tocoferol (18,2%), γ-tocoferol (22,5%) y δtocoferol (5,4%) (Gunstone et al. 1994). Entre los fitoesteroles presentes en este producto, predominan el
sitosterol y el campesterol (Eisenmerger y Dunford 2008). Además, este aceite es valorado debido a los
ácidos grasos que contiene, de los cuales se destacan el ácido linoleico (55%), palmítico (16%), oleico (14%)
y linolénico (7%) (Ramadan et al. 2008).
El rol principal de la vitamina E (tocoferoles y tocotrienoles) es la inhibición de los procesos de oxidación de
lípidos en alimentos y sistemas biológicos. Esta vitamina está implicada en la transformación del ácido
araquidónico en prostaglandinas y reduce la velocidad de agregación plaquetaria (Belitz y Grosch 1997); se
ha reportado como beneficiosa en el retardo de una variedad de enfermedades degenerativas tales como:
enfermedades cardiovasculares, cáncer, desórdenes neurológicos, enfermedades inflamatorias, cataratas y
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degeneración muscular relacionada con la edad, siendo muy importante en el mantenimiento del sistema
inmunológico (Nolasco 2001).
El deterioro de la calidad de los lípidos debido al proceso oxidativo es de gran importancia económica y
nutricional para la industria alimentaria, debido a la pérdida de ácidos grasos esenciales y vitaminas
liposolubles. Además la peroxidación de los lípidos produce radicales libres, los cuales están asociados a
problemas de salud como la carcinogénesis. Aunque los antioxidantes no pueden evitar la autoxidación de
los lípidos ni revertir la formación de peróxidos, pueden retrasar el proceso por eliminación de los ácidos
grasos radicales (Goffman y Möllers 2000). Por tal motivo, se considera de interés conocer los efectos que
distintas condiciones de almacenamiento del aceite de germen pueden tener sobre la concentración de
tocoferoles.
Player et al. (2006) estudiaron la descomposición de α-, γ- y δ-tocoferol en aceite de soja durante 24 días de
almacenamiento a 50°C. El α-tocoferol fue completamente destruido al día 16. Por otra parte, Chung (2007)
al estudiar la cinética de degradación oxidativa de los tocoferoles como función del tiempo y la temperatura,
disolviendo -α-, γ- y δ-tocoferol en glicerol y calentándolos a 100-250°C por 5-60 minutos, determinó que la
reacción seguía una cinética de primer orden.
El objetivo principal del presente trabajo fue estudiar el efecto de la temperatura y del tiempo de
almacenamiento del aceite de germen de trigo sobre la concentración de sus tocoferoles, analizando además
la influencia sobre la composición acídica y la cinética de degradación de tocoferoles. Asimismo se evaluó el
efecto del tratamiento de estabilización del germen sobre dichos parámetros.
MATERIALES Y MÉTODOS
Caracterización de muestras
El germen de trigo empleado fue suministrado por la empresa Molino Cañuelas SACIFI (Provincia de
Buenos Aires, Argentina). Se trabajó con dos clases de germen: uno, sometido a tratamiento de
estabilización por calor (E) y otro sin estabilizar (SE). Los mismos se almacenaron en recipientes de plástico
a 5°C hasta el momento de su uso.
Para la caracterización de las muestras de germen de trigo se determinó: contenido de humedad (AOCS Ba
2a-38 1998), rendimiento de aceite en un equipo Soxhlet (IUPAC 1.122 1992), contenido de proteínas
(AOCS Ba 4a-38 1998), fibra cruda (AOCS Ba 6-84 1998) y cenizas (AOCS Ba 5a-49 1998).
Para caracterizar al aceite se realizaron las siguientes determinaciones: acidez libre (IUPAC 2.201 1992),
índice de peróxidos (IUPAC 2.501 1992 y AOCS Cd 8-53 1998), composición acídica (Izquierdo 2007) y
contenido de tocoferoles (AOCS Ce 8-89 1998).
Una vez caracterizado el aceite se procedió a su almacenamiento a cuatro temperaturas diferentes (-20°C,
5°C, 25°C y 47°C) durante 3 meses, depositados en viales de plástico de 1,5 mL sobre bandejas cubiertas
para resguardo de la luz. Durante ese tiempo, el aceite fue analizado en cuanto al contenido de tocoferoles y
composición acídica siguiendo las normas estandarizadas antes mencionadas.
Cinética de degradación de tocoferoles
La reacción de degradación de tocoferoles en aceite de germen de trigo, sigue una cinética de primer orden
(Capitani et al. 2011).
Los valores de las constantes de velocidad de reacción (kexp) en los distintos aceites fueron calculados
mediante integración de la ecuación de velocidad para reacciones de primer orden (1):
ln Ct = ln C0 – kexp . t
(1)
donde Ct es la concentración de los tocoferoles a los distintos tiempos de almacenamiento (t), C0 es la
concentración inicial de los mismos. De la pendiente de la recta, graficando ln Ct vs. t, se obtiene el valor de
la constante de velocidad de reacción, kexp, determinada a cada temperatura de trabajo.
Análisis de datos
Para realizar los análisis de varianza (ANOVA) se utilizó el programa Software Infostat 6.0 (2003). En los
casos en que se observaron diferencias significativas entre medias de variables estudiadas (P<0,05), las
mismas se analizaron según la prueba de Tukey. Mientras que, para la realización del análisis de los datos de
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cinética se utilizó el programa Microsoft Excel 2007.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización del germen de trigo y del aceite
Las muestras de germen de trigo sin estabilizar (SE) y estabilizado por tratamiento con calor (E) presentaron
un contenido de aceite y de proteína cercano al rango informado en literatura (27-30%) para este
subproducto de la molienda del grano de trigo (Gunstone et al. 1994, İbanoğlu 2002), como así también el de
fibra cruda (aproximadamente 3%) (Dunford 2005). En la Tabla 1 se muestra la composición centesimal de
ambas muestras.
Tabla 1: Composición centesimal de las muestras de germen de trigo
Componentes
(% base seca)
Humedad
Germen de trigo
Estabilizado por tratamiento
Sin estabilizar (SE)
con calor (E)
14,00 ± 0,01 a
7,65 ± 0,11 b
Aceite
10,3 ± 0,05 a
8,4 ± 0,05 b
Cenizas
4,00 ± 0,37 a
4,32 ± 0,13 a
Fibra cruda
1,19 ± 0,01 b
1,75 ± 0,01 a
32,68 ± 0,11 a
32,25 ± 0,26 a
Proteínas
Para cada componente, letras distintas indican diferencia significativa (p≤0,05)
Las investigaciones reportan un aumento en el rendimiento del proceso de extracción de aceite de algunas
oleaginosas, mediante la utilización de diferentes enzimas o mezclas de ellas. Las más estudiadas son las
celulasas, hemicelulasas, pectinasas y proteasas. Las mismas tienen la capacidad de romper uniones
específicas, según cual se utilice, de los polisacáridos que conforman la pared celular de los tejidos vegetales,
de este modo la estructura se hace más permeable y se facilita la liberación de aceite. Un tratamiento
enzimático daña las paredes celulares mejorando la extracción de aceite. Dado que en el germen de trigo se
encuentran las enzimas proteasas (García Olmedo 1964), éstas podrían ser las causantes del mayor
rendimiento de aceite en el germen SE (Tabla 1), ya que en el mismo las enzimas se encuentran activas y
podrían haber facilitado la extracción.
En la Tabla 2 se pueden observar índices de calidad de los aceites obtenidos de germen de trigo SE y E.
Tabla 2: Índices de calidad iniciales de los aceites de ambas muestras de germen de trigo.
Índices de calidad
Aceite de germen SE
Acidez libre1
8,2 ± 0,15 b
Aceite de germen E
8,9 ± 0,03 a
1,9 ± 0,12 a
1,2 ± 0,19 b
Índice de peróxidos2
Expresada en % de ácido oleico.
2
Expresado en miliequivalentes de O2/kg de aceite. Para cada índice, letras distintas indica
diferencia significativa (p≤0,05).
1
Ambos aceites de germen de trigo presentaron una elevada acidez libre, indicativa de la acción de las lipasas
presentes en el germen. Si bien, es de esperar que el tratamiento de estabilización inactive las lipasas y el
índice de acidez resulte menor en el aceite de germen E, se observó un valor levemente superior respecto al
del aceite del germen SE. Este comportamiento podría ser atribuido a una inactivación incompleta de las
enzimas o a una infestación con moho durante el almacenamiento posterior al proceso de estabilización
(Gardner e Inglett 1971).
Por otra parte, ambos aceites presentaron un bajo valor de índice de peróxidos, inferior al límite superior de
10,0 miliequivalentes de O2/kg aceite establecido por el Códex Alimentarius (2012) para aceites no cubiertos
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por normas estándares. El menor índice de peróxidos observado en el aceite de germen E puede atribuirse a
la destrucción de lipoxigenasas (Zherebtsov et al. 2000).
Contenido de tocoferoles
La concentración inicial de tocoferoles totales fue de 3420 µg/g en el aceite de germen SE y 3545 µg/g en el
aceite de germen E, siendo el componente mayoritario el isómero α-tocoferol (64,2 % y 64,6%,
respectivamente), seguido por el β-tocoferol (33,3% y 32,7%, respectivamente) y pequeñas cantidades de γtocoferol (2,5% y 2,7%, respectivamente).
El análisis estadístico de los datos demostró que el aceite de germen E presentó una concentración
significativamente mayor de tocoferoles totales (p=0,0023), de α-tocoferol (p=0,0033) y β-tocoferol
(p=0,0081). La menor concentración de tocoferoles totales en el aceite de germen SE es concordante con el
mayor índice de peróxidos detectado en el mismo, debido a poseer una menor protección frente al proceso de
oxidación. El significativo menor contenido de tocoferoles en el aceite de germen de trigo SE (p<0,05)
puede justificarse por un efecto de dilución al obtenerse un mayor rendimiento de aceite.
Composición de ácidos grasos
El análisis inicial de la composición acídica del aceite de germen de trigo, indicó la presencia de los ácidos
grasos palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1), linoleico (18:2) y linolénico (18:3); siendo el ácido
graso insaturado linoleico el componente mayoritario (60,8 % y 60,5%, respectivamente). Se detectó
importante presencia del ácido saturado palmítico (18,5% y 18,2%, respectivamente) y el ácido
monoinsaturado oleico (13,8% y 14,0%, respectivamente), siendo escaso el contenido en ácido esteárico (0,5
% para ambas muestras). Es de destacar un contenido apreciable de ácido linolénico (6,4% y 6,8%,
respectivamente) similar a los aceites de canola (11%) (Zárate 2011) y de soja (8%) (Gunstone et al. 1994).
Según el análisis estadístico de los datos, el tratamiento de estabilización no afectó la composición acídica
inicial (p>0,05).
Almacenamiento del aceite
Efecto del almacenamiento del aceite sobre sus tocoferoles
La concentración de tocoferoles totales del aceite disminuyó al transcurrir el tiempo de almacenamiento,
siendo, en general, mayor el decrecimiento con el incremento de la temperatura (Tablas 3 y 4).
Tabla 3: Degradación de tocoferoles totales a las cuatro temperaturas de almacenamiento para aceite de
germen SE. Letras distintas indican diferencias significativas (Test: Tukey, p≤0,05)
Días de almacenamiento
0
9
23
49
82
Medias de la concentración de tocoferoles totales (µg/g)
47°C
25°C
5°C
-20°C
3420 j
3420 j
3420 j
3420 j
2450 e
3190 gh
3311 hij
3389 ij
1691 c
3130 g
3273 hi
3299 hij
415 b
2903 f
3244 gh
3283 hi
53 a
2195 d
3276 hi
3205 gh
Tabla 4. Degradación de tocoferoles totales a las cuatro temperaturas de almacenamiento para aceite de
germen E. Letras distintas indican diferencias significativas (Test: Tukey, p≤ 0,05)
Días de almacenamiento
0
9
23
49
82
Medias de la concentración de tocoferoles totales (µg/g)
47°C
25°C
5°C
-20°C
3545 k
3545 k
3545 k
3545 k
3395 ghi
3345 fgh
3479 jk
3440 ij
2976 d
3336 fg
3396 ghi
3425 hij
1293 b
3206 e
3352 fgh
3306 f
499 a
2739 c
3395 ghi
3329 fg
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Asimismo, dicha degradación de tocoferoles totales fue más rápida a temperaturas altas y en el aceite de
germen SE. En el aceite de germen SE los tocoferoles totales disminuyeron 98%, 36%, 4% y 6% a las
temperaturas de 47°C, 25°C, 5°C y -20°C respectivamente, entre el día cero de almacenamiento y el día 82.
Por su parte, en el aceite de germen E, los porcentajes de disminución del contenido de tocoferoles totales
fueron 86%, 23%, 4% y 6%, para 47°C, 25°C, 5°C y -20°C respectivamente, entre el día cero de
almacenamiento y el día 82.
Para los aceites de ambas muestras de germen (SE y E), las variables tiempo y temperatura influyeron
significativamente (p<0,0001) sobre la concentración de tocoferoles totales. Asimismo se detectó
interacción significativa tiempo x temperatura (p<0,0001). A temperaturas de 47°C y 25°C se detectaron
disminuciones significativas en la concentración de tocoferoles totales en todos los tiempos de análisis.
A 5°C disminuyó significativamente en el día 23 con respecto al contenido inicial, manteniéndose
aproximadamente constante luego hasta el último día, en ambos aceites. A -20°C, en el aceite de germen SE
se observó una disminución significativa a partir del día 49 de análisis, sin embargo, en el aceite de germen
E, con mayor concentración de tocoferoles, el inicio de una disminución significativa y progresiva se detectó
más tempranamente (9 días de almacenamiento).
El efecto de la temperatura fue más pronunciado sobre el aceite de germen SE, disminuyendo
significativamente la concentración de tocoferoles en mayor medida en el almacenamiento a 47°C respecto
a 25°C, y a su vez ambos, en general, en mayor proporción que en el aceite almacenado a 5°C y -20°C. En
el aceite de germen E, con mayor contenido de tocoferoles, las diferencias fueron significativas en general a
mayor tiempo de almacenamiento (≥ 23 días entre 47°C y 25°C y éstos dos con respecto a las menores
temperaturas ensayadas).
Respecto a α-tocoferol (tocol mayoritario), presentó un comportamiento, en general, similar al determinado
para tocoferoles totales (Figuras 1 y 2). Se observaron disminuciones progresivas de la concentración a lo
largo del almacenamiento a 47°C y 25°C, para los aceites de ambas muestras (SE y E). A 5°C y -20°C las
disminuciones significativas de la concentración de α-tocoferol recién se detectaron a ≥23 días de
almacenamiento.
Se detectó un bajo efecto del almacenamiento sobre el β-tocoferol, disminuyendo, en general,
progresivamente la concentración del mismo a lo largo del almacenamiento a 47°C y 25°C para los aceites
de ambas muestras (SE y E) y observándose una escasa o nula reducción a 5°C y -20°C.
En el aceite de germen E, el γ-tocoferol solamente disminuyó significativamente durante el almacenamiento
a 47°C, mientras que en el aceite de germen SE, se detectó disminución significativa de este isómero durante
el almacenamiento a las distintas temperaturas analizadas, con excepción de -20°C
En general, para todos los isómeros se observó que no existen diferencias significativas entre el
almacenamiento a 5°C y a -20°C y que a estas temperaturas es baja la disminución de los tocoferoles hasta
82 días.
Aceite de germen E
Aceite de germen SE
Figura 1: Degradación de α-tocoferol a 47°C
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Aceite de germen E
Aceite de germen SE
Figura 2: Degradación de α-tocoferol a 25°C
Efecto del almacenamiento del aceite sobre su composición acídica
El análisis estadístico de los datos indicó, para los ácidos grasos insaturados (linolénico, linoleico y oleico),
que existe un efecto significativo de la temperatura (p< 0,0001, p< 0,0001 y p<0,0248, respectivamente en
el aceite de germen SE y p<0,0001 para los tres ácidos grasos en el aceite de germen E), así como
interacción tiempo x temperatura significativa (p<0,0001, p<0,0001 y p<0,0336, respectivamente en el aceite
de germen SE y p<0,0001 para los tres ácidos grasos en el aceite de germen E). El efecto del tiempo fue
significativo en ambos aceites sobre los ácidos linolénico y linoleico y sobre el ácido oleico solamente en el
aceite de germen E (p<0,0001). Para los ácidos saturados, en general las diferencias observadas a mayor
tiempo y temperatura (incremento de porcentajes relativos) pueden atribuirse a la disminución de los ácidos
grasos poliinsaturados.
Efecto del almacenamiento del aceite sobre los parámetros cinéticos de degradación de sus tocoferoles
La reacción de degradación de los tocoferoles siguió una cinética de primer orden (Figuras 3 y 4). En las
Tablas 5 y 6 se pueden observar los valores de las constantes de velocidad y coeficientes de correlación
determinados a cada temperatura en el aceite de germen SE y E, respectivamente. Los valores de k exp
calculados a cada temperatura son mayores en el aceite de germen SE, siendo más altos a 47°C y 25°C que a
las otras temperaturas.
Figura 3. Degradación de α-tocoferol a 47°C en aceite de germen SE
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Figura 4. Degradación de α-tocoferol a 47°C en aceite de germen E
Tabla 5: Constantes de velocidad de reacción y coeficientes de correlación para la degradación de
tocoferoles en aceite de germen SE
Tocoferoles
Temperatura (°C)
Tocoferoles totales
47
25
47
25
47
25
47
25
α-tocoferol
β-tocoferol
γ-tocoferol
Constante de
velocidad (1/días )
0,0537
0,005
0,0907
0,0073
0,0463
0,0026
0,0261
0,0016
R
0,995
0,996
0,997
0,993
0,995
0,988
0,993
0,986
Tabla 6: Constantes de velocidad de reacción y coeficientes de correlación para la degradación de
tocoferoles en aceite de germen E
Tocoferoles
Temperatura (°C)
Constante de
velocidad (1/días )
R
Tocoferoles totales
47
25
47
25
0,0257
0,003
0,0466
0,0036
0,996
0,998
0,99
0,996
47
25
47
25
0,0165
0,0016
0,017
0,0035
0,987
0,994
0,996
0,98
α-tocoferol
β-tocoferol
γ-tocoferol
Por otro lado, en ambos aceites, los valores de constantes de velocidad de degradación obtenidos para tocoferol son superiores a los de -tocoferol, y éstos a los de -tocoferol, lo que sugiere que la degradación
térmica de -tocoferol es menor que la de -tocoferol y más lenta aún que la de -tocoferol.
CONCLUSIONES
En el presente trabajo se analizó la influencia de la temperatura y el tiempo de almacenamiento del aceite de
germen de trigo sobre la degradación de los tocoferoles y ácidos grasos como así también el efecto de un
tratamiento de estabilización de germen sobre los índices de calidad y genuinidad de su aceite.
El aceite de germen de trigo estabilizado (E) presentó una mayor concentración de tocoferoles totales (3545
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µg/g) que el aceite de germen sin estabilizar (SE; 3420 µg/g), que puede justificarse por un efecto de
dilución al obtener un mayor rendimiento de aceite en SE. La menor concentración de tocoferoles totales en
el aceite del germen sin estabilizar (SE) es concordante con el mayor índice de peróxidos detectado en el
mismo, debido a poseer una menor protección frente al proceso de oxidación.
El ensayo de almacenamiento indicó que la temperatura y duración del mismo afectó la concentración de
tocoferoles en los dos tipos de aceites. Las temperaturas de almacenamiento que mayor influencia tuvieron
sobre la degradación de los tocoferoles fueron 47°C y 25°C, siendo significativamente mayor su efecto
sobre la concentración de tocoferoles respecto a las temperaturas de 5°C y -20°C. Almacenar el aceite hasta
82 días a 5°C tiene el mismo efecto sobre los tocoferoles que almacenarlo a -20°C y preservan la mayor
cantidad de tocoferoles totales y de cada uno en particular. Los ácidos grasos insaturados (linolénico,
linoleico y oleico) fueron afectados significativamente por la temperatura en ambos aceites, favoreciendo la
preservación de los ácidos grasos esenciales (linoleico y linolénico), el almacenamiento a bajas temperaturas.
La reacción de degradación de los tocoferoles en el aceite de germen de trigo sigue una cinética de primer
orden, incrementando la velocidad de degradación con el aumento de la temperatura. El -tocoferol, con
valores mayores de las constantes de velocidad, fue menos estable que - y -tocoferol,
El estudio sobre los cambios sufridos por el aceite es un aporte a la mejora en las condiciones de
almacenamiento y tratamiento del mismo con el fin de preservar su calidad y valor nutricional. Asimismo,
brinda información a los sectores productivos para la optimización de sus procesos, obteniendo mayores
rendimientos y calidad y menores costos.
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90
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
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AGRADECIMIENTOS
Los autores de este trabajo agradecen a la UNCPBA, a la empresa Molino Cañuelas SACIFI por la donación
de las muestras de germen de trigo y a la Ing. Miriam Cocconi.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Efecto del pH y el almacenamiento sobre los fructooligosacáridos del yacón (Smallantus sonchifolius)
Maldonado S., Nuñez Souza M.
Laboratorio de investigación de Ingeniería para el Desarrollo Agroindustrial Regional – IDEAR, Centro de
Investigación de Tecnología de Alimentos – CITA, Facultad de Ingeniería, UNJu, San Salvador de Jujuy,
Argentina.
smaldonado@fi.unju.edu.ar
Resumen: El yacón, tubérculo originario de la región andina sudamericana, acumula fructooligosacáridos
(FOS) en su raíz. Los objetivos del presente trabajo fueron: estudiar el contenido de FOS en yacón y en un
extracto concentrado y envasado, evaluando la aplicabilidad del método enzimático; estudiar el
comportamiento de los FOS frente a variaciones de pH y al tiempo de almacenamiento. Se trabajó con
tubérculos provenientes de Bárcena, provincia de Jujuy. El contenido de FOS en el yacón fresco fue de 3,83
± 0,03 g /100 g. A los 30 días de almacenamiento el producto envasado sufre una pérdida del 14,8% de su
contenido de FOS. La apertura del envase a cualquier tiempo de almacenamiento provoca una importante
disminución en los FOS del producto. En promedio las muestras pierden un 14,6 ± 0,4% de su contenido de
FOS al cabo de 48 hs de apertura del envase. El contenido de FOS permanece constante entre valores de pH
4,5 y 7. El efecto del almacenamiento sobre los FOS del producto final presentó una disminución en la
cantidad inicial. Esta situación merece ser estudiada en profundad para lo cual podría cambiarse el material
del film del envase, a los fines de evitar o disminuir dicha pérdida.
Palabras claves: yacón; fructooligosacáridos; prebióticos
Abstract: The yacón is a tuber native of the Andean region of South-America, that accumulates
fructooligosaccharides (FOS). The objectives of this work were: to study the FOS content in the tuber and in
a purified packed extract of yacón. We evaluated the applicability of the enzymatic method; we studied the
behavior of FOS when the pH varies and when storage time passes. We worked with tubers from Bárcena Jujuy province. The content of FOS in fresh yacón was 3.83 ± 0.03 g/100g. The packaged product lost 14.8%
of FOS in 30 days of storage. The FOS content decreased significantly by opening the packaging, at any
storage time. The samples lost 14.6 ± 0.4% of FOS after 48 hours of opening. The FOS content remains
constant between pH values of 4.5 and 7.5. The effect of storage over the FOS content of the final product
showed a decrease in the initial amount. This deserves to be studied in depth, e.g. changing the packaging
film material, in order to avoid or reduce the loss.
Keywords: yacón; fructooligosaccharides, prebiotics
INTRODUCCIÓN
El yacón es un tubérculo originario de la región andina sudamericana cuya raíz, a diferencia de la mayoría de
las raíces y tubérculos que almacenan almidón, acumula una gran diversidad de azucares. La planta de yacón
es una hierba perenne capaz de crecer hasta 2 metros de alto, clasificada taxonómicamente dentro de las
asteráceas. Posee un sistema de raíces tuberosas que llegan a alcanzar una longitud de 10 a 25 cm de
diámetro (Grau y Rea 1997). Su nombre científico es Smallanthus sonchifolius y los nombres utilizados en
diferentes partes de Los Andes son llaqon, llacum, llacuma, yacumpi, aricuma, chicama, jiquima y jiquimilla.
El hábitat natural del yacón es la zona de los Andes comprendida entre los 800 y 2800 msnm y regímenes de
temperatura característicos de climas templados y subtropicales. Debido a su gran capacidad adaptativa se
cultiva también en muchas otras partes del mundo como ser Brasil, China, Corea, Estados Unidos, Japón,
Nueva Zelandia, Checoslovaquia y Taiwán (Ohyama et al. 1990, Grau y Rea 1997; Yan et al. 1999,
Seminario et al. 2003).
El yacón contiene principalmente agua e hidratos de carbono. Los hidratos de carbono se acumulan en forma
de fructooligosacáridos y azúcares simples: sacarosa, fructosa y glucosa. Aunque la proporción de cada
azúcar puede variar debido a diferentes factores (el cultivar, la época de siembra y cosecha, temperatura en
poscosecha, entre otros), según Maldonado et al. (2008) en concordancia con Hermann et al. (1999) se puede
considerar la siguiente composición (en base seca): fructooligosacáridos 40 a 70%, sacarosa 5 a 15%,
fructosa 5 a 15% y glucosa menos del 5%. Los fructooligosacáridos, también conocidos como oligofructanos
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o simplemente FOS (Hogarth et al. 2000) pertenecen a una clase particular de azúcares conocidos con el
nombre de fructanos. La estructura fundamental de los fructanos es un esqueleto de unidades de fructosa,
unidas entre sí por enlaces glucosídicos β (2-1) y en raras ocasiones por enlaces β (2-6). La presencia de
enlaces β (2-1) hace que los FOS no sean digeribles en el tracto digestivo, lo que a su vez tiene como
consecuencia que tengan un bajo valor calórico y funcionalidad como fibra dietaria (Niness, 1999). Son
considerados como prebióticos ya que estimulan el crecimiento selectivo de bacterias intestinales promotoras
de la salud, especialmente las bifidobacterias (Pedreschi et al. 2003). Se ha observado también un efecto
favorable en la asimilación del calcio (Andersson et al. 2001).
Sin embargo el yacón, como vegetal fresco, tiene corta vida útil expuesto a condiciones ambientales (30 a 45
días), por lo tanto es necesario aplicar tecnologías para aumentar su vida útil y potenciar sus atributos
naturales, por ejemplo la técnica de barreras o de métodos combinados disminuyendo el pH, la elaboración
de encurtidos mediante el agregado de ácido con la consiguiente disminución del pH, entre otros. Como
consecuencia de esto se hace necesario estudiar la influencia del pH sobre los FOS extraídos del yacón, dada
la importancia de mantenerlos durante el proceso. Los objetivos abordados en este trabajo fueron:
1) el estudio del contenido de FOS en el yacón y en un producto sólido obtenido a partir del extracto
acuoso del tubérculo, evaluando la aplicabilidad del método enzimático.
2) el comportamiento de los FOS frente a diferentes valores de pH, así como su variación con el tiempo de
almacenamiento
MATERIALES Y METODOS
Material botánico
Se utilizaron tubérculos de yacón, adquiridos en la localidad de Bárcena, provincia de Jujuy, Argentina. Se
adquirió directamente de los productores y se trasladó al laboratorio, acondicionado en bolsas de 10 Kg de
capacidad. Se mantuvieron en refrigeración entre 8-10ºC hasta los ensayos, tiempo no mayor a los 7 días. Se
trabajó con dos lotes de 10 kg cada uno, cosechados con una diferencia de 15 días.
Determinación del contenido de sólidos solubles
Se determinó el contenido de sólidos solubles en la muestra fresca usando un refractómetro marca QUARTZ,
serie 2001344. Los resultados se expresaron en º Brix.
Preparación de las muestras
Los individuos de cada lote se pesaron al 0,0001 g en balanza analítica marca DENVER, modelo APX –
200. Se trozaron, escaldaron en vapor saturado el tiempo necesario para alcanzar 75ºC en el centro térmico y
se homogeneizaron en un omnimixer marca OMNI International, incorporando diferentes proporciones de
agua para mejorar la extracción. La suspensión obtenida se filtró para obtener un líquido límpido. Sobre una
porción de este líquido se realizaron las determinaciones del contenido de FOS. Parte del filtrado se utilizó
para evaluar el efecto de los cambios del pH del medio y sólidos solubles.
Métodos de análisis y cuantificación de FOS
La determinación se realizó por método 999.03 de AOAC, el cual consiste en realizar una extracción con
agua caliente y tratarla con enzimas específicas: sacarasa, α-amilasa y maltasa. Estas destruyen todos los
carbohidratos presentes menos los fructanos. Los azúcares reductores resultantes se reducen a alcoholes por
medio de una disolución alcalina cuyo exceso se neutraliza con ácido acético diluido. Los fructanos ya
purificados y libres de otros polisacáridos, se hidrolizan con una mezcla de exo y endo inulasas. Los azúcares
reductores derivados de este tratamiento reaccionan con una solución ácida compuesta por p-hidroxibenzoico
e hidracina generándose un compuesto coloreado que puede medirse espectrofotométricamente (MacCleary
et al, 2000). Se usó para ello un espectrofotómetro marca Spectrum, modelo SP 2100 uv
Evaluación del efecto del pH sobre el contenido de FOS y sobre los sólidos solubles
Se estudió el efecto del pH sobre la variación del contenido de FOS y los sólidos solubles del jugo filtrado,
frente a distintos niveles de alcalinidad y acidez, por el agregado de dos agentes: un álcali (hidróxido de
calcio) y un ácido (ácido cítrico). Se tomaron 10 valores entre 4 y 8. Se midió el pH utilizando un pH metro
digital marca HANNA, Modelo HI 8424.
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Estudio del efecto del Almacenamiento sobre el contenido de FOS
Se utilizó un extracto de FOS, obtenido del yacón y concentrado, a partir del cual se obtuvo un sólido
granulado según Patente de invención N° P-080103806. Se almacenó en films de polipropileno baja
permeabilidad al O2 y al vapor de agua con las siguientes características: espesor (micrones): 102,
transmisión al oxígeno a 23 °C, 0% HR cc/m2/24 hs: 1; transmisión al vapor de agua a 38 °C, 90% HR g/m2/24 hs: 5, rango de Tº de sellado100° – 200 °C, resistencia nominal al sellado: 4 kg/25 mm. Se tomaron
muestras del sólido granulado recién elaborado (t = 0) y a los 15 y 30 días de almacenamiento. Al tiempo
pre-establecido se abrieron los envases y se extrajo una porción para análisis (muestra A). El resto se
mantuvo bajo refrigeración en las mismas condiciones anteriores, pero con el envase abierto, del cual al cabo
de 48 hs se extrajo una nueva porción para análisis (muestra B). Ambas porciones de cada muestra se
analizaron según el método enzimático-espectrofotométrico (método 999.03 de AOAC).
Análisis estadístico
Los resultados del efecto del tiempo de almacenamiento sobre el contenido de FOS del producto final se
evaluaron estadísticamente, usando el software SPSS versión 12, a través de análisis de la varianza y el test
de Duncan, con un nivel de confianza del 95%.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La selección apropiada del protocolo de determinación se realizó teniendo en cuenta la siguiente
composición relativa del yacón (en base seca): FOS 40 a 70%, sacarosa 5 a 15%, fructosa 5 a 15% y glucosa
menos del 5% (Hermann et al. 1999). Se aplicó el método AOAC 999.03: a) suponiendo 12-50 % FOS
(Muestra 1), b) suponiendo 50-100 % FOS (Muestra 2). Se realizaron los ensayos de control
correspondientes (fructanos/celulosa y sacarosa/celulosa). Ambos permitieron verificar y controlar la
efectividad de la técnica; el primero se efectuó sobre el contenido de FOS por cada lote de las muestras
analizadas y el segundo sobre la eficiencia de los reactivos por cada nuevo lote del mismo. Los resultados
obtenidos se muestran en la Tabla 1
Tabla 1: Determinación de FOS. Selección del rango de concentración
Muestra 1
12-50% FOS
∆A
0,361
f
40,971
SDF1
1,322
SDF2
1,320
SDF3
1,312
Abs (M)
1,231
Abs (D)
1,208
Abs (B)
0,859
(g FOS/100 g
18,31 ± 0,82
Muestra)
(g FOS/ 100 g
3,0 ± 0,1
Yacón)
Muestra 2
50-100%
FOS
0,158
40,971
1,322
1,320
1,312
1,048
1,036
0,726
control
fructanos/ce
lulosa
0,555
40,971
1,322
1,320
1,312
0,577
0,591
0,029
control
sacarosa/celulosa
16,1 ± 0,4
28,2 ± 0,5
0,182 ± 0,02
0,022
34,105
1,597
1,540
1,613
0,187
0,190
0,167
2,68 ± 0,07
Se obtuvieron valores de FOS entre 12 – 50%, encontrándose además que para su completa extracción es
necesario agregar 50 ml de agua destilada, lo que favorece además la posterior acción enzimática.
Se verificó la efectividad del ensayo de control de fructanos/celulosa con el valor obtenido de 28,2 ± 0,5% de
fructanos. De acuerdo a los resultados obtenidos este ensayo presentó un error del 2,097% en relación al
valor de referencia. Se verificó la afectividad del ensayo de control sacarosa/celulosa obteniéndose 0,2% de
fructanos. De acuerdo a esto, el estudio presentó un error del 9 % en relación al valor de referencia, a los
fines experimentales se consideró aceptable.
En la Tabla 2 se muestran las principales características del tubérculo y el jugo de yacón
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Tabla 2: Características de la materia prima
Lote de Procesamiento 1
Peso
Peso
yacón
c/cáscara
Brix
s/cáscara (gr)
(gr)
Promedio 229 ± 75
174 ± 58
6,5 ± 0,5
Totales
1148,1
874,6
Lote de Procesamiento 2
Peso
Peso
yacón
c/cáscara
s/cáscara
(gr)
(gr)
Promedio 204 ± 23
163 ± 16
Totales
1020,9
817,7
Jugo Filtrado
Total (gr)
830,3
PH
6,25
BRIX
6,0
Brix
7±1
Jugo Filtrado
Total (gr)
751,3
PH
6,22
BRIX
5,5
El rendimiento del yacón en la obtención de jugo filtrado fue del 72,96± 0,5 p/p.
Se determinó el contenido de FOS en el yacón fresco, pelado y escaldado, verificando la eficacia del método
a través de los controles. El valor promedio obtenido resultó de 3,6 ± 0,3 g de FOS/100 g de yacón. El
ensayo de control fructanos/celulosa arrojó un error de 1,5% y 3,05% para las muestras de raíces del lote 1 y
2 respectivamente.
Los resultados obtenidos a partir de la alcalinización del extracto acuoso de yacón se representan en la Figura
1. Los datos experimentales ajustaron a una ecuación polinómica de grado 4:
Y= – 0,0105x4 + 0,3002x3 – 3,202x2 + 15,145x – 23,695
R2 = 0,984
Figura 1: Efecto del pH sobre el contenido de FOS durante la alcalinización
En la Figura 1 se observa que a pH alcalinos superiores a 8 (ocho) el contenido de FOS disminuye (aunque
levemente), mientras que para valores inferiores a éste, existe un rango importante de pH para el cual
prácticamente el contenido de FOS no varía. Esto se debe a que el agregado de álcali hasta niveles de pH
inferiores a 8 (ocho), logra que precipiten compuestos químicos diferentes a los FOS sin que se produzca
degradación por efecto del tratamiento.
Se encontró que cuando se acidifica el medio el contenido de FOS permanece constante en 3,106 g
FOS/100g, para valores de pH entre 7,5 y 4.
La relación entre el pH y los sólidos solubles del jugo se muestra en la Figura 2, en la misma se observa una
disminución de los sólidos solubles a valores inferiores a pH 4,5 y superiores a pH 7,5, mientras que para
valores intermedios de pH los sólidos solubles se mantienen prácticamente constantes. Los datos
experimentales ajustaron a una ecuación polinómica de grado 4:
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Y= – 0,0114x4 + 0,2761x3 + 2,4926x2 + 9,9681x – 8,1824
R2 = 0,9728
6,80
º Brix . (g SS/100 g Yacon)
6,60
6,40
y = -0,0114x 4 + 0,2761x 3 - 2,4926x 2 + 9,9681x - 8,1824
R2 = 0,9728
PH
6,20
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
Figura 2: Variación del contenido de sólidos solubles (°Brix) con el pH.
Efecto del tiempo de almacenamiento sobre el contenido de FOS del producto final
El estado vítreo de los cristales ricos en FOS se pierde casi instantáneamente por higroscopicidad, una vez
que el producto es expuesto al ambiente, generándose una sustancia de aspecto meloso y muy viscosa. Sin
embargo luego de 15 a 20 días de almacenamiento se observó en distintas muestras de producto envasado y
almacenado que los cristales se degradaban de forma natural y gradualmente. En este sentido se evaluó si
este proceso traía consigo pérdidas o disminución del contenido de FOS durante el almacenamiento. Este
comportamiento se observa en la Figura 3, el que responde a una ecuación lineal.
3,400
g FOS/100 g Yacon
3,300
3,200
3,100
3,000
y = -0,0166x + 3,3753
R2 = 0,9895
2,900
2,800
0
5
10
15
20
25
t(dias) 30
Figura 3: variación del contenido de FOS durante el almacenamiento
De acuerdo a los resultados obtenidos, la pérdida de FOS por almacenamiento (Muestras A) resultó igual a
6,09% a los 15 días y 14,82% a los 30 días. El análisis de la varianza dio un valor p = 0,004. Considerando
un nivel de significación de 0,05 se puede afirmar que hay una diferencia significativa en el contenido de
FOS a medida que transcurre el tiempo de almacenamiento. Esta disminución en el contenido de los FOS
durante el almacenamiento es debida a que las moléculas de azúcares presentes se depolimerizan
convirtiéndose en azúcares simples y/o sustancias que luego no son detectados por el método de análisis.
Estos mecanismos pueden ser del tipo oxidativos, provocando liberación de agua intramolecular del interior
de la matriz cristalina de los azúcares (retrogradación). Las causas pueden ser transferencia de oxígeno del
aire a través del film durante el almacenamiento o absorción de vestigios de humedad del aire, previa
operación de envasado por exposición del producto al ambiente.
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La pérdida en el contenido de FOS por apertura del envase (Muestras B) resultó: 15,03%, 20,85% y 29,00%
a los 2, 17 y 32 días. Las causas probables de éste comportamiento también pueden ser la transferencia de
oxígeno del aire a través del film y/o que el producto absorbiera humedad del ambiente ya que al abrir el
envase se liberó todo el vacío que contenía, permitiendo la entrada de oxigeno del aire.
A través del análisis de la varianza con un valor p=0,006 menor que sig. = 0,05 podemos establecer que hay
pérdidas significativas de FOS por apertura del envase durante el almacenamiento refrigerado, razón por la
cual el producto deberá ser envasado en porciones individuales suficientes como para ser consumido
inmediatamente después de ser abierto el envase.
CONCLUSIONES
El contenido de FOS permanece constante a pH entre 5 y 8. La relación entre los sólidos solubles y el pH
disminuye a valores inferiores a pH 4,5 y superiores a pH 7,5. En ambos casos existe un rango importante de
pH (4,5 -7,5) para el cual el contenido de FOS y los sólidos solubles se mantienen prácticamente constantes.
Al cabo de 30 días de almacenamiento el producto en el envase sufre una pérdida del 14,8% de su contenido
inicial de FOS.
La apertura del envase a cualquier tiempo de almacenamiento provoca una importante disminución en el
contenido de FOS del producto. En promedio las muestras pierden un 14,6 ± 0,4% de su contenido de FOS al
cabo de 48 hs de apertura del envase.
El efecto del almacenamiento sobre los FOS del producto final presentó una disminución en la cantidad
inicial. Esta situación merece ser estudiada en profundad para la cual podría cambiarse el material del film
del envase a los fines de evitar o disminuir dicha pérdida.
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97
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Estabilidad frente a la refrigeración y congelación de leche de soja obtenida por micronización en
ausencia y presencia de calcio
Márquez A.L.1,2, Salvatore G.N.1, Otero R.G.1, Wagner J.R.1,2, Palazolo, G.G.1,2
1: Laboratorio de Investigación en Funcionalidad y Tecnología de Alimentos (LIFTA), Departamento de
Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina
2: CONICET
gpalazolo@unq.edu.ar
Resumen: El objetivo fue estudiar el efecto de la refrigeración y la congelación sobre la estabilidad de leche
de soja preparada mediante micronización a partir de una harina desgrasada, en ausencia y presencia de
calcio. Luego de 1 día de refrigeración, la leche con calcio presentó un menor tamaño de partícula y una
mayor viscosidad aparente que la muestra sin calcio, atribuible a la formación de agregados proteicos en
presencia del catión. Durante 9 días de refrigeración se produjo un aumento en el tamaño de partícula de las
dos leches, sin afectar apreciablemente la homogeneidad de los sistemas. La reología de la leche sin calcio
tampoco se vio afectada y la muestra fortificada con el catión sólo presentó una leve disminución en su
viscosidad, probablemente debido a la formación de agregados más compactos y menos hidratados con
menor interacción entre sí. Por su parte, la congelación durante 1 día produjo tamaños de partícula mucho
mayores que el tratamiento anterior, atribuido a un mayor grado de agregación proteica, y luego de 9 días se
observó una alta desestabilización de ambos sistemas con un aumento importante de tamaño de partícula.
Este último efecto fue más pronunciado en la leche con calcio.
Palabras clave: leche de soja, calcio, micronización, estabilidad.
Abstract: The objective was to study the effect of refrigeration and freezing on the stability of soybean milk
prepared by micronization from defatted flour, in absence and presence of calcium. After refrigeration for 1
day, the soymilk with calcium showed a lower particle size and a higher apparent viscosity than the sample
without calcium, attributed to the formation of protein aggregates in presence of the cation. Refrigeration for
9 days produced an increase in the particle size of both soymilks, without an appreciable effect on the
homogeneity of the systems. The rheology of the soymilk without calcium was neither affected and the
sample fortified with the cation only showed a mild decrease in its viscosity, probably because of the
formation of more compact and less hydrated aggregates with lower interaction between them. On the other
hand, freezing for 1 day produced much higher particle sizes than the previous treatment, attributed to a
higher protein aggregation degree, and high destabilization of both systems with important increase of
particle size was observed after 9 days. This effect was more pronounced in the soymilk with calcium.
Keywords: soybean milk, calcium, micronization, stability.
INTRODUCCIÓN
La leche de soja es una bebida muy nutritiva, libre de colesterol y lactosa, y con igual o mayor contenido de
proteínas que la leche de vaca. Tradicionalmente se prepara a partir de los granos enteros de soja eliminando
gran parte de la fibra, pero hay métodos alternativos de preparación de leche de soja a partir de harina
desgrasada. Una de las desventajas de la leche de soja frente a la leche vacuna es que su contenido en calcio
es considerablemente menor: 20-30 mg Ca2+/100 mL versus 120 mg Ca2+/100 mL (Chaiwanon et al. 2000).
Desde el punto de vista tecnológico, la dificultad de incorporar calcio a la leche de soja a niveles de la leche
vacuna se debe a la interacción de este catión con las proteínas, los fosfolípidos y la fibra (Appu Rao y
Narasinga Rao 1975, Whittinghill et al. 2000, Wagner y Tomás 2007, Pathomrungsiyounggul et al. 2007).
Debido a esto, con un tratamiento térmico aun suave como una pasteurización, las proteínas de la soja
coagulan por formación de agregados insolubles, en los que participan también las fibras, produciendo la
desestabilización de la leche por sedimentación de los mismos en la parte inferior del recipiente. Trabajos de
otros autores mostraron que es posible formular una leche de soja térmicamente estable con alto contenido de
calcio, adecuando los niveles de citrato y fosfato como agentes quelantes del catión (Yazici et al. 1997,
Pathomrungsiyounggul et al. 2010). El presente trabajo propone una solución alternativa que consiste en la
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micronización de los agregados formados debido a la fortificación de la leche de soja con una sal de calcio
soluble.
Trabajos previos estudiaron el efecto de la congelación sobre la leche de soja, obteniéndose coágulos tipo gel
similares al tofu (queso de soja) o yogurt (Shimoyamada et al. 1999a,b, 2000). Más recientemente se estudió
la estabilidad de emulsiones o/w preparadas con aislados de soja o caseinato de sodio frente a la congelación
(Palazolo y Wagner 2007, Palazolo et al. 2011). Se observó que las emulsiones preparadas con proteínas de
soja como único agente emulsificante son poco estables al ser congeladas, requiriendo el uso de
crioprotectores (azúcares y polialcoholes) para incrementar su estabilidad. La fortificación de la leche de soja
con calcio amplia el campo de estudio de la estabilidad del sistema frente al almacenamiento refrigerado y
congelado.
El objetivo de este trabajo fue obtener una leche de soja preparada a partir de una harina desgrasada
mediante la micronización del sistema en ausencia y presencia de calcio libre añadido, a fin de estudiar el
efecto de la refrigeración y la congelación sobre su estabilidad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Pellet desgrasado de soja con proteínas nativas (provisto por Bunge Argentina S.A.; Puerto San Martín,
Argentina); agua destilada; aceite de girasol refinado (Molino Cañuelas SACIFIA; Cañuelas, Argentina);
cloruro de calcio anhidro (Anedra; San Fernando, Argentina).
La composición del pellet desgrasado (g/100 g) fue la siguiente: proteínas (N×6,25): 43,6  0,9 (MicroKjeldahl con colorimetría final; Nkonge y Murray-Ballance 1982); humedad (secado en estufa a presión
normal y 103  2 °C, hasta peso constante): 8,36  0,08; y cenizas (calcinación a 550  5 °C): 6,45  0,03. El
contenido de lípidos totales en el pellet fue menor al 1%, según lo declarado por el proveedor.
Preparación de las leches de soja fluidas
La harina de soja desgrasada (HSD) fue obtenida a partir del pellet desgrasado por molienda (Molino
Chincan modelo FW100; China) y posterior tamizado (tamiz N° 20, IRAM 1501/76-ASTM-E-11-81, 500
m de poro). La HSD se dispersó en agua destilada a una concentración de 7,5% P/P de sólidos totales
utilizando un agitador magnético durante 3 horas para asegurar la completa dispersión e hidratación. La
dispersión se trató térmicamente en baño en ebullición durante 40 minutos con el fin de inactivar los factores
antinutricionales (factor antitríptico de Kunitz y lectina) presentes en la harina. El calentamiento se realizó en
ausencia y presencia de cloruro de calcio (120 mg Ca2+/100 g), observándose visualmente mayor coagulación
cuando el catión fue añadido. Posteriormente se agregó de aceite de girasol (2,5% P/P) y se pre-homogeneizó
la mezcla con un dispositivo rotor-estator Utraturrax T-25 (IKA-Labortechnik; Staufen, Alemania) usando
un rotor S25-20NK-18G (IKA-Labortechnik; Staufen, Alemania) a 20000 rpm por 1 min. La emulsión
obtenida fue pasada con un homogeneizador a válvula de alta presión (Panda 2K, GEA Niro Soavi; Parma,
Italia) a 1200 bar. Finalmente la leche de soja fue sometida a una pasteurización (75 ºC durante 1 min).
Almacenamiento refrigerado y congelado
Las leches de soja obtenidas fueron almacenadas en heladera a 7 ºC y en freezer a -18 ºC durante 1 y 9 días
en ambos casos. La descongelación de las muestras para su posterior caracterización se realizó a temperatura
ambiente.
Distribución de tamaño de partícula
Las distribuciones de tamaño de partícula (DTP) de las leches de soja fueron obtenidas con un analizador de
partículas (Malvern Mastersizer 2000E, Malvern Instruments Ltd.; Workcestershire, Reino Unido). Las
muestras fueron levemente agitadas para su homogeneización antes de la medición y diluidas en agua en la
unidad de dispersión húmeda (Hydro 2000MU, Malvern Instruments Ltd.; Workcestershire, Reino Unido) a
una velocidad de 2000 rpm. Los parámetros ópticos seleccionados en el dispositivo para la transformación de
los patrones de difracción de luz en las correspondientes DTP fueron: índice de refracción del agua y la fase
dispersa: 1,33 y 1,52, respectivamente y coeficiente de absorción, 0,01. Los diámetros de partícula promedio
d32 y d43 se obtuvieron a partir de las DTP expresadas como superficie (%) y volumen (%), respectivamente.
Cabe destacar que los diámetros obtenidos son aparentes puesto que se determinan aquellas partículas que
permanecen estables en las condiciones de alta dilución y agitación durante las medidas (Thanasukarn et al.
2004).
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Reología
El comportamiento de flujo de las leches de soja fue estudiado con un reómetro AR-G2 (TA Instruments;
New Castle, EE.UU.) con una geometría cono-plato (espacio entre plato y cono, 55 µm; diámetro de cono,
40 mm; ángulo de cono, 2º). La temperatura (21 ºC) se controló con un baño de agua (Julabo ACW100,
Julabo Labortechnik; Seelbach, Alemania) asociado al reómetro. El comportamiento de flujo fue analizado
aumentando la velocidad de corte de 0,1 a 100 s-1 durante 310 s, luego manteniéndola constante a 100 s-1
durante 60 s y finalmente disminuyéndola de 100 a 0,1 s-1 durante 310 s. El experimento fue descartado para
aquellas muestras que se encontraron altamente desestabilizadas, debido a su heterogeneidad.
Análisis estadístico
El análisis estadístico fue realizado por análisis de varianza y la prueba de mínima diferencia significativa (P
< 0,05) utilizando el programa estadístico Statgraphics Plus 5.1 (Statistical Graphic Corporation, EE.UU).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de la refrigeración
En la Figura 1 pueden observarse las DTP expresadas como volumen (%) de las leches de soja con y sin
calcio añadido, sometidas a refrigeración durante 1 y 9 días. En estas muestras, las partículas capaces de
dispersar luz son una conjunción de aceite, fibra y proteína insoluble. Luego de 1 día de almacenamiento, en
ambas leches se observó una población mayoritaria y definida de partículas con modas entre los 20 y 40 µm,
atribuible a las partículas de fibra hidratadas, ya que la micronización en las condiciones realizadas asegura
que tanto las proteínas insolubles como las gotas de aceite tengan tamaños menores a 5 µm. Sin embargo, la
presencia de calcio produjo un sistema con mayor cantidad relativa de partículas más pequeñas, lo cual se
manifiesta en un menor valor de d32 y d43 (Tabla 1). El calcio, al unirse a las proteínas de soja,
fundamentalmente a la glicinina, favorece la formación de agregados proteicos por interacciones
electrostáticas e hidrofóbicas (Appu Rao y Narasinga Rao 1975, Pathomrungsiyounggul et al. 2010). Por lo
tanto el resultado observado podría atribuirse al aumento de la cantidad de proteína insoluble en presencia
del catión y a cierto grado de floculación de gotas de aceite (por interacción de las interfases proteicas que
las rodean), surgiendo una nueva población de partículas más pequeñas que las de las fibras. Por su parte, la
refrigeración durante 9 días produjo aumentos significativos de los valores de d43 de ambas leches en
comparación con la leche almacenada durante 1 día (Tabla 1), lo cual podría deberse a la formación de
agregados proteína-fibra inducida por la baja temperatura de almacenamiento. De todas maneras, el carácter
de las distribuciones no se vio afectado considerablemente (Figura 1) y la apariencia visual de las leches se
mantuvo homogénea.
10
Volumen (%)
8
Sin calcio, 1 día
Con calcio, 1 día
Sin calcio, 9 días
Con calcio, 9 días
6
4
2
0
1
10
100
1000
Tamaño de partícula (m)
Figura 1: Distribución de tamaño de partícula de leches de soja con y sin calcio añadido, almacenadas a 7 ºC
durante 1 y 9 días.
100
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tabla 1: Tamaños de partícula promedio (d32 y d43) de leches de soja con y sin calcio añadido, almacenadas
a 7 ºC durante 1 y 9 días.
d32 (µm)
d43 (µm)
1 día
9 días
1 día
9 días
Sin calcio
24,8  0,7 b
26,1  0,6 c
40,5  2,5 b
59,5  1,4 d
Con calcio
11,5  0,2 a
11,1  0,3 a
32,9  0,8 a
49,7  1,0 c
Los valores son medias de tres replicados  desviación estándar.
Medias con letras diferentes indican que hay diferencias significativas entre muestras (P < 0,05).
Muestra
El comportamiento de flujo de las leches de soja refrigeradas puede observarse en la Figura 2. En todos los
casos se observó un comportamiento pseudoplástico, de acuerdo a la forma en que el esfuerzo de corte
aumenta con la velocidad de corte en la primera etapa del experimento. También se observó un
comportamiento tixotrópico en todas las muestras, reflejado por la disminución del esfuerzo de corte en la
etapa de velocidad de corte constante; y en la última etapa, donde se diminuyó la velocidad de corte, los
valores de esfuerzo de corte fueron menores que los de la primera etapa. Estos resultados indican una
disminución de la viscosidad aparente que puede ser atribuida a la disrupción de estructuras y agregados
dados por la interacción entre las partículas presentes en las leches (proteínas, gotas de aceite, fibra) en las
condiciones de flujo aplicadas. Por su parte, la adición de calcio produjo un sistema con mayores valores de
esfuerzo de corte, indicando una mayor viscosidad. Dado que la presencia del catión llevaría a la
insolubilización de proteína por formación de agregados, la muestra con calcio añadido dispondría de mayor
cantidad de partículas que interaccionan entre sí, repercutiendo en el comportamiento de flujo del sistema
(Pathomrungsiyounggul et al. 2010). La formación de flóculos inducida por la presencia de calcio también
puede ser responsable del aumento de viscosidad. En cuanto al efecto del tiempo de almacenamiento, a los 9
días no se observaron cambios reológicos apreciables en la leche sin calcio y hubo una disminución del 20%
en la viscosidad aparente (determinada a un tiempo de 100 s) de la muestra con el catión añadido (Figura 2).
Aunque como se mencionó anteriormente en ambas leches habría habido aumento de agregación de
proteínas con el tiempo de refrigeración, los nuevos agregados podrían ser más compactos y menos
hidratados, teniendo menor interacción entre sí. La menor interacción entre partículas explicaría la
disminución de la viscosidad en la leche con calcio, donde el efecto de las bajas temperaturas en la
compactación de los agregados sería mayor.
12
Esfuerzo de corte (Pa)
10
8
6
4
Sin calcio, 1 día
Con calcio, 1 día
Sin calcio, 9 días
Con calcio, 9 días
2
0
0
20
40
60
80
100
Velocidad de corte (1/s)
Figura 2: Comportamiento de flujo de leches de soja con y sin calcio añadido, almacenadas a 7ºC durante 1
y 9 días.
Efecto de la congelación
La Figura 3 muestra las DTP de las leches de soja sometidas a congelación durante 1 y 9 días, con y sin
calcio añadido. Las muestras congeladas durante 1 día mostraron distribuciones bimodales bien definidas y
tamaños de partícula considerablemente mayores que los de las muestras refrigeradas (Tabla 2), atribuidos a
101
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
una mayor agregación de proteínas y fibras por la congelación del agua. Cuando una emulsión se almacena a
temperaturas donde se produce la cristalización del agua, los componentes de la fase dispersa (gotas de
aceite y proteínas ya insolubilizadas) son forzados a permanecer en la fase acuosa no congelada. Además, la
crio-concentración de componentes solubles de la fase acuosa, como las sales propias que aporta la harina,
producen un considerable incremento de la fuerza iónica. Estos efectos se combinan favoreciendo la
floculación y/o coalescencia de las gotas de aceite y un mayor grado de agregación proteica (McClements
2004). La leche con calcio presentó una mayor población de partículas más pequeñas que la muestra sin el
catión añadido debido a la presencia de proteína insolubilizada, lo cual se ve reflejado en un menor valor de
d32 (Tabla 2). Al mismo tiempo, la presencia de calcio produjo un valor de moda mayor en la población de
partículas más grandes, dado que los agregados formados en este caso serían de mayor tamaño por la
interacción del catión con las proteínas; por tal motivo los valores de d43 de ambas muestras se igualan a
pesar de la evidente diferencia en el carácter de sus DTP. La crio-concentración del catión en la fase acuosa
durante el almacenamiento congelado tiene un rol preponderante en la formación de los agregados de mayor
tamaño en la leche con calcio añadido. Luego de 9 días de almacenamiento, en ambas leches se observó un
aumento en el tamaño y la cantidad de partículas más grandes a expensas de la disminución de la población
de partículas más pequeñas (Figura 3), lo cual se vio manifestado en un aumento de los valores de d32 y d43
(Tabla 2). Este resultado se atribuye a la extensiva agregación de proteínas sumada a la posible
floculación/coalescencia de gotas de aceite, durante el tiempo de congelación (Palazolo et al. 2011), y este
efecto fue más pronunciado en la leche con calcio añadido.
Con respecto al efecto de la congelación sobre el comportamiento de flujo de los sistemas, la leche sin calcio
añadido y congelada durante 1 día mostró una disminución del 50% en su viscosidad aparente (determinada
a un tiempo de 100 s) en comparación con la refrigeración durante el mismo tiempo. Como se explicó
anteriormente, la generación de agregados más compactos y menos hidratados, en este caso debido a la
congelación, produciría una disminución en la viscosidad del sistema por una menor interacción entre las
partículas. El proceso de coalescencia genera también una reducción del número de gotas de aceite, pudiendo
ser otro motivo al cual se debe la disminución de viscosidad. En el caso de la leche con calcio, la
congelación durante 1 día dio como resultado un sistema heterogéneo tras su descongelación, manifestado
por su alto grado de agregación (Figura 3); esta avanzada desestabilización de la muestra no permitió
determinar su comportamiento de flujo. Asimismo, luego del almacenamiento durante 9 días ambas leches
evidenciado un grado desestabilización aún mayor, producto de un tratamiento más prolongado de
congelación.
10
Volumen (%)
8
Sin calcio, 1 día
Con calcio, 1 día
Sin calcio, 9 días
Con calcio, 9 días
6
4
2
0
1
10
100
1000
Tamaño de partícula (m)
Figura 3: Distribución de tamaño de partícula de leches de soja con y sin calcio añadido, almacenadas a
-18ºC durante 1 y 9 días.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos indican que las leches de soja preparadas mediante micronización tuvieron una
aceptable estabilidad frente al almacenamiento refrigerado, observándose cambios moderados en la
microestructura de los sistemas y una leve disminución en la viscosidad de la muestra con calcio añadido, ya
102
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de por sí más viscosa. La congelación produjo cambios mucho más importantes, llevando a una alta
desestabilización de los sistemas luego del almacenamiento prolongado. Los resultados de este trabajo
muestran que la micronización de los agregados formados durante la etapa de cocción de la leche de soja es
un método prometedor para la obtención de esta bebida fortificada con calcio al nivel de la leche vacuna y
con buena estabilidad durante la refrigeración. Para obtener una leche de soja fortificada con calcio que sea
estable frente a la congelación podría evaluarse el uso combinado de agentes crioprotectores (azúcares,
polialcoholes, etc.) y sales que aporten menor cantidad de calcio libre que el cloruro (lactato, gluconato,
etc.).
Tabla 2: Tamaños de partícula promedio (d32 y d43) de leches de soja con y sin calcio añadido, almacenadas
a -18 ºC durante 1 y 9 días.
Muestra
d32 (µm)
d43 (µm)
1 día
9 días
1 día
9 días
Sin calcio
37,5  0,4 b
73,2  6,1 c
117,9  1,6 a
194,0  5,5 b
Con calcio
22,1  0,2 a
35,4  1,6 b
128,8  1,0 a
219,5  11,0 c
Los valores son medias de tres replicados  desviación estándar. Medias con letras diferentes indican que
hay diferencias significativas entre muestras (P < 0,05).
BIBLIOGRAFÍA
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103
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el aporte financiero de la Universidad Nacional de Quilmes (Programa I+D PUNQ
53/1007). G. N. Salvatore y R. G. Otero son estudiantes de Ingeniería en Alimentos de la Universidad
Nacional de Quilmes y A. L. Márquez, J. R. Wagner y G. G. Palazolo son investigadores del Consejo
Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).
104
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Propiedades físicas y térmicas de películas comestibles en base a proteínas de suero de queso
Michaluk, A. 1; Romero, A. 1; Judis, M.A. 1; Bertola, N. 2
1: Universidad Nacional del Chaco Austral, Argentina
2: Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA)-CONICET, Facultad de
Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina
nbertola@cidca.org.ar
Resumen: Se estudió el efecto de las concentraciones de proteínas y glicerol sobre las propiedades
mecánicas, el color, la humedad, la solubilidad y la temperatura de transición vítrea de películas comestibles
en base a proteínas de suero de queso.
Se seleccionaron tres concentraciones de proteína (6, 8 y 10% p/p) y tres de glicerol como plastificante (30,
60 y 90 % p/p proteína). Las películas se prepararon por moldeo y secado. La solubilidad se determinó en
agua a 30°C por 22 hs. La temperatura de transición vítrea (Tg) se halló mediante un calorímetro diferencial
de barrido (DSC) Q100. Para evaluar las propiedades mecánicas se realizaron ensayos de tensióndeformación para la determinación de la elongación antes de la ruptura y el módulo elástico de las diferentes
películas mediante análisis dinámico-mecánico (DMA). El color superficial se determinó a través de los
parámetros de cromaticidad a* y b* y la luminosidad.
Las películas obtenidas sin glicerol resultaron muy quebradizas y no pudieron ser desmoldadas. Cuando se
agregó plastificante se obtuvieron películas flexibles, transparentes y ligeramente amarillas. Los valores de
humedad y solubilidad aumentaron con el incremento de los niveles de glicerol. Se obtuvieron valores de Tg
para las películas con glicerol, entre 33º y 34ºC. El aumento en la concentración de proteínas produjo un
aumento en b* y en la deformación antes de la ruptura y una reducción del modulo elástico.
Palabras clave: películas, proteína de suero de queso, glicerol, propiedades mecánicas, Tg
Abstract: The objective of this work was to study the effect of concentrations of protein and glycerol on the
mechanical properties, color, moisture, solubility and glass transition temperature of edible films based on
whey proteins.
Three protein concentrations (6, 8 and 10% w / w) and three glycerol concentrations as plasticizer (30, 60
and 90% w / w protein) were selected. The films were prepared by casting and drying. The solubility was
determined in water at 30 ° C for 22 hours. The Tg was determined using a DSC Q100. To evaluate the
mechanical properties were carried out stress-strain tests for the determination of the elongation before
rupture and elastic modulus of the different films in a DMA. The surface color was determined by the
chromaticity parameters a* and b* and luminosity.
The films obtained without glycerol were very brittle and could not be demoulded. When added plasticizer
flexible, transparent and slightly yellow films were obtained. DSC showed lower values of Tg with
increasing plasticizer concentration. The increase in protein concentration produced an increase in b* and
deformation before rupture and reduced elastic modulus.
Keywords: film, whey protein, glycerol, mechanical properties, Tg
INTRODUCCIÓN
La tecnología de los recubrimientos comestibles surge como una alternativa prometedora para mejorar la
calidad y conservación de alimentos durante su procesado y/o almacenamiento. Los recubrimientos ofrecen
la posibilidad de consumirse con el alimento, extienden su vida útil ya que retardan la migración de humedad
y de lípidos, así como el transporte de solutos y aromas, mejoran las características organolépticas,
nutricionales y las propiedades mecánicas del alimento. Además, conservan la textura y permiten incorporar
nutrientes y/o aditivos (Kester y Fennema, 1986). Técnicamente, se habla de recubrimiento cuando una
solución aplicada sobre un producto forma una película superficial al secarse, mientras que una película se
forma con anterioridad y posteriormente se aplica sobre el producto. En la práctica, se habla indistintamente
de película o recubrimiento, haciendo referencia a una delgada capa de material que cubre la superficie del
alimento, aplicada mediante inmersión, pulverización o pintado, o bien como una envoltura continua que
105
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
separa distintos componentes alimenticios, que puede ser consumida como parte del producto (Guilbert
1986; Gennadios y Weller 1990).
Muchos polisacáridos y proteínas tienen buenas propiedades de formación de película (Gennadios y Weller
1990; McHugh y Krochta 1994). Se pueden usar solos o en combinación, con el objeto de mejorar sus
propiedades. Las películas producidas a partir de proteínas y polisacáridos presentan buenas propiedades de
barrera al oxígeno y a la migración de lípidos. Sin embargo, su naturaleza hidrofílica las hace pobres barreras
al vapor de agua (McHugh y Krochta 1994).
Las proteínas del suero de queso producen películas transparentes, blandas y flexibles, con muy buena
resistencia a la transferencia de oxígeno, volátiles y lípidos a humedades bajas. Sin embargo, la naturaleza
hidrofílica de las proteínas induce interacciones con el agua, aumentando la permeabilidad al vapor de agua.
El suero lácteo se obtiene como subproducto en la elaboración del queso y su eliminación suele resultar
problemática desde el punto de vista medioambiental. De hecho, se investigan diversas alternativas que
permitan su aprovechamiento, una de ellas es la utilización de sus proteínas en la formulación de películas
biodegradables y recubrimientos comestibles en alimentos.
Algunos de los recubrimientos requieren la incorporación de agentes plastificantes, los cuales ayudan a
mantener su integridad y aumentan la flexibilidad y la resistencia a la rotura (Carrillo-López et al. 2000).
Estos compuestos disminuyen las fuerzas intermoleculares en las cadenas del polímero produciendo un
descenso en las fuerzas de cohesión y por tanto, imparten movilidad molecular a la matriz, plastificándola.
Como consecuencia, aumenta el volumen libre y disminuye la temperatura de transición vítrea, afectando
significativamente sus propiedades mecánicas y de barrera al vapor de agua. La relación entre las
concentraciones de polímero y plastificante resulta ser, por lo tanto, un parámetro clave para determinar las
propiedades funcionales de una película. Entre los plastificantes más utilizados se encuentran mono-, di- y
oligosacáridos (jarabes de glucosa y fructosa, miel) y polioles (sorbitol, glicerol, derivados de la glicerina y
polietilenglicol) (Guilbert 1986), siendo el agua el plastificante natural de los productos alimenticios. Los
requerimientos para un plastificante son su compatibilidad con el polímero formador de la red y su
permanencia dentro de la estructura (García et al. 1998).
En este trabajo se estudió el efecto de las concentraciones de proteínas y glicerol (plastificante) sobre las
propiedades mecánicas, el color, la humedad, la solubilidad y la temperatura de transición vítrea de películas
comestibles en base a proteínas de suero de queso.
MATERIALES Y METODOS
Obtención de las películas
Se utilizó proteína de suero de queso concentrada (WPC) Lacprodan 80 (ARLA Foods Ingredients, Porteña,
Cordoba) y glicerol (Cicarelli, Santa Fe).
Las películas de WPC se prepararon de acuerdo al método descripto por Perez-Gago y Krochta (2000) con
algunas modificaciones. Para preparar las soluciones filmogénicas de diferentes concentraciones (6, 8 y
10%) se dispersó WPC en agua destilada con agitación constante durante 2 h. Las soluciones obtenidas
fueron desgaseadas por medio de vacío, se ajustó el pH a un valor de 7 por medio de Na(OH) 1N y fueron
desnaturalizadas térmicamente en baño de agua a 80ºC por 30 min. Se agregó el glicerol como plastificante
en diferentes concentraciones (30, 60 y 90% respecto al contenido de proteína). Cada experimento se realizó
por triplicado.
Aproximadamente 20 g de cada solución con y sin plastificante se dispersaron en placas de Petri (9 cm de
diámetro) y se secaron a 25 °C hasta peso constante. Las películas obtenidas se almacenaron a 23 °C y 650%
de humedad relativa. El espesor de las películas se determinó utilizando un medidor de espesor DCN-900
(Nueva York, EE.UU.) para materiales no conductores sobre sustratos no ferrosos.
Caracterización de las películas
La determinación de los valores de humedad se realizó por el método de secado en estufa a 105°C hasta peso
constante.
El ensayo de solubilidad se llevó a cabo a través de la inmersión de piezas de igual dimensión de cada una de
las películas de WPC con las distintas concentraciones de plastificante, pesadas previamente, en agua
destilada a 30°C. Luego de transcurrido un tiempo de hidratación de 22 hs, las películas se secaron sobre
una superficie absorbente. El porcentaje de material soluble fue determinado por el método de secado en
estufa a 105ºC, teniendo en cuenta el peso inicial de las muestras.
106
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El color superficial se determinó con un colorímetro Minolta CR400 (Japón), obteniéndose los parámetros de
cromaticidad a* y b* y la luminosidad (L).
Las propiedades térmicas de las películas se determinaron utilizando un DSC modelo Q100 controlado por
un módulo TA 5000 (TA Instruments, New Castle, Delaware, EE.UU.). Aproximadamente 7 mg de muestra
fueron pesados en cápsulas de aluminio y sellados herméticamente, una cápsula vacía se utilizó como
referencia. Se realizaron dos análisis entre -60 y 110ºC con una velocidad de calentamiento de 10 ºC/min. A
partir de los termogramas obtenidos se obtuvo la temperatura de transición vítrea (Tg) utilizando el programa
de análisis Universal Analysis V1.7F software (TA Instruments).
Los análisis dinámico-mecánico (DMA) se realizaron en un equipo Q800 (TA Instruments, New Castle,
EE.UU.), las película se cortaron con una geometría rectangular (30 mm de longitud, 6 mm de ancho y un
espesor entre 85 y 110 m). Las curvas de tensión- deformación se obtuvieron con una rampa de fuerza a
velocidad de deformación constante hasta alcanzar una fuerza de 18 N o hasta la rotura de las muestras.
Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza (ANAVA) para evaluar el efecto de los factores analizados utilizando el
programa Systat versión 12.0. Para los ensayos de comparación de medias se empleó el test de menor
diferencia significativa (LSD) con P> 0.05.
RESULTADOS Y DISCUSION
A partir de las soluciones de WPC se obtuvieron películas delgadas de espesor aproximado entre 80 y 115
μm. Las obtenidas sin el agregado de glicerol resultaron muy quebradizas y no pudieron ser desmoldadas.
Cuando se agregó glicerol como plastificante se obtuvieron películas flexibles, transparentes y ligeramente
amarillas, resultando muy pegajosas las películas con el mayor contenido de glicerol.
Humedad y Solubilidad
Los valores obtenidos de humedad y solubilidad son mostrados en la Figura 1, donde se puede observar que
a mayores niveles de glicerol se obtuvieron mayores valores de dichos parámetros. El aumento de la
humedad observado puede atribuirse a la naturaleza higroscópica del glicerol que atrae y retiene moléculas
de agua, favoreciendo así la humectación de la superficie de la película y por lo tanto la absorción de
humedad (Kokoszka et al. 2010).
La solubilidad en agua de las películas comestibles es una propiedad importante. Posibles aplicaciones
pueden requerir insolubilidad en agua para mejorar la integridad del producto, sin embargo, en algunos casos
podría ser beneficiosa la solubilización de la película en agua antes del consumo del producto. La
insolubilidad parcial de estas películas puede ser atribuida a la formación de enlaces intermoleculares fuertes
(por ejemplo, enlaces disulfuro, como resultado del tratamiento térmico) entre las moléculas de proteína en la
matriz de las películas de WPC (McHugh y Krochta 1994).
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30
Prot: 6%
Prot: 8%
Prot: 10%
Humedad (%)
25
d
d
d
c
20
b b
c, d
c
b
15
a
a
a
10
5
0
70
0
c,d,e
90
d,e
e, f
b, c
50
b,c,d
a, b
40
60
e, f f
% Glicerol (peso de Gli/peso
e, f de Prot)
60
Solubilidad (%)
30
a, b
b
a
30
20
10
0
0
30
60
90
% Glicerol (peso de Gli/peso de Prot)
Figura 1. Variación de los valores de Humedad y Solubilidad con las concentraciones de proteína y glicerol
(expresada respecto al contenido de proteína).
Color
El color es de vital importancia, ya que influye directamente en el atractivo del producto y la aceptación del
consumidor.
La concentración de proteínas afectó significativamente el color de las películas produciendo un aumento en
el parámetro b*, que representa el color amarillo. Los niveles de glicerol utilizados no afectaron
significativamente a ninguno de los parámetros de color analizados.
Propiedades térmicas
Los resultados de DSC mostraron que las temperaturas de transición vítrea (Tg) de las películas fueron
superiores a 30ºC existiendo diferencias significativas entre las muestras con y sin agregado de plastificante
(Figura 2). La Tg disminuyó con el agregado del plastificante. Sin embargo no se observaron diferencias
significativas en los valores de Tg entre las distintas concentraciones de glicerol estudiadas.
Las interacciones proteína-proteína y proteína-plastificante también pueden ser investigadas por calorimetría
diferencial de barrido (DSC). Los termogramas obtenidos de las películas de proteína de suero de queso
mostraron compatibilidad entre el polímero y el glicerol. No se hallaron picos relacionados con la fusión y la
cristalización del plastificante y se detectó sólo una transición de fase. Si el polímero y el plastificante fueran
inmiscibles, la mezcla presentaría dos Tg correspondientes a las dos fases puras (Ghanbarzadeh y Oromiehi
2009).
108
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60
50
c
c
Prot: 6%
Prot: 8%
Prot: 10%
c
b
Tg (ºC)
40
a
a
a
a
a
a
a
a
30
20
10
0
0
30
60
90
% Glicerol (peso de Gli/peso de Prot)
Figura 2. Variación de la Temperatura de Transición Vítrea (Tg) con las concentraciones de proteína y
glicerol (expresada respecto al contenido de proteína).
Propiedades mecánicas
Según Mancini et al. (1999) y Del Nobile et al. (2007), un modelo matemático capaz de describir toda la
curva de tensión-deformación se puede expresar como:
 T ( T )  E C  T exp ( T K)
(1)
donde Т es la tensión verdadera, σТ el esfuerzo verdadero, Ec el módulo elástico y K una constante que
permite ajustar el modelo.
Los datos de tensión-deformación, obtenidos para las películas de WPC con y sin glicerol, mostraron un
adecuado ajuste al modelo propuesto con valores de r2 mayores a 0.99 (Figura 3).
La Figura 4 muestra los valores del módulo elástico obtenido para todas las películas. Las propiedades
mecánicas solo fueron afectadas significativamente por los niveles del plastificante. El incremento de
concentración de glicerol produjo un incremento en la deformación antes de la ruptura y una reducción del
modulo elástico. Un comportamiento similar fue observado por Gupta et al. (2009) trabajando en tereftalato
de polietileno (PET) a diferentes temperaturas y por León et al. (2008) sobre una matriz de gelano.
Según Barreto et al. (2003), un aumento en el contenido de glicerol incrementa la elasticidad y la elongación
de la película debido a que limita la creación de enlaces de hidrógeno entre las cadenas de proteína,
incrementando así el espacio intermolecular y por lo tanto la movilidad de las cadenas.
CONCLUSIONES
A través de diferentes técnicas, se pudo comprobar que la relación entre las concentraciones de polímero y
plastificante resulta ser un parámetro clave para determinar las propiedades de las películas en base a
proteínas de suero de queso.
El agregado de glicerol mejoró las propiedades mecánicas de las películas haciéndolas más deformables a
iguales valores de esfuerzo aplicado.
Una mayor concentración de proteína permitió obtener películas más resistentes a la tracción, obteniéndose
mayores valores de la tensión máxima.
Se determinó una concentración máxima de glicerol a ser utilizada de 60% (respecto al contenido de
proteína)
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3.0
2.5
T (MPa)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08

Figura 3. Curvas de tensión – deformación de películas de proteína de suero de queso con el agregado de
glicerol. Los símbolos corresponden a los datos experimentales y las líneas al modelo
 Glicerol 30%,  Glicerol 60%,  Glicerol 90%. Rojo = Proteína 6%, Verde = Proteína 8%, Azul =
Proteína 10%.
600
Prot: 6%
Prot: 8%
Prot: 10%
500
c
c
c
Ec (MPa)
400
300
b
200
a, b a
100
a
a
a
0
30
60
90
% Glicerol (peso de Gli/peso de Prot)
Figura 4. Valores del módulo elástico (Ec) en función de las concentraciones de proteína y glicerol
(expresada respecto al contenido de proteína).
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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la financiación suministrada por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y
Técnicas (CONICET), la Universidad Nacional de la Plata y la Universidad Nacional del Chaco Austral,
Argentina.
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Películas biodegradables e inteligentes en base a gelatina capaces de detectar cambios de pH
Musso Y.S., Salgado P.R., Mauri A.N.
Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA, CONICET, UNLP), La Plata,
Argentina.
yanimusso@hotmail.com
Resumen: El objetivo de este trabajo es desarrollar películas biodegradables inteligentes de matriz proteica,
capaces de detectar procesos de deterioro de alimentos asociados a cambios de pH. Se obtuvieron películas
por casting a partir de dispersiones acuosas de gelatina comercial, glicerol e indicadores ácido-base –naranja
de metilo (NM), rojo neutro (RN) y verde de bromocresol (VBC), a pHs: 2, 6 y 11. Todas las películas
resultaron homogéneas y con diferentes coloraciones dependiendo del pH y del colorante empleado. Se
evaluó la respuesta de estos materiales frente a cambios de pH simulando su contacto con: alimentos
líquidos, alimentos semisólidos, y con el espacio de cabeza del envase a pHs ácido, neutro y alcalino. En
todos los ensayos se observó que las películas respondieron frente a los cambios de pH del medio
modificando su coloración. Por otro lado, la adición de NM y RN mejoró significativamente las propiedades
mecánicas de las películas proteicas, sin afectar sus contenidos de agua y permeabilidades al vapor de agua.
Estos materiales, usados como envases primarios o como etiquetas para pegar en la superficie interna de los
envases primarios de alimentos cuyos mecanismos de deterioro sean acompañados por cambios de pH,
podrían comunicarle al consumidor si el producto se encuentra apto para su consumo.
Palabras clave: envase inteligente, películas biodegradables, gelatina, cambios de pH, sensor de deterioro.
Abstract: The aim of this work was to develop smart biodegradable protein-based films capable of detecting
food spoilage processes associated with changes in pH. Protein films were obtained by casting from aqueous
dispersions of bovine gelatin, glycerol and acid-base indicators –methyl orange (NM), neutral red (RN) and
bromocresol green (VBC)–, at pH 2, 6 and 11. All resulting protein films were homogeneous, and had
different colors depending on pH and the indicator used. The response of these materials was evaluated
simulating its contact with liquid foods, semi-solid foods, and with the container headspace; at acid, neutral
and alkaline pH. In all tests, it was observed that protein films respond to changes in medium pH by
modifying their color. Furthermore, the addition of NM and RN significantly improved mechanical
properties of protein films without affecting its water vapor permeability values. These materials could be
used as primary packaging or labels to be placed on the inner surface of food packaging, whose deterioration
occurred with changes in pH. Thus they could indicate the consumer whether the product is suitable for
consumption.
Keywords: smart packaging, protein films, gelatin, pH changes, food spoilage sensor.
INTRODUCCIÓN
En las últimas décadas se ha incrementado el interés en la producción y empleo de materiales
biodegradables, obtenidos de fuentes renovables, para la preservación de alimentos (Restuccia et al. 2010).
En particular, en los últimos años ha cobrado gran importancia el agregado de aditivos a la formulación de
los materiales con el fin de conferirle al envase nuevas funciones (Brody et al. 2008). Así surgen los
conceptos de “envases activos” y “envases inteligentes” (Dainelli et al. 2008).
Un envase inteligente es aquel capaz de detectar algunas de las propiedades del alimento envasado y/o del
entorno e informar al productor, distribuidor o consumidor sobre el estado y la calidad del producto
envasado, o modificar ciertas propiedades a fin de optimizar sus condiciones de conservación (Danielli et al.
2008). Los envases inteligentes pueden clasificarse en diferentes grupos de acuerdo a la función que
cumplen; una de ellas es dar indicio de la calidad del producto (Kerry et al. 2006). Una buena alternativa
para desarrollar envases inteligentes es utilizar aditivos que cambien de color en presencia de la sustancia
indicadora de deterioro a cuantificar (por ejemplo: aminas, sulfuro de hidrógeno, etanol, toxinas, oxígeno,
dióxido de carbono, dióxido de azufre, pH, ácidos orgánicos, etc.) (Ahvenainen 2003). Este tipo de envases
resulta atractivo como estrategia para la realización de controles de calidad in situ y en productos cerrados.
Algunos procesos de deterioro de alimentos van acompañados de cambios en el pH, como por ejemplo el
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desarrollo de microorganismos (Kerry y Butler 2008). Por lo que un envase inteligente capaz de detectar
cambios de pH podría utilizarse como indicador del desarrollo microbiano en alimentos envasados.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar y caracterizar películas de matriz proteica, en base a gelatina,
capaces de detectar cambios de pH. Para ello se evaluó el agregado a la formulación de indicadores ácidobase, de manera que indujeran cambios de coloración en la película frente a variaciones en el pH del medio
con el que está en contacto el material.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Se utilizó gelatina bovina comercial (87% de proteínas; “Royal”, Kraft Foods, Argentina) como biopolímero
y glicerol (Anedra, Argentina) como plastificante. Los indicadores ácido-base que se emplearon fueron:
naranja de metilo (NM) (Mallinckrodt Baker, Estados Unidos), rojo neutro (RN) (Pablo Zubizarreta Ward,
Argentina) y verde de bromocresol (VBC) (Anedra, Argentina). Todos los demás reactivos empleados fueron
de grado analítico.
Formación de las películas
Se obtuvieron películas por casting. Se solubilizaron 5 g de gelatina en 50 ml de agua destilada a 100°C, y se
mezclaron con 50 ml de una solución acuosa del colorante (20 mg) y glicerol (1,25 g) a temperatura
ambiente. Se ajustó el pH a 2, 6 y 11, considerando el viraje de los indicadores ácido-base utilizados (Tabla
1). Las soluciones filmogénicas se agitaron 30 minutos a temperatura ambiente. Un volumen de 10 ml de
cada solución se moldeó en placas de Petri (d=9 cm) y se secó en estufa de convección forzada (Yamato,
DKN600, Estados Unidos) a 60°C durante tres horas. Las películas resultantes fueron acondicionadas 48 h a
20°C y 58%HR previo a su caracterización. Como control se obtuvieron películas de gelatina sin el agregado
de indicadores a cada pH analizado.
Tabla 1: Coloración de los indicadores ácido-base utilizados en función del rango de pH.
Indicador ácido-base
Naranja de Metilo
Rojo Neutro
Verde de
Bromocresol
Color
pH
Naranja
pH < 4
Amarillo 4 < pH < 7
Violeta
pH > 7
Violeta
pH < 3,3
Rojo
3,3 < pH < 7
Amarillo
pH > 7
Amarillo
pH <4
Azul
pH >5,5
Caracterización de las películas
Espesor: Se determinó con un medidor de espesor digital (Check Line DCN-900, Estados Unidos),
realizando 9 determinaciones, una en el centro y ocho sobre el perímetro de la película.
Humedad: El contenido de agua de las películas se determinó por secado en estufa a 105°C hasta lograr peso
constante (ASTM D644-99, 2004). El procedimiento se realizó por triplicado.
Solubilidad en agua: Se determinó colocando tres discos de cada película (~2 cm de diámetro y previamente
pesados) en 50 ml de agua destilada. Luego de 24 h de agitación a 100 rpm y 20°C se filtró la dispersión
sobre papeles de filtro, previamente secados en estufa y tarados. Posteriormente, cada uno de los filtros se
llevó a estufa a 105ºC, hasta peso constante, obteniendo así el peso seco de los sólidos insolubles. Teniendo
en cuenta el contenido de humedad de las películas, se calculó el peso seco de los sólidos solubles, y así el
porcentaje de solubilidad en agua. Las determinaciones se realizaron por triplicado.
Permeabilidad al vapor de agua: Se determinó según la norma ASTM E96-00 (2004). Las películas se
colocaron en celdas de acrílico (con un área expuesta determinada) y se almacenaron a 20°C en jarras
herméticas. Se mantuvo un gradiente de 75% de humedad relativa. Se registró el cambio en el peso de la
celda en una balanza analítica en función del tiempo. Los datos se regresionaron linealmente y de la
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pendiente se obtuvo la velocidad de transmisión de vapor de agua (WVTR, Water Vapour Transmission
Rate). La permeabilidad al vapor de agua (WVP, Water Vapour Permeability) en (g Pa-1 s-1 m-1) se calculó
multiplicando la WVTR por el espesor de la película y dividiéndolo por la fuerza impulsora (1754,45 Pa) y
el área expuesta de la película (~0,00185 m2). Las determinaciones se realizaron al menos por duplicado.
Propiedades mecánicas: Las películas se sometieron a ensayos de tracción empleando un texturómetro (TAXT2i, Stable Micro Systems, Inglaterra), siguiendo la norma ASTM D882-02 (2004). Se cortaron probetas
rectangulares de 80 mm de longitud y 6 mm de ancho y se montaron en un sistema de mordazas para tensión
A/TG, cuya separación inicial fue de 50 mm. Se aplicó una velocidad de separación de mordazas de 0,5
mm/s con una fuerza de 0,2 N, y se registró la curva fuerza vs. distancia, que luego se transformó en tensión
(σ=fuerza/área transversal de la película) vs. deformación (ε=porcentaje de elongación respecto de la
separación de mordazas). Se realizaron al menos nueve replicados para cada formulación.
Respuesta de las películas
Se evaluó la respuesta de las películas frente a cambios de pH enfrentando los materiales desarrollados a
distintos medios:
i) agregando una gota de HCl 2 N o NaOH 2 N, directamente sobre los materiales, simulando el contacto con
alimentos líquidos;
ii) poniendo las películas en contacto con geles de gelatina, preparados a partir de dispersiones de gelatina al
3% p/v a distintos pH = 2,5; 5,2; 7,5 y 11, a 4ºC; en este caso para simular el contacto con alimentos
semisólidos;
iii) exponiendo los materiales proteicos a atmósferas gaseosas generadas por ácido acético glacial y
amoníaco, para simular el contacto con el espacio de cabeza de alimentos envasados.
Estas respuestas se determinaron fotográficamente (Kodak M853, Estados Unidos) y registrando las
coordenadas L*, a*, b* de la escala CIELab con un colorímetro Minolta CR-400 (Konica Minolta, Japón)
(datos no mostrados). Las medidas se realizaron antes y después de provocar el cambio de pH para todos los
casos.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como promedio ± desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza de dos
factores (two-way ANOVA; dos factores: presencia o no de indicador ácido-base y pH, en cuatro y tres
niveles respectivamente) y se empleó el test de Tukey para la comparación de medias, con α=0.05,
empleando Statgraphics Plus (versión 5.1, Statgraphics, USA).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Todas las películas preparadas con o sin colorantes, y a distintos pH resultaron homogéneas, translúcidas
brillantes y delgadas (~ 50 m). El espesor de las mismas no se vio modificado por la presencia y tipo de
colorante empleado (p>0.05) ni por el pH de la solución filmogénica (p>0.05).
En la Figura 1 se muestra el aspecto visual de las mismas. Las películas de gelatina sin colorante (Control)
resultaron incoloras y transparentes a todos los pHs evaluados. Por esta característica, la gelatina fue
seleccionada como materia prima de manera que las películas pudieran adquirir la coloración propia del
colorante adicionado, sin interferencias por parte del biopolímero. Con el agregado de los distintos
colorantes a las formulaciones filmogénicas, se obtuvieron películas con coloración brillante y homogénea.
El color de los materiales desarrollados se modificó dependiendo del pH (2, 6 u 11) de la solución
filmogénica inicial de acuerdo con las características propias de cada colorante; naranja, amarillo y violeta
para el NM; violeta, rojo y amarillo para RN; y amarillo y azul para las aditivadas con VBC respectivamente.
Todas las películas presentaron una elevada transparencia, lo que resultaría particularmente interesante para
aplicaciones en donde es necesario que el packaging permita visualizar al alimento envasado. La coloración
alcanzada en las distintas películas también podría considerarse como un atributo adicional para algunas
aplicaciones comerciales.
114
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Figura 1: Películas de gelatina con o sin el agregado de colorantes a pH: 2, 6 y 11.
Efecto del agregado de indicadores ácido-base en las propiedades fisicoquímicas de los materiales.
El contenido de agua de las películas de gelatina con y sin agregado de colorantes a distintos pHs se muestra
en Tabla 2. Las películas Control presentaron ~20% de agua. Estos valores son similares a los que describen
Andreuccetti et al (2011) para películas elaboradas con gelatina porcina. El agregado de NM y RN
disminuyó significativamente (p<0.05) el contenido de humedad de las películas resultantes, mientras que la
adición de VBC no provocó cambios significativos (p>0.05) en este parámetro respecto del control. La
variación de pH sólo modificó el contenido de agua de las películas sin colorante (Control) y el de las
aditivadas con VBC. En ambos casos, las películas obtenidas a pH ácido presentaron los menores valores
(p<0.05).
Tabla 2: Contenido de agua de las películas de gelatina con y sin agregado de colorantes a pH: 2, 6 y 11.
Contenido de agua (%)
Película
Control
NM
RN
VBC
pH 2
19,22 ± 0,46a/x
16,87 ± 0,84b/x
17,41 ± 0,60b/x
20,50 ± 0,68a/x
pH 6
22,11 ± 0,62a/y
16,33 ± 0,47b/x
17,46 ± 1,12b/x
23,25 ± 1,16a/y
pH 11
21,47 ± 0,29a/y
17,28 ± 0,30b/x
16,45 ± 0,11c/x
Los valores informados son promedio ± desviación estándar. Letras diferentes en la
misma fila (a, b, c) indican diferencias significativas (p <0.05) respecto de la
presencia de colorante, de acuerdo al test de Tukey. Letras diferentes en la misma
columna (x, y, z) indican diferencias significativas respecto del pH (p <0.05), de
acuerdo al test de Tukey.
En la Tabla 3 se muestra la solubilidad en agua de los materiales desarrollados. Las películas Control
resultaron moderadamente solubles en agua (37-49%). La incorporación de NM en la matriz de gelatina
disminuyó su solubilidad en agua (p<0.05), siendo este efecto más notorio a pH 11 (disminución de ~60%)
que a pHs 2 y 6 (disminución de ~40%). Respecto a las películas aditivadas con los otros indicadores, sólo
las combinaciones VBC-pH=6 y RN-pH=11 presentaron menores valores de solubilidad en agua que sus
respectivos Controles (p<0.05). Las películas elaboradas a pH ácido, tanto Controles como coloreadas,
fueron más solubles que las obtenidas a pH neutro o alcalino (p<0.05), lo que sugeriría un diferente grado de
entrecruzamiento dependiendo del pH de las dispersiones y de la presencia de estos indicadores.
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Tabla 3: Solubilidad en agua de las películas de gelatina con y sin agregado de colorantes a pH: 2, 6 y 11.
Solubilidad en agua (%)
Película
Control
NM
RN
VBN
pH 2
49,63 ± 1,64a/x
30,70 ± 2,96b/x
53,52 ± 4,41a/x
51,25 ± 0,85a/x
pH 6
37,61 ± 2,71a/y
23,23± 1,41b/y
38,11 ± 1,85a/y
21,48 ± 0,48b/y
37,61 ± 1,81a/y 15,15 ± 0,01b/z 34,09 ± 1,03b/y
pH 11
Los valores informados son promedio ± desviación estándar. Letras diferentes en la
misma fila (a, b, c) indican diferencias significativas (p <0.05) respecto de la
presencia de colorante, de acuerdo al test de Tukey. Letras diferentes en la misma
columna (x, y, z) indican diferencias significativas respecto del pH (p <0.05), de
acuerdo al test de Tukey.
Independientemente de las observaciones en el contenido de agua y la solubilidad de las películas, no se
observaron diferencias significativas en sus permeabilidades al vapor de agua (~7·10 -11 g H2O s-1 m-1 Pa-1)
con la presencia y tipo de colorante (p>0.05) ni con el pH (p>0.05). Los valores de WVP encontrados son
similares a los descriptos por Tongnuanchan et al. (2012) para películas elaboradas con gelatina de pescado
(~4 10-11 g H2O s-1 m-1 Pa-1) y también para otras películas proteicas (Gennadios 2002, Bourtoom 2008).
En las Figura 2 se presentan las propiedades mecánicas (medidas en tracción) de las películas desarrolladas:
tensión máxima, módulo elástico y elongación a rotura (Figura 2 paneles A, B y C respectivamente). Las
películas Control mostraron moderadas propiedades mecánicas (σ máx~ 2,6-4,6 MPa; ε~150-270%; E~3,5-12
MPa), similares a los valores informados en la bibliografía para películas de gelatina de pescado (Gómez-
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A
B
C
Figura 2: Propiedades mecánicas (medidas en tracción) de las películas de gelatina con y sin agregado de
colorantes a pH: 2, 6 y 11. A) Tensión máxima (σmáx), B) Módulo de Young (E) y C) Elongación a rotura (ε).
Los valores informados son promedio ± desviación estándar. Letras diferentes en la misma fila (a, b, c, d)
indican diferencias significativas (p <0.05) respecto de la presencia de colorante, de acuerdo al test de Tukey.
Letras diferentes en la misma columna (x, y, z) indican diferencias significativas respecto del pH (p <0.05),
de acuerdo al test de Tukey.
Guillén et al. 2012). Estas propiedades se vieron afectadas tanto por la presencia y tipo de colorante (p<0.05)
como por el pH de la dispersión proteica inicial (p<0.05).El agregado de NM o RN a las formulaciones
produjo películas que presentaron mayores valores de tensión y módulo elástico, y menores elongaciones a
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rotura que las correspondientes películas Control (p<0.05). Estas mejoras resultaron más notorias a pHs
neutro y alcalino que a pH ácido. Por otra parte, el agregado de VBC empeoró las propiedades de los
materiales a pH ácido (p<0.05), mientras que no modificó significativamente las propiedades de las películas
obtenidas a pH neutro (p>0.05). En todos los casos, las películas obtenidas a pH 2 fueron menos resistentes y
más elongables que las de pH 6 y 11 (p<0.05). Estos resultados sugieren que NM y RN estarían favoreciendo
el entrecruzamiento proteico, haciendo a las películas más resistentes, pero sin modificar su permeabilidad al
vapor de agua.
Respuesta de las películas a cambios de pH
En la Figuras 3, 4 y 5 se muestran fotografías de los materiales proteicos aditivados con los distintos
colorantes (naranja de metilo, rojo neutro y verde de bromocresol respectivamente), y su respuesta frente a
diferentes medios –líquidos, gaseosos y semisólidos– a distintos pHs –ácido, neutro y alcalino–.
Las películas de gelatina con NM (Figura 3) modificaron su coloración al estar en contacto con líquidos
ácidos y alcalinos. Por ejemplo, las películas con NM obtenidas a pH 6 resultaron inicialmente amarillas,
mientras que al agregar HCl o NaOH se tornaron naranjas o violetas respectivamente. El mismo
comportamiento se observó cuando se expusieron los materiales a atmósferas gaseosas ácidas o alcalinas.
Cabe destacar que la atmósfera ácida producida por ácido acético no modificó la coloración de la película
amarilla (a pH 6), tornó amarilla a la película violeta (a pH 11), pero no llegó al color naranja característico
del NM en pH ácido. Esto se podría atribuir a que el pKa del ácido acético (pKa~4.8) es mayor que el pH de
viraje del NM a su forma ácida (pH<4). Asimismo, cuando las películas se pusieron en contacto con geles de
diferentes pHs, su color se modificó, excepto para las películas a pH neutro en contacto con un gel de pH:
2.5. Por otro lado, y como era de esperar, se observó que si no hay cambios de pH entre el medio y la
película, éstas no modificaron su coloración.
Película Control
Con naranja de
metilo
pH=2
pH=6
pH=11
Respuesta frente al
agregado de una gota de
medio ácido (HCl 2N)
Respuesta frente al agregado
de una gota de medio
alcalino (NaOH 2N)
Respuesta frente a vapores
de ácido acético
Respuesta frente a
vapores de amoníaco
Respuesta frente a
un gel de pH: 5.2
Respuesta frente a Respuesta frente a
un gel de pH: 2.5
un gel de pH: 2.5
Figura 3: Películas de gelatina aditivadas con naranja de metilo (NM) y sus respuestas frente a medios
líquidos, gaseosos y semisólidos a distintos pHs.
En las películas con el agregado de RN (Figura 4) todos los materiales proteicos modificaron su coloración al
agregar una gota de ácido o de álcali, mostrando la respuesta al cambio de pH, al igual que cuando se las
sometió a atmósferas gaseosas ácidas o alcalinas. Sin embargo, cuando se simuló el contacto de la película
proteica con alimentos semisólidos el cambio de coloración resultó menos evidente. La cinética de viraje del
indicador al estar en contacto con un gel a distinto pH resultó más lenta que al contactarlo directamente con
líquidos o gases ácidos o alcalinos.
118
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pH=2
pH=6
pH=11
Película Control
Con rojo neutro
Respuesta frente al
agregado de una gota de
medio ácido (HCl 2N)
Respuesta frente al
agregado de una gota de
medio alcalino (NaOH 2N)
Respuesta frente a
vapores de ácido acético
Respuesta frente a
vapores de amoníaco
Respuesta frente a
un gel de pH: 11
Respuesta frente a Respuesta frente a
un gel de pH: 11
un gel de pH: 5.2
Figura 4: Películas de gelatina aditivadas con rojo neutro (RN) y sus respuestas frente a medios líquidos,
gaseosos y semisólidos a distintos pHs.
Cuando el colorante adicionado fue VBC (Figura 5) se observó un comportamiento similar a las aditivadas
con RN, para los distintos medios ensayados. Se observaron cambios de coloración al estar en contacto con
medios líquidos y gaseosos, tanto ácidos como alcalinos. Estos cambios de coloración resultaron muy
notorios ya que las películas cambiaron de amarillo a azul o viceversa, lo que facilitaría la detección por
parte del consumidor. Aunque no fue tan pronunciado en los materiales semisólidos como puede observarse
en la figura.
Los cambios de coloración descritos también fueron confirmados mediante medidas colorimétricas (datos no
mostrados).
pH=2
pH=6
Película Control
con verde de
bromocresol
Respuesta frente al
agregado de una gota de
medio ácido (HCl 2N)
Respuesta frente al agregado
de una gota de medio alcalino
(NaOH 2N)
Respuesta frente a vapores
de ácido acético
Respuesta frente a
vapores de amoníaco
Respuesta frente a Respuesta frente a un
un gel de pH: 7.5
gel de pH: 2.5
Figura 5: Películas de gelatina aditivadas con verde de bromocresol (VBC) y sus respuestas frente a medios
líquidos, gaseosos y semisólidos a distintos pHs.
CONCLUSIONES
Se desarrollaron materiales proteicos en base a gelatina capaces de detectar cambios de pH por incorporación
de indicadores ácido-base en su formulación. Todas las películas proteicas aditivadas respondieron,
modificando su coloración al estar en contacto con medios líquidos, gaseosos y semisólidos a diferente pHs.
Estos materiales podrían emplearse como envases o recubrimientos de alimentos y servirían para comunicar
al consumidor, si el producto se encuentra apto para su consumo o no. El agregado de los distintos colorantes
a las formulaciones de películas de gelatina, además de otorgarles a éstas la capacidad de detectar cambios
119
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
de pH modificando su coloración, modificó las propiedades fisicoquímicas de las películas. En particular el
agregado de naranja de metilo pareciera favorecer el entrecruzamiento proteico aumentando la resistencia
mecánica y disminuyendo la solubilidad en agua de las películas, sin impedir la respuesta de los materiales al
cambio de pH.
BIBLIOGRAFÍA
Ahvenainen R. 2003. Novel food packaging techniques. CRC Press, Boca Raton. USA.
Andreuccetti C, Carvalho R, Galicia-García T, Martinez-Bustos F. 2011. Journal of Food Engineering, 103,
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Bourtoom T. 2008. International Food Research Journal, 15: 237-248.
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Dainelli D, Gotard N, Spyropoulos D, Zondervan-van den Beuken E, Tobback P. 2008. Trends in Food
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Tongnuanchan P, Benjakul S, Prodpran T. 2012. Food Chemistry, 134: 1571-1579.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la ANPCyT (PICT-2010-1837) y a la UNLP (11-X618) por el financiamiento
otorgado para la realización del presente trabajo.
120
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Caracterización reológica de queso Mozzarella a través de la viscosidad compleja
de sus estados sólido y fundido
Olivares M.L., Rubiolo A.C., Zorrilla S.E.
Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química (UNL-CONICET), Santa Fe, Argentina.
olivares@santafe-conicet.gov.ar
Resumen: Las propiedades funcionales más importantes del queso Mozzarella están relacionadas con la
reología de los estados sólido y fundido. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto del
envasado en atmósferas protectoras sobre las características reológicas de queso Mozzarella feteado. Se
obtuvieron fetas que se envasaron al vacío (EV) y usando una mezcla de 50% de CO2 y 50% de N2 (EG).
Se realizaron barridos de temperatura de 20 a 60°C y se analizó la influencia de la temperatura sobre la
viscosidad compleja a través de una ecuación del tipo Arrhenius. Se obtuvieron valores de energía de
activación (Ea) en una región de comportamiento sólido (20 - 40°C) y en una región de comportamiento
líquido (40 - 60°C). Se observaron comportamientos reológicos diferentes en ambos rangos de temperatura.
Asimismo, se observó que la viscosidad compleja cambia más rápidamente a mayores tiempos de
almacenamiento cuando se utilizó el método EG. Se podría inferir que la compresión inducida por el método
EV modifica características microestructurales, tales como el arreglo de la matriz proteica, el tamaño o la
forma de los glóbulos de grasa o la distribución del agua.
Palabras clave: queso Mozzarella, atmósferas protectoras, reología
Abstract: The most important functional properties of Mozzarella cheese are related to the rheology of the
solid and melted states. Therefore, the aim of this work was to study the effect of protective atmospheres on
rheological characteristics of sliced Mozzarella cheese. Slices were obtained and packaged under vacuum
(EV) and under a mixture of equal parts of CO2 and N2 (EG). Temperature sweep tests were carried out from
20 to 60°C and the influence of temperature on complex viscosity was analysed by an Arrhenius-type
equation. Activation energy values were obtained from a solid-like region (20 - 40°C) and a liquid-like
region (40 - 60°C). Different rheological behaviours were observed in both temperature ranges. In addition,
it was observed that complex viscosity changes faster at larger storage times and when the storage method
EG was applied. It may be inferred that the compression induced by the storage method EV modifies cheese
microstructural characteristics, such as, the arrangement of protein matrix, size and shape of fat globules or
water distribution.
Keywords: Mozzarella cheese, protective atmospheres, rheology
INTRODUCCIÓN
Desde el punto de vista reológico, el queso se puede clasificar como un sistema multifásico que exhibe un
comportamiento viscoelástico que cambia gradualmente desde un estado principalmente sólido hacia un
estado líquido a medida que se calienta. En el caso particular del queso Mozzarella, sus propiedades
funcionales más importantes están relacionadas con la reología de los estados sólido y fundido. En este
sentido, los ensayos reológicos pueden ser utilizados como herramientas para el control de calidad y para
detectar cambios microestructurales provocados por la aplicación de métodos de conservación que pueden
afectar las propiedades funcionales deseables en este tipo de queso.
El envasado en atmósferas protectoras (EAP) aumenta la vida comercial de los quesos debido a que se
combina convenientemente la protección contra la oxidación y la deshidratación con la inhibición de
microorganismos indeseables. En estas tecnologías se usan films con baja permeabilidad al oxígeno y al
vapor de agua y medios gaseosos modificados. El envasado del producto también puede ser al vacío aunque
no es adecuado para productos frágiles tales como los quesos feteados (García Iglesias et al. 2006). Por otro
lado, las atmósferas que contienen CO2 y N2 han sido efectivas para inhibir el crecimiento de
microorganismos indeseables.
A pesar de que las tecnologías EAP se utilizan cada vez más para el envasado de queso Mozzarella, se
encuentran pocos trabajos científicos donde se evalúen las condiciones óptimas de envasado y los efectos
sobre las características microestructurales del queso (Eliot et al. 1998). Más aún, no se han encontrado
121
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
trabajos que evalúen el efecto de la aplicación de EAP sobre la capacidad de fundido. Por lo tanto, el
objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto del EAP sobre las características reológicas de queso
Mozzarella feteado en sus estados sólido y fundido.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de las muestras
Se usaron 7 barras de queso Mozzarella recién elaboradas (281010 cm3), las cuales se almacenaron a 4°C
durante 15 días. Luego, se obtuvieron fetas de 2 mm de espesor que se envasaron en bolsas de policloruro de
vinilideno marca Cryovac con permeabilidad al oxígeno 10-18 cm3 m-2 día-1 bar-1 (23°C, 0% HR) y
velocidad de transmisión de vapor de agua de 7.5 g día-1 m-2 (38°C, 100% HR). Se evaluaron dos métodos de
envasado: envasado al vacío (EV) y envasado con una mezcla de 50% de CO2 y 50% de N2 (EG). Los gases
usados fueron mezclas industriales provistas por Praxair Argentina S.R.L. Para cada tratamiento, se
obtuvieron 60 bolsas con 10 fetas cada una, las cuales se almacenaron a 4°C durante 8 semanas.
Ensayos reométricos
Muestras obtenidas a 8, 15, 29, 43 y 57 días de almacenamiento fueron utilizadas para los ensayos
reométricos. Estos ensayos se realizaron usando un reómetro Haake RheoStress RS80 (Haake Instrument
Inc., Paramus, NJ, U.S.A.) con geometría de platos paralelos (35 mm de diámetro y 2 mm de separación).
Para evitar el resbalamiento de la muestra se colocó papel de lija en el plato superior. Se realizaron barridos
de temperatura de 20 a 60°C (1.33 °C min-1) a una amplitud de deformación de 0.01 y una frecuencia de 1
Hz. La región viscoelástica lineal se determinó realizando barridos de deformación de 0.001 a 0.1 a 20 y
60°C, para todos los tiempos de maduración analizados.
Los valores obtenidos en estado dinámico incluyen los dos componentes del módulo complejo (G*): el
módulo de almacenamiento (G’), el cual es una medida de la energía recuperada y almacenada por ciclo de
deformación (componente elástica) y el módulo de pérdida (G’’), el cual contiene la información referida a la
energía disipada o pérdida por ciclo de deformación (componente viscosa) (Gunasekaran y Ak 2003). Estos
parámetros están relacionados de la siguiente forma:
G *   G '   G ''
2
2
2
Se analizó el efecto de la temperatura en la viscosidad compleja (  *  G *  ,
(1)
 es la frecuencia de
oscilación) mediante una ecuación del tipo Arrhenius:
 *  AVISC exp  Ea RT 
(2)
donde AVISC es un factor pre-exponencial, Ea es la energía de activación (cal mol-1), R es la constante de los
gases (1.9872 cal mol-1 K-1) y T es la temperatura (K) (Rao 1999, Tunick 2000, 2010).
Análisis estadístico
Se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa Statgraphics (Statgraphics Inc.,
Rockville, MD, U.S.A.). Cuando se detectaron diferencias significativas entre tratamientos (P < 0.05), se
realizó una comparación múltiple de medias.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A través de los barridos de temperatura, se analizó la influencia de ésta sobre las propiedades reológicas del
queso Mozzarella. Los cambios de G’ y G’’ con la temperatura se muestran en la Figura 1 donde se observa
la transición desde el estado sólido hacia el estado fundido. Por debajo de los 40°C, el material se comporta
como un sólido elástico, presentado valores de G’ mayores a los de G’’. A medida que la temperatura
aumenta, el queso comienza a fundir y a experimentar cambios estructurales. Estos cambios incluyen la
transición de la grasa desde el estado sólido al estado líquido y el aumento de la movilidad de la fase proteica
(Muliawan y Hatzikiriakos 2007). En efecto, la temperatura a la cual se produce el cruce de los módulos (G’
= G’’) indica el comienzo del fundido del queso. Luego, los valores de G’’ comienzan a superar a los de G’
mostrando un comportamiento similar al de un fluido viscoso (Gunasekaran y Ak 2003). Estos resultados
coinciden con los reportados en la literatura para este tipo de material (Gunasekaran y Ak 2003). Además, en
122
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
G', G'' (Pa)
estos sistemas, el agua actúa como plastificante y modifica algunas propiedades de los polímeros
alimenticios presentes (Gunasekaran y Ak 2003). Cuanto más hidratada está la estructura de las proteínas
éstas pueden deslizarse más fácilmente unas sobre otras, favoreciendo la capacidad de fundido.
10000
1000
20
30
40
50
60
Temperatura (°C)
Figura 1: Barrido de temperatura característico de una muestra de queso Mozzarella almacenada al vacío
durante 29 días. (■) G’, (○) G’’.
Asimismo se obtuvo información microestructural a través de los barridos de temperatura analizando la
energía de activación (Ea) estimada con la ecuación (2). Es relevante mencionar que para el caso de los
quesos, Ea no tiene el significado típico de barrera energética que se debe superar para vencer la resistencia
al flujo. En los quesos, Ea cuantifica cuán rápido se degrada la estructura a medida que éste se calienta
(Tunick 2010). Por lo tanto, los valores de Ea pueden proveer mayor información referente al efecto del
tiempo de almacenamiento y el tipo de envasado sobre los cambios que ocurren en la matriz de queso con el
calentamiento.
Teniendo en cuenta que la grasa es el único sólido presente en el queso que verdaderamente funde alrededor
de 40°C, se puede inferir que por encima de esta temperatura el material es estructuralmente diferente
(Muliawan y Hatzikiriakos 2007). Por lo tanto, los datos de viscosidad compleja adquiridos se dividieron en
dos rangos de temperatura y se obtuvieron valores de Ea de la región de comportamiento sólido (20 - 40°C)
y de la región de comportamiento líquido (40 - 60°C). La Figura 2 muestra claramente las diferencias de
comportamiento reológico del queso en ambos rangos de temperatura.
Los valores de Ea para las diferentes condiciones estudiadas se listan en la Tabla 1. Se observó que los
valores obtenidos en la región de comportamiento sólido son mayores a los obtenidos de la región de
comportamiento líquido. Esto indica un cambio más rápido de la viscosidad compleja con la temperatura en
el rango de 20 - 40°C (Steffe 1996). El ANOVA indicó que los factores principales tiempo de
almacenamiento y método de envasado tuvieron efecto significativo en los valores de Ea obtenidos en ambos
rangos de temperatura. En el rango de 20 - 40°C, Ea aumentó con el tiempo de almacenamiento, mientras
que se obtuvieron valores mayores en las muestras EV. En el rango de 40 - 60°C, Ea aumentó con el tiempo
de almacenamiento pero este comportamiento no fue claramente observado en las muestras EG.
123
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
9
ln *
8
7
6
0.0030 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034
1/T (K-1)
Figura 2: Valores de viscosidad compleja característicos en función de la inversa de la temperatura absoluta
de una muestra de queso Mozzarella almacenada al vacío durante 8 días.
(□) intervalo de 20 - 40°C, (○) intervalo de 40 - 60°C.
Tabla 1: Valores promedio de energía de activación correspondientes a las muestras de queso Mozzarella
estudiadas.*
Método de
envasado
EV
Tiempo de
almacenamiento
(días)
8
15
29
43
57
Ea (Kcal mol-1)
Rango: 20 - 40°C
Ea (Kcal mol-1)
Rango: 40 - 60°C
18.9a
20.7bc
21.7cde
21.9de
22.5e
11.6c
10.4b
9.9ab
13.5d
13.7d
8
18.6a
11.6c
b
15
20.0
10.9bc
29
20.2b
9.0a
bcd
43
20.9
10.0ab
de
57
21.9
11.5c
* Los valores promedio con letras diferentes en una columna indican diferencias significativas (P < 0.05).
EG
A través del estudio de Ea se observó que la matriz de queso se degradó más rápidamente con el
calentamiento a mayores tiempos de almacenamiento y cuando se usó el método EV. Sin embargo, la
degradación de la matriz del queso fue menos perceptible en el rango de comportamiento líquido. Por lo
tanto, el rango de temperatura seleccionado para la evaluación de Ea resulta crítico para detectar cambios
microestructurales ocurridos en el queso. Se podría inferir que la compresión inducida por el método EV
modifica características microestructurales, tales como el arreglo de la matriz proteica, el tamaño o la forma
de los glóbulos de grasa o la distribución del agua (Olivares et al. 2012). Estos resultados también muestran
que los valores de Ea obtenidos a partir de datos de viscosidad compleja son capaces de detectar cambios
microestructurales que pueden afectar algunas propiedades funcionales del queso Mozzarella.
124
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
CONCLUSIONES
Se concluye que ambos métodos de envasado resultaron efectivos para mantener las propiedades reológicas
adecuadas para el queso Mozzarella durante el período de almacenamiento estudiado, aunque se observó un
comportamiento reológico diferente debido al método de envasado, el cual se podría asociar a diferencias en
las características microestructurales del material.
Estos resultados muestran además la sensibilidad que presentan los ensayos reométricos para detectar
cambios microestructurales capaces de influir en forma significativa sobre las propiedades funcionales del
queso Mozzarella.
BIBLIOGRAFÍA
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AGRADECIMIENTOS
Este estudio fue financiado por la Universidad Nacional del Litoral, el CONICET y la ANPCyT. Los autores
agradecen a Sancor Cooperativas Unidas Ltda. por el suministro de los quesos y a la empresa Sealed Air Argentina por el suministro de los envases.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Biodisponibilidad de nisina y natamicina en películas de almidón de mandioca y su efecto sobre las
propiedades físicas
Ollé Resa, C. P.1, 2; Jagus, R. J.2; Gerschenson, L. N.3
1- Becaria de ANPCyT.
2- Laboratorio de Microbiología Industrial: Tecnología de Alimentos, Departamento de Ingeniería Química,
FI, UBA.
3- Departamento de Industrias, FCEN, UBA; Miembro de la Carrera del Investigador CONICET. Pabellón
de Industrias, Ciudad Universitaria, (1428) Buenos Aires, Argentina.
carolinaolle@gmail.com
Resumen: Las películas comestibles pueden soportar antimicrobianos, contribuyendo a su concentración en
superficie y/o a su liberación controlada, pudiendo ser útiles para la protección microbiológica de alimentos.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la biodisponibilidad de natamicina y nisina incluidas
simultáneamente en películas comestibles constituidas en base a almidón de mandioca y plastificadas con
glicerol, frente a Saccharomyces cerevisiae y Listeria innocua (cultivos simples o mixtos) mediante ensayos
de difusión, y el efecto que producen estos antimicrobianos sobre el color y la solubilidad de las películas.
Palabras clave: natamicina, nisina, películas comestibles, almidón de mandioca.
Abstract: Edible films can support antimicrobial additives for the purpose of surface concentration and/or
controlled release, being useful for the safety of food products.
The objective of the present research was the study of the biodisponibility of natamycin and nisin supported
on edible films based on tapioca starch and plasticized with glycerol, in relation to the growth of
Saccharomyces cerevisiae and Listeria innocua (simple or mixed cultures) using diffusion assays and the
effect of these antimicrobials on the color and solubility of the films.
Keywords: natamycin, nisin, edible films, tapioca starch
INTRODUCCION
El principal objetivo del procesamiento de alimentos es proveer bienestar al ser humano por medio de
alimentos seguros, nutricionalmente adecuados, cubriendo las expectativas de sabor, aroma, apariencia y
accesibilidad. Para mejorar la estabilidad microbiana de la superficie de alimentos mínimamente procesados
actualmente se encuentran en estudio una amplia variedad de antimicrobianos naturales (Gould 1997) en
reemplazo de químicos sintéticos.
La natamicina, también conocida como pimaricina, es un macrólido polieno producido por Streptomyces
natalensis. Se utiliza ampliamente en la industria alimentaria para prevenir la contaminación por hongos y
levaduras de la superficie de quesos y otros alimentos no estériles ( Reps et al. 2002; Gallo y Jagus 2006; ElDiasty et al. 2008). Ha sido aprobado como aditivo alimentario en más de 40 países y es considerado GRAS
(generalmente reconocido como seguro) por la Food and Drug Admisnistration, FDA (Koontz et al. 2003).
También está aprobado como conservante natural en la Unión Europea (CEE N° 235). La natamicina actúa
uniéndose a los esteroles de la membrana micótica, principalmente al ergosterol, siendo de esta forma activo
únicamente frente a hongos (te Welscher et al. 2008, 2010).
La nisina es un polipéptido producido por cepas de Lactococcus lactis ssp. Lactis. Exhibe actividad
antimicrobiana contra un amplio rango de bacterias gram positivas asociadas a los alimentos y es
particularmente efectiva contra esporas resistentes a las altas temperaturas (Delves-Broughton et al. 1996;
Moll et al. 1997). Dentro de las bacteriocinas, la nisina está descripta como miembro de la Clase IA, el grupo
que contiene a los lantibióticos (Klaenhammer 1993). Los lantibióticos de tipo A, como la nisina, son
moléculas flexibles, elongadas y anfipáticas que actúan básicamente mediante la formación de poros en la
membrana citoplasmática de las bacterias (Brotz y Sahl 2000). Se ha permitido su utilización en más de 50
países como preservante en distintos tipos de alimentos. Fue reconocido como preservante biológico seguro
y legal en 1969 por el Comité Experto de Aditivos de Alimentos de FAO / WHO (Thomas et al. 2000). En
1988 fue aprobada como aditivo de alimentos por la FDA, y aceptada como un compuesto GRAS.
126
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Las películas comestibles pueden soportar antimicrobianos, contribuyendo a su concentración en superficie
y/o a su liberación controlada, pudiendo ser útiles para la protección microbiológica de los alimentos.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la biodisponibilidad de natamicina y nisina incluidas
simultáneamente o por separado en películas comestibles constituidas en base a almidón de mandioca y
plastificadas con glicerol, frente a Saccharomyces cerevisiae y Listeria innocua (cultivos simples o mixtos) y
el efecto que producen estos antimicrobianos sobre el color y la solubilidad de las películas.
MATERIALES Y METODOS
Materiales
Se utilizó almidón de mandioca (Industrias del Maíz SA, Argentina) y glicerol (Mallickrodt, Argentina). Los
antimicrobianos natamicina comercial (Delvocid®) conteniendo 50% p/p de NaCl y 50% p/p de natamicina
y nisina comercial (Nisin®) conteniendo 97.5% p/p de NaCl y 2.5% p/p de Nisina, fueron donados por
DSM (The Netherlands), filial Argentina.
Preparación del pelicula
Se prepararon mezclas de almidón, glicerol y agua (1.8:1:32.5, en peso) (C) o de almidón, glicerol, agua y
natamicina (NA) o de almidón glicerol, agua, natamicina y nisina (NANI). En las dos últimas formulaciones,
se reemplazaron 10 ml de agua por una suspensión de natamicina en el primer caso y de natamicina y nisina
en el segundo caso, de una concentración tal que las películas contenían 9,25mg natamicina/dm2 (NA) y
9,25mg de natamicina/dm2 y 2,31mg de nisina/dm2 (NANI).
La gelatinización del almidón se realizó a velocidad constante de 1,5°C/min, aproximadamente, hasta
alcanzar una temperatura final de 82C. Se aplicó vacío para eliminar el aire ocluido en el gel. La suspensión
se dispensó en alícuotas de 12 g en placas de 7cm de diámetro. El secado de las películas se realizó a 37C
durante 24 horas en una cámara con convección. Una vez constituidas, las películas se separaron de las
placas y se equilibraron a 28C sobre solución saturada de NaBr (actividad de agua, aw0.575) durante
aproximadamente 7 días.
Solubilidad en agua
La solubilidad se define como el porcentaje de materia seca de película solubilizada después de 24 horas de
inmersión en agua destilada (Gontard et al. 1992). El porcentaje inicial de la materia seca se determinó
mediante el secado de discos de 2 cm de diámetro a 100ºC durante 24 horas y al vacío. Se cortaron discos
adicionales, se pesaron y sumergieron en 50 ml de agua destilada, con agitación, durante 24 horas a 25 °C.
Las películas no solubilizadas fueron sacadas y secadas en las condiciones previamente descriptas para
determinar la materia seca remanente. La solubilidad se reporta como la diferencia entre la materia seca
inicial y final con respecto a la materia seca inicial. La determinación se realizó por duplicado.
Evaluación del Color
Las mediciones de color en cada película evaluada se realizaron con un colorímetro Minolta (Minolta CM508d, Tokio, Japón) utilizando una abertura de 1,5 cm de diámetro. Discos de películas de diámetro
adecuado se apoyaron sobre un fondo blanco estándar (Trezza y Krochta 2000). El área expuesta era lo
suficientemente grande con respecto a la zona iluminada como para evitar cualquier efecto de captura de luz.
Se midieron los parámetros CIELab: L*, a* b*, y el índice de amarillo (YI) de acuerdo con el método de
ensayo estándar (ASTM D1925, 1995), en al menos cuatro posiciones seleccionadas al azar para cada
muestra. Los parámetros de color oscilan de L* = 0 (negro) a L* = 100 (blanco),-a* (verde) a +a* (rojo), y –
b* (azul) a +b* (amarillo). Los valores estándar considerados fueron los del fondo blanco. Los cálculos se
hicieron para el iluminante D-65 y con un observador a 2°.
Se evaluó la diferencia total de color (∆E) (Hill et al. 1997) en las muestras tratadas con respecto al control
(C) utilizando la siguiente ecuación:
∆E = [(∆L*)2 + (∆a*)2 + (Δb *)2]1/2
Siendo:
∆L* = L* - L0*
∆a* = a* - a0*
∆b* = b* - b0*
donde L0*, a0* y b0* corresponden a los valores evaluados en el control C (película sin antimicrobiano) y L*,
a* y b* corresponden a los valores de la muestra analizada.
127
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Cepas y condiciones de crecimiento
Saccharomyces cerevisiae (CBS 1171, cepa de colección SC) se cultivó en 150 ml de caldo Sabouraud
enriquecido con 6 g/l de extracto de levadura (Biokart, Francia) en continua agitación a temperatura
controlada de 28°C hasta que se alcanzó la fase estacionaria temprana. Listeria innocua (CIP 80.11) se
cultivó en 150 ml de caldo triptona soja (TSBYE, Diagnóstico Biokar, Francia), en continua agitación a
temperatura controlada de 28°C durante la noche. Posteriormente, 2 ml de este cultivo fueron inoculados en
caldo TSBYE fresco y agitado durante aproximadamente 1h hasta alcanzar la concentración de células
buscada.
Para la preparación del cultivo mixto, cada uno de los microorganismos fue cultivado en su respectivo caldo
hasta lograr la densidad poblacional deseada. Posteriormente, alícuotas de 30 ml de los cultivos fueron
centrifugadas a 10.000 rpm y el pellet de células fue resuspendido en el mismo volumen de caldo TSYE.
Método de difusión en agar
El ensayo de difusión en agar se utilizó para determinar la biodisponibilidad de los antimicrobianos
contenidos en las películas sobre S.cerevisiae y L.innocua. Brevemente, 100μl del inóculo que contenía
1x106 UFC/ml de cada microorganismo, preparado de acuerdo a lo descripto en el ítem anterior, se
extendieron sobre la superficie de placas de Petri conteniendo agar YGC, TSYE (Diagnóstico Biokar,
Francia) y TSYEC (TSYE conteniendo cicloheximida, Sigma-Aldrich). Se colocaron discos de película (7
mm de diámetro) C, NA y NANI, sobre las placas previamente inoculadas.
Las placas se pre-incubaron a 4 °C durante 48 horas y posteriormente se incubaron a 28°C durante 72 horas
(Hanušová et al. 2010). La actividad inhibitoria se cuantificó midiendo el diámetro total (disco más zona de
inhibición).
Análisis estadístico de los datos
Los datos fueron analizados a través de un análisis de varianza de dos factores con : 0,05 y se aplicó como
prueba post-hoc el test de Tukey. Los resultados se presentan en función de su media y desviación estándar
(Sokal y Rohlf 2000). Se utilizó el software GraphPad Prism ®, versión 5.01 (GraphPad Software, Inc., CA,
USA) para el tratamiento y análisis de datos.
RESULTADOS Y DISCUSION
Los resultados obtenidos mostraron que el agregado de natamicina a la película no modificó en forma
marcada la solubilidad de la misma. Por el contrario, la presencia de nisina, aumentó significativamente (α:
0,05) este valor (Figura 1).
Basch et al. (2012) evaluaron películas elaboradas a partir de almidón de mandioca adicionadas con
hidroxipropilmetilcelulosa, conteniendo sorbato de potasio y nisina. Estos investigadores observaron que la
presencia de estos antimicrobianos aumentaba la solubilidad de la matriz y sugirieron que este efecto puede
ser atribuido a la disrupción de la matriz polisacárida provocada por los antimicrobianos. En este sentido
Flores et al. (2010) informaron que el agregado de estos antimicrobianos en las películas causa un
incremento de la región amorfa, aumentando la interacción con el agua, lo cual podría incrementar la
solubilidad y reducir la integridad de las películas en contacto con el solvente.
60
C
N
NN
% Solubilidad
50
40
30
20
10
0
Figura 1: Solubilidad de las películas con y sin antimicrobianos. C: Control, NA: natamicina y NANI:
natamicina+nisina.
La Figura 2 muestra los parámetros de color para las películas estudiadas. Se pudo observar que las tres
películas presentaron valores de a* negativo y valores de b* positivos, lo que indica un color verde-amarillo
de las mismas. Las diferencias en los parámetros evaluados fueron muy pequeñas entre la película
128
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
conteniendo natamicina y la película control, mostrando la primera, mayores valores de L*, b* y YI y menor
valor de a*. Sin embargo, la presencia de nisina afectó los parámetros de color, disminuyendo la luminosidad
e incrementándose el color amarillo respecto a la película con natamicina (aumento de b* y del índice de
amarillo, YI). Estas películas fueron las que mostraron una mayor diferencia de color (ΔE) en relación a las
películas control. Flores et al. (2010) reportaron que la adición de nisina a películas fabricadas en base a
almidón de mandioca, producía un incremento del valor de b* de 4 a 12 unidades y una disminución del
valor de L* desde 86 a 79.
0.0
90
a*
L*
-0.5
85
-1.0
-1.5
80
-2.0
30
10
20
b*
YI
15
5
10
0
0
15
C
NA
NANI
AE
10
5
0
Figura 2: Parámetros de color de las películas con y sin antimicrobianos.C: Control, NA: natamicina y
NANI: natamicina+nisina.
A través del ensayo de difusión en agar se pudo cuantificar la actividad antimicrobiana de las películas
frente a poblaciones microbianas individuales y mixtas. La película C no mostró actividad inhibitoria hacia
ninguno de los dos microorganismos evaluados. Por el contrario, las películas NA y NANI presentaron
distinto grado de actividad antimicrobiana. Los antimicrobianos contenidos en las películas se liberaron a
distinta velocidad, difundiendo a través del agar, y generando la formación de halos de inhibición de
dimensiones significativas (Tabla 1).
La natamicina contenida en las películas y liberada hacia el agar (película NA) fue efectiva para inhibir el
desarrollo de S. cereviseae, independientemente de la presencia de L. innocua, ya que el halo en el cultivo
simple no presentó diferencias significativas con el observado en el cultivo mixto. Es de destacar que en el
medio TSYE para el cultivo mixto, por debajo del halo de inhibición de la levadura se observó el crecimiento
de bacterias (Figura 3a), ya que estas no fueron inhibidas por la natamicina liberada al medio.
Sin embargo, L. innocua tampoco pudo crecer en el medio YGC debido a que su composición restringió el
crecimiento. Por otra parte, en los medios TSYE y TSYEC, se observó un crecimiento sin restricciones de L.
innocua. Este comportamiento fue análogo al observado en cultivo mixto.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tabla 1: Ensayo de difusión. Diámetro de los halos de inhibición (cm) en cultivos simples y mixtos
generados a partir de películas conteniendo natamicina (NA) o natamicina y nisina (NANI).
Película NA sobre distintos medios
Microorganismos en
YGC
TSYE
TSYEC
el cultivo
L. innocua
S/C
S/H
S/H
3,15
± 2,95
±
S. cereviseae
S/C
0,07
0,07
Mixto (S. cereviseae 3,25
y L. innocua)
0,07
± 3,15
0,07
±
S/H
Película NANI sobre distintos medios
YGC
TSYE
TSYEC
S/C
2,85
0,07
1,85 ± 0,07
1,85 ± 0,07
2,95 ± 0,07
S/C
3 ± 0,07
±
Doble halo:
3,05 ± 0,07 y 2,25 ± 0,40
1,85 ± 0,07
S/C: sin crecimiento; S/H: sin halo.
Por otra parte, al evaluar la actividad de la película NANI se observaron halos de inhibición de 3 cm de
diámetro, aproximadamente, cuando se enfrentaron a un césped de S. cereviseae en medio YGC y TSYE,
siendo estos diámetros análogos a los observados en película NA.
La nisina contenida en las películas NANI fue efectiva para la inhibición de L. innocua mostrando un halo de
1,85 cm en los medios TSYE y TSYEC. En presencia de un cultivo mixto, el halo observado fue función de
los medios de cultivo en los que se realizó el césped. En medio YGC el halo correspondió a S. cereviseae y
mostró valores semejantes a los observados con la película NA. En el medio TSYE C (medio restrictivo para
levadura) se observó únicamente el halo de inhibición correspondiente a la actividad de la nisina liberada
desde la película sobre L. innocua.
Cuando la película NANI se enfrentó a un cultivo mixto en medio TSYE (sin restricciones para el
crecimiento de ambos microorganismos), se observan dos halos (Figura 3b). El más pequeño correspondió a
la inhibición del desarrollo de L. innocua por la presencia de nisina, y su diámetro fue similar al observado
cuando se evaluó el desarrollo de esta bacteria en forma individual. A su vez, el segundo halo correspondió
al producido por la inhibición del crecimiento de S. cereviseae debida a la presencia de natamicina. También
en este caso, el diámetro del halo fue comparable al observado en el cultivo individual.
a
b
Figura 3: Ensayo de difusión: halos de inhibición observados a partir de un cultivo mixto (S. cereviseae + L.
innocua) desarrollado en medio TSYE. a: película NA; b: película NANI.
Por todo lo antedicho, se puede concluir que la presencia de nisina en la película no afectó la
biodisponibilidad de la natamicina.
Pintado et al. (2010) estudiaron películas de aislado proteico de suero con natamicina y nisina, solos o
combinados y en presencia de ácido málico. Dichos autores observaron la formación de halos de tamaño
semejante a los obtenidos en el presente trabajo e informaron que no existían diferencias entre las zonas de
inhibición obtenidas con nisina sola o en combinación con natamicina contra las bacterias testeadas, y
tampoco entre las zonas de inhibición obtenidas con natamicina sola o en combinación con nisina contra las
levaduras testeadas.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos indicaron que la presencia de nisina en las películas combinadas (NANI) afectó el
color y la solubilidad de las mismas. La presencia conjunta de natamicina y nisina en las películas
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
comestibles no afectó la biodisponibilidad de la natamicina en el control de crecimiento de la levadura y
permitió contar con una matriz con un rango ampliado de actividad antimicrobiana, que pudo inhibir también
el crecimiento de L. innocua, tanto en el caso de cultivo simple como mixto.
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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo económico de: Universidad de Buenos Aires, Agencia Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas y CONICET.
131
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
132
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Evaluación de la capacidad de barrera antioxidante de películas comestibles de pectina a través de
espectroscopia de fluorescencia. Cuantificación de tocoferoles.
Pérez C.D.1, 3, De’Nobili M.D.2, 3, Rizzo S.A.1, Rossetti L.1, Descalzo A.M.1, Rojas A.M.2, 3
1: Instituto de Tecnología de Alimentos (ITA), INTA Castelar, Buenos Aires, Argentina
2: Departamento de Industrias, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Ciudad Universitaria, CABA,
Argentina
3: CONICET
cperez@cnia.inta.gov.ar
Resumen: Una película comestible (PC) de pectina de alto metoxilo (HMP) portadora de ácido L-(+)ascórbico (AA), plastificada con glicerol, fue evaluada frente a un sustrato vulnerable a la oxidación como el
aceite de nuez, por almacenamiento durante 50 días a 25°C y a 57% de humedad relativa (HR) constantes, en
ausencia de luz. En estas condiciones de almacenamiento, el tiempo de vida medio (t1/2) del AA en esta
película fue de 83 días, según resultados previos. A partir de los espectros de fluorescencia (pico a 308 nm)
se determinó que, durante los 50 días de almacenamiento, las muestras de aceite de nuez cubiertas con PC
portadora de AA mantuvieron los niveles de tocoferoles significativamente (p < 0.001) por encima tanto de
las muestras cubiertas con PCs elaboradas sin AA como de las muestras control almacenadas sin cubierta de
ningún tipo. Además, se determinó el contenido de tocoferoles por HPLC, en las muestras de aceite
recolectadas durante el almacenamiento del aceite de nuez en las condiciones arriba mencionadas,
encontrándose una correlación significativa (coeficiente de correlación de Pearson r = 0,95; p < 0.05) entre
la intensidad de fluorescencia detectada a 308 nm y el contenido de tocoferoles determinado por HPLC.
Palabras clave: películas comestibles, pectina, ácido L-(+)-ascórbico, tocoferoles, espectroscopía de
fluorescencia.
Abstract: A high methoxyl pectin (HMP) edible film carrying L-(+)-ascorbic acid (AA) and plasticized with
glycerol was evaluated against a vulnerable substrate of oxidative stress like walnut oil, by storage during 50
days in the dark at constant relative humidity (RH, 57%) and temperature (25 ºC). At these storage
conditions, 83 days-half-life time (t1/2) was previously determined for the AA compartmentalized in this
HMP film formulation. From the fluorescence spectra (peak at 308 nm), it was determined that during the 50
days-storage, those walnut oil samples coated with the edible film carrying AA, showed their tocopherol
levels significantly (p<0.001) above those values that were determined in walnut oil samples either coated
with edible films made without AA or uncoated (control) samples. The tocopherol content was also
determined by HPLC in walnut oil samples collected at different times during storage in the same conditions
above mentioned. These values of tocopherol content correlated significantly (Pearson correlation
coefficient r = 0.95; p < 0.05) with the fluorescence intensity observed at 308 nm in the fluorescence spectra.
Keywords: pectin edible films, L-(+)-ascorbic acid, tocopherols, fluorescence spectroscopy.
INTRODUCCION
Las películas comestibles definidas como finas láminas elaboradas con polímeros capaces de proveer fuerza
mecánica a dicha estructura (Han y Gennadios, 2005) han sido aplicadas principalmente como
recubrimientos en frutas y vegetales mínimamente procesados, carnes y derivados, pescados y derivados y
quesos. En particular resulta de gran interés el desarrollo de PCs portadoras de antioxidantes naturales
debido al efecto protectivo que ejercen principalmente contra la acción del oxígeno (Atarés et al., 2011).
Las nueces están recibiendo gran interés como alimento saludable debido a que se ha informado que su
consumo regular disminuye el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Los beneficios saludables son
atribuidos a su composición química ya que son fuente de ácidos grasos esenciales y tocoferoles. El principal
ácido graso es el linoleico n-6 seguido por el oleico n-9 y linolénico n-3. Se ha sugerido que su alto
contenido de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) reduce el riesgo de enfermedades del corazón por
disminución del colesterol total y de la fracción asociada a lipoproteínas de baja densidad (LDL) y aumento
del colesterol asociado a la fracción de lipoproteínas de alta densidad (HDL). Se ha informado que los
alimentos de origen vegetal como las frutas, verduras y semillas son una fuente natural de antioxidantes. Los
133
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antioxidantes poseen un rol importante en la prevención de enfermedades y mantenimiento de la salud. Es
entonces útil también preservar los antioxidantes naturales propios de un producto, en su propia fuente. El
efecto antioxidante demostrado por estos productos proviene de los compuestos fenólicos y de otros
fitoquímicos, los que protegen del peligroso efecto de la excesiva producción de radicales libres (Pereira et
al., 2008).
La principal fuente de vitamina E en la dieta son los aceites vegetales, nueces, cereales, vegetales verdes y
frutas. El isómero γ-tocoferol es el mayor componente de la vitamina E en la dieta occidental y el segundo
tocoferol más común en el suero humano (10 – 20%). Se ha reportado que dicho isómero es el principal
componente en las nueces (Amaral et al., 2005), con lo cual posee actividad antioxidante, principalmente en
la prevención de los procesos de oxidación de los lípidos (Pereira et al., 2008) sin embargo, su alto contenido
de PUFA limita la vida útil debido a que son susceptibles a la oxidación. La oxidación de los lípidos es el
parámetro de calidad más importante dado que reduce el valor económico de las nueces durante el
almacenamiento. El resultado de la oxidación hace que el producto sea inaceptable por el consumidor debido
al gusto rancio indeseable. La concentración de oxígeno es uno de los factores más importantes que afectan
la oxidación, la cual se puede disminuir a través del uso de material de empaque con baja permeabilidad al
oxígeno o por almacenamiento de las nueces en bajo nivel de oxígeno (Bakkalbas et al., 2012).
La espectroscopia de fluorescencia es una de las técnicas más prometedoras y de gran interés para el análisis
de alimentos debido a su selectividad respecto a otras técnicas espectroscópicas, la alta sensibilidad para un
amplio rango de potenciales analitos y, en general, el beneficio de evitar el uso de reactivos y tiempo en el
pre-tratamiento de la muestra (Sikorska et al., 2005).
El aceite de nuez es un ingrediente funcional muy valorado debido a su alto contenido de PUFA. Los
tocoferoles son los antioxidantes naturales del aceite de nuez. La vida útil de los tocoferoles condicionaría la
aparición de los signos tempranos del deterioro oxidativo del aceite. El aceite de nuez obtenido del primer
prensado en frío fue utilizado en el presente trabajo como sustrato vulnerable al estrés oxidativo. El objetivo
del presente trabajo fue evaluar el desempeño como interfase antioxidante de una PC portadora de AA,
desarrollada con HMP y plastificada con glicerol, utilizando aceite de nuez. Se recurrió a la espectroscopia
de fluorescencia sincrónica como técnica de seguimiento de los cambios oxidativos tempranos acontecidos
en el aceite. El componente del aceite que se vió modificado en los espectros de fluorescencia, fue luego
confirmado a través de su detección y cuantificación por una técnica de HPLC.
MATERIALES Y METODOS.
Se utilizó aceite de nuez (IL Noce, Parque Industrial de Escobar, Pcia. de Buenos Aires, Argentina)
obtenido por prensado en frío de la nuez del nogal (Junglans regia L.), cuyos frutos maduros fueron
cosechados durante el período 2009-2010 en la provincia de Catamarca, Argentina.
Las muestras de PC de HMP portadoras de AA y plastificadas con glicerol fueron elaboradas por el método
de casteo según Pérez et al. (2009). De la misma manera se elaboraron muestras de esta PC, pero sin agregar
AA a la formulación. De esta manera se conformaron tres grupos de ensayo simultáneo: 1) “control”; 2) “PC
con AA”; 3) “PC sin AA”. Cada placa contenedora de vidrio de 25 mm de diámetro fue llenada totalmente
con una muestra de aceite y, luego, totalmente cubierta con uno u otro tipo de PC, excepto el grupo “control”
(sin cubrir). Todas las placas fueron almacenadas al resguardo de la luz, y a 57% HR y 25 ºC constantes
durante 50 días. Los experimentos se realizaron por duplicado. Se tomaron muestras en tiempos preestablecidos: 0, 8, 15 y 50 días. Para cada muestra se registraron los espectros de fluorescencia sincrónicos
utilizando un LS 55 fluorescence Spectrometer 230V (Perkin Elmer, Massachusetts, Estados Unidos)
montado con el accesorio front-surface de ángulo variable y cubeta de cuarzo de 10 mm.
Se realizaron las extracciones de vitaminas liposolubles y la saponificación según Buttriss y Diplock (1984)
y el análisis utilizando un sistema de HPLC (Thermo Separation Products, Holanda) equipado con una
bomba cuaternaria (modelo P4000), membrana desgasificadora al vacío y autosampler (AS4000) con un loop
de 100 μL de inyección conectado a una columna C18 Alltima (250 x 4,6 mm) de 5μm de tamaño de
partícula (Alltech). El detector de arreglo de diodo (UV600LP Spectrasystem) se utilizó a 330 nm para la
detección de tocoferoles. La fase móvil consistió en una mezcla isocrática de etanol:metanol 60:40 a 1
mL/min. Las curvas de calibración se realizaron con los estándares (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)
preparados en el momento en etanol absoluto.
134
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
En la Figura 1 se pueden observar, a modo de ejemplo, los espectros de fluorescencia sincrónicos
recolectados al analizar aceite de nuez durante los 50 días de su almacenamiento en la oscuridad a 25°C y
57% de HR, y cubierto con PCs de HMP con AA. Para ello se utilizó primeramente un offset (λ) de
emisión-excitación de 20 nm. El espectro de fluorescencia sincrónico a ∆λ = 20 nm mostró principalmente
dos picos importantes con un máximo a  308 nm y otro menor a  670 nm. Del mismo modo, se observó
dichos máximos en todos los aceites aquí ensayados.
Figura 1: Espectros de fluorescencia sincrónicos obtenidos a ∆λ = 20 nm del aceite de nuez cubierto con
películas de HMP conteniendo ácido L-(+)-ascórbico, recolectados durante los 50 días de almacenamiento a
25°C, en la oscuridad. El sentido de la flecha indica aumento del tiempo de almacenamiento.
En su trabajo previo, realizado sobre el estudio de aceite de oliva virgen durante el almacenamiento bajo
distintas condiciones, Sikorska et al. (2008) también observaron en su espectro de fluorescencia sincrónico
dos picos importantes a  301 nm y  666 nm. Dichos autores informaron que los principales compuestos
fluorescentes identificados del aceite fueron los pertenecientes al grupo de los tocoferoles y clorofilas.
Dentro del grupo de las clorofilas se podrían incluir las clorofilas a y b y las feofitinas a y b. Dichos
pigmentos generalmente se encuentran presentes en los aceites “crudos”, obtenidos directamente por
extracción de las semillas, los cuales son luego removidos durante el procesamiento, por ejemplo, durante la
refinación del aceite. Zandomeneghi et al. (2005) asignaron el pico de las clorofilas a una longitud de onda
de emisión de 675 nm para los espectros de fluorescencia obtenidos de aceite de oliva. Por lo tanto, los picos
con máximos a  308 nm y  670 nm aquí observados podrían ser atribuidos a los tocoferoles y a las
clorofilas, respectivamente.
Por otro lado, no hay evidencia de formación de nuevos compuestos fluorescentes en los espectros
sincrónicos de todos los sistemas aquí ensayados durante los 50 días de almacenamiento a 25°C (Figura 1).
Sikorska et al. (2008) encontraron nuevos picos en sus espectros sincrónicos del aceite almacenado bajo la
luz y tentativamente los asociaron con productos fluorescentes derivados de la foto-descomposición/fotooxidación de las clorofilas u otros pigmentos. Sin embargo, éste no sería el caso del ensayo realizado en el
presente trabajo, ya que el mismo se efectuó al resguardo de la luz. Éste podría ser uno de los posibles
motivos de no haber encontrado diferencias significativas entre los niveles de intensidad de fluorescencia del
pico asignado a las clorofilas dada la falta de descomposición de las mismas. Es sabido que los pigmentos
(clorofilas, riboflavina, porfirinas, etc.) se transforman en pro-oxidantes en presencia de la luz al quenchear
fotones (Pokorný, 2001). Además, la identificación de nuevos picos fluorescentes puede indicar la formación
de otros productos de oxidación. Se ha demostrado que los aceites almacenados al resguardo de la luz
principalmente contienen productos de oxidación primaria, mientras que aquellos que son expuestos a la luz
contienen productos de oxidación secundarios. Estos productos pueden reaccionar con otros componentes del
aceite y formar entonces compuestos fluorescentes (Sikorkska et al., 2008). Los productos primarios
procedentes de la autooxidación son inodoros e insípidos (por ejemplo, los hidroperóxidos del ácido linoleico
e hidroperóxidos en general). La calidad de un alimento comienza a alterarse cuando se producen
compuestos volátiles secundarios a los cuales pertenecen sustancias con gran intensidad aromática,
135
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
característica que, inclusive a las pequeñas concentraciones a las que normalmente se encuentran, modifican
muy fuertemente el olor y el sabor, como por ejemplo, compuestos carbonílicos aromáticos, dialdehído
malónico, alcanos y alquenos (Belitz y Grosch, 1992).
En la Figura 2 se pueden observar los espectros sincrónicos obtenidos a ∆λ=10 nm para las muestras de
aceite de nuez cubiertas con PCs de HMP conteniendo AA. Se encontraron diferencias significativas en la
intensidad de los picos asignados a los tocoferoles ( 308 nm) durante el almacenamiento del aceite. Dichos
espectros presentaron varios picos en la zona atribuida a los tocoferoles y esto puede ser debido,
probablemente, al efecto de la concentración de la muestra ya que no solo estaría presente el pico asignado a
los tocoferoles sino también los picos correspondientes a otros compuestos presentes que también emiten en
este rango de longitud de onda (Sikorska et al., 2005), teniendo así un efecto muy pronunciado la
concentración utilizada para la medición, que en el presente caso fue el aceite puro sin diluir. Cuando se
representan los valores obtenidos para dicho pico ( 308 nm) a partir del espectro sincrónico con ∆λ = 10
nm, es posible observar el efecto de la condición de almacenamiento de los aceites. Como se puede observar
en la Figura 3, las muestras de aceite de nuez que permanecieron cubiertas con PCs de HMP con AA
mantuvieron significativamente (p < 0,001), durante el período de almacenamiento, el nivel de “tocoferoles”
siempre por encima del observado en las muestras cubiertas con PCs de HMP sin AA y en las muestras
“control” (sin película), mostrando así la capacidad protectora de las películas antioxidantes desarrolladas.
Cabe destacar que, en estas condiciones de almacenamiento, el tiempo de vida medio (t1/2) del AA en estas
películas constituidas por HMP fue de 83 días (Pérez et al., 2012), lo cual indica que durante los 50 días de
almacenamiento a 25 ºC del presente trabajo, el nivel de AA no decayó significativamente.
Cuando el AA no estuvo presente en la formulación de las PCs, los niveles de “tocoferoles” del aceite fueron
en general siempre menores al aceite protegido por películas de HMP con AA (p<0,001), aunque más
cercanos (p<0,05) a los valores del control (sin PC). El uso de películas sin AA en el experimento demuestra
la capacidad de barrera al oxígeno de las mismas.
Figura 2. Intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias (UA) a 308 nm ∆λ=10 nm en función de
tiempo de almacenamiento en oscuridad y 57% HR de los aceites de nuez. El sentido de la flecha indica
aumento del tiempo de almacenamiento.
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UA de fluorescencia
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50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (días)
CONTROL
HMP c/AA
HMP s/AA
Figura 3. Intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias (UA) a 308 nm en función de tiempo de
almacenamiento en oscuridad y 57% HR de los aceites de nuez.
Para probar la relación cuantitativa entre la fluorescencia atribuida a los tocoferoles y el contenido real en las
muestras de aceite de nuez se realizó el análisis de correlación (Pearson) entre la intensidad de fluorescencia
a 308 nm y la concentración determinada analíticamente de vitamina E (isómero γ-tocoferol) para todos los
aceites a lo largo del almacenamiento. En la Figura 4 se puede observar el contenido de γ-tocoferol en cada
muestra de aceite de nuez a lo largo del almacenamiento, luego de su extracción y cuantificación por HPLC.
μg γ-tocoferol/g de aceite
800
700
600
500
400
300
200
0
10
20
30
40
50
Tiempo (días)
CONTROL
HMP c/AA
HMP s/AA
Figura 4. Contenido de γ-tocoferol en los aceites de nuez determinado por HPLC en función del tiempo de
almacenamiento en oscuridad y 57% HR.
Se encontró un coeficiente de correlación de Pearson de 0,95 (p< 0.05) lo que indicaría que el pico
observado a partir del espectro de fluorescencia sincrónico utilizando un ∆λ=10 nm a 308 nm puede ser
atribuido a la emisión de los tocoferoles, principalmente γ-tocoferol, isómero mayoritario de la vitamina E
presente en los aceites de nuez. Este resultado muestra que el espectro de fluorescencia sincrónico podría ser
utilizado para cuantificar tocoferoles luego de una apropiada calibración.
CONCLUSIONES.
En el presente trabajo se pudo probar la actividad antioxidante de las PCs de HMP soportando AA. Se
demostró así la utilidad de estas películas como interfases antioxidantes, protegiendo al alimento de la
importante pérdida de vitaminas (tocoferoles) del aceite de nuez gracias a la presencia del AA en la matriz
137
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
polimérica, hecho que fue demostrado debido a que los aceites almacenados con PC pero sin AA en su
formulación, no mantuvieron el nivel de tocoferoles más elevado durante el almacenamiento. De todas
maneras, estas últimas demostraron capacidad de barrera al oxígeno. La presencia del AA retenido en la
película, presente en la interfase película/aceite actuaría evitando la oxidación de los tocoferoles, tal como
ocurre naturalmente con la dupla AA/tocoferol (Miková, 2001).
Por otro lado, se encontró una muy buena correlación entre las técnicas de fluorescencia y de cuantificación
analítica por HPLC utilizadas para la determinación de vitamina E en los aceites. El presente estudio
demuestra el potencial de la espectroscopía de fluorescencia sincrónica en el análisis del aceite de nuez. La
rápida medición de fluorescencia podría utilizarse directamente para el monitoreo y detección temprana de
los procesos oxidativos en el aceite de nuez, que acontecen durante el almacenamiento.
Finalmente la espectroscopia de fluorescencia es una técnica alternativa prometedora, o al menos una técnica
complementaria a los métodos analíticos actuales, utilizada en la evaluación de la calidad del aceite.
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AGRADECIMIENTOS.
Se agradece el apoyo financiero de la Universidad de Buenos Aires, CONICET, ANPCyT e INTA
(PNLEC071021).
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Evaluación de sanitizantes alternativos al hipoclorito de sodio para la desinfección de espinaca:
calidad microbiológica y organoléptica.
Rubinstein A.1, Jagus R.J.1, Agüero M.V.1,2
1: Laboratorio de Microbiología Industrial: Tecnología de Alimentos, Fac. Ingeniería, UBA
2: CONICET.
mvaguero@di.fcen.uba.ar
Resumen: Se estudió el reemplazo del hipoclorito de sodio (H) en la desinfección de espinaca. Se ensayaron
lavados utilizando: agua corriente (A) y soluciones de H (200ppm), ácido cítrico (C, 2%), natamicina (N,
0.2%) y té verde (T, 0.25%). Luego del lavado, las muestras fueron envasadas y almacenadas durante 6 días
a 6-8ºC. Se evaluó la calidad microbiológica (BMA: bacterias mesófilas aerobias; HyL: hongos y levaduras)
y organoléptica (color y textura). La carga microbiana inicial (BMA= 6.39log; HyL= 4.43log) se redujo entre
0.7 y 3 log luego de los lavados, con las mayores reducciones de BMA para H y C, y de HyL para A y H.
Durante el almacenamiento, sólo las muestras lavadas con C mantuvieron bajos los recuentos, pero su
calidad organoléptica presentó un deterioro significativo de la textura (hidrólisis, roturas en el tejido) y del
color (amarillamiento extendido). Finalizado el almacenamiento, los recuentos microbianos de las muestras
lavadas con H resultaron sin diferencias significativas respecto de las lavadas con N, pero estas últimas
tuvieron mayor calidad organoléptica. El reemplazo del H por N permite obtener igual calidad
microbiológica que las muestras lavadas con H pero mejor calidad organoléptica al finalizar el
almacenamiento.
Palabras clave: hortalizas de hoja, calidad microbiológica, calidad organoléptica, antimicrobianos naturales,
desinfección.
Abstract: The replacement of sodium hypochlorite (H) in the disinfection of spinach was studied. Washings
were tested using water supply (A) and solutions of H (200ppm), citric acid (C, 2%), natamycin (N, 0.2%)
and green tea extract (T, 0.25%). After washing, the samples were packed and stored for 6 days at 6-8 °C.
Mesophilic aerobic bacteria (MAB) and yeast and molds (Y&M) were used as microbiological indices.
Organoleptical quality was assessed through instrumental measurements of color and texture. The initial
microbial load (MAB=6.39 log; Y&M=4.43log) fell between 0.7 and 3 log after washing, with the largest
reductions in MAB for H and C solutions, and for A and H in the case of Y&M. During storage, only
samples washed with C did not show increases in microbial counts, but their organoleptical quality showed a
significant degradation with detriment in texture (hydrolysis) and color (extended yellowing). At the end of
storage, microbial counts of samples washed with H were not significantly different from samples washed
with N, but this presented better organoleptical quality. The replacement of H by N allows to obtain equal
microbiological quality than samples washed with H but with better organoleptic quality but at the end of
storage.
Keywords: Leafy vegetables, microbiological quality, organoleptical quality, natural antimicrobials,
disinfection.
INTRODUCCIÓN
Los cambios registrados en las últimas décadas en el estilo de vida de los consumidores han llevado al auge
en el consumo de hortalizas refrigeradas mínimamente procesadas (RMP) (Olaimat y Holley 2012, São José
y Vanetti 2012, Sagong et al. 2011). Dos factores han sido determinantes en este proceso: el interés de los
consumidores en incorporar vegetales a su dieta y la conveniencia que estos productos ofrecen debido a su
rápida y sencilla preparación (Gupta et al. 2012, Sagong et al. 2011, Rico et al. 2007). Paralelamente, se ha
registrado un notable aumento de enfermedades transmitidas por alimentos asociados al consumo de estos
productos (Olaimat y Holley 2012, Taban y Halkman 2011, Warriner et al. 2009).
Entre las etapas de producción de hortalizas RMP, el lavado y desinfección tienen una importancia relevante
debido a que esta es la única etapa donde la carga microbiana inicial puede ser reducida (Neal et al. 2012,
São José y Vanetti 2012, Allende et al. 2006). El hipoclorito de sodio (NaClO) es el sanitizante más utilizado
en la desinfección industrial (Ilic et al. 2012). Sin embargo, numerosos estudios han cuestionado su uso en
139
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
productos vegetales debido a la formación de productos carcinógenos y mutagénicos (Cobo-Molinos et al.
2008, Martín Diana et al. 2008). Esto ha impulsado la investigación y el desarrollo de nuevas estrategias de
desinfección, buscando reemplazar los aditivos químicos utilizados en este proceso por otros más naturales
que logren un efecto sanitario similar.
El uso de ácidos orgánicos (cítrico, láctico, ascórbico, entre otros) ha sido propuesto como una natural
alternativa para el reemplazo del NaClO (Gupta et al. 2012, Neal et al. 2012, Allende et al. 2008). Estos
compuestos inhiben el crecimiento de microorganismos a través de la disrupción de membrana celular,
inhibición de reacciones metabólicas esenciales, estrés en la homeostasis de pH celular y acumulación de
aniones tóxicos (Huang y Chen 2011).
En los últimos años se ha prestado especial interés a los compuestos antimicrobianos naturales, como las
bacteriocionas, para reducir la carga microbiana de la materia prima y estabilizar los productos elaborados.
Entre las bacteriocinas, la natamicina (piramicina) es un antifúngico producido por Streptomyces natalensis y
considerado como un compuesto GRAS (Generally recognized as safe) por la FDA (Koontz y Marcy 2003).
Es efectiva contra hongos y levaduras y actúa bloqueando el crecimiento de estos microorganismos a través
de su unión con el ergosterol (Welscher et al. 2008).
Otras alternativas están asociadas al uso de polifenoles, contenidos en compuestos como el té verde. Este
constituye una excelente fuente de antioxidantes y, a su vez, ha mostrado capacidad antimicrobiana en
distintas matrices alimentarias (von Staszewski et al. 2011, Martín-Diana et al. 2008).
El objetivo del presente trabajo fue estudiar el reemplazo de hipoclorito de sodio por productos más naturales
y seguros, evaluando la eficiencia para reducir la carga microbiana de la materia prima, afectando
mínimamente la calidad organoléptica y logrando una adecuada vida útil.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materia prima y preparación de muestras
Los estudios se realizaron utilizando espinaca (Spinacea oleracea L.) como materia prima. Los atados de
espinaca fueron obtenidos en comercios minoristas de Capital Federal y transportados al laboratorio donde
fueron cortados para descartar las raíces y la porción inferior del tallo. Luego, las hojas fueron mezcladas
para lograr muestras homogéneas.
Una parte de la materia prima fue analizada en la primera hora luego de su arribo al laboratorio (muestras sin
lavar) para caracterizar la calidad inicial. El resto del material, fue sometido a los tratamientos de lavado y
desinfección correspondientes (ver apartado “Lavado y desinfección”). La materia prima tratada fue
empacada y almacenada en las condiciones que se detallas en el apartado “Empaque y almacenamiento”. Se
analizó la evolución de la calidad del producto realizando muestreos a los 0, 3 y 6 días de almacenamiento.
Lavado y desinfección
Se ensayaron lavados por inmersión de 5 minutos utilizando diferentes soluciones: agua de red (A),
hipoclorito de sodio (200ppm), ácido cítrico (2%p/v), natamicina (0.2%p/v) y extracto de té verde
(0.25%pv). En todos los casos, la relación masa de producto a volumen de solución se mantuvo en 1:20
(Sagong et al. 2012). Durante la inmersión se agitó manualmente utilizando una cuchara. Luego del
tratamiento, las muestras fueron retiradas de la solución, escurridas y centrifugadas en una centrífuga manual
de cocina durante 30 segundos.
Los compuestos desinfectantes propuestos y sus concentraciones fueron seleccionados teniendo en cuenta
estudios previos de otros autores (Neal et al. 2012, Hondrodimou et al. 2011, Sagong et al. 2011, Randazzo
et al. 2009, Martín-Diana et al. 2008). Los reactivos que se utilizaron en la preparación de las soluciones
desinfectantes fueron: Hipoclorito de sodio concentrado (55 g Cl/L) comercial (Ayudín®, Argentina), ácido
cítrico anhidro (Anedra, Argentina), Delvocid® Salt (DSM, Holanda), té verde comercial (Chinese Good
Shan Good Shui, China).
El extracto de té verde se preparó siguiendo la metodología descripta por von Staszewski et al. (2011).
Brevemente, se pesaron 3,0 g de hojas de té, se molieron en molinillo de café doméstico y se agregaron a 100
mL de agua destilada caliente (95ºC) para lograr un extracto soluble al agua al 3% p/v. Esta infusión se
mantuvo en un baño térmico a 95ºC durante 20 minutos y luego se enfrió hasta temperatura de refrigeración.
Se mantuvo en frío hasta su utilización, momento en el que se diluyó hasta una concentración final de 0.25%
p/v.
Empaque y almacenamiento
140
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
La materia prima lavada y desinfectada fue empacada en unidades de 20g. El material de empaque fue
poliolefina (PD960, Cryovac®, Argentina) con una permeabilidad de 6000-8000 y 19000-22000 cm3.m2
.24h-1 a O2 y CO2, respectivamente; y una permeabilidad al vapor de agua de 5-6 g.cm2.24h-1. Estas
muestras fueron almacenadas en condiciones de refrigeración comercial (6-8ºC).
Indicadores de calidad
Para determinar la eficiencia de la operación de lavado y desinfección se utilizaron los siguientes indicadores
de calidad:
Calidad microbiológica
Se caracterizó la calidad microbiológica a través de los recuentos de bacterias aerobias mesófilas totales
(MA) y hongos y levaduras (HyL), siguiendo la metodología descripta por Agüero et al. (2011). Brevemente,
10 g de hojas fueron maceradas y homogenizadas en agua peptonada. Los recuentos microbianos de MA
fueron llevados a cabo utilizando plate count agar (PCA, Biokar Diagnostics, Francia) para recuento total,
incubando a 32-35ºC durante 48-72 h (ICMSF, 1983). Los recuentos de HyL se llevaron a cabo utilizando
como medio de cultivo cloranfenicol glucosa agar (YGC, Biokar Diagnostics, Francia), incubando a 25ºC
durante 5 días (ICMSF, 1983). Los recuentos se expresaron como logUFC.mL-1. Los recuentos se realizaron
por triplicado para cada tratamiento.
Calidad organoléptica
Se midió el color utilizando un colorímetro triestímulo MINOLTA (CM-508d, Japón). Se tomaron 5 hojas de
cada tratamiento y se tomó el color en 5 puntos diferentes del lado adaxial de cada hoja. A partir de los
valores L* (luminosidad o brillo), a* (rojo – verde) y b* (azul – amarillo), coordenadas del sistema Hunter
Lab, se calculó el parámetro ángulo Hue (Hº) que determina el tono o matiz de la muestra. Valores entre 90 y
180º corresponden al espacio entre el amarillo y verde, color esperable para las muestras de espinaca.
Adicionalmente, se determinó la textura de las hojas de espinaca utilizando un ensayo de corte con un
texturómetro TA.TX.Plus (Stable Micro Systems, Reino Unido), utilizando una adaptación del ensayo
descripto por Sagong et al. (2011). Para ello se cortaron porciones rectangulares de 3 x 5 cm de las hojas en
sentido longitudinal evitando la nervadura central. Tres porciones fueron utilizadas en cada ensayo para
determinar la fuerza máxima de corte. Los ensayos se realizaron por quintuplicado para cada tratamiento. Se
utilizó una celda de carga de 5 N, una velocidad de pre- y post-ensayo de 5 mm/s, velocidad de ensayo 1
mm/s avance. Los resultados se expresaron como Fmax por unidad de masa (N/g).
Análisis estadístico
Los resultados son expresados como valores medios obtenidos por el método de mínimos cuadrados, junto
con sus desviaciones estándar (Kuehl 2001). Los resultados fueron analizados utilizando el software SAS,
versión 9.0 (SAS Inc., 2002). Se utilizó el procedimiento GLM (Modelos lineales generales) para realizar el
análisis de varianza (ANOVA) en el que se empleó como factor de variación: TRAT (tratamiento), TIEMPO
(tiempo de almacenamiento) y la interacción entre estos factores. Las diferencias entre los tratamientos
fueron determinadas mediante el test de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer con un nivel de
confianza del 5%.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los recuentos microbianos iniciales en hojas de espinaca sin lavar resultaron 6.39 ± 0.12 y 4.43 ± 0.20 log
UFC.mL-1 para bacterias aerobias mesófilas totales y para hongos y levaduras, respectivamente.
La Figura 1 presenta los resultados obtenidos al realizar el recuento de estas poblaciones microbianas luego
del lavado de la materia prima con diferentes soluciones sanitizantes (día 0) así como también la evolución
de estos indicadores durante el almacenamiento refrigerado.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Figura 1: Recuentos de bacterias aerobias mesófilas (A) y hongos y levaduras (B) en hojas de espinaca
sometidas a tratamientos de desinfección con diferentes sanitizantes y almacenadas en condiciones de
refrigeración comercial.
El lavado de la materia prima por inmersión de 5 minutos en agua de red produce significativas reducciones
de ambas poblaciones microbianas bajo estudio, especialmente en el caso de bacterias. Este resultado
demuestra la importancia del lavado como operación preliminar en la elaboración de productos hortícolas
mínimamente procesados.
El agregado de hipoclorito de sodio, en una concentración de 200ppm, tiene un efecto beneficioso para la
calidad microbiológica inicial del producto ya que permite una reducción adicional de 1 ciclo log de
bacterias, resultando una reducción de 1.99 log respecto de las muestras sin lavar (Fig. 1A). Este efecto es
menos significativo para las poblaciones de hongos y levaduras (Fig. 1B), para las cuales el lavado con esta
solución presenta una reducción adicional de 0.7 log respecto del lavado con agua de red (1.26 log respecto
de las muestras sin lavar). El efecto del hipoclorito de sodio es bien conocido. Su poder desinfectante se debe
a sus propiedades como oxidante fuerte (Artés et al. 2009). Es altamente efectivo para inactivar bacterias,
hongos, levaduras y virus. Sin embargo, las reducciones en las poblaciones de microflora nativa de la
superficie de hortalizas no son superiores a los 2 ciclos log con tratamientos de desinfección utilizando
hipoclorito (Aruscavage et al. 2006, Sapers 2006).
La mayor reducción inicial de bacterias aerobias mesófilas (3.04 ciclos log) se obtuvo cuando la operación
de lavado y desinfección se realizó con la solución de ácido cítrico. En el caso de hongos y levaduras, las
reducciones logradas con este tratamiento no presentaron diferencias significativas con las obtenidas para el
lavado con solución de hipoclorito de sodio. La utilización de los ácidos orgánicos sobre productos
hortícolas está ampliamente difundida para la prevención de pardeamiento enzimático y no-enzimático, pero
tiene también un efecto antimicrobiano siendo más eficiente contra bacterias que contra hongos y levaduras
(Artés et al. 2009). Existen referencias de numerosos estudios acerca del lavado y desinfección con ácidos
orgánicos y su efecto sobre la calidad microbiológica de tejidos vegetales (Jiang et al. 2004). Entre ellos,
Gómez y Artés (2004) y Roura et al. (2003) encontraron que la desinfección de apio y lechuga,
respectivamente, con soluciones de hipoclorito (100 ppm) puede ser reemplazada por un lavado con una
solución de ácido cítrico (0,1 M) y ácido ascórbico (0,5 M).
El agregado de natamicina o extracto de té verde, en las concentraciones ensayadas en este estudio, no tuvo
un efecto beneficioso adicional ya que las reducciones en los recuentos microbianos obtenidos con los
lavados con estas soluciones no fueron significativamente diferentes de los obtenidos con lavados con agua
de red. El efecto sobre la microflora nativa de estos tres tratamientos (A, N y T) se debe a un arrastre
mecánico, favorecido por la agitación, de la solución en contacto con el material sustrato.
Durante el almacenamiento, las muestras sin lavar presentaron un incremento significativo de la microflora
nativa bajo estudio alcanzando, al final del almacenamiento valores, de 7.66 y 5.09 log de bacterias
mesófilas aerobias y hongos y levaduras, respectivamente.
La calidad microbiológica de la materia prima lavada con agua de red o con solución de hipoclorito de sodio
mostró un comportamiento similar durante el almacenamiento. Las bacterias aerobias mesófilas tuvieron un
leve incremento alcanzando valores de 5.80 y 5.62 log, respectivamente. Por su parte, los recuentos de
142
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
hongos y levaduras mostraron un incremento significativo al final del almacenamiento alcanzando valores de
4.88 y 4.18 log, respectivamente.
El tratamiento de lavado con la solución de ácido cítrico fue el que presentó la mejor performance respecto
de este indicador, ya que las poblaciones microbianas se mantuvieron estables durante el almacenamiento,
con recuentos bajos y similares a los detectados inmediatamente después de realizado el tratamiento.
Durante el almacenamiento, los recuentos de bacterias de las muestras lavadas con natamicina tuvieron un
comportamiento similar al registrado para las muestras lavadas con A o H, con incrementos significativos. Al
final del almacenamiento, los recuentos de bacterias en las muestras lavadas con N no fueron
significativamente diferentes de las lavadas con H. En cambio, el efecto de esta bacteriocina sobre las
poblaciones de hongos y levaduras fue más importante. En este caso, luego de una reducción en los
recuentos durante los primeros días de almacenamiento, hacia el final del período analizado se observó un
incremento en estas poblaciones, alcanzando valores similares a los detectados en las muestras lavadas con
solución de hipoclorito de sodio. Otros estudios han verificado la eficiencia de la natamicina contra hongos y
levaduras en diferentes sustratos alimenticios como quesos, suero de queso, embutidos, aceitunas (ArroyoLópez et al. 2012, Mann y Beuchat 2008, Gallo et al. 2006, Delves-Broughton et al. 2004, Odds et al. 2003,
Suloff et al. 2003), pero no se registran antecedentes en el uso de natamicina como antimicrobiano en
hortalizas de hoja.
Finalmente, el extracto de té verde, no tuvo un efecto beneficioso adicional, ya que los recuentos de bacterias
se incrementaron significativamente al final del almacenamiento superando los valores logrados en las
muestras lavadas con agua de red o con hipoclorito de sodio. Este efecto también fue observado en las
poblaciones de hongos y levaduras, en las que se alcanzaron valores de recuentos similares a los encontraron
para muestras sin lavar.
La calidad organoléptica de hortalizas de hoja está constituida por diferentes componentes como apariencia
fresca, color verde brillante, textura crujiente y ausencia de pardeamiento (Kader 2002). De estos aspectos,
se evaluaron la textura y el color. La Figura 2 presenta los cambios producidos en estos parámetros luego
del tratamiento de lavado con diferentes soluciones sanitizantes y su evolución durante el almacenamiento
refrigerado de las muestras.
La textura de hortalizas de hoja está determinada por la estructura de la pared celular y la presión interna de
la célula o turgor (Ragaert et al. 2007). Una textura crujiente es asociada por el consumidor con un producto
fresco y este es un importante atributo de calidad evaluado en el momento de compra. Numerosos estudios
evalúan este parámetro a través de la fuerza máxima que debe ejercerse para cortar el tejido (Rico et al.
2007). Las muestras de espinaca sin lavar presentaron valores de fuerza máxima por unidad de masa de
19.36 ± 1.81 N.g-1. La comparación de este valor con otros reportados por otros investigadores es dificultosa
debido a la utilización de diferentes adaptaciones del test de corte, con diferentes celdas de carga, diferente
manipulación de las muestras para la realización del ensayo, diferente variedad de materia prima, entre otros.
Figura 2: Textura (A) y color (B) de hojas de espinaca sometidas a tratamientos de desinfección con
diferentes sanitizantes y almacenadas en condiciones de refrigeración comercial.
El lavado de la espinaca produjo una disminución significativa en la fuerza máxima de corte, cualquier haya
sido la solución sanitizante utilizada en el tratamiento, alcanzando valores promedios de 12.33 ± 0.37, para
los lavados con agua de red, hipoclorito de sodio y natamicina, y de 15.28 ± 0.17 para las soluciones de
ácido cítrico y té verde. Esta disminución (entre 35 y 20 % respecto del valor para la espinaca sin lavar)
143
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
puede estar asociada al daño que se produce en el tejido debido a la agitación. La espinaca, como algunas
variedades de lechuga, es un tipo de hortaliza delicada, muy sensible al daño mecánico (O’Connor-Shaw
2004). Como resultado, la fuerza máxima de corte disminuye ya que el tejido presenta una rotura previa de
las paredes celulares.
Durante el almacenamiento de las muestras se observaron dos efectos contrarios en la fuerza máxima de
corte. Por una parte, las muestras de espinaca sin lavar presentaron una disminución en este indicador
especialmente durante los primeros días de almacenamiento. Este efecto puede deberse al inicio de los
procesos de senescencia en el tejido que se manifiestan a través daños a nivel de membranas celulares y
pared celular (Kader 2002). Por otra parte, las muestras lavadas (con cualquiera de los tratamientos
evaluados) tuvieron un incremento en la fuerza máxima de corte (Fig. 2A).
El color es otro importante atributo sensorial y puede ser un factor crítico de calidad (Rico et al. 2007) ya
que el consumidor puede rechazar un producto utilizando este criterio de selección. Se han desarrollado
numerosos sistemas para las mediciones colorimétricas, siendo la mayoría de ellos convertibles entre sí. Sin
embargo, el espacio de color Hunter Lab, utilizado en este trabajo, se caracteriza por una adecuación
documentada para la cuantificación de cambios de color en hortalizas de hoja (Gnanasekharan et al. 1992). A
partir de las coordenadas L a b de este sistema se calculó el parámetro ángulo Hue (ºH), utilizado en este
trabajo como descriptor del color de espinaca. La espinaca sin lavar presentó valores iniciales de 118.69 ±
0.41, correspondiendo al rango de color amarillo a verde.
El lavado de la materia prima provocó un aumento en este parámetro posiblemente debido a la disminución
de la tierra o material extraño sobre la hoja de espinaca (Sapers 2006). Durante el almacenamiento
refrigerado se produjo una disminución significativa del color en las muestras lavadas con hipoclorito o con
ácido cítrico, que se manifestaron mediante un amarillamiento extendido en el tejido.
CONCLUSIONES
Estos resultados refuerzan la idea de la necesidad de la aplicación de la operación de lavado y desinfección
en espinaca ya que este proceso produce una significativa disminución de la carga microbiana inicial de la
materia prima. El reemplazo del hipoclorito de sodio por ácido cítrico, en las concentraciones ensayadas,
permite obtener una reducción microbiana inicial mayor, pero afecta significativamente la calidad
organoléptica (principalmente el color) a través de una pérdida significativa del color verde característico del
producto a lo largo del almacenamiento refrigerado. A su vez, el reemplazo del hipoclorito por natamicina ó
el lavado con agua sin agregado de hipoclorito permite obtener igual calidad microbiológica y mejor calidad
organoléptica al finalizar el almacenamiento.
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AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Buenos Aires y la Agencia Nacional de Promoción
Científica y Tecnológica.
146
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Estudio cinético en las modificaciones de los parámetros en los distintos estacionamientos de la yerba
mate
Trela V.D., Holowaty S.A., Schmalko M.E.
Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones, Posadas, Argentina.
saholowaty@hotmail.com
Resumen: El objetivo del presente trabajo fue evaluar la cinética de modificación de las propiedades y
componentes de la yerba mate durante la etapa de estacionamiento, mediante el ajuste a ecuaciones cinéticas
integradas de orden cero, uno y dos. El procesamiento de la yerba mate involucra una serie de etapas dentro
de las cuales se encuentra el estacionamiento, donde se producen reacciones que implican la pérdida del
color verde intenso, y la variación del sabor y aroma. El conocimiento de la velocidad y de las condiciones
con que ocurren estos cambios permitiría introducir mejoras en el control de calidad en esta etapa. Se han
encontrado modificaciones en la mayoría los parámetros y componentes analizados, siendo las más
significativas los parámetros de color, cafeína y fructosa, los cuales pudieron ajustarse a ecuaciones
cinéticas, tanto de orden cero, uno, como así también a las de orden dos, con elevados coeficientes de
regresión. Tanto en el estacionamiento acelerado como en el mixto, la mayor parte de los ajustes
corresponden a las ecuaciones cinéticas de orden cero, en cambio, en el natural, se relacionan en mejor
medida, a las de orden dos. Se comprobó que la constante de velocidad específica es mayor para todos los
parámetros que se ajustan significativamente en el estacionamiento acelerado respecto a los estudiados en los
otros dos depósitos, lo cual demuestra que las modificaciones se dan con mayor rapidez.
Palabras clave: yerba mate, estacionamiento, cinética.
Abstract: The objective of this research was to evaluate the kinetic changes of properties and components of
yerba maté during aging by adjusting integrated kinetic equations to zero, one and two orders. The yerba
maté processing has a series of stages including aging, where reactions involving the loss of green color, and
the variation of flavor and aroma are produced. Knowledge of rate and conditions in which these changes
happen let improvements in quality control at this stage. Changes in most of parameters and components
analyzed were, most significant parameters color, caffeine and fructose, they were fit to kinetic equations of
zero, one and two orders, with high regression coefficients. Both, in the controlled and temperature
controlled aging most of the fitting corresponds to zero order kinetics equations, however, in the natural
aging (without control), fit better to a second order equation. Specific constant rate is higher in the controlled
aging than in the others two, which shows that the changes occur more rapidly.
Keywords: yerba maté, aging, kinetic
INTRODUCCIÓN
El procesamiento de la Yerba comprende 5 etapas: zapecado, secado, molienda gruesa o canchado,
estacionamiento y molienda fina. La yerba mate es procesada en las dos primeras etapas hasta alcanzar un
contenido de humedad de tal forma que no sufra transformaciones de deterioro. Luego se somete a una
molienda gruesa (canchado), se colocan en bolsas de 40-50 Kg las que son almacenadas en depósitos para su
estacionamiento.
El “estacionamiento natural” se lleva a cabo durante varios meses, en los cuales no se realiza casi ningún tipo
de control de las condiciones ambientales. El tiempo de estacionamiento varía de 9 a 24 meses dependiendo
del establecimiento. El “estacionamiento acelerado” se lleva a cabo en cámaras acondicionadas durante un
período de hasta 60 días. Las condiciones usuales de trabajo son, en general, 60ºC de temperatura y 60% de
humedad relativa. En algunas empresas se utiliza un sistema mixto de estacionamiento donde solo se
controla la temperatura del aire pero no la humedad relativa, usualmente, temperaturas intermedias de 35 a
40ºC, donde la yerba permanece hasta 6 meses. El grado de estacionamiento del producto es controlado
mediante análisis sensorial de catadores expertos que deciden cuando el mismo está en condiciones de ser
consumido.
Durante el estacionamiento se producen reacciones que involucran la pérdida del color verde intenso y la
variación del sabor de la yerba mate. Estos cambios percibidos merecen un estudio más profundo que aporte
147
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
al conocimiento de cómo varían en el tiempo los compuestos que se relacionan con la percepción de los
sentidos de la visión y el gusto. El conocimiento de los cambios en la concentración de las sustancias
relacionadas (cafeína, azúcares, color, etc.) constituirá un aporte para mejorar el procesamiento de la yerba
mate de acuerdo al tipo de estacionamiento que cada industria esté aplicando.
Gran parte de los estudios de degradación de color (clorofilas) corresponden a las etapas de zapecado y
secado donde las pérdidas de los pigmentos verdes alcanzan el 90 % (Schmalko, M.E. y Alzamora, S.M.
2001). Otros autores (Gomez Vara y col. 1979) encontraron que en los primeros 10 meses de
estacionamiento natural el contenido de clorofila varió desde 1,36 a 0,25 mg/g ss. En el estacionamiento
acelerado se han encontrado variaciones desde 1,07 a 0,33 mg/g ss durante los primeros 20 días (Lloret et al.
1992).
Los azúcares son otro grupo de compuestos que sufren variaciones durante el zapecado y secado. Gómez
Vara y col. encontraron que la reducción llega al 34 %. Se ha reportado que se produce un aumento de
sacarosa y una disminución de glucosa y fructosa (Känzig R.G. et al. 1987, Känzig R.G. et al. 1995,
Paredes A.M. et al. 2000, Esmelindro et al.. 2002). Durante el estacionamiento natural (Gómez Vara et
al.1979) encontraron que las variaciones en el contenido de azúcares totales no fueron significativas; pero en
este estudio se emplearon técnicas analíticas de baja precisión, por lo que se considera que el estudio debe
ser realizado nuevamente empleando técnicas de HPLC.
La disminución del contenido de cafeína también es importante durante el sapecado y secado alcanzando un
30 %. Sin embargo, a diferencia de los pigmentos y azúcares, la mayor variación se registra durante el
secado (Schmalko y Alzamora, 2001). Bertoni et al. (1992) han informado que durante el estacionamiento
natural las pérdidas de cafeínas llegan al 15 %.
La variación de las propiedades en los alimentos durante el almacenamiento puede explicarse utilizando
ecuaciones cinéticas lineales de diferentes órdenes. La mayoría de los trabajos encontrados utilizan
ecuaciones cinéticas de orden cero para describir el pardeamiento no enzimático en diferentes productos,
como ser: cebollas deshidratadas (F. Kaymak-Ertekin and A. Gredik 2005), en jugos cítricos concentrados
(H.S. Burdurlu et al. 2006) y de primer orden en la degradación de vitaminas, pigmentos y parámetros color
en alimentos secos (P. Kumar and H. N. Mishra 2004, C. Niamnuy et al. 2008, M. S. Uddin et al. 2002, N.
Sanjuán et al. 2004). Se encontraron, en menor medida, trabajos que utilizan el ajuste cinético de segundo
orden para describir los cambios de color en manzanas deshidratadas (M. Cortés y A. Chiralt 2008) y en el
pardeamiento no enzimático de cebollas deshidratadas (F. Kaymak-Ertekin y A. Gedik 2005).
El trabajo plantea ampliar el conocimiento actual de los cambios de color, cafeína, azúcares, acidez,
humedad y otros compuestos, que ocurren cuando la yerba mate es sometida a los diferentes tipos de
estacionamiento. El conocimiento de la velocidad y de las condiciones con que ocurren estos cambios
permitiría introducir mejoras en el control de calidad de la etapa de estacionamiento. (Ramallo et al.1998,
Sabatella et al. 2003, Schamlko et al. 2005). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la cinética de las
modificaciones de ciertas propiedades y componentes de la yerba mate durante esta etapa, ajustándose las
variaciones a las ecuaciones cinéticas integradas de orden cero, uno y dos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de las muestras
Las muestras se obtuvieron de establecimientos industriales de la provincia de Misiones de acuerdo al
sistema que cada uno de ellos emplea: estacionamiento natural, acelerado y mixto. Se partió de una misma
muestra de aproximadamente 150 kg proveniente de un secadero de la Provincia de Misiones, la misma se
repartió entre los tres tipos de estacionamiento. Las muestras destinadas a cada tipo de estacionamiento se
colocaron en 2 bolsas diferentes para poder realizar las determinaciones por duplicado. De cada depósito de
estacionamiento se tomaron muestras al inicio y luego a tiempos variables de acuerdo a su extensión: cada 30
días para el estacionamiento natural durante 10 meses, cada 5 días para el estacionamiento acelerado durante
50 días y cada 10 días para el estacionamiento mixto durante los 3 primeros meses y luego cada 30 días
hasta el término del mismo. Se obtuvieron en total 65 muestras: 20 de Estacionamiento Acelerado, 24 de
Estacionamiento Mixto y 20 de estacionamiento natural, además de la muestra al inicio del estacionamiento.
Se procedió a separar hojas de palos en cada muestra tomada de los depósitos y se preparó cada muestra de
ensayo molida destinada a los diferentes análisis (aproximadamente 0,600 kg) con un contenido de palo del
20% y se conservó a -20ºC a fin de evitar cambios entre el tiempo de la toma de muestra y el análisis.
148
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Se realizaron las mediciones de color, extracto acuoso, contenido de humedad del producto sólido; así como,
el contenido de azúcares, cafeína y sólidos solubles de la solución extraída simulando una mateada (AOAC
1990).
Metodología de Análisis
Contenido de humedad en las muestras molidas: Se determinó de acuerdo a la Norma IRAM 20503.
Medición de los parámetros de color: Se realizan mediciones de los parámetros de color L, a, b (Sistema
HunterLab) de muestras extraídas, molidas, a cada tiempo de acuerdo al tipo de estacionamiento, con un
medidor de color MiniScan® EZ HunterLab (Hunter Associates Laboratory, Inc.).
Determinación del Extracto Acuoso Total (EAT): Se determinó de acuerdo a la Norma IRAM 20510.
Determinación de sólidos solubles obtenidos de la Mateada (SSM): Se extrajeron los sólidos solubles
simulando una mateada y se llevó a sequedad de acuerdo a la norma IRAM 20510.
Determinación de azúcares: la cuantificación se realiza por HPLC en columna amino, previa extracción en
medio acuoso (IRAM 20532).
Determinación del contenido de cafeína en la Mateada: En una alícuota filtrada se determinará por HPLC
con columna C18 y fase móvil acetonitrilo-agua en proporción 20:80, previa extracción de solubles en agua
en forma de Mateada (IRAM 20512).
Análisis Estadísticos:
Los datos obtenidos a partir de los análisis de las 65 muestras, se ajustaron a ecuaciones cinéticas integradas
de orden cero, uno y dos, utilizando el paquete estadístico Statgraphics Centurion 2009.
Modelos
Para describir la cinética de los resultados experimentales, es decir, para evaluar los cambios en los
parámetros y propiedades de calidad estudiadas en el producto función del tiempo de estacionamiento, se
utilizaron ecuaciones cinéticas de distintos órdenes de reacción. La variación cinética de parámetros en
alimentos se puede expresar en forma general como

(1)
= .   .

Donde dC/dt representa la pérdida o ganancia de algún parámetro o propiedad estudiada, k representa la
constante de velocidad específica, C es el parámetro o propiedad de calidad, determinada para cada muestra
por los distintos análisis descritos anteriormente, y n es el orden de reacción. Para una ecuación cinética de
orden cero, la ecuación integrada tiene la siguiente forma:
(2)
 −  = .
Para una ecuación cinética de primer orden, la ecuación integrada tiene la siguiente forma:

(3)
= .

Las variaciones de las propiedades y parámetros estudiados en la yerba mate en función del tiempo, se
ajustaron además a ecuaciones cinéticas de segundo orden, cuya forma integrada se describe por:

1
1
(4)
( − ) = .
 
Los valores de constante de velocidad de los parámetros estudiados fueron ajustados mediante regresión
lineal simple.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En las Tablas 1, 2 y 3 se observan los resultados de los ajustes utilizando las ec. 2, 3 y 4 para los distintos
parámetros en el estacionamiento acelerado, mixto y natural, respectivamente. En ellas se muestran los
valores de la constante de velocidad específica (k) para cada componente o parámetro, así como los
estadísticos R2 y p. Las pendientes negativas de las constantes de velocidad específica (k) corresponden a la
disminución del parámetro analizado en función del tiempo.
149
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
En el estacionamiento acelerado (Tabla 1), las concentraciones de cafeína y fructosa, se ajustaron mejor a un
modelo cinético de orden cero, con valores de R2 elevados y p<<0,05; los SSM y el parámetro de color “a” a
un modelo de primer orden; la humedad, EAT, parámetro de color “L” y sacarosa, a un modelo de segundo
orden y no resultaron significativas los ajustes del parámetro de color “b” y de glucosa.
Tabla 1: Constante de velocidad específica (k), parámetros estadísticos R2 y p de los ajustes de orden cero,
uno y dos en el estacionamiento acelerado.
Parámetros
Humedad
EAT*
Color L
Color a
Color b
SSM**
Cafeína
Fructosa
Glucosa
Sacarosa
k
0,000266
0,077595
0,078684
0,0398647
0,000103
0,0403783
-0,005087
-0,004528
0,001197
0,021289
Cero
R2
52,54
77,34
91,80
98,30
0,19
45,85
95,68
94,64
9,02
73,42
Uno
R2
P
k
0,0076
0,0002
0,0000
0,0000
0,8923
0,0156
0,0000
0,0000
0,3429
0,0004
0,003749
0,001963
0,001999
0,0359517
0,0000064
0,001381
-0,008844
-0,008801
0,0006272
0,008630
54,97
78,16
92,26
98,71
0,15
45,21
95,37
92,03
7,84
74,62
Dos
R2
p
k
0,0058
0,0001
0,0000
0,0000
0,9043
0,0166
0,0000
0,0000
0,3780
0,0003
-0,0529491
-0,00005028
-0,00005070
0,00316997
-5,71429E-7
-0,00004680
0,015571
0,017512
-0,0003260
-0,003533
57,28
79,09
92,77
0,08
0,22
43,61
94,50
87,66
6,66
75,58
p
0,0044
0,0001
0,0000
0,9305
0,8846
0,0194
0,0000
0,0000
0,4178
0,0002
* EAT: Extracto Acuoso Total.
** SSM: Sólidos Solubles obtenidos de la Mateada.
En el estacionamiento mixto (Tabla 2), se determinó que la humedad, parámetros de color “L”, “a”, ”b” y
glucosa se ajustaron a un modelo de orden cero, con p<<0,05; el EAT, la cafeína y sacarosa a un modelo de
segundo orden y no resultó significativa el ajuste de SSM.
La cafeína y los parámetros de color “L” y “b”, presentaron ajustes significativos con los tres modelos
cinéticos, superaron los valores de R2 del 87% y los valores p fueron mucho menores a 0,05.
La humedad, EAT, fructosa y glucosa presentaron coeficientes de regresión entre 30 y 70 %. Esto puede
deberse a la pequeña variación entre los puntos al inicio y al término del estacionamiento, lo cual influye en
el método de ajuste.
Tabla 2: Constante de velocidad específica (k), parámetros estadísticos R2 y p de los ajustes de orden cero,
uno y dos en el estacionamiento mixto.
Parámetros
Humedad
EAT*
Color L
Color a
Color b
SSM**
Cafeína
Fructosa
Glucosa
Sacarosa
k
Cero
R2
P
k
Uno
R2
p
k
Dos
R2
p
-0,000052
36,31
0,0293
-0,000857
35,33
0,0322
0,0140001
34,10
0,0361
0,0291056
34,98
0,0332
0,0007330
37,04
0,0273
-0,000018
38,88
0,0228
0,0452026
0,0169492
90,59
95,23
0,0000
0,0000
0,0011198
0,0137674
90,03
87,91
0,0000
0,0000
-0,000027
0,0117247
89,09
8,95
0,0000
0,3208
0,005722
89,41
0,0000
0,0004022
89,29
0,0000
-0,000028
88,92
0,0000
-0,007426
-0,002390
-0,000578
-0,007765
0,006249
19,05
87,79
37,12
66,09
63,57
0,1359
0,0000
0,0271
0,0007
0,0011
-0,000276
-0,004685
-0,001032
-0,006308
0,002566
19,32
90,75
37,14
64,75
64,66
0,1329
0,0000
0,0270
0,0009
0,0009
0,000010
0,009589
0,001849
0,005361
-0,001062
19,61
92,46
36,76
62,50
65,53
0,1296
0,0000
0,0280
0,0013
0,0008
* EAT: Extracto Acuoso Total.
** SSM: Sólidos Solubles obtenidos de la Mateada.
150
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tabla 3: Constante de velocidad específica (k), parámetros estadísticos R2 y p de los ajustes de orden cero,
uno y dos en el estacionamiento natural.
Parámetros
Humedad
EAT*
Color L
Color a
Color b
SSM**
Cafeína
Fructosa
Glucosa
Sacarosa
k
Cero
R2
0,000068
-0,004628
0,020369
0,010778
0,000862
0,005144
-0,000298
0,000141
-0,004116
0,003763
27,64
29,72
96,58
98,86
17,53
51,96
93,27
19,50
83,83
66,62
Uno
R2
P
k
0,0792
0,0668
0,0000
0,0000
0,1755
0,0082
0,0000
0,1506
0,0000
0,0012
0,000893
-0,00012
0,000516
0,007977
0,000060
0,000179
-0,000465
0,000209
-0,003345
0,001516
29,65
30,99
96,67
95,56
16,70
52,47
92,66
18,76
85,39
68,41
p
k
0,0672
0,0601
0,0000
0,0000
0,1871
0,0077
0,0000
0,1596
0,0000
0,0009
-0,011925
0,000003
-0,000013
0,009806
-0,000004
-0,000006
0,000729
-0,000309
0,002848
-0,000617
Dos
R2
31,77
31,62
96,85
27,02
15,83
52,25
91,99
17,89
86,87
70,00
p
0,0563
0,0570
0,0000
0,0832
0,2002
0,0079
0,0000
0,1707
0,0000
0,0007
*
EAT
:
Extr
acto
Acu
oso
Tota
l.
**
SSM
:
Sóli
dos
Solu
bles obtenidos de la Mateada.
En el estacionamiento natural (Tabla 3), tanto el parámetro de color “a” como la concentración de cafeína se
ajustaron mejor a una cinética de orden cero; los SSM a una de primer orden; parámetro de color “L”,
concentración de sacarosa y glucosa a una cinética de segundo orden y no resultaron significativas los ajustes
de humedad, EAT, parámetro de color “b” y fructosa.
Los ajustes de la mayor parte de los parámetros analizados en este ultimo tipo de estacionamiento, excepto
los parámetros de color, se obtuvieron valores de R2 inferiores al 50%, aún con valores p<0,05. Esta falta de
ajuste puede deberse a variabilidad causada en el momento de las determinaciones de los parámetros.
Los parámetros que se ajustaron significativamente a modelos de orden cero en los tres depósitos estudiados
son: color L, color a, cafeína, EAT, fructosa, los cuales muestran constantes de velocidad específica que
disminuyen según el tipo de estacionamiento. Se observó que los mayores valores de k se dan en el
estacionamiento acelerado, en menor medida en el mixto y por último en el natural, aún cuando los ajustes
para EAT y fructosa no resultan significativos en el natural. La variación de componentes que se ajustaron a
reacciones cinéticas de orden cero significa que la velocidad de la reacción es independiente de la
concentración de las sustancias reaccionantes, sino que depende de otros factores limitantes, como ser:
concentración de enzimas, minerales, etc.
Los resultados muestran un comportamiento esperado de las constantes de velocidad específica, ya que se
obtuvieron valores más elevados en el estacionamiento acelerado, debido al empleo de temperaturas
mayores, respecto al mixto y natural. Esto indica que las modificaciones de los componentes estudiados
varían con mayor rapidez con el incremento de la temperatura de los depósitos. El mismo comportamiento
se observó en los ajustes a ecuaciones de primer orden para los mismos parámetros en estudio, la cual
sucede cuando la reacción depende de la concentración de un solo componente, que se descompone en uno o
más productos. En este caso, el mecanismo de reacción se da por difusión y se podría describir por la
Primera Ley de Fick para la cafeína, la cual se pierde por evaporación, y lo hace con mayor velocidad en el
estacionamiento acelerado.
En las Fig 1, 2 y 3 se muestran los mejores ajustes obtenidos al utilizar las distintas ecuaciones (orden cero,
uno o dos), las cuales se refieren a las mediciones de concentración de cafeína y de los parámetros de color
“L” y “a”, respectivamente. En todos estos casos, dichos ajustes, presentaron un coeficiente de regresión
lineal mayor al 90%. El periodo de análisis fue de 60, 180 y 300 días para los estacionamientos acelerado,
mixto y natural, respectivamente.
En la Fig. 1, se observa el ajuste cinético de la variación del contenido de cafeína en función del tiempo, en
los tres tipos de estacionamientos. Los ajustes corresponden a ecuaciones cinéticas de orden cero para el caso
de los estacionamientos acelerado y natural, y de orden dos, para el mixto. Ademas, demuestra que las
mayores pérdidas de este componente ocurre en los estacionamientos acelerado y mixto, debido las
condiciones ambientales utilizadas. En los resultados de los ajustes, representados en las tablas, se puede
observar que la constante de velocidad específica es mayor en el estacionamiento acelerado, indicando una
mayor velocidad de disminución de la concentración de cafeína.
151
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
0,80
Conc. Cafeína
(g/lt)
0,70
0,60
EXP acelerado
0,50
TEOR acelerado
EXP mixto
0,40
TEOR mixto
EXP Natural
0,30
TEOR natural
0,20
0
50
100
150
200
250
300
Tiempo (días)
Figura 1. Ajuste cinético de la concentración de Cafeína (g/l) en función el tiempo para cada tipo de
estacionamiento.
Para el caso del parámetro de color “L” (Fig. 2), los valores se ajustaron a ecuaciones cinéticas de orden dos
tanto en el estacionamiento acelerado como el natural, obteniendo un ajuste de orden cero para el mixto. La
constante de velocidad específica es mayor para el caso del estacionamiento acelerado, indicando un cambio
más brusco en este parámetro, reflejado en una variación del producto desde un color más oscuro hacia uno
más claro. De todas maneras, las mediciones indican que al final de la etapa de estacionamiento se obtienen
productos similares, indistintamente del tipo de estacionamiento utilizado, ya que no hay diferencias de las
determinaciones en los puntos finales.
49,0
47,0
Color "L"
45,0
EXP acelerado
43,0
TEOR acelerado
EXP Natural
41,0
TEOR natural
39,0
EXP Mixto
TEOR Mixto
37,0
35,0
0
50
100
150
200
250
300
Tiempo (dias)
Figura 2. Ajuste cinético del parámetro de color “L” en función del tiempo para cada tipo de
estacionamiento.
Finalmente, el parámetro de color “a”, se ajustó mejor a una ecuación de orden cero en los tres tipos de
estacionamientos. La velocidad con la que aumenta este parámetro de color, como se puede observar en la
figura 3, es mucho mayor en el estacionamiento acelerado, teniendo una constante de velocidad especifica
igual a 0,0398647 dias-1 en comparación con valores de 0,0169492 y 0,010778 dias-1 para el mixto y natural,
respectivamente. Esta modificación indica el cambio de color verde intenso que posee la yerba mate antes de
someterla al estacionamiento al verde mucho mas claro al final de esta etapa del procesamiento. A diferencia
de lo que ocurre con el parámetro de color L, se observa en este caso que los puntos finales de las
mediciones en cada uno de los estacionamientos son diferentes, lo cual revela claramente que en el
152
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
estacionamiento natural se obtiene un producto final de color verde mucho más claro que en el obtenido en el
mixto y acelerado.
2,00
1,50
Color "a"
1,00
EXP acelerado
0,50
TEOR acelerado
0,00
EXP mixto
-0,50
TEOR mixto
EXP Natural
-1,00
TEOR natural
-1,50
-2,00
0
50
100
150
Tiempo (días)
200
250
300
Figura 3. Ajuste cinético del parámetro de color “a” en función del tiempo para cada tipo de
estacionamiento
Los resultados demuestran que la concentración de los azucares durante el periodo de estacionamiento de la
yerba mate disminuyen en diferentes medidas. El comportamiento es similar a la concentración de cafeína,
ya que los valores de las constantes de velocidad específica son mayores en el estacionamiento acelerado y
menores en el natural, como consecuencias de la temperatura y humedad relativa empleadas en los depósitos.
En cuanto a los ajustes cinéticos, para los casos de la glucosa en el estacionamiento acelerado y la fructosa
en el mixto, no fueron significativos.
CONCLUSIÓN
Los resultados obtenidos demuestran que la cinética de degradación de los componentes y propiedades de la
yerba mate durante la etapa de estacionamiento puede ajustarse significativamente a ecuaciones de orden
cero, uno o dos. Resultaron en menor medida, los ajustes de orden uno.
En la mayoría de los casos, no coincidió el orden de ajuste del mismo parámetro en los tres tipos de
estacionamiento.
Tanto en el estacionamiento acelerado como en el mixto, la mayor parte de los ajustes corresponden a las
ecuaciones cinéticas de orden cero, en cambio, en el natural, se relacionan en mejor medida, a las de orden
dos.
Se comprobó que la constante de velocidad especifica es mayor para todos los parámetros que se ajustan
significativamente en el estacionamiento acelerado respecto a los estudiados en los otros dos depósitos, lo
cual demuestra que las modificaciones se dan con mayor rapidez, especialmente en las concentraciones de
cafeína, azucares y parámetros de color. Esto se debe principalmente a las condiciones de estacionamiento
que se utilizan en este depósito, temperaturas elevadas y humedad relativa controlada durante un corto
periodo de tiempo.
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155
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Métodos de prevención del deterioro de zanahoria mínimamente procesada
Vasco M.F.1, Monti M.C.1, Agnelli M.E.2
1: UNMdP Fac. Cs. Agrarias, Balcarce. Argentina.
2: EEA INTA Balcarce, CONICET.
agnelli.miriam@balcarce.inta.gov.ar
Resumen: Se determinó la efectividad del escaldado por microondas (M2: W5-90´´) para retardar el
deterioro nutritivo y sensorial de zanahorias trozadas, respecto del escaldado tradicional (M1: 100ºC-30´´),
en muestras almacenadas a 4°C, utilizando una muestra sin escaldar como control (MC). Inicialmente ambos
tratamientos disminuyeron significativamente la actividad de la POD respecto de MC, siendo para estas
condiciones, menor con M2. Durante el almacenamiento, esta continuó disminuyendo en las muestras
tratadas. Por el contrario, la de MC aumentó en forma continua. Tanto el contenido de fenoles totales como
el de β carotenos no mostraron diferencias significativas con MC inicialmente ni durante el almacenamiento,
manteniéndose en valores constantes y similares en todas las muestras. Visualmente, M1 presentó apariencia
cercana al producto cocido mientras que M2 resultó similar al fresco. Además M1 exhibió mayor exudado y
pérdida de turgencia que M2. MC presentó lignificación superficial, pérdida de color y aroma con los días.
La pérdida de peso debida al escaldado fue mayor en M1 que en M2, tanto inicialmente como durante el
almacenamiento.
Palabras clave: escaldado, microondas, hortalizas refrigeradas, antioxidantes, calidad sensorial.
Abstract: The aim of this study was determine microwave blanching effectiveness to retard nutritional and
organoleptic deterioration in sliced carrots as regards the traditional blanching in hot water. Carrots
purchased in the local market, were selected according to its diameter (≈2 cm), washed in chlorinated water,
peeled and sliced into 1 cm. One portion was blanched in water at 100ºC during 30´´ (M1). The other portion
was blanched in a microwave at medium power (400 W) during 1:30´´ (M2). After each treatment, samples
were immediately cooled, packed in PEBD bags and store at 4 °C for seven days. Fresh slices without
treatment were also stored as control (MC). Loss of weight, appearance, peroxidase (POD) activity, βcarotenes and phenolic compounds contents were measured during storage in the three carrot batches. POD
activity diminish in the same extent and remains constant the storage period. while POD activity of MC
increased continuously. Phenolic compounds and β-carotenes contents showed no changes during storage in
all the cases. Visual appearance presented some differences as M2 looks like fresh after 7 days. Weight loss
was negligible for M2. In brief, microwave blanching resulted more effective than the traditional one as
samples presents a better aspect and flavor than those blanched in water.
Keywords: blanching, microwave, refrigerated vegetables, antioxidants, sensory quality
INTRODUCCIÓN
Actualmente los consumidores buscan productos saludables y de alta calidad nutricional y requieren
presentaciones que les resulten prácticas a la hora de elaborar las comidas. La aparición de productos
mínimamente procesados está asociada a estos cambios en los hábitos de consumo. Estos productos, que
presentan un valor añadido y una alta calidad nutritiva y sensorial, generalmente se consumen crudos o con
un tratamiento térmico suave. Por este motivo, resulta imprescindible conocer el efecto de las distintas
tecnologías de conservación de su calidad.
Cualquiera sea el proceso elegido para la conservación, después del lavado y las manipulaciones de cortado,
los productos frutihortícolas deben someterse a una etapa de escaldado que tiene como principal objetivo
llevar a cabo la inactivación de enzimas (causantes de malos olores, malos sabores y cambios de color),
eliminación de aire ocluido, fijación de color y reblandecimiento del tejido como consecuencia del estrés
oxidativo que sufren principalmente durante el cortado que conducen a cambios tanto en el contenido como
en la composición de los componentes bioactivos (Lindley,1998; Chen and Djuric, 2001).
La zanahoria, es una de las hortalizas de mayor preferencia, debido a su versatilidad en los usos culinarios y
sus componentes nutritivos tales como fitonutrientes y fibra dietética. Dicho producto es particularmente rico
en compuestos antioxidantes como los fenólicos (Heinonen 2002) y los β-carotenos. Se destacan
156
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
particularmente estos últimos por ser los responsables del color naranja característico y precursores de la
vitamina A, cuyo su papel en relación con la salud es de enorme interés. (Hurtado, Sanchez Mata e Isasa
2001.). Lamentablemente son inestables cuando son expuestos al O2 o la luz (Shi and Maguer, 2000), cosa
que ocurre cuando las células se rompen y los tejidos internos quedan expuestos al ser cortados. Los estudios
realizados hasta el momento en cuanto a la retención de carotenoides en zanahoria trozada no son
concluyentes (Carlin et al., 1990; Howard y Dewi, 1996; Li and Barth, 1998; Alasalvar et al., 2005).
Los daños producidos en las zanahorias promueven la producción de compuestos fenólicos como los ácidos
clorogénico y el hidroxibenzoico (Aubert et al., 1993). Los compuestos fenólicos están relacionados con
varios atributos sensoriales (Howard y Griffin, 1993; Talcott y Howard, 1999; Alasalvar et al., 2001) y
parecen ser buenos indicadores de capacidad de de las distintas variedades para adecuarse al almacenado en
frio como para la transformación industrial en vegetales trozados frescos (Aubert et al., 1993).
La oxidación de los compuestos fenólicos por oxireductasas, un grupo de enzimas que incluyen la peroxidasa
y la polifenoloxidasa está relacionada con el pardeamiento de los tejidos cortados (Vermerris y Nicholson,
2006) y la decoloración superficial en zanahorias cortadas (Howard et al., 1994). Además pueden producir
metabolitos que provocan el deterioro de los alimentos después del procesamiento. Los compuestos fenólicos
también pueden auto-oxidarse por exposición a la luz y al oxígeno (Vermerris y Nicholson, 2006).
Otro indicador importante de la calidad en el post-procesamiento es la actividad de enzimas específicas. La
peroxidasa es una enzima clave en el proceso de lignificación en zanahorias y en la oxidación enzimática del
caroteno considerada como indicador del estrés oxidativo (Howard y Griffin, 1993; Li y Barth, 1998;
Lamikanra y Watson, 2001). La peroxidasas puede también interactuar con los fenoles en reacciones
relacionadas con los cambios por deterioro (Barz et al., 1985).
Dentro de los procesos que engloba la preparación de los productos procesados, la etapa de escaldado
aparece como una de las más sensibles en cuanto a las pérdidas de calidad tanto organolépticas como
nutricionales.
El color de los alimentos se debe a diferentes compuestos, principalmente orgánicos, a pigmentos naturales o
colorantes sintéticos añadidos. Cuando son sometidos a tratamientos térmicos, estos pueden alterarse. La
mayoría de las frutas y vegetales deben su color a sus correspondientes pigmentos, que son compuestos
químicos con una función biológica muy importante en el tejido. Existe una gran cantidad de pigmentos
relacionados con las frutas y vegetales, entre ellos las clorofilas, los carotenoides, las antocianinas, los
flavonoides, los taninos, las betalaínas, y otros (Badui 1999).
Una buena práctica de escaldado debe asegurar la calidad sensorial de los productos y facilitar su manejo.
Esta operación se debe llevar a cabo en forma muy controlada en cuanto a la magnitud del tratamiento
térmico en nivel de temperatura y período de aplicación. Además, el tratamiento debe ser detenido en forma
rápida mediante un enfriamiento eficiente. Siempre es preferible un tratamiento de alta temperatura por un
período corto.
A pesar de ser una operación esencial en el pretratamiento de frutihortícolas, el escaldado con agua presenta
serios inconvenientes. Por lado, requiere de un gran consumo de agua y por lo tanto, de un elevado consumo
energético. Por otro lado, genera efluentes que contienen una elevada carga microbiana y por lo tanto deben
tratarse para reducir la contaminación ambiental.
Durante el proceso se produce pérdida de nutrientes y de propiedades sensoriales. Una alternativa al
escaldado convencional mediante agua caliente es el efectuado con microondas. La energía que proporciona
el microondas origina la fricción de las moléculas debido a la rápida oscilación en el campo magnético y por
consiguiente el calentamiento de las mismas (Giese 1992, IFT 1989, Decareu 1986). Este proceso tiene las
ventajas de no generar efluentes y reducir el consumo energético. Sin embargo, deben determinarse
cuidadosamente los tiempos de exposición y la potencia a utilizar a fin obtener un producto de buena calidad
sensorial y nutricional.
Entre las ventajas del uso de microondas están la rapidez y uniformidad en el tratamiento sin provocar
pérdidas de los componentes nutricionales. La conservación del color original mediante este procedimiento
ha sido la razón de varios estudios. (Schwartz y Von Elbe 1983, Jiménez et al. 1999). Entre los pigmentos
estudiados se reportaron estudios en carotenoides, (Sharon-Raber y Khan 1983, Ott 1992) y la relación entre
antocianinas y polifenoloxidasa (Wesche-Ebeling y Montgomery 1990).
Hasta el momento no se han encontrado en la literatura estudios significativos que utilicen esta técnica de
escaldado. El objetivo de este estudio fue determinar la efectividad del escaldado por microondas para
retardar el deterioro nutritivo y sensorial de zanahorias trozadas, respecto del escaldado tradicional. Para ello
se estudiaron la calidad organoléptica (aroma, apariencia), nutricional ( carotenos, fenoles totales),
157
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
inactivación de la POD y pérdida de peso de zanahorias trozadas escaldadas con microondas, y se siguió la
evolución de dichos parámetros durante su almacenamiento en cámara de refrigeración. Estos resultados, se
compararon posteriormente, con los obtenidos mediante escaldado tradicional y los del producto fresco (sin
tratamiento).
MATERIALES Y METODOS
Preparación de la muestra
Las zanahorias (Daucus carota) fueron adquiridas en un mercado local. Las raíces fueron seleccionadas de
acuerdo a la uniformidad de diámetro, descartándose aquellas cónicas y fueron almacenadas en cámara de
refrigeración a 4 °C hasta su análisis.
Las zanahorias seleccionadas se cepillaron bajo agua corriente y se sumergieron en baño de agua clorada 200
ppm durante una hora, a fin de disminuir la carga microbiana inicial. Luego fueron peladas manualmente y
cortadas en rodajas de un cm de espesor, con una máquina cortadora especialmente diseñada con seis
cuchillas, según la siguiente técnica de corte: la zanahoria fue colocada en posición transversal a las
cuchillas, dejando fuera de las mismas 5 cm aproximadamente de la corona, y se cortó a partir de allí 6
rodajas de 1 (un) cm del tejido consecutivo a la corona, con el fin de evitar posibles errores en resultados
debido a distribución de nutrientes en el tejido. De esta forma se estandariza el muestreo uniformemente,
eliminándose corona y cola. Del total de las rodajas obtenidas, se toman al azar aproximadamente 120
gramos de las mismas (alrededor de 17 rodajas). Este número conformará la muestra.
Proceso de escaldado y almacenamiento refrigerado
Antes del escaldado, las zanahorias cortadas fueron previamente descontaminadas por inmersión en agua
clorada 50 ppm durante un minuto y posteriormente al mismo, fueron inmediatamente enfriadas bajo agua
fría corriente durante tres minutos, a fin de frenar el proceso (Agüero et al, 2008).
Escaldado tradicional por agua caliente
Las muestras fueron sumergidas en agua a ebullición (100°C) durante 30 segundos, (estas condiciones fueron
seleccionadas a partir de ensayos previos en los que se buscó obtener un producto visualmente similar al
fresco). La relación peso de la muestra / volumen de agua fue 60:4000, de modo que la introducción de las
muestras no produzcan una caída significativa en la temperatura del baño.
Escaldado por microondas
Se utilizó un microondas domestico Goldstar modelo ER-686MD con una potencia efectiva de 800 W;
2450MHz. Las rodajas de zanahoria se colocaron en una bandeja plástica de altura previamente definida, en
torno a su circunferencia exterior, a fin de garantizar la uniformidad de radiación recibida. El escaldado se
realizó manteniendo la masa constante a 400 W durante 1:30´´, condiciones seleccionadas del mismo modo
que para el escaldado con agua (Fakhourl, 1992).
Las muestras tratadas por ambas técnicas de escaldado, pesadas en balanza analítica, fotografiadas fueron,
antes y después del tratamiento y finalmente almacenadas durante siete días, en cámara con temperatura
controlada a 4 °C, en bolsas de polietileno de baja densidad, de 70 micrones de espesor, a fin de garantizar
una permeabilidad intermedia al oxigeno, evitando posible deterioro oxidativo por exceso de oxígeno o
fermentación por ausencia total del mismo.
Una muestra sin tratar se tomó como control. Las determinaciones físico-químicas y sensoriales de las
muestras tratadas y sin tratar, se llevaron a cabo en cuatro estadios de muestreo, a saber: día 0, 3, 5 y 7. Cada
experimento se repitió dos veces.
Análisis de la peroxidasa
Extracción
La POD se analizó de acuerdo con el método de Blancas et al. (2002), con algunas modificaciones. Las
muestras se procesaron hasta formar un puré. 5 gramos del puré se mezclaron luego con buffer fosfato de
potasio frio, 0,1 M pH: 6,5 y se homogeneizó durante un minuto a 11000 RPM. Las suspensiones se filtraron
usando una capa de tela de lino para eliminar partículas sólidas. Para eliminar la turbidez del resto de los
homogeneizados se centrifugaron a 5000 RPM durante 20 minutos. Los sobrenadantes se filtraron a través de
158
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
papel de filtro Whatman N° 2 y se mantuvieron en hielo hasta su análisis. Los extractos enzimáticos se
prepararon por duplicado para comprobar la reproducibilidad del total de lecturas iniciales de actividad
enzimática de las muestras.
Actividad
La solución sustrato POD se preparó diariamente mediante la mezcla de guayacol 0,1 ml, 0,1 ml de peróxido
de hidrógeno (30%) y 99,8 ml de fosfato potásico tampón (0,1 mol/l), pH 6,5. La solución sustrato se
homogeneizó, agitando vigorosamente durante unos minutos. Los ensayos de actividad se llevaron a cabo
POD mezclando en tubos de vidrio 0,120 ml de extractos enzimáticos con 3,48 ml de solución sustrato. La
actividad POD se midió a partir del aumento de la absorbancia a 470 nm en función del tiempo con un
espectrofotómetro (UVPC 2401, Shimadzu Co.). La reacción se controló durante 20 min. Se realizaron dos
repeticiones y se consideró su valor promedio para el análisis final.
La actividad enzimática se determinó a partir del cambio de absorbancia por minuto. Para calcular el cambio
de absorbancia con tiempo U (Abs/min), solo se tuvieron en cuenta los incrementos iniciales
correspondientes a la máxima pendiente de la curva de abs en función del tiempo, y su valor se calculó
mediante regresión lineal. La actividad de la enzima se expresó en U/ml extracto enzimático.
Cuantificación de los fenoles totales
Extracción
El extracto metanólico se preparó mediante la adición de 25 ml de metanol a 8 gramos de la muestra puré.
Las muestras fueron homogeneizadas mediante un homogeneizador Ultra Turrax-T-25, 8 veces a 16000 rpm,
durante un minuto la primera homogeneización, y las restantes durante 20 segundos con intervalos de 2,5
minutos entre una y otra, por un total de 20 minutos, para evitar recalentamiento y pérdida de fenoles.
Transcurrido ese tiempo, las muestras se centrifugan durante 15 min a 5000 rpm. Se toman 6 ml de la
muestra los cuales son filtrados a través de cartuchos acondicionados de C 18.
Cuantificación
Los Fenoles totales (FT) se determinaron utilizando el reactivo Foline Ciocalteu (FC) de acuerdo con el
método de Singelton, Orthofer y Lamuela Raventós (1999), con algunas modificaciones. Se colocaron en
tubos de microcentrifuga de 2 ml: 200 µl del extracto fenólico, 200 µl de metanol, 200 µl de MeOH, 200 µl
reactivo FC y 1,4 ml de Na2CO3. Las muestras se agitaron brevemente e inmediatamente se dejaron
reaccionar en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Luego, las muestras se centrifugaron en
microcentrífuga Biofuge® pico a 13000 rpm durante 3 min. Se leyó la absorbancia de la muestra a 725 nm
con solución acuosa de ácido gálico (10- 100 ppm) como estándar. Los resultados se expresaron como mg de
equivalente de ácido gálico por 100 g de peso seco de la muestra.
Cuantificación de β carotenos
Los -Carotenos se analizaron de acuerdo con el método de Biswas, Sahoo, y Chatli (2011), con algunas
modificaciones. Las muestras procesadas como puré se conservaron congeladas hasta su análisis, y se
descongelaron el día anterior a 4°C en heladera. En todas las etapas las muestras se mantuvieron fuera del
alcance de la luz y a baja temperatura. Para la extracción, una porción representativa de esta muestra (1
gramo) fue pesada en un tubo de centrifuga de vidrio recubierto por papel aluminio. Se añadió al mismo 5
ml de acetona fría, y el tubo se homogeneizó 2 minutos a 11000 rpm en baño de agua con hielo, enjuagando
luego el omni mixer con 5 ml de acetona para evitar pérdida de muestra. Se agitó ocasionalmente entre
muestra y muestra, finalmente se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se recogió en un
tubo de ensayo, y el sedimento se re-extrajo con 5 ml de una acetona, seguido por centrifugación de la misma
forma que la anterior. La mezcla de ambos de los sobrenadantes fue filtrada con un filtro Whatman N°42. La
absorbancia del extracto fue determinada a 449 nm en espectrofotómetro UV visible. Los resultados se
expresaron como µg de beta caroteno por g de peso fresco de la muestra.
Materia Seca (%)
Se determinó por pesaje de la muestra que se ha secado en estufa a 60 °C hasta peso constante (48 horas):
MS (%)= (Peso cápsula + Peso seca) - Peso cápsula * 100
(Peso cápsula + Peso fresco) - Peso cápsula
Pérdida de peso (%)
159
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Las rodajas de las muestras tratadas y sin tratar fueron pesadas antes del escaldado, después del mismo (en
aquellas tratadas), y en cada día de análisis, en balanza analítica, para determinar su pérdida de peso en
liquido debida al escaldado y al tiempo de almacenamiento, expresado en porcentaje.
Aspecto visual
Se construyó una tabla en la que se tuvo en cuenta: aspecto de las rodajas respecto de la muestra fresca,
color, olor típico, exudado de líquido externo e interno, firmeza ante el corte con cuchilla, pegajosidad
superficial. Para esto, se tomaron fotos de las muestras tratadas y sin tratar, antes del escaldado, después del
mismo (en aquellas tratadas) y en su correspondiente día de análisis.
Análisis estadístico
Los resultados obtenidos se analizaron con el programa estadístico infoStat, versión actualizada al 2012. Se
llevó a cabo un análisis de la varianza (ANOVA, dos repeticiones), con el test de comparaciones de tukey y
un nivel se significación α= 0,01, para evaluar el efecto del tiempo-temperatura/potencia de escaldado sobre
la actividad peroxidasa, contenido de fenoles totales, y beta carotenos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la Figura 1 se muestra actividad de la POD en función del tiempo de almacenamiento normalizadas con el
valor de la POD inicial (antes del tratamiento) para todos los casos evaluados. Se puede observar que ambos
tratamientos conducen valores de inactivación similares. Estos valores se mantuvieron durante el constantes
durante el almacenamiento en cámara.
La muestra sin escaldar, por el contrario, muestra un aumento de la actividad con el tiempo de
almacenamiento concordante con los daños sufridos por el material biológico y los cambios deteriorativos en
el color, (Howard et al., 1994
2
POD
1,5
sin trat.
en agua
MO
Fenoles totales
1,5
1
1
0,5
sin trat
0
en agua
MO
0,5
0
2
4
t [dias]
6
8
Figura 1. Efecto de la Actividad de la POD con el
almacenamiento en muestras sin tratar, y escaldadas
en agua y MO.
0
2
4
t [dias]
6
8
Figura 2. Efecto del contenido de fenoles totales con
el almacenamiento en muestras sin tratar, y
escaldadas en agua y MO.
La figura 2 presenta los resultados del contenido de fenoles totales normalizados con el valor inicial de las
muestras sin tratar. Tal como se puede comprobar, no se encontraron variaciones significativas en el
contenido de fenoles entre las muestras escaldadas mediante ambas técnicas y las correspondientes muestras
sin escaldar, (Fig. 2). (p≤0,01) y su valor se mantuvo constante durante todo el período de almacenamiento.
Estos resultados no concuerdan con lo esperado de acuerdo a lo reportado en la literatura que indican que el
contenido de compuestos fenólicos aumentaría con el daño producido (Aubert et al., 1993, Reyes et al.,
2007). Sin embargo otros autores ya han encontrado resultados similares o en los que se observa un descenso
en contenido de los mismos (Milza Moreira et al., 2011, Rocha et al., 2007). Reyes et al. (2007) reportaron
que los cambios en el contenido de fenoles en respuesta al daño podía variara desde una disminución del 26
% a un aumento del 191 %, dependiendo del tipo de tejido del vegetal o fruta considerado. A pesar de indicar
un aumento del contenido de fenoles para zanahorias cortadas, no se sabe si este cambio difiere entre
distintos cultivares o el grado de madurez en el momento de la cosecha.
Tanto para las muestras escaldadas por ambas técnicas como sus correspondientes muestras sin tratar, no se
registraron diferencias significativas en el contenido de carotenos, ya sea en su análisis inicial como durante
el almacenamiento (Figura 3). (p≤0,01). Según esto, los niveles de carotenoides en zanahorias peladas y pre160
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
cortadas, con y sin tratamiento de escaldado se verían afectados durante el almacenamiento. Resultados
similares fueron obtenidos por Chen et al., 1996, en zanahoria fresca trozada y Carrasco y Cisneros Zevallos,
2002, en zanahorias en rodajas frescas y escaldadas.
1,50
Carot
perdida de peso (%)
10,00
1,00
0,50
sin trat
en agua
MO
2
4
t [dias]
6
En agua
Sin tratar
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0
MO
0,00
8
0
Figura 3. Efecto de la retención de β carotenos
(normalizado con su valor inicial) con el
almacenamiento de muestras sin tratar y escaldadas
en agua y MO.
2
4
t [dias]
6
8
Figura 4. Pérdida de peso por almacenamiento de
rodajas de zanahorias sin tratar y escaldadas por
agua y MO.
En la Figura 4 se puede ver que las muestras sin tratar, sufrieron un bajo porcentaje de pérdida de peso que
se mantuvo contante durante los días de almacenamiento. Este efecto se visualiza con el aspecto reseco sobre
la superficie de las rodajas. (Tabla 1).
Las muestras escaldadas por el método tradicional en agua caliente, tuvieron una pérdida de peso
considerable, que fue directamente proporcional a los días de almacenamiento. Este efecto pudo corroborarse
con el exudado de líquido sobre la superficie de las rodajas. (Tabla 1). Las muestras escaldadas mediante
microondas, presentaron una pérdida de peso intermedia entre las muestras sin tratar y las escaldadas por
agua caliente. Estos valores se mantuvieron constantes durante los días de almacenamiento.
La Tabla 1 exhibe los resultados de la observación visual realizada en las rodajas de zanahoria antes, después
de los tratamientos de escaldado y durante el almacenamiento en cámara a 4°C. Se puede destacar que, con
respecto al producto fresco, las muestras sin tratar mostraron un aspecto reseco, lignificado, y ausencia de
aroma y color característico que se fue acentuando con los días de almacenamiento. Por su parte, las
muestras tratadas por el método tradicional mostraron un color naranja intenso, manteniendo el aroma típico
durante los días de almacenamiento. Sin embargo se observó una disminución de la firmeza de dichas
muestras, junto a un gran exudado de líquido en superficie, similar al producto cocido, es decir, un aspecto
no deseado,. Estos últimos efectos no se observaron en las muestras escaldadas mediante MO, las cuales
mostraron una apariencia óptima, similar al producto fresco en cuanto aroma, color, firmeza y aspecto
general.
Los resultados en la decoloración observada en el producto sin tratamiento indicarían que el cambio de color
de naranja intenso a pálido observado durante almacenamiento de las rodajas sin tratar no se debería a
cambios en el contenido de carotenoides. Sin embargo, no se puede descartar que se puedan producir
oxidación de los carotenoides en forma localizada al nivel de la superficie, lo cual podría explicar los
cambios de color observados. Sin embargo, por su aspecto, en las muestras no escaldadas, el cambio en la
intensidad del color naranja que se observa podría estar asociado a los cambios fisiológicos como la
formación de lignina.
161
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tabla 1. Evaluación subjetiva de aspectos de calidad en las zanahorias sin tratamiento y escaldadas por
ambos métodos durante el almacenamiento a 4°C.
Dia
0
Aspecto evaluados
Aspecto general
Sin trat.
Típico, fresco
Escaldado en agua
cocido
Naranja
típico
Firme, típico fresco
Naranja intenso
típico
firme
3
Color
Aroma
Textura (corte con
cuchillas)
Exudado
Aspecto general
Escaldado con MO
Similar al fresco, no
cocido
Naranja intenso
Típico
Firme
Algo lignificado y
reseco
Naranja
blanquecino
Típico, menos
intenso
Firme
Cocido
Similar, no cocido
Naranja intenso
Naranja intenso
típico
Típico
Firme. Menos que el
testigo almacenado.
Aureola blanca
alrededor del centro
Alto
Cocido
Firme. Tejido no
contraído, uniforme
Naranja intenso
Naranja intenso
típico
Típico
Firme. Disminución en
superficie
Alto
Muy cocido
Más firme que agua.
Naranja muy fuerte
Naranja fuerte,
brillante
Típico
Ídem día 5. No libera
líquido en el interior.
Tejido uniforme.
Color
Aroma
Textura (corte con
cuchillas)
5
Exudado
Aspecto general
7
Color (respecto al
fresco)
Aroma (respecto al
fresco)
Textura (prueba de
corte con cuchillas)
Exudado
Aspecto general
Color
Aroma
Textura (corte con
cuchillas)
Exudado
Bajo
Lignificado, reseco,
agrietado
Naranja pálido
blanquecino
típico
Firme, tejido algo
contraído
Bajo
Lignificado, muy
reseco, agrietado
Naranja
blanquecino, pálido
Sin olor
Firme. Exuda
líquido en el
interior. Tejido
contraído
Bajo
típico
Ídem día 5. No libera
líquido en el interior.
Tejido uniforme, no
contraído
Alto
Medio
Algo cocido
Medio
Algo cocido
Medio
CONCLUSIONES
Las zanahorias peladas y cortadas constituyen un producto interesante debido a su aporte en pigmentos
antioxidantes, y nutrientes y si bien su consumo es recomendable, su estabilidad sensorial, sin embargo es
limitada. En este trabajo se demostró que ambas técnicas de escaldado inactivan eficazmente la enzima por
igual. Ambas técnicas de escaldado en rodajas de zanahorias mostraron un incremento en la intensidad del
color, en comparación con el testigo, debido a la inhibición parcial de la enzima oxidante. Sin embargo, las
muestras escaldadas por MO presentan mayor similitud al producto fresco en cuanto a firmeza, aspecto,
exudado, aroma y color, resultando por dichos motivos el método de escaldado más favorable. Además no se
observaron cambios significativos en los contenidos de fenoles totales y β- carotenos tanto después del
tratamiento como durante el almacenamiento. Sin embargo este trabajo debería complementarse analizando
162
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
otras combinaciones posibles de potencia y tiempo de tratamiento y con un estudio microbiológico para
asegurar su vialidad.
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164
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Propiedades térmicas y estructurales de películas compuestas de poli (vinil alcohol) y
carboximetilcelulosa
Villarruel S. Rivero1 S. y Pinotti1,2 A.
1. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA), CONICET, Facultad
Ciencias Exactas,
2. Facultad Ingeniería, UNLP, La Plata, ARGENTINA.
sandra_gmr@yahoo.com
Resumen: Los objetivos propuestos fueron: evaluar las propiedades térmicas de las películas desarrolladas a
base de poli vinil alcohol (PVA) y carboximetilcelulosa (CMC), identificar los grupos funcionales
involucrados en las interacciones de la matriz polimérica.
A partir de los espectros dinámico mecánicos de las películas de PVA y CMC se visualizó en las curvas de
tan δ la temperatura de transición vítrea (Tg) localizada a 65ºC y a 142ºC, respectivamente valores que
correlacionaron con los obtenidos por calorimetría diferencial de barrido modulada (MDSC).
Por espectroscopía de infrarrojo se identificaron las bandas características de cada polímero. El espectro
resultante de las películas compuestas de PVA y CMC mostró una combinación de los espectros
individuales. Los desplazamientos y la aparición de nuevos picos confirmaron las interacciones establecidas
entre la CMC y el PVA a través de puentes de hidrógeno Por microscopía electrónica de barrido (SEM) se
evidenció una estructura del tipo globular, lo que permite explicar los cambios en las propiedades del
material. Se demostró la factibilidad de la CMC para formar películas de un solo componente y sistemas
combinados con PVA. Se comprobó que el agregado de PVA en la formulación mejoró propiedades de
barrera al vapor de agua sin detrimento de las propiedades mecánicas.
Palabras claves: Películas biodegradables, propiedades térmicas, propiedades mecánicas.
Abstract: The objectives were: to evaluate the thermal properties of the films based on poly vinyl alcohol
(PVA) and carboxymethyl cellulose (CMC) and to identify the functional groups involved in the interactions
of the polymer matrix.
From dynamic mechanical spectra of PVA films, the glass transition temperature (T g) located at 37°C was
visualized in tan δ curves, while CMC films presented a Tg at about 142°C. These values correlated with
those obtained by Modulated differential scanning calorimetry (MDSC).
From infrared spectroscopy bands were identified the characteristics of each polymer. Moreover, the films
composed of PVA and CMC resulting spectrum showed a combination of the individual. The displacements
and the appearance of new peaks confirmed the interactions established between the CMC and the PVA
through hydrogen bridges scanning electron microscopy (SEM) shows a globular type structure, allowing to
explain the changes in material properties. The feasibility of the CMC to form a single component films and
combined with PVA. It was found that addition of PVA in the formulation improved barrier properties to
water vapor without detriment of the mechanical properties.
INTRODUCCIÓN
La modificación de polímeros sintéticos empleando otros polímeros de origen natural es una vía para la
obtención de materiales biocompatibles y/o biodegradables. El alcohol polivinílico (PVA) es un polímero
hidrosoluble que puede ser utilizado como base para la realización de mezclas con otros polímeros. El PVA
es sintético, con una estructura semicristalina, obtenido mediante hidrólisis del acetato de polivinilo (Kubo y
Kadla, 2003). A pesar de su origen sintético es un polímero no tóxico, biodegradable y biocompatible, por lo
que ha sido utilizado en las industrias químicas, de envases y en las áreas farmacéutica y médica.
La carboximetilcelulosa (CMC) es un derivado de la celulosa con propiedades filmogénicas, utilizada en el
área de alimentos. La combinación de ambos polímeros para producir películas biodegradables permite
obtener materiales con propiedades con posibles aplicaciones en el desarrollo de envases (Dalla-Vecchia et
al. 2005).
Los objetivos propuestos fueron: evaluar las propiedades térmicas de las películas desarrolladas a base de
poli vinil alcohol (PVA) y carboximetilcelulosa (CMC), identificar los grupos funcionales involucrados en
las interacciones de la matriz polimérica.
165
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MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
Se utilizó poli vinil alcohol (ELVANOL T25) proporcionado por DuPont, y carboximetilcelulosa, sódica
(Parafarm).
Preparación de las películas
Las soluciones de PVA al 2% (p/p) se prepararon por solubilización en agua a 80ºC durante 40 min. La
soluciones de CMC al 1.5% (p/p) se prepararon por solubilización en agua y mediante agitación durante 24
horas. Todas las películas se prepararon mediante la técnica de moldeo de 20 g de la solución formadora de
películas en placas de acrílico; las cuales se secaron en estufa a 37°C. A partir de estas soluciones
formadoras de películas se prepararon mezclas de CMC y PVA con las siguientes proporciones CMC:PVA:
25:75, 50:50, 75:25 (p/p).
Espesor de las películas
Las medidas de los espesores de las muestras se realizaron utilizando un medidor electrónico CheckLine 900
(EE.UU) para materiales no conductores y sustratos no ferrosos. Los valores informados fueron el promedio
de al menos 10 medidas.
Contenido de humedad
La pérdida de peso de las películas se determinó midiendo el peso a tiempo inicial y luego de ser secadas en
estufa a 105°C hasta peso constante. Las muestras se analizaron por triplicado, y los resultados obtenidos
fueron expresados en porcentaje (g agua / 100 g película).
Permeabilidad al vapor de agua (PVA)
La permeabilidad al vapor de agua, se determinó según una modificación del método de la ASTM E96
(Rivero et al. 2009). Las películas se colocaron en celdas de acrílico, y las mismas fueron depositadas en
recipientes herméticos. Las muestras se sometieron a un gradiente de humedad relativa, colocando sílica gel
anhidra en la celda (0% RH), y una solución saturada de NaCl en el recipiente (75% RH). Este gradiente
corresponde a una fuerza impulsora de 1753.55 Pa, expresada como presión parcial de vapor de agua a 20°C.
Se registró el cambio en el peso de la celda en una balanza analítica y ésta se graficó en función del tiempo
(h). Los datos se regresionaron linealmente, se calculó la permeabilidad al vapor de agua (PVA) en g Pa-1 s-1
m-1 de las películas desarrolladas considerando el espesor de las mismas.
Propiedades mecánicas
La resistencia a la tracción (MPa), la elongación porcentual (%) y el módulo elástico se determinaron en un
texturómetro TA.XT2i – Stable Micro Systems (Inglaterra) mediante ensayos con un sistema de pinzas de
tensión A/TG según la norma ASTM D882-91 (1996). Para los ensayos se utilizaron películas de 6 cm de
longitud y 0.7 cm de ancho. Las curvas de fuerza (N) en función de la deformación (mm) fueron registradas
por el software Texture Expert Exceed instalado en una PC conectada al equipo.
Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Los estudios de la morfología de las películas se realizaron por microscopía electrónica de barrido con un
SEM FEI QUANTA 200 (Japón). Para las observaciones de secciones transversales las películas fueron
criofracturadas por inmersión en nitrógeno líquido. Las muestras se montaron en tacos de bronce con una
cinta bifaz, permitiendo así la visualización de las superficies y de las secciones transversales. Además, las
observaciones SEM también permitieron evaluar el espesor de las películas.
Difracción de rayos X
Los patrones de difracción de rayos X de las películas se obtuvieron usando un equipo X’Pert Pro P
Analytical Model PW 3040/60 (Holanda), utilizando la línea Cu Kα (1.542 Å), con una diferencia de
potencial de 40 kV y una densidad de corriente de 30mA. Las muestras se registraron entre 3–60º grados
(2θ). Para efectuar el análisis las muestras fueron acondicionadas a 20ºC y 55% HR.
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Propiedades térmicas de las películas (MDSC)
Las propiedades térmicas de las películas formuladas con PVA, CMC y sus mezclas fueron determinadas
usando un calorímetro diferencial de barrido modulado (DMSC) modelo Q100 de (TA Instruments, New
Castle, Delaware, USA).
Muestras de aproximadamente 6-5 mg se pesaron en cápsulas de aluminio selladas herméticamente,
utilizando una cápsula vacía como referencia. Los análisis de DSC se realizaron a una velocidad de
calentamiento de 10 ºC min-1 en un intervalo de temperaturas de -100 a 250 ºC. Luego de que el primer
barrido fue completado, la muestra se enfrió hasta -100 ºC y se registró una segunda corrida sobre la misma
muestra.
Se efectuaron dos barridos en simultáneo. Los parámetros vinculados al proceso se determinaron con el
software Universal Analysis V1.7F (TA Instruments).
Análisis dinámico mecánico (DMA)
Los ensayos fueron realizados en un equipo de análisis dinámico-mecánico térmico Q800 (TA Instruments,
New Castle, EE.UU) usando pinzas de tensión con un sistema de enfriamiento con N2 líquido. Las películas
se cortaron con una geometría rectangular (30 mm de largo, 6 mm de ancho y espesores entre 50 y 70 m).
El barrido de amplitud se realizó a una frecuencia fija de 5 Hz con el objeto de determinar el rango de
viscoelasticidad lineal de la muestra y seleccionar la amplitud de trabajo. Se llevaron a cabo ensayos de
barrido de frecuencias a 1, 3, 5, 10 y 15 Hz dentro del rango de viscoelasticidad lineal. La temperatura varió
entre -90 a 200°C a una velocidad de calentamiento de 5°C/min.
Las curvas del módulo de almacenamiento (E´), el módulo de pérdida (E”) y la tan δ (E”/E´) en función de la
temperatura fueron registradas y analizadas utilizando el software Universal Análisis 2000. Se determinaron
las temperaturas de los procesos de relajación asociadas a la transición vítrea del material a través del pico
máximo alcanzado en las curvas de la tan δ y del módulo E”, y el punto de inflexión en la curva del módulo
E´.
Análisis estadístico
Para el análisis de los resultados obtenidos se empleó el test de comparación de medias de Fisher (LSD) y de
análisis de varianza (ANOVA), utilizando el paquete estadístico Systat (versión 10, USA), con un nivel de
significación de 0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización fisicoquímica de las películas
Las películas de un solo componente (PVA o CMC) y sus mezclas fueron transparentes y de apariencia
uniforme. Las mismas fueron fácilmente removidas de las placas de acrílico en todas las concentraciones
ensayadas, y el espesor promedio de las mismas se encontró en el rango de 50 a 70 μm.
Los valores de permeabilidad al vapor de agua (WVP) y de humedad de las películas obtenidas se muestran
en la Tabla 1. Los valores de WVP para las películas de CMC y PVA fueron de 7,68 y 1,46 × 1011 g s-1 m-1
Pa-1, respectivamente. Se observa una mejora de las propiedades de barrera con el agregado de PVA en las
mezclas. Asimismo, las películas de CMC y las películas mezclas con mayos proporción de CMC presentan
mayores valores de humedad esto puede atribuirse a las propiedades hidrofílicas del polímero.
Tabla 1 Contenido de humedad y propiedades de barrera al vapor de agua de películas compuestas por CMC
y PVA*.
CMC
75-25
50-50
25-75
PVA
*
Contenido de humedad
(g/100 g de películas)
24,06 (0,54)
19,05 (0,07)
16,08 (0,56)
17,05 (0,86)
9,18 (0,51)
WVP g x 1011
g s-1 m-1 Pa-1
7,68 (0,93)
3,63 (0,24)
2,07 (1,32)
1,59 (0,54)
1,46 (0,51)
Los valores entre paréntesis corresponden a la desviación estándar.
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Propiedades mecánicas
La Figura 1a y b muestra los parámetros obtenidos de los perfiles mecánicos de los materiales desarrollados.
Las películas de CMC presentan un comportamiento de un material rígido y quebradizo, mientras que el
PVA un patrón correspondiente a una matriz flexible.
Las mezclas no presentan un comportamiento que refleje el aporte ponderado de sus componentes. Las
películas compuestas 50-50 y 75-25 reproducen el comportamiento de la CMC con ligeras diferencias en la
elongación para la mezcla 50-50. Mientras que sólo la formulación 25-75 evidenció un patrón mecánico
similar al del PVA.
80
Esfuerzo (MPa)
a
60
40
20
0
PVA
25-75
50-50
75-25
CMC
160
b
Elongación (%)
120
80
40
0
PVA
25-75
50-50
75-25
CMC
Figura 1: Propiedades mecánicas de películas a base de CMC y PVA y sus mezclas en distintas
proporciones.
Análisis por microscopía electrónica de barrido
Llamamos morfología a la forma constituida por las dos fases y al arreglo de las fases. Controlando las
cantidades relativas de los polímeros es posible afectar la morfología de una mezcla inmiscible. Como se
muestra en la Figura 2 las películas de un solo componente evidencian una estructura homogénea, compacta,
sin poros, en tanto la morfología de muestras compuestas analizadas por SEM es principalmente globular.
En la micrografía de la mezcla 25:75 es posible observar al componente minoritario, CMC, inmerso en una
fase continua de PVA. En el caso del sistema compuesto 75:25 se tiene el arreglo contrario, es decir una fase
discontinua de PVA en la fase mayoritaria de CMC. Cuando las cantidades de una y otra son iguales, es decir
en la mezcla 50:50 los dominios de ambos polímeros son co-continuos.
168
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Figura 2: SEM de corte transversal de películas a base de CMC y PVA y sus mezclas en distintas
proporciones.
Propiedades térmicas y espectroscópicas
La Figura 3 muestra la dependencia de la tan δ con la temperatura para las películas de PVA, CMC y sus
mezclas.
La relajación β, característico del movimiento local de los segmentos de las cadenas poliméricas o asociado a
los movimientos de las moléculas de agua en los materiales, se localizó alrededor de -25ºC para la CMC y la
mezcla 75:25. Sin embargo no fue visible para el PVA y las mezclas 50:50 y 25:75.
El segundo pico observado en las curvas de tan δ de los espectros de las películas de CMC y PVA
corresponde a la relajación α, la que se asocia a la transición vítrea dinámica (T g). Los espectros dinámico
mecánicos de las películas de PVA y de CMC evidenciaron la Tg localizada a 37ºC y 142ºC,
respectivamente. Este evento es independiente de la frecuencia ensayada y refleja la movilidad de los
segmentos de las cadenas largas en los dominios amorfos del polímero (Lazaridou y Biliaderis, 2002).
En el caso de las mezclas, se observa un comportamiento típico de sistemas binarios inmiscibles, donde se
observa la contribución de cada componente individual de la mezcla en los fenómenos de relajación.
Similares resultados fueron informados por Sarli y Scandola (1995) para películas compuestas por colágeno
y poli vinil alcohol.
A través del análisis de las curvas de flujo de calor reversible obtenidas por MDSC se pudo observar
nuevamente el comportamiento típico de un sistema binario inmiscible evidenciado por la aparición de dos
temperaturas de transición vítrea cada una correspondientes a los polímeros empleados para la formulación
de las mezclas.
0,40
0,35
0,30
tan ()
0,25
PVA
25-75
50-50
75-25
CMC
0,20
0,15
0,10
0,05
-100
-50
0
50
100
150
200
Temperatura (ºC)
Figura 3: Espectro dinámico mecánico de películas de CMC y PVA y sus mezclas en distintas proporciones.
Se analizaron los espectros obtenidos por difracción de rayos X de las películas, dado que el conocimiento de
la microestructura del material es crítico y determina sus propiedades mecánicas y de barrera.
169
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(Figura 4
lo que indicó la presencia de una estructura semicristalina
típica del polímero, consistente con estudios preliminares realizados por Bhadra y Sarkar (2010).
En el caso de las películas de CMC el patrón de difracción presentó un solo pico muy ancho a 21º. Las
películas compuestas evidenciaron un comportamiento intermedio entre ambos polímeros. La mezcla 75:25
presentó aún un pico muy poco definido a 11º y otro definido a 20º. Las mezclas con cantidades crecientes
de CMC sólo permiten visualizar el pico a 20º, con una intensidad creciente a medida que aumenta la
proporción de PVA. Este hecho podría ser explicado teniendo en cuenta cierto grado de ordenamiento de las
moléculas involucradas en las interacciones entre polímeros. Estos resultados explican las diferencias
encontradas en las propiedades de barrera al vapor de agua de las películas. Las mezclas entre los polímeros
pueden inducir la formación uniones puente hidrógeno inter e intramoleculares dando lugar a la formación de
una estructura con un ordenamiento diferente que modifique las propiedades de los materiales.
PVA
25-75
50-50
75-25
Intensidad (cps)
CMC
10
20
30
40
50
60
2
Figura 4: Espectros de difracción de rayos X de películas de PVA y CMC y sus mezclas en distintas
proporciones.
Análisis por FTIR
La Figura 5 muestra los espectros de FTIR de películas de PVA y CMC y sus mezclas.
PVA
25-75
50-50
75-25
Absorbancia
CMC
4000
3000
2000
1500
1000
500
-1
Número de onda (cm )
Figura 5: Espectros de FTIR de películas de PVA y CMC y sus mezclas en distintas proporciones.
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En el caso de los de las películas de PVA los espectros evidenciaron una banda localizada en la región de
3500-3000 cm-1 debida la vibración del estiramiento -OH de las moléculas de alcohol y agua, mientras los
picos a 2943 y 2911 cm-1 correspondieron a los grupos CH y CH2 (Labidi y Djebaili, 2008). Además, la
banda a 1713 cm-1 asociada con las vibraciones del estiramiento del C=O de los grupos acetato se
correlacionaron con el hombro a 1270 cm-1, que está de acuerdo con un alcohol polivinílico parcialmente
hidrolizado.
En las películas de CMC se visualizó una banda debida a los -OH en la región de 3500 cm-1, un pico a 2927
cm-1 correspondiente a la vibración del estiramiento CH y a 1064 cm-1 ( unión -COC) debido el estiramiento
asimétrico de la banda de éter.
La desprotonación de los grupos carboxilo se puede comprobar por la ausencia del estiramiento del carbonilo
a 1732 cm-1 y la presencia tanto del pico a 1583 cm-1 debido al estiramiento asimétrico de la unión -COOcomo del pico a 1418 cm-1 correspondiente al estiramiento simétrico del mismo (Cuba-Chiem et al. 2008).
La banda observada a 1110 cm-1 es atribuida a las vibraciones de las uniones C(5)-C(6) y C(6)-O(6)
mientras la banda a 1153 cm-1 se debe a una combinación de la CO-y-CC-COH con estiramiento y flexión CCH.
El espectro resultante de las películas compuestas de PVA y CMC mostró una combinación de los espectros
individuales. Los desplazamientos y la aparición de nuevos picos confirmaron las interacciones establecidas
entre la CMC y el PVA a través de puentes de hidrógeno (Taleb et al. 2009).
CONCLUSIONES
Se demostró la factibilidad de la CMC para formar películas de un solo componente y sistemas combinados
con PVA. Se comprobó que el agregado de PVA en la formulación mejoró propiedades de barrera al vapor
de agua sin detrimento de las propiedades mecánicas. Asimismo, los espectros dinámico mecánicos
permitieron visualizar el comportamiento de los componentes de la mezcla. Los espectros de difracción de
rayos X, la microscopía electrónica de barrido y los espectros obtenidos por FTIR evidenciaron los cambios
ocurridos a nivel estructural que permitieron explicar las modificaciones en las propiedades de los
materiales.
BIBLIOGRAFÍA
Bhadra J, Y Sarkar D. 2010. Electrical and optical properties of polyaniline polyvinyl alcohol composite
Films. Indian Journal of Pure & Applied Physics, 48, 425-428.
Cuba-Chiem LT, Huynh L, Ralston J, and Beattie DA. (2008) In situ particle film ATR FTIR spectroscopy
of carboxymethyl cellulose adsorption on talc: binding mechanism, pH effects, and adsorption kinetics.
Langmuir, 24, 8036-8044.
Dalla-Vecchia R, Sebrao D, Nascimento MG, Soldi V. 2005. Carboxymethylcellulose and poly(vinyl
alcohol) used as a film support for lipases immobilization. Process Biochem. 40, 2677–2682.
Kubo S, Kadla JF. 2003. The Formation of Strong Intermolecular Interactions in Immiscible Blends of
Poly(vinyl alcohol) (PVA) and Lignin. Biomacromolecules, 4, 561-567.
Labidi NS, Djebail A. 2008. Studies of the mechanism of polyvinyl alcohol adsorption on the calcite/water
interface in the presence of sodium oleate. Journal of Minerals & Materials Characterization &
Engineering, 7 (2), 147-161.
Lazaridou A, Biliaderis CG. 2002. Thermophysical properties of chitosan, chitosan-starch and chitosanpullulan films near the glass transition.Carbohydrate polymer, 48, 179-90.
Rivero, S, García MA, A, Pinotti. 2009. Composite and bi-layer films based on gelatin and chitosan. Journal
of Food Engineering, 90, 531-539.
Sarti B, Scandola M. 1995. Viscoelastic and thermal properties of collagen/poly(vinyl alcohol) blends.
Biomaterials, 16, 785-792.
Taleb MFA, Abd El-Mohdy HL, Abd El-Rehim HA. 2009 Radiation preparation of PVA/CMC copolymers
and their application in removal of dyes. Journal of Hazardous Materials, 168, 68-75.
171
Biotecnología
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Estudio de la coagulación enzimática de micelas de caseína bovina inducida por endopeptidasas
segregadas por Bacillus sp. P45
Apesteguía A1, Mancilla Canales M1, Quiroga M1, Daroit D2, Brandelli A2, Risso P1,3
1: Universidad Nacional de Rosario. Rosario, Argentina.
2: Universidade Federal de Rio Grande do Sul. Porto Alegre, Brasil.
3: IFIR-CONICET. Rosario, Argentina.
phrisso@yahoo.com.ar
Resumen: Se evaluó el proceso de coagulación enzimática de micelas de caseína bovina (MC). Las enzimas
se obtuvieron a partir de Bacillus sp. P45 aislados de Piaractus mesopotamicus. La bacteria creció en medio
de cultivo nutritivo por 48 h a 30 °C.
Se centrifugaron los cultivos, luego se adicionó sulfato de amonio al sobrenadante hasta alcanzar un 60 % de
saturación. Por último se realizó una filtración en gel en una columna Sephadex G-100. Las fracciones que
mostraron actividad proteolítica sobre la azocaseína se recolectaron para ensayos de hidrólisis proteica. Se
aplicó un diseño de experimentos factorial para evaluar la significancia de la temperatura (T), pH y la
concentración de enzima (E) sobre el tiempo de coagulación (t c), la velocidad inicial de agregación (vi) y la
dimensión fractal (Df). Se practicaron t-test ANOVA para determinar si los factores independientes
estudiados resultaban significativos (p < 0,05) y se obtuvieron modelos matemáticos descriptivos y
predictivos. Se determinó que tc aumenta al incrementar el pH y al disminuir E y T. La vi dependió en forma
directa de T pero disminuyó al aumentar el pH y la E. El grado de compactación al final del proceso de
coagulación, estimado a través de Df, tiene una dependencia directa con la temperatura pero decrece al
hacerlo el pH y E.
En conclusión, el pool enzimático P45 induce la coagulación enzimática de las MC, encontrándose
ecuaciones modelo que permiten describir y predecir la cinética de coagulación y el grado de compactación
de los coágulos obtenidos.
Palabras claves: coagulación enzimática, endopeptidasas bacterianas, micelas de caseína
Abstract: It was evaluated the enzymatic coagulation process of bovine casein micelles (MC). The involved
enzyme was obtained from Bacillus sp. P45 isolated from Piaractus mesopotamicus. Bacillus sp. P45 was
cultured in feather meal broth for 48 h at 30 °C. Cultures were centrifuged, and then ammonium sulfate was
added to the supernatant until 60% saturation was reached. Finally a gel-filtration in Sephadex G-100
column was performed. Fractions showing proteolytic activity on azocasein were pooled for protein
hydrolysis. We applied a factorial design of experiments to evaluate the significance of temperature (T), pH
and enzyme concentration (E) on the coagulation time (tc), the initial aggregation rate (vi) and the fractal
dimension (Df). Through statistical parameters (t-test ANOVA) it was identified the factors and interactions
that were significant (p < 0.05) and obtained descriptive and predictive mathematical models. It was found
that tc increase its value as the pH increases and E and T decrease. The vi has a direct dependence on T but
decreases as pH and E increase. The degree of compactness at the end of the coagulation process, estimated
through Df, has a direct dependence with T but it decreases with the pH and E. In conclusion, the enzymatic
pool P45 induced the coagulation of MC, it could be found equations that model and predict the kinetics of
this coagulation and the degree of compactness of aggregates obtained.
Key words: enzymatic coagulation, bacterial endopeptidases, casein micelles.
INTRODUCCIÓN
Las caseínas (CN), mayores componentes de las proteínas lácteas, son fosfoproteínas específicas de la leche
y están compuestas de distintas fracciones: αS1-, αS2-, β- y κ-CN. Las mismas se encuentran en la leche en
forma de micelas (MC), las que se mantienen estables debido a factores electrostáticos y estéricos [3]. En los
últimos veinte años, se ha evidenciado que las CN presentes en los quesos, son fuente de péptidos bioactivos
con potencial beneficio para la salud [4]. Estos péptidos están inactivos dentro de la secuencia de la proteína
de origen y pueden ser liberados durante el procesamiento del alimento o digestión gastrointestinal. Una vez
173
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liberados, los péptidos poseen diversas actividades biológicas, entre las cuales se destacan actividades
regulatorias de los sistemas gastrointestinal, inmune, cardiovascular, y nervioso [5-6].
Las proteínas del suero lácteo, un subproducto reconocido como ingrediente alimentario con importante
valor nutricional y funcional, han recibido interés y aceptación creciente como ingrediente funcional para
alimentos [7]. El suero constituye cerca del 85-90% del volumen de leche utilizado para la elaboración de los
quesos, y retiene cerca del 55% de los nutrientes de la leche. Formulaciones con proteínas de suero
hidrolizadas son benéficas para los niños con intolerancia a la leche bovina.
Existe, por tanto, un significativo potencial para uso de hidrolizados de proteínas lácteas, caseínas o
proteínas del suero, con miras al desarrollo de nuevos productos o ingredientes alimentarios. En la
manufactura de productos lácteos uno de los procesos más frecuentemente utilizados es la gelación o
coagulación de dichas proteínas, ya sea por el agregado de enzimas y/o por la adición de substancias o de
cultivos bacterianos que modifican la acidez del medio [3].
En el caso de la coagulación enzimática, las enzimas utilizadas son endopeptidasas ácidas de origen animal,
vegetal, fúngico u obtenidas por técnicas de ADN recombinante. Los productos de hidrólisis obtenidos con
dichas enzimas poseen sabor amargo, lo que dificulta el aprovechamiento del suero lácteo tal como es
obtenido. Es necesario utilizar técnicas de intercambio iónico y ultrafiltración para obtener concentrados o
aislados proteicos del suero bovino (WPC o WPI), que encarecen la producción de dichos ingredientes
alimentarios [8].
La hidrólisis enzimática bajo condiciones moderadas de pH (6-8) y de temperatura (40-60 °C) hace posible
obtener componentes nutricionales bioactivos con propiedades funcionales aumentadas. Esta hidrólisis puede
modificar las propiedades funcionales proteicas tales como la gelación/coagulación [5, 9].
Las proteasas son importantes enzimas hidrolíticas ampliamente usadas en las industria alimentaria para
diferentes propósitos como la elaboración de quesos, productos de panadería, preparación de hidrolizados de
soja y tiernizado de carnes [10-11]. Por lo tanto, la investigación de nuevas preparaciones obtenidas a partir
de proteasas de diferentes fuentes y la profundización del conocimiento de sus productos derivados ha
adquirido gran importancia.
Las proteasas microbianas son particularmente interesantes debido al alto rendimiento logrado durante su
producción a través de métodos de cultivo bien establecidos. La producción de proteasas es una propiedad
inherente de los microorganismos, y la explotación de la biodiversidad es considerada una alternativa
favorable para proveer a la industria con una gran variedad de microorganismos y proteasas adecuadas para
diversos propósitos [12].
Las bacterias del tracto intestinal de peces son consideradas especialmente como una fuente aún no
explorada para la producción de enzimas [13]. En este sentido, se ha reportado que bacterias identificadas
filogenéticamente como linajes de Bacillus, aisladas del conducto intestinal del Piaractus mesopatamicus,
producen elevados niveles de proteasas extracelulares con potencial biotecnológico al ser cultivadas en
medios relativamente económicos [14-16].
Estas endopeptidasas son activas en un rango restricto de pH (5-8) y son poco termotolerantes. Debido a sus
velocidades de reacción intermedias, generan menos amargor en los hidrolizados de proteínas alimentarias
que las endopeptidasas ácidas, por lo tanto, son de interés para la industria de los alimentos. Su baja
termotolerancia es ventajosa para controlar su reactividad [10]. Además se ha comprobado que generan
hidrolizados de CN con actividad biológica variada (poder antioxidante, actividad antibacteriana y
antifúngica, poder reductor, actividad quelante), tópico de interés en el campo de los alimentos funcionales
[17-18].
Los geles proteicos son responsables de la mayoría de las propiedades reológicas/texturales (ej. elasticidad,
resistencia, dureza) de diversos productos alimenticios [19]. Durante la formación de un gel alimenticio, la
composición del sistema, las interacciones entre sus componentes y las condiciones del proceso afectan las
propiedades mecánicas de dicho gel y, por lo tanto, su textura [20]. Los cambios en la velocidad del proceso
de coagulación pueden afectar las propiedades físicas del gel formado, como la textura y la capacidad de
retención de agua del producto. Las propiedades mecánicas pueden explicarse considerando la estructura de
los geles coloidales como una red de agregados fractales empaquetados o en forma de racimos [21].
El profundo conocimiento de la compleja relación entre los distintos componentes de una formulación
alimenticia permitirá controlar y/o monitorear mejor la micro/nano estructura y, consecuentemente,
manipular la textura de los alimentos procesados y formular nuevos productos con características
diferenciadas. Sin embargo, los modelos para predecir sistemas complejos necesitan ser modificados
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continuamente con el fin de relacionarlos con la textura del alimento más estrechamente. En este caso, la
utilización de sistemas modelo es muy importante para proveer un marco científico [22].
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
La MC se reconstituyeron al 10 % P/V a partir de leche en polvo descremada (SVELTY) en una solución
acuosa de cloruro de calcio 10 mM en buffer Tris-HCl de pH a ensayar (6,5-8,5). La concentración proteica
se determinó por espectrofotometría utilizando el método de Kuaye, el cual se basa en la modificación del
espectro del aminoácido tirosina a altas longitudes de onda (λ) de la región UV en un medio alcalino fuerte
(pH13) [26].
Obtención del pool enzimático P45
El pool enzimático fue producido por el Bacillus sp. P45, cepa aislada del intestino del pez Piaractus
mesopatamicus; las bacterias se inocularon en tubos de ensayo con infusión de cerebro-corazón (BHI)
líquida (5 mL) y se dejaron 24 h a 30 ºC. Luego, una muestra de 1 mL se traspasó a otro tubo de ensayo con
BHI (5 mL) y se volvió a incubar 24 h a 30 ºC. Por último, se tomaron 500 μL y se inocularon en un medio
agar-BHI que se dejó en estufa por 24 h a 37 ºC. Al cumplirse dicho tiempo, se aisló una colonia del pasto y
se inoculó en un nuevo medio agar-BHI. Seguidamente se puso en estufa por 24 h a 37 ºC. Luego se tomó
una colonia aislada y se colocó en un erlermeyer conteniendo 100 mL de medio de cultivo con NaCl 0,5 g L 1
, KH2PO4 0,4 g L-1, K2HPO4 0,3 g L-1 y harina de pluma de gallina al 1%, y se incubó 48 h a 30 ºC con
agitación constante a 180 rpm en un agitador rotatorio. Posteriormente, se centrifugó durante 15 min a 3.000
g. El sobrenadante de cultivo fue precipitado con sulfato de amonio al 60 % de saturación, se dejó 1 h en
agitación y luego1 h a 4 ºC. Posteriormente, se centrifugó 15 min a 10.000 g a 4 ºC. El precipitado se
resuspendió en la menor cantidad posible de buffer Tris-HCl 20 mM pH 8. Por último, se realizó una
cromatografía líquida en Sephadex G-100 (1 g en 100 mL de buffer Tris-HCl 20 mM pH 8). Las fracciones
recolectadas con actividad proteolítica formaron un pool enzimático que denominamos proteasa P45.
Determinación de la actividad proteolítica de la proteasa P45
La actividad proteolítica se midió por el Método de Azocaseína [27]. La mezcla de reacción (300 μL) se
preparó con 100 μL de proteasa P45, 100 μL de medio Tris-HCl 20 mM pH 8, 100 μL de azocaseína 1% P/V
(en buffer Tris-HCl). Se incubó a 37 ºC por 10 min y luego se adicionaron 500 μL de TCA 10% P/V en todas
las muestras. Se centrifugó 5 min a 10.000 g. El sobrenadante se mezcló con 200 μL de NaOH 1,8 N y se
midió la absorbancia (A) a 420 nm. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de
proteasa que causa un aumento de 0,1 en la A en las condiciones del ensayo.
Evaluación de la cinética de la coagulación enzimática mediante un diseño experimental
El ensayo de coagulación de las MC fue iniciado por adición de la enzima P45 (70 U.mL -1), evaluando el
efecto de relación de volúmenes enzima/sustrato (E/S), temperatura (T) y pH. Se realizaron diseños
experimentales factoriales considerando como factores independientes la relación E/S (V/V: 1/240-1/60), T
(35-55 ºC) y pH (6,5-8,5), manteniendo la concentración de CN y Ca2+ constantes. Como variables
respuestas se evaluaron el tiempo al cual comienza la coagulación (tc), la velocidad inicial de coagulación
(vi) y la dimensión fractal de los coágulos obtenidos (Df). A través de los parámetros estadísticos obtenidos
del t-test ANOVA se determinaron los factores e interacciones que resultaron significativos. Una vez
determinados los mismos, se ajustaron las respuestas mediante el modelo correspondiente y se analizaron los
residuos comprobándose normalidad e independencia de los mismos. Para visualizar el comportamiento de
las variables respuestas se graficaron superficies y contornos convenientes para cada situación. Se utilizó
regresión múltiple con variables codificadas para obtener modelos matemáticos descriptivos y predictivos
del comportamiento del sistema.
La cinética de la coagulación enzimática se evaluó mediante los cambios de turbidez (La cinética de la
coagulación enzimática se evaluó mediante los cambios de turbidez (τ) a través del tiempo luego de
adicionada la proteasa P45. Los cambios de tamaño y/o grado de compactación de las MC se estudiaron
basándose en la dependencia de la La cinética de la coagulación enzimática se evaluó mediante los cambios
de turbidez (τ) (medida como A) con la longitud de onda (λ en el rango de 450-650 nm, rango en donde no
hay absorción de los grupos cromóforos proteicos. El parámetro β, relacionado con el tamaño y grado de
175
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
compactación de las partículas y que puede ser utilizado para evaluar el estado de las partículas durante la
coagulación, se define como:
β  4,2 
 log A
 log λ
(1)
Donde logA/log λ es la pendiente de un gráfico lineal de log A vs. Log λ obtenido a partir de espectros de
absorción realizados a distintos tiempos (t) antes y durante la coagulación. A modo de ejemplo, se presenta la
Figura 1.
La Df, medida del grado de compactación de la malla del coágulo, se estimó como el máximo valor de β
alcanzado (Figura 1A). La vi se estimó como la pendiente de la porción lineal inicial de un gráfico de β vs. t,
como se muestra en la Figura 1B. En este caso, el tc se determinó como el tiempo al que comienza un
aumento brusco de β (Figura 2).
2.4
2.4
2.2
2.2
2.0
2.0
1.8


Df
1.6
1.8
Vi
1.6
1.4
A
B
1.4
1.2
1.2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0
2
4
6
t (min)
8
10
12
14
16
18
t (min)
Figura 1. Ejemplo de la obtención de la Df (A) y de vi (B).
2.4
2.2

2.0
1.8
1.6
1.4
tc
1.2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
t (min)
Figura 2. Ejemplo de la obtención de la tc.
Análisis estadístico
Las determinaciones se realizaron al menos por duplicado. Los valores reportados son los valores promedio
± su error estándar. El análisis estadístico fue hecho con los programas Sigma Plot 10.0, Minitab 16 y Origin
Pro. La relación entre variables fue estadísticamente evaluada por análisis de correlación utilizando el
coeficiente de correlación de Pearson. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas a
valores de p < 0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación de la cinética de la coagulación de las MC inducida por la proteasa P45
Para este estudio se aplicó un diseño factorial fraccionado para evaluar la significancia de los efectos de las
variables independientes T, pH y la relación E/S sobre las variables dependientes t c, vi y Df. En la Tabla I se
muestran los valores de las variables independientes no codificadas y codificadas. Todos los ensayos se
realizaron al menos por duplicado, a concentración de CN y Ca 2+ constantes de 30 g/L y 10 mM,
respectivamente.
176
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tabla I. Diseño de experimentos con los valores de las variables independientes no codificadas y
codificadas
PRUEBA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
pH
6,5 (-1)
8,5 (+1)
6,5(-1)
8,5(+1)
6,5(-1)
8,5(+1)
6,5(-1)
8,5(+1)
6,5(-1)
8,5(+1)
6,5(-1)
8,5(+1)
6,5(-1)
8,5(+1)
6,5(-1)
8,5(+1)
T (ºC)
40 (-1)
40 (-1)
55 (+1)
55(+1)
40(-1)
40(-1)
55(+1)
55(+1)
40(-1)
40(-1)
55(+1)
55(+1)
40(-1)
40(-1)
55(+1)
55(+1)
E/S (V/V)
1/60 (+1)
1/60 (+1)
1/60 (+1)
1/60 (+1)
1/240 (-1)
1/240 (-1)
1/240 (-1)
1/240 (-1)
1/60 (+1)
1/60 (+1)
1/60 (+1)
1/60 (+1)
1/240 (-1)
1/240 (-1)
1/240 (-1)
1/240 (-1)
La Tabla II muestra los valores p para tc, donde se observa que todos los factores independientes estudiados
resultaron significativos (p < 0,05), no así sus interacciones (valores no mostrados). Teniendo en cuenta este
ANOVA, se analizó la totalidad de los datos mediante ajuste factorial obteniéndose la ecuación 2, que
presenta el modelo para la variación de tc, comprobándose independencia de los residuos.
Tabla II. Efectos y coeficientes estimados para tc (unidades codificadas). r2 = 0,9875
Término
Coeficiente
Efecto
p
Constante
1,940
0,4195
0,010
pH
1,460
0,4498
0,031
T
-1,181
0,4498
0,059
E/S
-1,955
0,4498
0,012
tc = 1,94 + 1,46 pH - 1,18 T - 1,95 E/S
(2)
De acuerdo a la ecuación 2 y a los resultados de los gráficos de contorno y de superficie de respuesta
correspondientes (gráficos no mostrados), se determinó que tc aumenta al incrementar el pH y al disminuir
E/S y T.
Al crecer T, aumenta la velocidad de los procesos que conducen a la coagulación y además se intensifican las
interacciones de tipo hidrofóbico (ΔH>0) que participan en dicho proceso y, por lo tanto, se acorta el t c. Un
incremento de E/S conduce a un aumento en la velocidad de hidrólisis proteica y, por lo tanto, a una
disminución del tiempo necesario para que se desestabilicen las partículas de MC y comiencen a agregar y
luego coagular. Al aumentar el pH inicial, se incrementa la densidad de carga superficial negativa de las MC
y con ello aumenta su estabilidad electrostática, con el consiguiente retardo para coagular.
En la Tabla III se muestra la evaluación ANOVA de los valores de p para vi, donde se observa que los 3
factores independientes resultaron significativos (p < 0,05) y además un término cuadrático para el pH.
177
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Tabla III. Efectos y coeficientes estimados para vi (unidades codificadas). r2 = 0,9821
Término
Coeficiente
Efecto
p
Constante
0,38800
0,018321
0,000
pH
-0,05700
0,007242
0,004
T
0,08075
0,007242
0,002
E/S
0,07550
0,007242
0,002
pH*pH
-0,11975
0,019701
0,009
Teniendo en cuenta el ANOVA anterior, se analizó la totalidad de los datos mediante ajuste factorial
obteniéndose la ecuación 3, que presenta el modelo para la variación de vi, comprobándose independencia de
los residuos.
vi = 0,388 - 0,057 pH + 0,080 T - 0,075 E/S - 0,119 pH*pH
(3)
A partir de la ecuación 3 y de los gráficos de superficie de respuesta y de contorno correspondientes
(gráficos no mostrados) puede observarse que vi dependió en forma directa de T pero disminuyó al aumentar
el pH inicial y E/S.
Los efectos de las variables independientes T y pH sobre vi son opuestos a los observados para tc, ya que los
cambios en dichas variables que conducen a un menor tc, inducen un aumento en la velocidad inicial de
coagulación. Al aumentar E/S, aumenta el grado de hidrólisis y, por lo tanto, el tamaño medio de la
partículas proteolizadas, lo que retrasa la formación del coágulo.
En la Tabla IV se muestran los valores de p para Df, los que indican que las variables independientes las 3
variables resultaron significativas, pero no sus interacciones (valores p para las interacciones no mostrados).
Tabla IV. Efectos y coeficientes estimados para Df (unidades codificadas). r2 = 0,8396
Término
Constante
pH
T
E/S
Coeficiente
224,981
-0,09437
0,13137
-0,11063
Efecto
0,02758
0,02926
0,02926
0,02926
p
0,000
0,023
0,006
0,013
Tomando en consideración el ANOVA anterior, se examinó la totalidad de los datos mediante ajuste
factorial obteniéndose la ecuación 4, que presenta el modelo para la variación de Df, comprobándose
independencia de los residuos.
Df = 2,4249 - 0,094 pH + 0,1313 T + 0,11 E/S
(4)
Según el modelo, el grado de compactación de los coágulos (Df) se incrementa al aumentar la T pero
disminuye con el pH y la E/S. Un aumento de T favorecería el establecimiento de las interacciones
hidrofóbicas que participan en la estructuración del gel. A mayor pH, mayor densidad de carga superficial
negativa, lo que dificultaría la desestabilización electrostática y el establecimiento de las interacciones entre
las partículas proteolizadas, conduciendo a la formación de agregados menos compactos. Partículas
hidrolizadas de menor tamaño, debidas a un incremento de E/S, conducen a la formación de agregados más
compactos.
CONCLUSIONES
Se obtuvo un pool enzimático, denominado proteasa P45, a partir del cultivo del Bacillus sp. P45 en un
medio de cultivo preparado con un desecho de la industria avícola (plumas de gallina), con acción
proteolítica sobre las CN de la leche.
178
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Se determinó, utilizando un diseño de experimentos, que los valores óptimos de pH y T para la acción
coagulante de la proteasa P45 sobre las MC fueron 7,03 y 49 ºC, respectivamente, para una concentración de
CN de 30 g/L y de ion calcio 10 mM.
Estos resultados representan una evaluación previa a la utilización de la proteasa P45 como enzima
coagulante con vista a la elaboración de productos lácteos.
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180
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Clarificación de jugo de uva Isabella con extractos enzimáticos producidos por una cepa de
A. niger aislada en la provincia de Misiones
Brousse M.M., Cruz N.E. , Martos M.A.
Facultad de Ciencias Exactas Qcas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones.
brousse.mariamarcela@gmail.com
Resumen: A. niger Nº 300, aislado de frutas cítricas en descomposición en la provincia de Misiones,
Argentina, fue capaz de producir enzimas pécticas mediante fermentación sumergida.
En el presente trabajo se estudió el efecto de la concentración de enzima y la temperatura en función del
tiempo de clarificación de jugo de uva de la variedad Isabella, utilizando el extracto enzimático producido
por A. niger 300. La clarificación se realizó con tres concentraciones de enzima (1, 10, 20 % v/v) y tres
temperaturas (30, 40 , 50°C), hasta 2 h. Posteriormente se evaluó, en las condiciones seleccionadas, la
variación de la viscosidad, turbiedad y densidad óptica durante el proceso de clarificación.
El extracto enzimático de A. niger 300 fue capaz de clarificar jugo de uva. El análisis de varianza reveló que
los tres factores estudiados (concentración de enzima, temperatura y tiempo de incubación), influyeron
significativamente en el proceso de clarificación (p<0,05). El mayor porcentaje de clarificación se obtuvo a
40°C, con una concentración enzimática del 20% (v/v), durante 2 h. En estas condiciones, los tres parámetros
evaluados (viscosidad, turbiedad y densidad óptica) disminuyeron en función del tiempo de clarificación.
Los valores experimentales fueron ajustados a ecuaciones cuadráticas, obteniéndose buenos ajustes.
Palabras Clave: Aspergillus niger, pectinasas, jugo de uva, clarificación.
Abstract: Aspergillus niger Nº 300, isolated from decay citrus peels in the province of Misiones, Argentina,
was able to produce pectinases by submerged fermentation.
In this work it was studied the effect of enzyme concentration and temperature as a function of clarification
time of grape juice of Isabella variety, using the enzyme extract produced by A. niger 300. Clarification was
carried out with three concentrations of enzyme (1, 10 and 20 % v / v) and three temperatures (30, 40 and 50
°C), until 2 h. Later it was evaluated, in the conditions selected, the variation of viscosity, turbidity and
optical density during the clarification process.
The enzymatic extract of A. niger 300 was able to clarify apple juice. Analysis of variance revelead that the
three factors studied (enzyme concentration, temperature and clarification time) significantly influenced in
the clarification process (p< 0.05).The highest percentage of clarification was obtained at 40 ° C, with an
enzyme concentration of 20% (v / v), during 2 h. Under these conditions, the three parameters evaluated
(viscosity, turbidity and optical density), decreased with clarification time. Experimental values were fitted
to quadratic equations, yielding good fits.
Key words: Aspergillus niger, pectinases, grape juice, clarification.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas cuya acción biológica consiste en la catálisis de las reacciones del metabolismo
celular, las que transcurrirían muy lentas sin su intervención. Las enzimas hacen que los procesos
industriales sean eficientes y menos costosos ya que tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad. En
los últimos años su uso en gran cantidad de industrias de alimentos, ha adquirido gran relevancia.
Las enzimas pécticas juegan un rol importante en tecnología de los alimentos, principalmente en el
procesamiento de jugos de frutas y vinos. Los jugos de uvas presentan partículas dispersas así como
coloides.
Las partículas mayores que 1 μm dan al jugo la característica de turbidez. Por otro lado los coloides
compuestos principalmente de polisacáridos con diámetros entre 0.001 a 0.1 μm dan una apariencia de
opalescencia al jugo (Girard y Fukumoto 2000). Este efecto se debe a la presencia de pectinas, las que
pueden degradarse por la acción de enzimas pectinolíticas presentes en el propio jugo o adicionadas al
mismo, permitiendo que estas partículas se separen por sedimentación o filtración, dejando un jugo claro
(Costa et al. 2007, Croak y Corredig 2006, Sin y col. 2006).
181
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
La clarificación es una etapa importante en el procesamiento de jugos de frutas y la mayoría de las veces es
realizada ya sea por microfiltración, por tratamiento enzimático o mediante agentes clarificantes como
gelatina, bentonita, silica, o una combinación de estos compuestos (Chatterjee et al. 2004).
Las enzimas pécticas comerciales son producidas principalmente por hongos del género Aspergillus (A.
niger, A. oryzae, A. wentii y A. flavus) (Aguilar y Huitrón 1990). El hongo filamentoso A. niger tiene la
ventaja de poseer el status GRAS (generalmente aceptado como seguro) que permite el uso de metabolitos,
incluyendo sus enzimas extracelulares en las industrias de alimentos (Taragano y Pilosof 1999).
Estudios previos demostraron que un hongo, A. niger Nº 300, aislado de frutas cítricas en descomposición en
la provincia de Misiones, Argentina, es capaz de producir enzimas pécticas (poligalacturonasa, pectinesterasa
y pectinliasa) en un medio de cultivo líquido formulado en base a sales, sulfato de amonio como FN y
pectina de citrus comercial como única fuente de carbono y energía (Martos et al. 2009). Otras enzimas
capaces de hidrolizar otros polímeros de la pared celular tales como celulasas y xilanasas, también fueron
detectadas en los sobrenadantes.
Este trabajo tuvo como objetivo estudiar, en primera instancia, el efecto de la concentración de enzima y la
temperatura en función del tiempo de clarificación del jugo de uva de la variedad Isabella, utilizando el
extracto enzimático de A. niger 300. Una vez obtenidas las condiciones óptimas de clarificación, se estudio
la variación de la viscosidad, la turbiedad y la densidad óptica durante el proceso de clarificación del jugo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del extracto enzimático
Microorganismo: A. niger aislado de frutas cítricas en descomposición en la provincia de Misiones,
Argentina.
Medio de mantenimiento: KH2PO4, 4 g/L; Na2HPO4, 6 g/L; FeSO4·7H2O, 0,01 g/L; CaCl2·2H2O, 0,01 g/L;
MgSO4·7H2O, 0,2 g/L; (NH4)2SO4, 2 g/L; H3BO3, 10 g/L; MnSO4·H2O 10 g/L; ZnSO4·7H2O, 70 g/L;
pectina cítrica (Parafarm, Buenos Aires Argentina), 5 g/L; agar (Britania, Buenos Aires, Argentina), 15 g/L,
pH 5,0.
Medio de fermentación: posee la misma composición de sales que el medio de mantenimiento pero sin el
agregado de agar, pectina cítrica, 20 g/L (Martos et al. 2009).
La pectina cítrica fue lavada para eliminar los azúcares y otros excipientes presentes en la pectina comercial.
Los lavados se realizaron con alcohol 70 % v/v en HCl (0,05 N) (Cavalitto y col. 1996).
La FCE (pectina), los fosfatos y el resto de las sales, fueron esterilizaros por separado, previo ajuste del pH.
Las tres fracciones se esterilizaron en autoclave 15 min a 121 ºC. El medio se reconstituyó antes de su
utilización.
Inóculo: a partir del hongo desarrollado en medio de mantenimiento a 30 ºC, durante 7 días, se preparó una
suspensión de esporos en Tween 80 al 0,05 %, a partir de la cual se realizaron las diluciones de manera de
obtener una concentración de 1,25 × 107 esporos/mL. El recuento del número de esporos se realizó en
cámara de Neubauer.
Fermentación: se inocularon frascos Erlenmeyers de 500 mL que contenían 95 mL del medio de
fermentación con 5 mL de la suspensión de esporos de manera de obtener una concentración inicial de 1,25 ×
106 esporos/mL de medio. Los mismos se incubaron a 30 °C en baño termostatizado rotatorio (New
Brunswick, modelo 676; 1,27 cm de excentricidad) a 180 rpm, hasta 7 días. La biomasa se separó por
filtración (papel Whatman # 1) y el filtrado enzimático, al que se lo denominó extracto enzimático (EE), se
mantuvo a –18 °C hasta su utilización como fuente de enzima.
Preparación del jugo de uva
Para la obtención de jugo de uva, se utilizaron 13 kg de uva Isabella, la misma fue despalillada en forma
manual y posteriormente prensada en marmita extractora durante 2 h. El jugo obtenido se envasó en caliente
en botellas de vidrio. Este proceso se realizó en el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA),
Cerro Azul, Misiones.
Ensayos de clarificación
Se ensayo la capacidad del pool de pectinasas de A. niger 300 de clarificar jugo de uva.
1. Efecto de la temperatura y la concentración de enzima en la clarificación de jugo de uva
182
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
En una primera etapa se estudió el efecto de la temperatura y la concentración de enzima en función del
tiempo de clarificación de jugo de uva Isabella con el EE de A. niger.
Para el proceso de clarificación, se trabajó con el EE al 1 %, 10 % y 20 % v/v. Cada una de estas
experiencias fue realizada a las siguientes temperaturas: 30°C, 40°C y 50°C, en baño termostatizado. Al
erlenmeyer control se le adicionó agua en lugar del EE. Se tomaron muestras cada 30 min. El proceso
de clarificación se llevó a cabo hasta las 2 h, considerando que este es el tiempo de clarificación informado
por otros autores (Lee et al. 2006; Sing et al. 2006; Rai et al. 2004).
Las muestras fueron tomadas de cada tubo de ensayo a los diferentes tiempos y colocadas en Baño María por
un tiempo de 5 min a 100 °C, a los efectos de inactivar la enzima. Posteriormente, se centrifugó a 2350g
durante 10 min (centrífuga Rolco CM-3070, Rolco, S. R. L., Argentina). Todas las determinaciones se
realizaron por triplicado y para los cálculos se tomaron los valores promedios. Como criterio de la
evolución de la clarificación se midió la densidad óptica (DO) a 540 nm (espectrofotómetro Labnics UVVIS).
2. Estudio de parámetros fisicoquímicos en la clarificación de jugo de uva con el EE de A. niger
En una segunda etapa se procedió a determinar la variación de la densidad óptica, turbiedad y viscosidad, en
función del tiempo de clarificación del jugo de uva con el EE de A. niger, a la temperatura y con la
concentración de enzima seleccionadas en la etapa anterior.
Para el proceso de clarificación se siguió el mismo procedimiento que se describió anteriormente.
Densidad óptica: se midió a 540 nm en espectrofotómetro Labnics UV-VIS.
Turbiedad: se determinó en un turbidímetro portátil marca LaMotte, modelo TC-3000 (U.S.A.) y los
resultados se reportan en unidades nefelométricas de turbidez (NTU).
Viscosidad: fue determinada a los diferentes tiempos con viscosímetro Cannon Fenske, serie 150, a
temperatura ambiente (28±1°C) y los resultados se expresaron en cSt.
En todos los casos, las experiencias se realizaron por triplicado y se tomaron para los cálculos los valores
promedios.
Análisis de datos
Los valores experimentales de la primera etapa, se evaluaron mediante ANOVA factorial y los resultados de
la segunda etapa se evaluaron a través de un ANOVA simple, para determinar si existían diferencias
significativas en el rango estudiado.
Los valores experimentales de densidad óptima, turbiedad y viscosidad se ajustó a ecuaciones de segundo
orden y la bondad de ajuste de los modelos se evaluó con los parámetros R2 (coeficiente de determinación),
RMSE (raíz cuadrada del error medio cuadrático) y E % (error porcentual promedio) dado por las
ecuaciones:
 n
2
  (c cal  c exp ) n
RM SE   i 1
n



E%






0,5
n
(ccal  c exp ) n
i 1
c exp n

n
(1)
·100
(2)
ccal : valor calculado
cexp : valor experimental
n: número de determinaciones
Un buen ajuste es indicado por valores pequeños de RMSE, R2 > 0,85 y E % < 10 % (Park et al. 2002; VegaGálvez et al. 2006).
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de la temperatura y la concentración de enzima en la clarificación de jugo de uva
El EE producido por A. niger 300 en medio líquido, presentó una actividad PG de 7,08 UE/mL. Otras
enzimas como PE y PL también fueron detectadas en dicho extracto.
De estudios previos se demostró que la enzima PG presente en el EE exhibió mayor actividad en un rango de
pH entre 4,5 y 5,0 (datos aún no publicados), sin embargo el presente estudio se realizó al pH inicial propio
del jugo (3,6), el cual no fue modificado.
En la Figura 1a, b y c, se presenta el incremento en la densidad óptica (ΔDO540) obtenidos a los distintos
tiempos de clarificación, a las tres concentraciones de enzimas estudiadas, para 30ºC, 40ºC y 50ºC,
respectivamente.
(a)
(b)
(c)
Figura 1: Incremento en la densidad óptica (ΔDO540) en función del tiempo de clarificación del jugo de uva
Isabella, a las tres concentraciones de enzimas estudiadas. a: 30 ºC (a), 40 ºC (b) y 50 ºC (c).
El EE de A. niger fue capaz de clarificar jugo de uva. El ANOVA factorial, mostró que todos los factores
estudiados tuvieron efectos estadísticamente significativos (p < 0,05) sobre la DO, medida a 540 nm (Fig. 1).
En la Figura 1a y b se observa un aumento en ΔDO540 en función del tiempo de clarificación, a las tres
concentraciones de enzimas estudiadas. Para un determinado tiempo, se obtuvo un mayor incremento en la
ΔDO al aumentar la concentración de enzima. Los mayores títulos se obtuvieron a las 2 h y con una
concentración de enzima del 20 % (v/v). A 50°C (Fig. 1c), se observó un menor incremento en la ΔDO 540 en
función del tiempo a las tres concentraciones de EE. Esta disminución en la clarificación de jugo de uva
observada a esta temperatura se pudo asociar a fenómenos de inestabilidad enzimática al pH propio del jugo
de uva.
De estudios previos se demostró que la enzima PG presente en el EE fue estable hasta 50 ºC, durante 60 min,
pero dichos ensayos fueron realizados a pH 5,0.
En la Figura 2 a y b se presenta la evolución de la clarificación (valores porcentuales de ΔDO 540), en función
de la concentración de EE, a las tres temperaturas estudiadas durante 1,5 y 2 h, respectivamente.
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(b)
(a)
Figura 2: Evolución de la clarificación (valores porcentuales de ΔDO540) del jugo de uva Isabella en función
de la concentración de EE a las tres temperaturas estudiadas, a 1,5 h (a) y 2 h (b).
Como se observa en la Figura 2 a y b, el mayor porcentaje de clarificación se presentó a 40° C a las tres
concentraciones de EE estudiados.
Para la clarificación enzimática del jugo de sapodilla con Pectinex 3X L de Aspergillus niger, se reportaron
valores similares de temperatura y tiempos óptimos de clarificación (Sin et al. 2006).
La mejor combinación de las distintas variables del proceso en la clarificación del jugo de banana con
enzimas comerciales pectolíticas, Pectinex Ultra SP-Land y enzimas amilolíticas, AMG 300L, fue 0,084%,
temperatura de 43,2 ° C, y el tiempo de incubación 80 min. Estos resultado reportados por Lee et al. 2006,
son similares a los reportados en este trabajo, en temperatura y tiempo de clarificación, aunque la
concentración de enzima en la clarificación del jugo de uva es marcadamente superior.
Evolución del proceso de clarificación de jugo de uva con el EE de A. niger
En base a los resultados obtenidos en la etapa anterior y considerando que el proceso de clarificación
realizado a las 1,5 h y 2 h, con 20 % de enzima y a 40 °C, no presentaron diferencias significativas, se utilizó
el menor tiempo para realizar las siguientes pruebas de clarificación.
La evolución del proceso de clarificación (valores de DO a 540 nm) de jugo de uva Isabella, en función
del tiempo del tratamiento enzimático, realizado a 40 °C, con 20 % de la solución enzimática, se presenta en
la Figura 3. Los resultados se muestran como un promedio de tres repeticiones.
Densidad óptica (540 nm)
0.9
Densidad óptica
0.8
0.7
0.6
0
25
50
75
100
125
150
Tiempo (min)
Figura 3: Variación de la densidad óptica en función del tiempo de clarificación con una concentración de
enzima de 20% v/v y a 40° C.
Los puntos de coordenadas representan el valor promedio de tres repeticiones y las barras el desvío estándar.
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La DO disminuyó al aumentar el tiempo. Un ANOVA simple determinó que existe diferencias significativas
entre las densidades ópticas medias de un nivel de tiempo a otro (p > 0,05) para un nivel de confianza del
95%. Se ajustaron los valores experimentales a una ecuación cuadrática y se determinó la bondad del ajuste,
obteniéndose un RMSE de 4,5 e-3 y un error porcentual de 0,53.
La ecuación obtenida fue:
DO  (0,832  7e 3 )t 2  (0,001  2,2e 4 )t  (1e 5  1,4e 6 )
R2= 0,94
El efecto del chitosan, bentonita y gelatina como agentes clarificantes, en el jugo de manzana, uva, limón y
naranja disminuyeron la absorbancia a 540 nm en un tiempo de 90 minutos (Sandipan Chatterjee et al. 2004).
Este tiempo es la mitad de la que se obtiene en la clarificación enzimática del jugo de uva de la variedad
Isabelle.
En la Figura 4 se presentan los valores experimentales y el ajuste para la turbiedad y la viscosidad como
función del tiempo de clarificación, realizado a 40 °C, con 20 % de la solución enzimática. Los ANOVAS
simples determinaron que existe diferencias significativas entre los valores medios de turbiedad y de
viscosidad, a diferentes tiempos (p>0,05) para un nivel de confianza del 95%. Se ajustaron los valores
experimentales a ecuaciones cuadráticas y se determinó la bondad del ajuste por medio del RMSE y el error
porcentual. Los datos y sus error estándar obtenidos fueron los que se muestran en la Tabla Nº 1.
120
1.40
Viscosidad (cSt)
100
Turbiedad (NTU)
Viscosidad (cSt)
1.45
Turbiedad (NTU)
80
60
40
1.35
1.30
1.25
1.20
1.15
20
1.10
0
1.05
0
25
50
75
100
125
150
0
25
Tiempo (min)
50
75
100
125
150
Tiempo (min)
Figura 4: Variación de la turbiedad y viscosidad en función del tiempo a una concentración de enzima de
20% v/v y a 40° C.
Los puntos de coordenadas representan el valor promedio de tres repeticiones y las barras el desvío estándar.
Tabla 1: Términos calculados a partir de la ecuación cuadrática y la bondad del ajuste del modelo.
Turbiedad
Viscosidad
a
102,7±1,85
1,32±7e-3
b
-1,31±0,06
-3e-3±2e-4
c
-3
5e ±3,7e-4
1e-5±1,3e-6
R2
0,99
0,97
RMSE
2,96
9 e-3
ERROR %
9,04
0,77
Todas las propiedades disminuyeron significativamente a medida que aumentó el tiempo de clarificación
(Fig. 4). Estos parámetros pudieron ser ajustados mediante polinomios de segundo orden (Tabla 1).
La aplicación de ecuaciones polinómicas en el estudio de la variación de propiedades en función del tiempo
en clarificaciones de jugos, es frecuentemente encontrada en la bibliografía (W.C. Lee et al. 2006; P. Rai et
al. 2004).
CONCLUSIONES
El extracto enzimático de A. niger fue capaz de clarificar jugo de uva. Los diferentes factores estudiados
durante el proceso de clarificación de jugo de uva Isabella con el extracto enzimático de A. niger, tales como
la concentración de la enzima, la temperatura y tiempo de incubación, influyeron significativamente en dicho
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proceso. El mejor tratamiento empleado para la clarificación del jugo de uva se obtuvo con una
concentración enzimática del 20% v/v, a 40° C, durante 2 h. La densidad óptica, la turbiedad y la viscosidad
son tres importantes propiedades que se midieron durante el proceso de clarificación. Estas tres propiedades
disminuyeron significativamente a medida que aumentó el tiempo de clarificación. Estos parámetros
pudieron ser ajustados mediante polinomios de segundo orden.
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Efecto de la aireación en la actividad fermentativa de Candida stellata
durante la producción de sidra
Estela-Escalante, WD1,2., Rychtera, M1., Melzoch, K1., Cortes-Miranda, P2., Elguera-Hilares, A2.
1. Department of Fermentation Chemistry and Bioengineering, Faculty of Food and Biochemical
Engineering. Institute of Chemical Technology Prague. Technická 5, 166 28. Praha 6, Dejvice. Czech
Republic.
2. Laboratorio de Biotecnología Agroindustrial, Escuela de Ingeniería Agroindustrial, Universidad Nacional
Micaela Bastidas de Apurímac. Av. Arenas 121, Abancay–Apurimac, Perú.
waldire@post.cz
Resumen: El efecto de la aireación en la actividad fermentativa de Candida stellata RIVE 3-16-1 fue
estudiado con la finalidad de evaluar la síntesis de compuestos químicos de importancia sensorial durante la
producción de sidra. Para ello, la cepa fue cultivada en frascos Erlenmeyer conteniendo jugo de manzana
estéril y sin aroma. Los compuestos químicos producidos durante la fermentación en frascos agitados (200
min-1) y estáticos fueron determinados por cromatografía gaseosa y líquida. Los resultados mostraron que la
agitación del medio de cultivo aumenta la producción global de alcoholes superiores (620 mgL-1) y etil
acetato (176.0 ± 5.0 mgL-1) comparado al cultivo estático (486 mgL-1 y 17.0 ± 1.5 mgL-1) respectivamente.
Por el contrario, la producción de glicerol (3.8 ± 0.3 gL-1) y ácido acético (150.0 ± 6.5mgL-1) resultaron ser
mayores en cultivo estático comparado al cultivo agitado (1.9 ± 0.1 gL-1 y 90.0 ± 3.5 mgL-1)
respectivamente. Experimentos adicionales de cultivo batch realizados en biorreactor con flujo de aire
constante (25.0 h-1) reportaron una tasa específica de crecimiento de 0.13 h-1 y una producción máxima de
etanol de 27.02 gL-1 durante la fase de fermentación aerobia de azúcares. La aireación en este caso promueve
el crecimiento, disminuye el rendimiento de etanol y, provoca el consumo de ácido acético y glicerol una vez
que los azúcares hayan sido agotados. Los mejores resultados en términos de aceptabilidad de las bebidas
fermentadas se obtuvieron cuando se cultivaron estáticamente. El control de la aireación durante la
fermentación puede usarse para controlar la síntesis de compuestos químicos de importancia sensorial en la
producción de sidra.
Palabras clave: Candida stellata, fermentación alcohólica, alcoholes superiores, etil acetato, cultivo por
lote.
Abstract: The effect of aireation on the fermentative activity of Candida stellata RIVE 3-16-1 was studied
in order to evaluate the synthesis of chemical compounds of sensory importance during cider fermentation.
The strain was cultured in Erlenmeyer flasks containing sterile and aroma removed apple juice. The chemical
compounds produced during fementation in agitated (200 min-1) and static flasks were determined by gas and
liquid chromatography. The results showed that agitation of culture medium increases the overall production
of higher alcohols (620 mgL-1) and ethyl acetate (176.0 ±5.0 mgL-1) compared to static cultivation (486 mgL1
and 17.0 ± 1.5 mgL-1) respectively. Additional experiments in batch cultivation carried out in bioreactor
with constant air flow (25.0 h-1) reported a specific growth rate 0.13 h-1 and maximum ethanol production
27.02 gL-1 during the aerobic fermentation phase. Aireation promotes growth, diminishes the ethanol yield
and provokes consumption of acetic acid and glycerol once sugars have been depleted. The best results in
terms of aceptability of fermented beverages were obtained when cultivated in static fashion. Control of
aireation during fermentation can be used to control synthesis of chemical compounds of sensory importance
in cider production.
Key words: Candida stellata, alcoholic fermentation, higher alchols, ethyl acetate, batch cultivation.
INTRODUCCIÓN
Candida stellata es comúnmente aislada de mostos de uva y sobrevive durante la fermentación espontánea
de vinos por periodos largos (Fleet et al., 1984; Jolly et al., 2003). Esta levadura muestra un carácter
fuertemente fructofílico y osmofílico (Benda, 1988; Magyar y Toth, 2011). C. stellata es una levadura
Crabtree positivo (Rodicio y Heinisch, 2009) así, dependiendo de la concentración de oxígeno y glucosa en
el medio muestra un comportamiento metabólico variado. A condiciones anaeróbicas o de limitación de
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oxígeno sucede la fermentación alcohólica (Van Dijken y Scheffers, 1986). A condiciones totalmente
aerobias se observa un metabolismo repiro-fermentativo mixto cuando la concentración de azúcar excede un
cierto valor límite que en el caso de Saccharomyces cerevisiae por ejemplo es muy bajo, aproximadamente 1
mM (Kappeli, 1986; Verduyn, 1991). Condiciones que conducen a la fermentación de azúcar resultan en la
producción de etanol, ácido acético, glicerol y otros compuestos menores y consecuentemente disminuye el
rendimiento en biomasa (Beudeker et al., 1990). Los compuestos menores producidos durante la
fermentación incluyen alcoholes superiores, esteres, ácidos grasos volátiles, compuestos carbonilos, etc., y
representan menos del 1% w/v del azúcar utilizado. Debido a estas pérdidas metabólicas, la fermentación
completa de hexosas rinde sólo 94–96% del rendimiento teórico máximo de etanol (Ribereau-Gayon et al.,
2000).
Estudios realizados sobre la actividad metabólica y fermentativa de algunas levaduras no-Saccharomyces
mostraron que Candida stellata podría influir positivamente al sabor y aroma de bebidas alcohólicas (Ciani y
Maccarelli, 1998; Ciani y Ferraro, 1998). Candida stellata exhibe un comportamiento peculiar de
fermentación caracterizado por una tasa de fermentación muy baja y alta producción de compuestos
secundarios de la fermentación como glicerol, acetoína, acetaldehído y ácido succínico. Se ha reportado que
Candida stellata es un potente productor de glicerol a condiciones aerobias y anaerobias de crecimiento, con
una mayor producción a condiciones anaerobias (Ciani et al., 2000). Otras investigaciones han reportado que
esta levadura puede producir concentraciones de etanol suficientemente altas para completar la fermentación
alcohólica de mosto de uva (Clemente-Jimenez et al., 2004).
Durante la fermentación alcohólica las levaduras producen muchos compuestos químicos de importancia
sensorial. Entre ellos, los ésteres son producidos a partir de alcoholes, ácidos grasos, co-enzima A y alcohol
acetil transferasas (Nordstrom, 1962). Los esteres con producidos intracelularmente y dependiendo de la
longitud de sus cadenas difunden hacia fuera de la célula de levadura (Nykanen et al., 1977; Suomalainen,
1981). Por otro lado, los alcoholes superiores son producidos catabólicamente a partir de la degradación de
aminoácidos importados o anabólicamente vía su biosíntesis a partir de la utilización de la fuente de carbono
(Hammond, 1993). Los aminoácidos son convertidos a sus correspondientes α-cetoácidos por transaminación
(leucina a ácido α-cetoisocaproico, valina a ácido α-cetoisovalerico e, isoleucina a ácido α-ceto-βmetilvalerico) (Dickinson y Norte, 1993; Dickinson et al., 1997). Alternativamente, estos α-cetoácidos
pueden ser producidos a través de la degradación de glucosa (Dickinson et al., 1997).
El presente estudio reporta sobre el efecto de la aireación sobre el metabolismo fermentativo y producción de
compuestos de importancia sensorial por Candida stellata RIVE 3-16-1 cultivado en jugo de manzana. En
los experimentos se consideraron básicamente dos condiciones de cultivo tomando en cuenta su importancia
tecnológica, a condiciones de limitación de oxígeno muy bajo (cultivo estático) y a condiciones de limitación
de oxígeno (cultivo agitado). Adicionalmente se realizaron, cultivos batch en biorreactor con la finalidad de
evaluar el efecto del flujo de aire constante en el comportamiento fermentativo de Candida stellata RIVE 316-1.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismo y mantenimiento
La cepa Candida stellata RIVE 3-16-1 adquirido de la colección de levaduras del Instituto de Investigación
de Vinicultura y Enología de Bratislava, República Eslovaca fue usado en los experimentos. La cepa fue
mantenida en agar extracto de malta a 7oC y renovado cada tres meses.
Síntesis de compuestos de importancia sensorial
En los experimentos se usó jugo de manzana concentrado, esterilizado por ultrafiltración y sin aroma
adquirido de Severofrukt a.s, Terezin, República Checa. El jugo fue reconstituido con agua estéril hasta
alcanzar una concentración de azúcar de 12.8 % peso/volumen y pH 3.8 (Downing, 1988). Las
fermentaciones se realizaron en cultivo agitado y estático (sin agitación) a 28oC en frascos Erlenmeyer de
500 ml conteniendo 250 ml de medio. En las fermentaciones realizadas en agitación los frascos fueron
agitados a 200 min-1 durante 8 días y aquellos fermentados estáticamente el tiempo de fermentación fue de
15 días aproximadamente. Todas las fermentaciones se consideraron terminadas cuando el azúcar en el
medio fue consumido. Todos los experimentos fueron realizados a 28oC. La propagación del inoculo se
realizó en 100 ml de jugo de manzana estéril a 28oC durante 24 horas. Los frascos fueron agitados a 200 min1
en un agitador orbital. La biomasa fue separada por centrifugación (3000 min-1 durante 10 minutos) y luego
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lavada tres veces con solución fisiológica estéril. Los medios de fermentación fueron inoculados con 1.0 ±
0.1 gramos de células basado en peso húmedo.
Cultivo batch en biorreactor
Jugo de manzana de variedad Rubin conteniendo 13 % peso/volumen de azúcares totales y pH 3.8 fue
utilizado en estos experimentos. El jugo fue extraído por presión y luego colocado en envases de vidrio de 10
L. La pasteurización del jugo se realizó en un termostato a 65–70 oC durante 10 horas (incluyendo el tiempo
de calentamiento y enfriado) con la finalidad de eliminar la microflora y los compuestos volátiles varietales
(El-Nemra et al., 1988; Su y Wiley, 1998). Subsecuentemente, al jugo se adicionó 1.2 gL-1 de KH2PO4 y 1.2
gL-1 de (NH4)2SO4 como fuente de fósforo y nitrógeno para promover el crecimiento celular.
Los cultivos fueron realizados en un biorreactor de 2 L (BIOSTAT–B. Braun International, Alemania)
conteniendo 1.5 litros de jugo de manzana. El equipo estuvo provisto de un pH-metro, termómetro, agitador
y un electrodo de medición de oxígeno disuelto. El biorreactor estuvo conectado a una unidad de regulación
y medición micro-DCU-300. Los parámetros que fueron mantenidos constantes todo el proceso de cultivo
fueron la temperatura (18 oC), frecuencia de agitación (300 min-1) y flujo de aire 25 Lh-1 (0.2 mol O2h-1). El
tiempo de cultivo se consideró hasta observar el incremento del valor de oxígeno disuelto a su valor inicial
(100%).
El inoculo fue propagado en 80 mL de medio sintético de la siguiente composición: glucosa 8.0 gL -1;
peptona 10.0 gL-1; KH2PO4 1.2 gL-1; (NH4)2SO4 1.2 gL-1 y extracto de levadura 10.0 gL-1. El pH se ajustó a
3.8. La propagación celular se realizó en un agitador orbital a 150 min-1 durante 48 horas a 28 oC.
Subsecuentemente, las células fueron separadas por centrifugación (3000 min-1 durante 10 minutos), lavadas
con solución fisiológica estéril y finalmente inoculadas en el biorreactor.
Métodos analíticos
Los compuestos volátiles (alcoholes superiores y esteres) producidos durante la fermentación fueron
analizados por GC (Hewlett-Packard 5890II), equipado con una columna HP5 (30m x 0,32mm) y detector
FID. Las muestras fueron centrifugadas y luego filtradas con micro-membranas de 0.45 µm. La extracción de
compuestos volátiles se realizó mediante el método de microextracción con diclorometano (Ortega et al.,
2001). Finalmente 1μl de cada extracto fue inyectado en la columna del equipo. El ácido acético, succínico,
málico, etanol, glicerol, fructosa y glucosa fueron analizados por HPLC (bomba LCP 4000), equipado con
una columna Batres 250 x 8 mm (Ostion LGKS 0800 H+) y un detector RID. Las condiciones de análisis
fueron: temperatura de la columna 80 °C, fase móvil 5 mM H2SO4, tasa de flujo 1mLmin-1. Las muestras
después de la centrifugación (10000 min-1) y filtración fueron diluidas con agua desmineralizada (1:3) antes
de inyectar al equipo.
Análisis sensorial y estadístico
La evaluación sensorial de sidras fermentadas tanto estáticamente como en agitación se realizaron usando un
análisis descriptivo. Atributos como sabor, aroma y olor fueron evaluados usando una escala Hedónica de
cinco puntos (1 = me desagrada mucho y, 5 = me agrada mucho). Las muestras fueron evaluadas por un
panel entrenado de 10 jueces, (hombres entre 25-30 años). La evaluación sensorial fue realizado según
Meilgaard et al. (1999). Los datos de la evaluación sensorial fueron presentados como promedios de los
puntajes de los jueces. La prueba “t” estándar se utilizó para evaluar la significancia estadística (P<0.01) de
las diferencias observadas entre los puntajes de las bebidas fermentadas (cultivadas en agitación y
estáticamente). El análisis estadístico se realizó con ayuda del programa Statistica v.8.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cultivo a condiciones estáticas y de agitación
El suministro de oxígeno en cultivos agitados es un factor limitante. El oxígeno es necesario para mejorar el
metabolismo y así completar exitosamente la fermentación. Los compuestos producidos durante la
fermentación de jugo de manzana por Candida stellata RIVE 3-16-1 en cultivos estáticos y agitados se
muestran en la Tabla 1. Adicionalmente se muestran los compuestos analizados en sidras fermentadas con
diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae obtenidas por diferentes autores. Marcada diferencia se
observó en la producción de glicerol en cultivo estático (3.8 ± 0.3 gL-1) y agitado (1.9 ± 0.1 gL-1). Las
condiciones aerobias promoverían la respiración celular y así disminuiría la producción de glicerol. C.
stellata es conocida como una gran productora de glicerol, es capaz de producir hasta 11.76 gL -1 (Ciani y
190
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Maccarelli, 1998). Desde el punto de vista tecnológico una mayor producción de glicerol es favorable por
influir positivamente en la calidad sensorial de bebidas alcohólicas al impartir un ligero sabor dulce y
contribuye a la complejidad del sabor del vino en bajas concentraciones (Nieuwoudt et al., 2002; Prior et al.,
2000).
Los alcoholes superiores, mayormente son perjudiciales para la calidad sensorial de bebidas fermentadas con
algunas excepciones. Sin embargo, a bajas concentraciones contribuirían positivamente al aroma y sabor de
sidras, vinos y cervezas. En nuestros experimentos se observó una mayor producción de alcoholes superiores
totales a condiciones de agitación (620.9 mgL-1) comparado con las condiciones estáticas (486.0 mgL-1) de
cultivo. Desde el punto de vista sensorial, los alcoholes sensoriales confieren olores y sabores fuertes y
pungentes (Swiegers y Pretorius, 2005; Swiegers et al., 2005) así, concentraciones mayores a 400 mgL-1
contribuirían negativamente a la calidad organoléptica de vinos (Rapp y Mandery, 1986). Con excepción del
2-feniletanol el cual imparte un aroma floral (Ribereau-Gayon et al., 2006), cuyo límite de percepción es 10
mgL-1 (Rous et al., 1983), el resto de alcoholes superiores imparten características sensoriales desagradables
(Rapp y Mandery, 1986; Ribereau-Gayon et al., 2006).
Los esteres son indudablemente los compuestos aromáticos más importantes en bebidas alcohólicas; la
presencia de éstos determina la calidad sensorial. El etil acetato es probablemente el más importante debido a
su alta concentración comparada con el resto de esteres. Imparte un aroma ligeramente frutado o a solvente,
dependiendo de su concentración. Los resultados de nuestros experimentos mostraron que la agitación
mejoró la producción de etil acetato (176.0 ±5.0 mgL-1) comparado con el cultivo estático (17.0 ±1.5 mgL-1).
Los esteres de acetato son producidos en altas concentraciones durante la etapa temprana de fermentación
(Henschke y Jiranek, 1993). Desde el punto de vista sensorial, concentraciones de etil acetato menores a 80.0
mgL-1 contribuyen positivamente al aroma y sabor de vinos (Ribereau-Gayon, 1978). Por el contrario,
concentraciones sobre 200.0 mgL-1 impartirían un sabor a vinagre (Dequin et al., 2003). Por otro lado, los
esteres etílicos de ácidos grasos como el etil decanoato (olor floral) son también importantes en el bouquet de
vinos y otras bebidas fermentadas.
El análisis estadístico de los resultados de aroma, sabor y olor mostraron una diferencia significativa
(P<0.01) entre los dos tipos de bebidas fermentadas. Los resultados de los panelistas han descrito a la bebida
fermentada en agitación con sabor intenso como a solvente, ligeramente ácido y perfil sensorial no
balanceado, pero no desagradable. Por otro lado, se describió a la bebida fermentada en agitación sin cuerpo,
deficiente de aroma y sabor. Las bebidas fermentadas estáticamente tuvieron una aceptabilidad global basada
en los atributos evaluados.
191
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tabla 1. Compuestos de importancia sensorial producidos por Candida stellata RIVE 3-16-1 cultivado en jugo de manzana a 28oC en cultivo estático y agitado.
Además, compuestos típicos encontrados en sidras y jugo de manzana.
Tipo de cultivo con Candida stellataa
Agitado
Estático
Compuestos analizados en sidras
Compuestos analizados en
fermentadas con
jugo de manzana
Saccharomyces cerevisiae
Glicerol*
1.9 ± 0.1
3.8 ± 0.3
4.05 ± 0.131; 2.59 ± 1.72
0.05
1
2
1-Propanol
58.0 ± 3.0
11.0 ± 2.0
20.01 ± 0.35 ; 27.3 ± 13.0
7.06
1
2
1-Butanol
2.4 ± 0.5
3.0 ± 0.5
6.99 ± 0.04 ; 6.1 ± 0.7
4.50 ± 0.234
2-Butanol
1.5 ± 0.2
2.0 ± 0.2
–
–
2-Metil-propanol
113.0 ± 4.0
154.0 ± 6.0
22.17 ± 0.081; 34.8 ± 8.92
0.75 ± 0.044
3-Metil-butanol
162.0 ± 5.0
137.0 ± 3.5
232.00 ± 13.803
2.11 ± 0.114
+
+
2-Metil-butanol
130.0 ± 4.0
154.0 ± 3.5
94.8 ± 0.2 ; 173.0 ± 41.1
9.06
1
2
2-Feniletanol
154.0 ± 4.5
25.0 ± 2.0
7.8 ± 0.39 ; 131.5 ± 55.3
0.46 ± 0.024
1
2
Etil acetato
176.0 ± 5.0
17.0 ± 1.5
231.06 ± 33.09 ; 114.6 ± 35.5
0.57 ± 0.034
Butil acetato
n.d
tr
0.27 ± 0.024
0.58 ± 0.034
Isoamilacetato
n.d
12.0 ± 2.0
16.66 ± 1.04
2.48 ± 0.124
4
Etil decanoato
2.9 ± 0.5
n.d
1.50 ± 0.09
0.01 ± 0.0024
1
4
Ácido acético
90.0 ± 3.5
150.0 ± 6.5
900.0 ± 140.0 ; 282.93 ± 16.9
0.05
1
2
Ácido succínico*
1.7 ± 0.15
1.2 ± 0.1
200.0 ± 30.0 ; 0.5 ± 0.06
0.05
*g/L., tr.: trazas, n.d: no detectado, aResultados obtenidos en este estudio. 1Valores encontrados en sidras fermentadas con S. cerevisiae (Suarez et al., 2005).
2
Valores encontrados en sidras (Picinelli et al., 2000). 3Valores encontrados en sidras fermentadas con S.cerevisiae (Jarvis et al., 1995). 4Valores promedio (Wang
et al., 2004). 5Valores promedio (Cabranes et al., 1998). 6Valores promedio (Souci et al., 2000). +Alcoholes amilicos: 3-Metil-butanol+2-Metil-butanol (Suarez et
al., 2005; Picinelli et al., 2000). Compuestos no reportados (–).
-1
Compuestos (mgL )
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Cultivo batch en biorreactor a flujo de aire constante
El cultivo batch a flujo de aire constante permite el suministro constante de oxígeno al medio. Sólo el
oxígeno disuelto en la fase líquida está disponible para las células. En nuestros experimentos, la tasa de flujo
de aire 25.0 Lh-1 (0.2 mol O2h-1) se ha mantenido constante durante todo el tiempo de cultivo (232 horas). En
las Figuras 1 y 2 se muestran el curso del consumo de oxígeno, crecimiento celular, cambio de pH y la
síntesis y utilización de sub productos del metabolismo. El oxígeno es el parámetro más importante el cual
determina el balance entre la actividad fermentativa y respiratoria en muchas levaduras. Los azúcares fueron
rápidamente agotados, siendo la glucosa consumida primero y luego la fructosa; sin embargo, la tasa de
consumo de fructosa fue mayor que la de glucosa. Candida stellata es una levadura fructofílica y por eso la
utilización de fructosa fue más rápida. Durante la fermentación aerobia, etanol y glicerol fueron
principalmente producidos (Figura 2). La producción de ácido acético se observó principalmente al final del
periodo de cultivo cuando el etanol se convirtió en la fuente principal de carbono.
Por otro lado, la concentración de biomasa alcanzó los 19.6 gL-1 al final del cultivo y la tasa de crecimiento
específico a estas condiciones fue 0.13 h-1. Ciani et al. (2000) encontró que la presencia de oxígeno
incrementa la tasa de crecimiento en aproximadamente tres veces (desde 0.05 a 0.16 h -1) cuando cultivó C.
stellata en frascos agitados a 150 min-1, en medio sintético comparado a condiciones anaerobias. En nuestro
estudio, una vez que los azúcares fueron consumidos, el etanol y glicerol fueron simultáneamente utilizados
como fuente de carbono y, luego también el ácido acético. Esta manifestación también fue observada cuando
S. cerevisiae fue cultivada en glucosa como fuente de carbono en cultivo batch a condiciones aerobias, aquí
la glucosa fue inicialmente fermentada a etanol, la cual, en una segunda fase de crecimiento sirvió como
fuente de carbono y energía (Fiechter et al., 1981). El consumo de etanol y la respiración disminuyen a
medida que la concentración de oxígeno en el medio desciende (Wiebe et al., 2008).
%pO2
pH
biomasa(g/L)
120
25
100
80
15
60
10
40
pH, biomasa (g/L)
Oxígeno disuelto (%pO2)
20
5
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (h)
Figura 1. Cultivo de Candida stellata RIVE 3-16-1 a flujo de aire constante (25
Lh-1) a 18 oC.
El consumo de azúcares durante la fermentación aerobia resultó en la producción máxima de etanol (27 gL -1)
y glicerol (1.2 gL-1) antes de ser consumidos aeróbicamente (Figura 2). Después del consumo de azúcar, el
etanol y glicerol producidos sirvieron como fuente de carbono para mantener el crecimiento celular. A partir
de esta etapa, la concentración de oxígeno disuelto cayó a cero y permaneció así hacia el final del cultivo. Se
produjo ácido acético al final del cultivo durante la asimilación de etanol. La producción de glicerol por
levaduras constituiría una respuesta a la alta osmolaridad del medio (Hohmann, 2002), ya que de otro modo
perderían agua (osmoregulación). El jugo de manzana normalmente contiene alta concentración de azúcar y
puede provocar este fenómeno en Candida stellata RIVE 3-16-1.
193
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etanol(g/L)
ác. acético ppm
glucosa(g/L)
glicerol ppm
fructosa(g/L)
80
1400
1200
60
1000
50
800
40
600
30
400
20
Glicerol, ác. acetico (mg/L)
Etanol, glucosa, fructosa (g/L)
70
200
10
0
0
50
100
150
200
0
250
Tiempo(h)
Figura 2. Consumo de azúcar y metabolitos producidos durante el cultivo
batch de Candida stellata RIVE 3-16-1 a flujo de aire constante (25 l/h) a
18oC.
Experimentos realizados por Sahoo y Agarwal (2002), con Candida magnoliae mostraron que el crecimiento
celular asi como la producción de glicerol son fuertemente afectados por el suministro de oxígeno. El
mejoramiento de la tasa de transferencia de oxígeno resultó en el incremento del crecimiento celular y el
rendimiento en glicerol.
Tabla 2. Compuestos utilizados y producidos por Candida stellata RIVE 3-16-1 durante el cultivo batch a
flujo constante de aire a 18oC.
Concentración inicial de azúcares y ácido málico (g/L)
fructosa
Glucosa
sucrosa
ácido málico
70.95
22.6
35.5
5.02
Compuestos finales (g/L)
fructosa
glucosa
traces
traces
etanol
4.3
glicerol
0
ác. acético
0
Alcoholes superiores y etil acetato producidos (mg/L)
1-propanol
propil acetato
2-metil
3-metil
propanol
Butanol
traces
0
1.7±0.04
5.6±0.05
ác. succínico
1.0±0.3
2-metil
butanol
3.0±0.05
ác. málico
2.6±0.6
Etil
acetato
13.1±0.06
Azúcar utilizado (S), biomasa final (X), rendimiento (YX/S, YE/S), tasa de crecimiento (µ)
S
X
YX/S
YE/S
µ
124.8
19.6
0.11
0.22
0.13
YX/S: g. de biomasa/g.azúcar; YE/S: g. de etanol/g.azúcar; µ: tasa de crecimiento específico (h -1); X: biomasa
seca final (gL-1); S: azúcar total consumido (gL-1).
Durante la fermentación aerobia, alcoholes superiores y esteres de acetato son producidos. En nuestros
resultados, se confirmó con los compuestos residuales que se encontraron al final del cultivo (Tabla 2). En la
segunda etapa (asimilación aerobia de etanol) probablemente los alcoholes superiores sirvieron también
como fuente de carbono para mantener el crecimiento celular. Desde el punto de vista tecnológico, las
194
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fermentaciones deberían ser detenidas una vez que los azúcares sean consumidos o cuando la concentración
de etanol haya alcanzado el valor deseado. La aireación excesiva durante la fermentación conllevaría al
incremento de la biomasa celular y como consecuencia disminuir la producción de etanol y compuestos
volátiles.
CONCLUSIONES
La concentración de azúcar y oxígeno son los factores más importantes que afectan el metabolismo de
Candida stellata RIVE 3-16-1. A altas concentraciones de glucosa, sucede la fermentación alcohólica
incluso si está presente oxígeno en cantidades suficientes. En cultivos agitados realizados en frascos
Erlenmeyer, la transferencia de oxígeno es un factor limitante así, la concentración de oxígeno disuelto en la
fase líquida sería muy baja. Estas condiciones influyen en la síntesis de sub-productos de la fermentación en
Candida stellata RIVE 3-16-1. El oxígeno afecta la síntesis de glicerol, incrementa la síntesis de alcoholes
superiores totales y esteres, especialmente etil acetato. La capacidad de síntesis de alcoholes superiores y
esteres a estas condiciones dependería también de la cepa. Adicionalmente, la producción de ácido acético
disminuyó a condiciones de agitación, esto sería ventajoso dado que las bebidas alcohólicas con baja acidez
volátil son deseables. Desde el punto de vista sensorial, el cultivo estático resultó en bebidas fermentadas de
mejor aceptabilidad y la mejor alternativa para fermentar el jugo de manzana.
En cultivos batch realizados a flujo de aire constante, el oxígeno mejora el crecimiento celular y como
consecuencia la velocidad de la fermentación pero por el contrario afecta el rendimiento de etanol. En este
caso, una excesiva aireación debería ser evitada para mejorar su rendimiento. Así mismo, Candida stellata
RIVE 3-16-1 produce etanol, glicerol durante la fermentación aerobia, los cuales son luego consumidos y el
oxígeno promueve el consumo. Desde el punto de vista tecnológico, el control de la tasa de aireación sería
una herramienta importante para controlar la síntesis de sub productos de la fermentación. El oxígeno juega
un rol muy importante en el metabolismo de Candida stellata RIVE 3-16-1, y sólo en pequeñas cantidades
sería beneficioso para la síntesis de sub productos de la fermentación.
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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Colección de Levaduras del Instituto de Investigación de Viticultura y Enología,
Bratislava, República Eslovaca, por suministrar la cepa de levadura estudiada.
197
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Glucose Avaliation as Organic Carbon Source for Chlorella minutissima Biomass Production
Ferreira S.P.1, Lisboa C.R.1, Holz J.C.P.1, Furlong V.B. 1, Costa J.A.V.1
1. FURG – Universidade Federal do Rio Grande
Resumen: El creciente interés en el estudio de cultivo de microalgas se ha orientado a la obtención de
compuestos bioactivos y fármacos con alto valor de mercado en todo el mundo. El cultivo heterotrófico de
las microalgas emplea compuestos orgánicos que, en ausencia de luz, utiliza el carbono orgánico como
fuente de energía para la producción de biomasa. Este tipo de cultivo ofrece ventajas tales como la
eliminación de la necesidad de control de la luz en el cultivo y el bajo costo para la recuperación de la
biomasa, debido a la alta densidad de células obtenida. El objetivo del trabajo fue evaluar el uso de la
glucosa como fuente de carbono en el cultivo heterotrófico de Chlorella minutissima en diferentes medios de
cultivo para la producción de biomasa. Los cultivos que adicióonados com glucosa fueron los que
presentaron multiplicación celular. La máxima concentración celular (1.14 g.L -1) y la máxima productividad
(0.26 g.L-1.d-1) se obtuvieron en el cultivo con medio BG11 con 10 g.L-1 de glucosa. Sin embargo, la tasa
máxima de crecimiento específico (0.28 1.d-1) se obtuvo en el cultivo com medio Basal con 10 g.L-1 de
glucosa.
Palabras clave: Biomasa, cultivo heterotrófico, microalga.
Abstract: A growing interest is rendered to microalgae in order to scale up biomass production processes to
enable the attainment of high commercial value bioactive and medicinal compounds that may be utilized in
functional foods design as results of its nutritional and pharmaceutical properties. Heterotrophic microalgae
culture employs organic compounds, without light utilization, as energy source for the biomass production.
As such source carbohydrates are widely used, especially glucose, however, other carbon sources may be
utilized, such as glycerol, acetate and others. This kind of culture offers advantages, as light necessity
elimination, broader culture control, low cost biomass downstream, due to higher cell concentration when
compared with autotrophic cultivation. This work objective was to validate glucose utilization as carbon
source in Chlorella minutissima heterotrophic culture under different culture media for biomass production.
The cultures that had glucose addition were the ones that presented cellular multiplication. Maximum
cellular concentration (1.14 g.L-1) and maximum productivity (0.26 g.L-1.d-1) were obtained by the culture in
BG11 medium with 10 g.L-1 of glucose. However, maximum specific growth rate (0.28 1.d-1) was obtained
by the culture in Basal medium with 10 g.L-1 of glucose.
Keywords: Biomass, heterotrophic culture, microalga.
INTRODUCTION
The increasing interest in microalgae culture parameter studies are aimed to improve biomass production.
This production is utilized in the elaboration of food products, as well as in the bioactive and medicinal
compounds obtainment. These products are usually of high value in the world market. Their utilization is
specially interesting in the development of functional food products, due to its nutritional and pharmaceutical
properties (Borowitzka 1999, Molina-Grima et al. 2003).
From microalgae biomass driven cultures several compounds may be extracted. The first product is the
biomass itself. Microalgae biomass usual composition is rich in high biological value proteins, carbohydrates
and fatty-acids. Other compounds inherent to microalgae biomass are natural dyes, antioxidants, enzymes,
biopolymers and other special products. These substances are extracted from large scale cultures. Such
cultures are conducted in biorefineries (Junior 2007).
The denomination microalgae includes organisms with two cellular structures, prokaryotic and eukaryotic.
The prokaryotic structure has species in the divisions Cyanophyta (cyanobacteria) and Procholorophyta. As
for the eukaryotic structure, it has species in the divisions Chlorophyta, Euglenophyta, Rhodophyta,
Haptophyta (Prymnesiophyta), Heterokontophyta (Bacillariophyceae, Chrysophyceae, Xantophyceae etc.),
Cryptophyta and Dinophyta (Derner et al. 2006).
Chorella is an eukaryotic unicellular spherical microalgae. Its diameter varies between species among 5 µm
an 10 µm (Illman et al. 2000). Chorella belongs to the Chlorophyta division and Chlorococcales order. Its
198
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
usual composition has a protein content of 53%, carbohydrates content of 23%, 9% lipids content and 5%
mineral content (Henrikson 1994). Some species of Chlorella have the capacity of growing in
photoautotrophic environments, as well as heterotrophic condition. A specie capable of such behavior is
Chlorella protothecoides (Wu et al. 1994).
Chlorella minutissima is a green algae, microscopic and usually found in fresh water systems. This species is
characterized as having a rigid cellular wall, as well as a large amount of chlorophyll. C. minutissima
chlorophyll content is larger than other superior algae (Morais 2006). Economical interest in its culture has
been growing due to a series of characteristics. Such characteristics are, relatively easy culture, high protein
content, capable of achieving up to 65% of its dry weight, varying according to the culture conditions
(Venkataraman and Becker 1985).
Microalgae autotrophic culture is conducted by utilizing carbon dioxide as carbon source, and sun light as
energy provider. The energy is necessary to establish a proton gradient capable of turning inorganic into
organic carbon trough a series of reactions. However, some microalgae species also have the ability of
growing under mixotrophic conditions. In this system, two carbon sources are utilized simultaneously. Both
carbon dioxide and an organic carbon source are utilized, as well as sun light as a proton gradient generator
(Chojnacka and Marquez-Rocha 2004).
In the microalgae heterotrophic cultures, such as those with organic carbon sources, carbohydrates are the
most utilized group (Cid et al. 1992), specially glucose (Miao and Wu 2006, Xu et al. 2006, Liang et al.
2009, Heredia-Arroyo et al. 2010, Shen et al. 2010, O’Grady and Morgan 2011). However, other organic
carbon sources may be utilized, such as glycerol (Liang et al. 2009, O’Grady and Morgan 2011), acetate
(Liang et al. 2009, Heredia-Arroyo et al. 2010), among others. When compared with the autotrophic culture,
this sort of culture provides several advantages, such as, the elimination of light requirement, a simpler
culture control and, biomass downstream coast reduction, due to the larger cellular density obtained (Chen
and Johns 1991).
D-glucose is a carbohydrate (molecule which posses a carbon atom together with hydrogen and oxygen
atoms, in the same proportion as they occur in water molecules) and it is the most abundant organic
compound. This molecule is characterized as a monosaccharide. Glucose is also considered to be an polyol
and an aldehyde. When D-glucose is represented in its open chain or vertical form, know as its alicyclic
structure, it has an aldehyde group in one extremity (carbon atom 1), and a primary hydroxyl group in the
other extremity (carbon atom 6). Secondary hydroxyl groups are connected to the inner carbon atoms, they
are 2, 3, 4 and 5, all of which have four different substituents, making them all chiral (Damodaran et al.
2010).
This work objective was to evaluate glucose utilization as a carbon source in heterotrofic culture of the
microalgae Chlorella minutissima in different culture media for biomass production.
MATERIAL AND METHODS
Microorganism and culture media
In this study the microalga Chlorella minutissima was utilized. This species belongs to the collection of the
Laboratory of Biochemical Engineering from the Federal University of Rio Grande – FURG (Rio Grande,
Brazil). The microalga was cultivated in BG11 medium (Rippka et al. 1979) containing (g.L-1): NaNO : 1.50;
K HPO .3H O: 0.04; MgSO .7H O: 0.075; CaCl .2H O: 0.036; Ferric ammonium citrate: 0.006; Disodic
EDTA: 0.001; Na CO : 0.02; Citric Acid: 0.006; H BO : 2.86; MnCl .4H O: 1.81; ZnSO .7H O: 0.222;
Na MoO .2H O: 0.39; CuSO .5H O: 0.079; Co(NO3)2.6H O: 0.0494; and in Basal medium (Wu et al. 1992)
containing (g.L-1): KH2PO4: 0.7; K2HPO4: 0.3; MgSO4·7H2O: 0.3; FeSO4·7H2O: 0.003; glycine: 0.1; B1
vitamin: 0.00001 and of 1 mL.L-1 A5 mineral solution.
3
2
4
2
2
2
4
2
4
2
4
2
3
2
2
3
3
2
2
4
2
2
Culture conditions
Heterotrophic cultures of Chlorella minutissima microalga were realized. The microalga was cultivated in
BG11 and Basal media complemented with 0, 5 and 10 g.L-1 of glucose in a feed batch process. The glucose
addition to the cultures was realized daily with one tenth of its final glucose concentration being added (5
and 10 g.L-1). The experiments, as well as the glucose addition, lasted for 10 days. The cultures were carried
in orbital shakers (INNOVA®44) at 150 RPM and 30°C. The utilized reactor was a closed bioreactor (2L
erlenmeyer) with 1.6L of solution. The initial cellular concentration was 0.15 g.L-1. Each glucose final
concentration generated an experiment; these were realized in duplicates, totaling 12 essays. At the end of
each experiment the solution was centrifuged. The precipitate was then dried at 40°C for 60h and ground.
199
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Analytical determinations
Biomass growth was monitored daily through the media optical density at 670 nm in spectrophotometer
(Femto 700 Plus, Brazil) correlated by a previously established standard curve. The standard curve correlates
the optical density of the media with the biomass dry weight in that solution. The kinetic evaluated
parameters were the maximum biomass concentration (X máx, g.L-1), maximum productivity (Pmáx, g.L-1.d-1)
obtained according to the equation P = (Xt X0)/(t t0), where Xt is a biomass concentration (g.L-1) in a given
time point (d), and X0 the biomass concentration (g.L-1) in the experiment's beginning(d) (Schmidell et al.
2001), and maximum specific growth rate (μmáx, 1.d-1), this was obtained by exponential regression applied to
the exponential growth phase (Bailey e Ollis 1986).
The culture pH was determined daily by digital pH meter (Quimis Q400HM, Brazil).
Glucose concentration was evaluated daily with the utilization of a Glucose PAP Liquiform colorimetric
enzymatic kit (Labtest, Brazil). The abosorbance reading was realized at 505 nm and the conversion to
glucose by a previously established standard curve.
RESULTS AND DISCUSSION
Table 1 presents the kinetic profiles of the microalgae Chlorella minutissima under the described growth
conditions.
The microalgae Chlorella minutissima reached its maximum cellular concentration (1.14 g.L-1) after 10 of
culture. The culture where this concentration conditions were 30ºC in standard BG 11 medium, in a
heterotrophic manner, where the daily addition of glucose was approximately one tenth of the final
concentration (10 g.L-1). When the microalga was cultivated with a smaller final amount of glucose (5 g.L-1),
but with the same addition protocol, the maximum achieved cellular concentration was 0.92 g.L-1.
Maximum productivity (0.26 g.L-1.d-1) was reached in the essay that utilized the BG11 medium
complemented with 10 g.L-1 of glucose. Such, relative, rapid proliferation was credited to the fact that in
such essay the total carbon concentration was higher than the other experiments. Thus the higher
productivity achieved.
Maximum specific growth rate (0.28 1.d-1) was reached when the microalga was cultivated in Basal medium,
complemented with 10 g.L-1 of glucose. This result is most likely due to the low nitrogen concentration in the
medium, and the nature in which it presents itself: NO2.
Similar results were achieved by Liang et al. (2009) studied and compared the growth of the microalga
Chlorella vulgaris under different growth conditions. This species was cultivated in autotrophic and
heterotrophic manners utilizing glucose, acetate and glycerol as exogenous carbon sources. It was observed
that this species, under heterotrophic conditions, achieved highest cellular concentration (1.2 g.L -1) and
highest productivity (0.151 g.L-1.d-1) when 1% of glucose was added to the medium. However, when
cultivated under mixotrophic conditions, utilizing 1% of glucose and carbon dioxide as organic and inorganic
carbon sources, respectively, the biomass cellular concentration reached 1.7 g.L -1 and productivity of 0.25
g.L-1.d-1.
Xu et al. (2006) cultivated the microalga Chlorella protothecoides in a heterotrophic fashion, in a Basal
medium, under a glycine restriction (nitrogen source) and utilizing glucose and powder hydrolyzed corn as
carbon sources. Under these conditions, this species reached 3.92 g.L-1 and 3.74 g.L-1 after 144 hours of
culture when the utilized substrates were powder hydrolyzed corn and glucose, respectively.
Costa et al. (2006) cultivated in an autotrophic manner the cyanophytes microalgae Chlorella vulgaris e
Chlorella minutissima and studied their kinetic parameters. In such study, it was observed that the microalga
Chlorrella vulgaris reached 5.06 g.L-1 after 22 days of culture. Culture conditions were 35ºC, iluminance of
2500 Lux, 16.8 g.L-1 of NaHCO3 as carbon source and 1.0 g.L-1 de NO3. When the same species was
cultivated under the addition of other carbon source, 1% (v/v) of carbon dioxide, it reached 2.62 g.L -1 of
cellular concentration. When cultivating Chlorella minutissima, the maximum cellular concentration was
1.53 g.L-1 in the essay with 35ºC, luminance of 2500 Lux, 16.8 g.L-1 of NaHCO3 as carbon source and 0.5
g.L-1 of NO3. Maximum productivity for the microalgae Chlorella vulgaris and Chlorella minutissima were
reached in the essays which contained 16.8 g.L-1 of NaHCO3 as carbon source, with values of 0.23 g.L-1.d-1
and 0.06 g.L-1.d-1, respectively, resulting in a higher growth in the same time period. Such occurrence is
correlated to the higher amount of nutrients in the medium, as well as the high temperature and luminance,
all of which enhance photosynthesis activity. Maximum specific growth rate (0.09 1.d-1) was reached by
200
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Chlorella vulgaris when cultivated with NaHCO3 as carbon source and 1.0 g.L-1 of NO3-. For the microalga
Chlorella minutissima the highest specific growth rate was achieved with CO2 as carbon source and 0.5 g.L-1
NO3- as nitrogen source.
Table 1: Maximum biomass concentration (Xmáx, g.L-1), maximum productivity (Pmáx, g.L-1.d-1), maximum
specific growth rate (µmáx,1.d-1) obtained for the microalga Chlorella minutissima under different culture
conditions.
Glucose Final
Xmáx
Pmáx
µmáx
Medium
Concentration (g.L-1)
(g.L-1)
(g.L-1.d-1)
(1.d-1)
0
0.14
0.03
0.00
Basal
5
0.39
0.16
0.22
10
0.38
0.20
0.28
0
0.19
0.04
0.00
BG11
5
0.92
0.19
0.18
10
1.14
0.26
0.22
Figure 1 presents the growth curves for Chlorella minutissima throughout the experiments.
Figure 1: Growth curves to the microalga Chlorella minutissima cultivated in the medium BG11 and Basal,
supplemented or not with glucose. Essays: (●) BG11 + 0 g.L -1 glucose;(■) BG11 + 5g.L-1 glucose; (▲)
BG11 + 10g.L-1 glucose; (○) Basal + 0g.L-1 glucose; (□) Basal + 5g.L-1 glucose; (∆) Basal + 10g.L-1 glucose.
Observing Figure 1, is possible to verify that the microalga Chlorella minutissima presented a similar
behavior when cultivated with BG11 medium without the addition of glucose and with Basal medium
complemented also without glucose. The experiments without glucose maintained their cellular
concentration during the entire experiment, that is, these experiments did not presented growth. However, the
experiments realized with the Basal medium added with glucose presented growth. Nevertheless, the
exponential growth phase in the Basal experiments was relatively small. The essays with BG11 medium,
added with 5 and 10 g.L-1 of glucose showed a similar behavior among themselves, with larger exponential
growth stage when compared to the other experiments.
It is observed that in the essay there was no apparent adaptation stage among the realized essays. Such
behavior is due to the fact that the inoculum underwent an adaptation period to the modified media before
the experiments begun. Cellular decay occurred after the 9th day of culture, in the essay with BG11 medium
added with 10 g.L-1 of glucose. However, the other experiments did not presented a decrease in the cellular
concentration.
Costa et al. (2006) when cultivating Chlorella vulgaris and Chlorella minutissima under autotrophic
conditions observed that the cellular decay stage occurred after 22 days of culture under culture conditions
201
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
different to the ones here described. Furthermore, it was possible to verify that the essay with Chlorella
vulgaris at the temperature of 35ºC, iluminance of 2500 Lux, utilizing NaHCO3 as carbon source, and NO3- at
the concentration of 1.0 g.L-1 presented a larger exponential growth phase than the other experiments, as well
as improving biomass final concentration.
Otherwise, for Chlorella minutissima all the essays presented similar behaviors, with brief exponential
growth phase, when compared to the tests with Chlorella vulgaris. As oppose to what was observed with C.
vulgaris, for the microalga Chlorella minutissima the utilization of carbon dioxide as carbon source
increased cellular obtainment. Other research works also verified this carbon dioxide absorption efficiency.
Works such as Laing (1991), which verified an increase of 2 to 5 times in cellular concentration when carbon
dioxide was introduced to the cultures. Or as Ishida et al. (2000) in which the addition of carbon dioxide
rendered a enhancement of 7 times in the productivity.
CONCLUSIONS
Chlorella minutissima biomass production was influenced by the amount of glucose add throughout the
experiment to the utilized medium. The highest biomass production (1.14 g.L-1) was reached when the
microalga was cultivated in BG11 medium added with 10 g.L-1 of glucose.
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The Nanofotobiotec Network – Integrating Network of Microalgae Nanotechnology and Biotechnology for
the Development Scientific/Technological and Human Resources, for the financial support.
203
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
pH Influence in Microalga Chlorella vulgaris Culture
Ferreira S.P.1, Lisboa C.R.1, Holz J.C.P. 1, Furlong V.B.1, Costa J.A.V.1
1. FURG - Universidade Federal do Rio Grande - FURG
shanaferreira@gmail.com
Resumen: El cultivo de microalgas está creciendo poco a poco en todo el mundo. La biomasa producida se
destina para las más diversas aplicaciones, como la producción de proteína monocelular, lípidos,
carotenoides, clorofila, enzimas, antibióticos y vitaminas. Como otros microorganismos, las microalgas
reaccionan a los cambios en el entorno exterior con cambios en su ambiente intracelular. El pH interfiere con
todas las reacciones químicas y bioquímicas, además de interferir en conformaciones especiales de
moléculas. El pH es considerado uno de los parámetros más críticos para la actividad biológica. La forma
predominante de fijacion el carbono es altamente dependiente del pH. La forma bicarbonato (HCO 3-) se ve
favorecida a pH más alcalino, alcanzando más del 80% entre pH 7 y 9, mientras que las formas de CO2 y
carbonato (CO3-2) predominan por debajo o por encima de estos valores, respectivamente. El objetivo del
trabajo fue estudiar la influencia del pH en el crecimiento de Chlorella vulgaris. El pH del medio influyó en
la producción de biomasa de Chlorella vulgaris, donde se obtuvo la máxima concentración celular (0.30 g.L1
) en un medio a pH del medio estándar (6.8) y enriquecido con 5 g.L-1 de glucosa.
Palabras clave: Chlorella vulgaris, cultivo heterotrófico, pH.
Abstract: Microalgae culture is gaining growing interest for the scientific community. The biomass
produced by these cultures is intended to several applications, such as production of unicellular proteins,
lipids, carotenoids, chlorophyll, enzymes, antibiotics, and vitamins. As much as other micro-organisms,
microalgae react to variations in the external environment with alterations in its cytoplasm. The pH interferes
in all the internal chemical and biochemical reactions and also in special molecules conformations. pH is also
regarded as the most important parameter for biological activities. The predominant carbon fixation form is
also highly pH dependent, where alkaline values favour bicarbonate (HCO3-) formation, constituting 80% of
the forms at pHs between 7 and 9, meanwhile the free CO2 form and bicarbonate (HCO3-) are abundant at pH
below or above this range, respectively. The objective of this work was to study the pH influence in
Chlorella vulgaris growth. The cultures that had glucose addition were those that presented cellular
multiplication. Those that did not recevied glucose did not presented growth, maintained its initial
concentration (0.15 g.L-1). The pH in influenced the Chlorella vulgaris biomass production, where the
maximum cellular concentration (0.30 g.L-1) was obtained in a medium at standard pH (6.8) and added with
5 g.L-1 of glucose.
Key-words: Chlorella vulgaris, heterotrophic culture, pH.
INTRODUCTION
Microalgae are represented as photosynthetic prokaryotic and eukaryotic beings. They are found mostly in
aquatic environments (Vonshak 1997).
In Brazil, researches with microalgae are relatively recent, and have been mostly focused in growth profiles
under different environmental conditions. Such conditions may vary with culture media, specific nutrients
composition in the media, culture temperature, salinity and light incidence (Derner 1995, Oliveira 1995,
Sipaúba-Tavares et al. 1999, Costa et al. 2001). Microalgae culture is growing worldwide. The produced
biomass may be destined to a wide variety of applications. Among such applications are unicellular protein
production, lipids extraction, carotenoids, chlorophyll, enzymes downstream, esters production, antibiotics,
hydrocarbons and vitamins (Pulz and Gross 2004).
Microalgae have been utilized in human feed as a high nutritional value supplement (Morais et al. 2006),
biodyes (Silveira et al. 2007) and in animal feed as well (Ceballos et al. 2007). Furthermore, the national and
international scientific community has realized a series of studies that showed their interest of utilizing the
microalgae biomass as a source for the production of biofuels, such as biodiesel (through the utilization of
the biomass lipid portion) (Chisti 2007). As microalgae have the capacity to fixate carbon dioxide, the
biomass production system may also contribute to diminish this substance liberation into the atmosphere.
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The carbon dioxide provided to the microalgae culture may be originated from different sources, such as
thermoelectric power plant flue gas, thus helping to decrease greenhouse effect (Morais and Costa 2007a,
Morais and Costa 2007b).
Microalgae biochemical composition varies not only with its species, but as well with its growth conditions.
Such conditions variations include light intensity, temperature, pH, nutrients media composition and
agitation (Miao and Wu 2004). In the example of other micro-organisms, such changes occur due to the fact
that microalgae counterbalance external changes with intracellular alterations (Araujo and Garcia 2005).
pH media is one of the most important factor in the culture, varying from neutral to alkaline for most
microalgae species (Ville 1967, Raven 1990). The importance of pH is related to the fact that it influences
microalgae metabolism directly (Becker 1995). pH depends of a series of factors such as the media
composition, buffering capacity, dissolved carbon dioxide concentration, temperature (which determinates
the carbon dioxide concentration) and cellular metabolic activities (Becker et al. 1988). The pH variation in
microalgae cultures occurs due to the consume of substrates, and metabolites production (Grima et al. 1999).
Although pH is a physical-chemical variable, its control is essential in order to fully ensure the absorption of
media compounds. Affecting directly the availability of such compounds (Lourenço 2006).
Microalgae culture involves the consumption of the dissolved carbon dioxide. This consumption increases
the medium pH, eventually, to high levels (for example 9.0 – 9.5) possibly toxic to some species (Lourenço
2006). The optimum pH for Chlorella minutissima is pH 7. The solution pH influences in how the carbon
dioxide is founded, the possible natures in which it can be found are: H2CO3, HCO3-1 or CO3-2 (Richmond
1990). The inorganic carbon, fundamental to the photosynthesis process is mostly found in pHs around 5.0.
In pHs among 7 and 9 the bicarbonate fraction becomes important, as over 9.5 the carbonate is highlighted.
The specie Chlorella vulgaris is a unicellular microalga, mostly found in fresh water. Its class is
Chlorophyceae, order Chlorococcales and family Oocystaceae (Hoek et al. 1995). C. vulgaris may be found
as an unicellular being, or as a colony. Both of which have the ability to pigments such as chlorophyll, βcarotene and xanthophylls. Its main reserve structure is starch, however, under stressful situations, this
species may start oil accumulation. It reproduces itself mainly by binary division, sexual spores and sexual
reproduction (Hoek et al. 1995, Esteves 1998, Raven et al. 2001, Tomaselli 2004).
The microalga Chorella posses the GRASS (Generally Recognized As Safe) certificate emitted by the FDA
(Food and Drug Administration), which grants the possibility of using such species as a food product, or part
of it, without human health risk (Henrard 2009). According to Sung et al. (1999), Chlorella has a specific
growth rate above pH 4.2, therefore explaining its facility in growing in tanks and lakes.
The objective of this work was to study the influence of the pH in the growth of the microalgae Chlorella
vulgaris.
MATERIAL AND METHODS
Microorganism and culture medium
In this study the microalgae Chlorella vulgaris was utilized. This species belongs to the collection of the
Laboratory of Biochemical Engineering from the Federal University of Rio Grande – FURG (Rio Grande,
Brazil). The microalga was cultivated in Basal medium adjusted to the pHs 6.8 and 8 (Wu et al. 1992),
containing (g.L-1): KH2PO4: 0.7; K2HPO4: 0.3; MgSO4·7H2O: 0.3; FeSO4·7H2O: 0.003; glycine: 0.1; B1
vitamin: 0.00001 and of 1 mL.L-1 A5 mineral solution.
Culture conditions
The microalga was cultivated in a Basal medium complemented with 0, 5 and 10 g.L-1 of glucose in a feed
batch process. The glucose addition to the cultures was realized daily with one tenth of its final glucose
concentration being added (5 and 10 g.L-1). The experiments, as well as the glucose addition, lasted for 10
days. The cultures were carried out in orbital shakers (INNOVA®44) at 150 rpm and 30°C. The utilized
reactor was closed bioreactor (2L erlenmeyers) with 1.6 L of solution. The initial cellular concentration was
0.15 g.L-1. 4 experiments were realized in duplicates, where 3 were with the medium standard pH (6.8)
complemented with 0; 5 e 10 g.L-1 of glucose, and another with pH 8, complemented with 5 g.L-1 of glucose,
totaling 8 essays. At the end of each experiment the solution was centrifuged. The precipitate was then dried
at 40°C for 60 h and ground.
Analytical determinations
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Biomass growth was monitored daily through the media optical density at 670 nm in spectrophotometer
(Femto 700 Plus, Brazil) correlated by a previously established standard curve. The standard curve correlates
the optical density of the media with the biomass dry weight in that solution. The culture pH was determined
daily by digital pH meter (Quimis Q400HM, Brazil).
Glucose concentration was evaluated daily with the utilization of a Glucose PAP Liquiform colorimetric
enzymatic kit (Labtest, Brazil). The abosorbance reading was realized at 505 nm and the conversion to
glucose by a previously established standard curve.
RESULTS AND DISCUSSION
Figure 1 presents the distinct behavior of the microalga Chlorella vulgaris when cultivated in Basal medium
complemented or not with glucose under different pHs.
A
B
Figure 1: A Heterotrophic culture of Chlorella vulgaris in Basal medium complemented with 0; 5 and 10
g.L-1 of glucose under pHs 6.8 and 5 g.L-1 of glucose under pH 8, respectively from left to right. B Growth
profiles of the microalgae Chlorella vulgaris cultivated in Basal medium, supplemented or not with glucose.
Essays: (○) Basal + 0 g.L-1 glucose pH 6.8; (□) Basal + 5g.L-1 glucose pH 6.8; (∆) Basal + 10 g.L-1 glucose
pH 6.8; (■) Basal + 5 g.L-1 glucose pH 8.
Observing Figure 1 A is possible to notice the different colors between the cultures. The cultures realized
with the microalgae Chlorella vulgaris under glucose addition (final concentrations of 5 g.L-1 e 10 g.L-1)
presented a decrease of the its usual green coloration. Such fact is correlated with a lessening of the cell
pigmentation, that is, the decay of chlorophyll inside the microalgae cell.
This means that in the essays with 5 g.L-1 of glucose, independent of the medium pH, the culture color
decayed to a light-green color, as for the essay with 10 g.L-1 presented a light-yellow color. However, in the
essays without the glucose addition the microalga Chlorella vulgaris did not achieved the necessary cellular
viability in order to present growth. Nevertheless, after the 10 days of culture, the microalga still presented
its initial green color, denoting that there was not a large decay of chlorophyll.
According to Tel-or et al. (1980) the concentration of chlorophyll in the microalgae cells is influenced by
several factors. Such as the medium composition, the cell age, as well as the process conditions. Therefore,
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in autotrophic cultures (carbon dioxide + light) and mixotrophic (carbon dioxide + light + organic substrate)
the light intensity and carbon dioxide levels are the most important factors.
The majority of microalgae are capable of sustaining growth under heterotrophic conditions (light absence +
organic substrate), but while doing so, their chlorophyll accumulation does not reach the levels obtained by
cultures utilizing a light source. According to Lourenço (2006) the heterotrophic culture of Chorella
presented the higher productivity than mixotrophic cultures, reaching 48 g.L-1d-1. However, under such
conditions, the microalga lose its pigment molecules.
Rubio et al. (1989) studies the amount of chlorophyll during a heterotrophic culture of chlorella pyrenoidosa
utilizing as energy and carbon source the monosaccharides glucose, fructose and manose. These authors
observed that in the first hour of culture the was a increase in the chlorophyll cellular levels. However, after
5 to 6 hours it was verified that even though the level of chlorophyll had risen, in mol.mL -1, its weight
percentage diminished gradually. Similar results for all the monosaccharides occurred. The chlorophyll
decrease was more rapid as the organic substrate concentration was larger
The results presented here are congruent to the ones exposed by Rubio et al. (1989) and Kariander e Krausm
(1966), in which it was observed that Chlorella vulgaris heterotrophic growth, utilizing glucose as energy
and carbon source presented a decrease of chlorophyll cellular concentration after the second day of culture.
While in the first day the relationship chlorophyll/cell remained constant or a small decrease occurred.
Trough the analysis of Figure 1 B is possible to verify that there was no adaptation stage, this occurred due to
the fact that the inoculum were previously adapted to the essay condition. Furthermore, it is verified that the
microalga did not grow when a organic carbon source was not added (glucose). This behavior is explained
by the fact that there was no possibility of obtaining energy through photosynthesis, for the experiments were
realized without ambient light.
It is also possible to notice that the exponential growth phase was intense in the first day of culture,
extending itself to the third and fourth days of culture, in the essays complemented with 5 g.L-1 of glucose.
The microalga growth capacity was influenced by the medium pH. In pH 6.8 it was obtained a maximum
biomass concentration of 0.30 g.L-1, while in pH 8 the maximum biomass concentration was 0.25 g.L-1. Thus
confirming the pH influenced in cellular growth, and therefore, its influence in productivity. In this case, the
slightly acid pH (6.8) enhanced the microalga growth. When a higher glucose concentration was utilized (10
g.L-1) in the medium with pH 6.8, the growth profile was similar to the one with a smaller glucose
concentration (5 g.L-1), the obtained values for maximum biomass concentration were 0.29 g.L-1 and 0.30
g.L-1, respectively, presenting a small influenced of the added glucose concentration.
The results here presented are congruent with the ones exposed by Marinho et al. (2009), where it was
evaluated Chlorella vulgaris growth under different pHs (5, 7, 9). It was verified that the largest, maximum
cellular density of approximately 9500x104 cel.mL-1 was observed in the essay with pH 5 at the ninth day of
culture. For the essay containing the medium adjusted to a pH 7 the maximum cellular density was 4900x10 4
cel.mL-1, in the sixth day of culture. In the essay containing medium with pH 9 the maximum achieved
cellular concentration dropped to 4200x104 cel.mL-1, in the ninth day of culture. These results indicate that
the microalga Chlorella vulgaris presents better growth results in low pHs. According to Esteves (1998), in a
aqueous environment inorganic carbon may presents itself as CO2, H2CO3 (carbonic acid), HCO3(bicarbonate) or CO32- (carbonate) and its proportion varies with the pH in which the media is. As pH rises,
the proportion of carbonate and bicarbonate also rise as well. Therefore, in a culture, a lower pH enhances
the proportion of carbon dioxide inside the medium, and this is the preferable form for microalgae.
Different results to pH alteration occur in other microalgae species, one specie with a different behavior is
Spirulina. Karam and Soccol (2007) evaluated the pH influence in the production of Spirulina major and
verified that when this microalgae was cultivated in pH 8 the final biomass concentration (1.274 g.L-1) was
higher and statistically different than the cultures with pH 7 (1.137 g.L -1), pH 9 (1.030 g.L-1) and pH 10
(0,9970 g.L-1). Therefore, they have concluded that the optimum pH for this microalga is 8. However,
according to Ferraz (1985) and Materassi et al. (1984) the optimum pH for S. major is between 9.0-10.0, a
larger value than to other Spirulina species.
CONCLUSIONS
The culture pH influenced the production of Chlorella vulgaris. Thus, it was verified that the largest cellular
concentration (0.30 g.L-1) occurred when the microalga was cultivated in the standard Basal medium pH
(6.8) complemented with 5 g.L-1 of glucose.
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ACKNOWLEDGMENT
The Nanofotobiotec Network – Integrating Network of Microalgae Nanotechnology and Biotechnology for
the Development Scientific/Technological and Human Resources, for the financial support.
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Condiciones de producción y comportamiento térmico de lactasa recombinante.
Lupi G. J, Perillo M.A.y Sanchez J.M.
IIBYT (CONICET-UNC)- ICTA, FCEFyN,UNC.
jmsanchez@efn.uncor.edu
Resumen: El objetivo del presente trabajo fue comparar la actividad de la beta-galactosidasa nativa de
Escherichia coli (-GalE.coli) con respecto a -GalHis6. Esta última es una proteína recombinante derivada de
-GalE.coli con el agregado de 6 residuos de histidina (His-tag) fusionados en el extremo carboxilo terminal.
Esta modificación facilitó su purificación por cromatografía de afinidad ión-metal (IMAC). La hidrólisis de
lactosa catalizada por -Gal se determinó con el método de la glucosa oxidasa por espectrofotometría visible
frente condiciones variables de temperatura, pH, concentración de lactosa. Nuestros resultados mostraron
que, ambas enzimas presentan un perfil de actividad similar frente a pH y temperatura. Por otro lado, la
enzima recombinante presentó una leve resistencia a la inactivación por temperatura y pH con respecto a la
enzima nativa. Ambas enzimas presentaron una cinética michaeliana y similar afinidad por la lactosa
(KM≅4,2 mM). Sin embargo, en todos los casos la actividad específica de -GalHis6 fue menor con respecto a
-GalE. coli sugiriendo que la presencia de histidinas podría afectar la actividad enzimática al nivel del
mecanismo de reacción. Sin embargo, no se descartan posibles diferencias conformacionales entre estas dos
variantes de la enzima.
Palabras claves: Lactasas recombinantes, actividad enzimática
Abstract: The aim of this study was to compare the activity against lactose of native E.coli betaGalactosidase (-GalE-coli) with a recombinant parent protein -GalHis6. -GalHis6 was over-expressed in E.
coli and contained 6 histidine residues fused to the carboxyl terminal, which facilitated its purification by
metal-ion affinity chromatography, (IMAC). The hydrolysis of lactose was quantified spectrophotometrically
at varying conditions of temperature, pH and lactose concentration . Both enzymes showed similar affinity
for lactose (Km ≅ 4.2 mM ). The recombinant enzyme showed a slight resistance to inactivation by
temperature and pH. The specific activity of -GalHis6 was lower with respect to -GalE. coli suggesting that the
presence of histidine could affect in the reaction mechanism. Furthermore, possible conformational changes
cannot be discarded.
Keywords: Recombinant lactase, enzyme activity
INTRODUCCIÓN
La β-galactosidasa o β-D-galactosido-galactohidrolasa (β-Gal) es una enzima perteneciente a la familia de las
glicosidasas, las cuales son capaces de disociar uniones entre dos o más carbohidratos o entre un
carbohidrato y un grupo no carbohidrato (aglicona). Esta enzima ampliamente utilizada y de gran interés en
la industria láctea cataliza la hidrólisis de un enlace β-galactosídico terminal presente en carbohidratos,
glicolípidos, glicoproteínas y glicosaminoglicanos (Tanaka et al., 1975).
Uno de los sustratos naturales más importante es la lactosa (β-D-galactopiranosil-(1-4)- D-glucopiranosa) o
azúcar de la leche la que se disocia en sus componentes monoméricos: glucosa y galactosa. El método
enzimático para hidrolizar lactosa es más conveniente que el uso de ácidos y alta temperatura (150°C) donde
se generan subproductos indeseables causados por la interacción de los grupos amino de las proteínas
lácteas con lactosa, debido al gran poder reductor de esta última.
El principal uso de la β-Gal es la disponibilidad de sistemas inmovilizados que permiten la hidrólisis
contínua de la lactosa de la leche (Mateo et al. 2002). Este tratamiento de la leche con β-Gal antes de la
comercialización tiene importancia a los fines de solucionar problemas nutricionales (como la intolerancia a
la lactosa) y/o tecnológicos (cristalización o azucaramiento del dulce de leche por envejecimiento). Es de
gran interés también para el tratamiento de residuos de la industria láctea que contienen lactosa (como es el
caso del suero de la leche, desechado en la producción de queso), debido a que este disacárido tiene una tasa
de biodegradabilidad muy baja y puede producir contaminación del ambiente por bioacumulación. El alto
poder edulcorante de los productos de hidrólisis de lactosa, hace que este proceso tenga un atractivo extra
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debido a la posibilidad de obtener jarabes de galactosa y glucosa, utilizados en la elaboración de helados,
golosinas y productos de confitería y panadería, postres, alimento de animales, y aditivos para ensilaje.
Además la mezcla de glucosa y galactosa (productos de la hidrólisis de lactosa) es 2 a 3 veces más dulce que
la lactosa. Esto produce un cambio perceptible y en la mayoría de los casos indeseado en el sabor del
alimento. Más aún, β-Gal se utiliza para la eliminación de azúcares de jugos de frutas (Brenchley, 1996), la
producción de nuevos derivados de azúcares, galacto-oligosacáridos (GOS) a partir de transglicosilaciones
con diferentes donores (Sheridan y Brenchley, 2000). Estos últimos, son considerados suplementos
alimenticios (o sustancias prebióticas) no digeribles y actúan como fibras en la dieta promoviendo el
crecimiento de bífido bacterias (probióticos) en el intestino que mejoran sensiblemente el funcionamiento
orgánico ya que modifican positivamente la flora intestinal y favorecen el funcionamiento del sistema
inmune y, por tanto, la salud global del organismo (Sako et al, 1999).
Además, de los usos tecnológicos, también existe la posibilidad de utilizar β-Gal con fines terapéuticos en las
terapias de sustitución enzimática para el tratamiento de la hipolactasia. En este sentido, nuestro grupo de
investigación ha logrado la incorporación de β-Gal encapsulada en liposomas para ser incorporados a la
leche utilizada en la alimentación de personas intolerantes a la lactosa. Esto podría presentar algunas
ventajas, respecto al consumo de leche deslactosada principalmente en cuanto a la preservación de los
caracteres organolépticos de la leche (Turina,et al, 2002).
Por todo esto, es importante disponer de esta enzima en grandes cantidades. En consecuencia, uno de los
objetivos del presente trabajo, fue establecer las condiciones óptimas para la transformación de bacterias
(E.coli) con el gen de que codifica para una -Gal recombinante (-GalHis6,) que contiene 6 residuos de
histidina (His) unidos al carboxilo terminal de cada uno de los 4 monómeros que conforman la estructura de
la proteína.
Esto no sólo permite disponer de una fuente de producción de enzima en grandes cantidades sino que
también facilita la purificación de la misma aprovechando la propiedad que le confiere la cola de poli-His de
unirse selectivamente a una columna de afinidad (Sánchez et al., 2009).
Además, se han reportado resultados que demuestran que la presencia de histidinas adicionales en la
estructura primaria de enzimas en algunos casos puede afectar su actividad catalítica (Cadel et al, 2004) y en
otros casos puede ser inocua (Mateo et al., 2006). Además, nosotros hemos demostrado que la enzima
recombinante interactúa de manera diferente con interfases lipídicas con respecto a la enzima nativa
(Sanchez, et al., 2009) y por lo tanto se sugiere que es posible encontrar características funcionales diferentes
en la enzima recombinante -GalHis6. En consecuencia, otro objetivo del presente trabajo fue estudiar el
comportamiento bioquímico de -GalHis6 de manera comparativa con el de la -GalE.coli nativa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales.
Actividad de β-Gal: La enzima β-galactosidasa [EC 3.2.1.23] Grado VII de E. coli, en forma de polvo
liofilizado (en presencia de sales de buffer Tris/HCl, MgCl 2 y β-mercaptoetanol) nativa de origen comercial
adquirida en Sigma Chem. Co. (β-GalE.coli). La enzima β-galactosidasa recombinante (β-GalHist6), producida
en nuestro laboratorio a partir de una cepa de E. coli transformada con el plásmido pET26+.
Reactivo Glicemia enzimática AA líquida utilizado para medir la concentración de Glucosa. Lactosa
monohidratada utilizada como sustrato (Anedra) y el o-nitrophenyl-β-D-galactopiranósido (ONPG)
adquirido en Sigma Chem. Co., otros reactivos de grado analítico, Purificación de proteínas: Medio de
cultivo LB: Triptona (Britania), Extracto de levadura (Britania), NaCl (Anedra), Kanamicina (Cristalomicina
Inyectable), Agar (Britania). Inductor: isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) (UltrapureTM 99% de pureza
Invitrogen). Cromatografía de afinidad: Resina (ProBondTM Resin). Elución de proteína: Imidazol
(Biopack) Cepas de E. coli BL2 1λpri-Codon plus: catalogadas como seguras por la FDA (Food and Drugs
Admininstration, USA)
Métodos
Producción y purificación de β-galactosidasa recombinantes.
Bacterias E. coli de la cepa BL2 1λpri-Codon plus, previamente transformadas fueron incubadas en 500 mL
de medio de cultivo Luria Bertani (LB) en presencia del antibiótico kanamicina (20 μg/mL), con el fin de
seleccionar las bacterias que tuvieran inserto el plásmido pET26(+). Este plásmido posee en su secuencia el
gen de resistencia a la kanamicina además del gen de β-Gal. El cultivo se agitó durante toda la noche (O.N.)
a 37 °C. Luego se tomaron 6 mL del mismo y se centrifugó a 4000 rpm, por 10 min. a 4°C. Se descartó el
211
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sobrenadante y se resuspendió el pellet en 600 mL de medio de cultivo LB en presencia de kanamicina (20
ug/ml). Se dejó crecer a 37 °C durante ~3 h, con agitación, hasta alcanzar una densidad óptica (DO) entre 0,4
y 1,0. Una vez lograda la DO deseada se agregó IPTG (0,4 mM) para inducir la expresión de la enzima y el
cultivo se mantuvo con agitación O.N. a 20°C. Posteriormente las células se cosecharon por centrifugación,
se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 20 mL de buffer fosfato 0,05 M y NaCl 1mM pH
6,8. Luego las células fueron lisadas por tres ciclos consecutivos de sonicación (en un sonicador de punta de
alta frecuencia Marca: Biologics INc. (Mod 150 V/T)), congelación (aire líquido -196°C) y descongelación
(baño termostatizado a 30°C).
El lisado celular obtenido se mezcló con la resina conteniendo iones de Ni, con afinidad para la unión a
residuos de histidina; se dejó interactuar durante 2 h a 4ºC con agitación y posteriormente se realizaron
lavados con soluciones de imidazol de concentración creciente desde 60, 100, 200 mM; finalmente la resina
interactuó durante 15min. con una solución de imidazol 400 mM y luego se dejó eluir la solución. El
imidazol se eliminó por diálisis contra buffer fosfato 0,05 M pH 6,8 usando membranas de diálisis y el
dialisado se liofilizó (-90°C y vacío) para obtener la enzima en forma de polvo.
La expresión y la pureza de las proteínas fueron determinadas por electroforesis en geles de poliacrilamida
en presencia de SDS (SDS-PAGE).
Determinación de la concentración de enzima.
La concentración de β-Gal se determinó por el método de Lowry (1951).
Hidrólisis de lactosa.
La actividad de β-Gal se determinó por el método de Huber y sus colaboradores (1976). El
medio de reacción contuvo 20 μL enzima (entre 0,1 y 0,2 mg/L) y 80 μL lactosa (250 mM, ambos reactivos
se disolvieron en buffer fosfato 0,05 M pH 6,8, la reacción se mantuvo a 37°C durante 20 min. y la reacción
se detuvo calentando el sistema de incubación a 100ºC durante 5 min, para desnaturalizar e inactivar la
proteína. Uno de los productos de hidrólisis (glucosa) se cuantificó por el método de glucosa oxidasa (Raba y
Mottola, 1995)
Efecto de temperatura y pH y tiempo sobre la actividad enzimática
Para medir el efecto de la temperatura la reacción se llevó a cabo en un rango de 22 a 66 ºC a pH 6,8. El
efecto del pH se analizó midiendo la actividad de cada una de las enzimas estudiadas en un rango de 3 a 9
logrado por buffer citrato (3,00 a 6,21), fosfato (5,83 a 8,13) y Tris/HCl (7,53 a 9,00) a 37ºC, (Tris =
tris(hidroximetil)aminometano). El efecto del tiempo de reacción (entre 10 y 330 min,) se analizó a 37ºC y
buffer pH 6,8, en tubos tapados con tapones de goma, para evitar la evaporación de agua.
Determinación de los parámetros cinéticos:
Los parámetros cinéticos KM y Vmax se determinaron a partir del ajuste de la ecuación de Michaelis Menten,
por el método de mínimos cuadrados, a las curvas de velocidad inicial en función de la concentración de
lactosa en un rango de 0,5 a 250 mM..
Estudios de reversibilidad de la actividad enzimática
Se realizaron estudios de reversibilidad de la actividad preincubando cada enzima durante 30 min. a distintas
temperaturas o distintos pH y luego se midió la actividad en condiciones óptimas (37ªC, pH 6,8).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Purificación de -GalHis6.
Para determinar las condiciones de sobreexpresión de β-galactosidasa se probaron 2 variables en el
tratamiento del cultivo de la bacteria, la densidad óptica (DO) (0,45 y 1,00) y la concentración de inductor
(IPTG) (0,4 mM y 1,0 mM). Los resultados se muestran en la Fig. 1.
212
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0.16
0.14
ONP/tiempo
(mol/min)
0.12
DO=0.45+IPTG 0.4 mM
DO=0.45 + IPTG 1 mM
DO=1 + IPTG 0.4 mM
DO=1 + IPTG 1 mM
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
-Gal
sin purificar
-Gal
-Gal
1º Elución 2º Elución
Imidazol
60 mM
-Gal
3º Elución
Imidazol
100 mM
-Gal
4º lavado
Imidazol
200 mM
Figura 1. Actividad enzimática de β-Gal proveniente de sucesivas etapas de purificación (indicadas en la
figura). La muestra de β-Gal sin purificar corresponde a la solución previo a la incubación con la resina. La
muestra β-Gal 1° elución corresponde a la solución luego de ser incubada con la resina y antes de comenzar a
eluir con imidazol. Se indica la actividad enzimática de muestras lavadas con soluciones de imidazol a las
concentraciones indicadas en el gráfico.
La mayor actividad se observó en las muestras lavadas con 100 mM de imidazol y cuando los valores de DO
y concentración de IPTG correspondieron a 1,00 y 1,0 mM respectivamente (condición 4º). A pesar de esto,
la condición de cultivo que presentó mayor eficiencia fue DO = 1,00, y concentración de IPTG = 0,4 mM
(condición 3º). El uso de una concentración de más del doble de IPTG (condición 4º respecto de condición
3º) indujo un aumento en la actividad de la enzima de sólo un 30%. Esto podría deberse a que el exceso de
IPTG puede tener un efecto negativo en la expresión de proteínas ya que estas proteína recombinantes a
determinada concentración podrían ser tóxicas para la bacteria (Corona et al., 2007). Por otro lado, la
sobreexpresión de proteínas en E. coli ocurre habitualmente bajo la forma de cuerpos de inclusión. Estos
requieren un tratamiento adecuado y costoso para obtener la proteína soluble (Alibolandi et al. 2009).
Por esto fue la condición 3º, la seleccionada como más apropiada para posteriores. purificaciones. Con
soluciones de proteínas provenientes de esta condición de purificación DO = 1,00 y IPTG = 0,4mM se
realizó la electroforesis SDS-PAGE en gel de poliacrilamida para determinar el grado de pureza alcanzado.
Esta se muestra en la Fig. 2.
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Figura 2. Electroforesis SDS-PAGE de las muestras provenientes en las sucesivas etapas de purificación.
Carril 1: marcador de peso molecular. Carril 2: elución con imidazol 400 mM. Carril 3: elución con imidazol
100 mM. Carril 4: elución con imidazol 60 mM. Carril 5: elución sin imidazol. Marcadores de referencia:
200 miosina; 116,25 β-galactosidasa; 97,4 fosforilasa b; 45 ovalbumina; 31 anhidrasa carbónica; 21,5
inhibidor de tripsina de la soja; 14,4 lisozima; 6,5 aprotinina.
Se observó un alto grado de pureza en la elución, que se realizó con la solución de imidazol de concentración
100 mM. Carril 3 de la Fig. 2.
Se realizó una nueva electroforesis, para determinar y comparar el grado de pureza de cada una de las
soluciones enzimas (β-GalHist6 y β-GalE.coli) que fueron utilizadas para la determinación de la actividad
enzimática en cada uno de los experimentos.
Figura. 3 Electroforesis SDS-PAGE de la muestras conteniendo beta galactosidasa nativa y recombinante..
La flecha indica el peso molecular del monómero de β -galactosidasa (116 kD). Carril 1: β-GalE. coli. Carril
2: Marcador de peso molecular. Carril 3: β-GalHis6 (elución con imidazol 100 mM). Se observó que
ambas enzimas se encuentran en un alto nivel de pureza. Marcadores de referencias: 200 mi osina;
116,25 β-galactosidasa; 97,4 fosforilasa b; 45 ovalbumina; 31 anhidrasa carbónica; 21,5 inhibidor de
tripsina de la soja; 14,4 lisozima; 6,5 aprotinina.
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Esta electroforesis sugirió que ambas soluciones de β-Gal se encontraron libres de otras proteínas. Este dato
fue muy significativo a la hora de determinar la concentración de enzima de las soluciones, para lo cual se
utilizó el método de Lowry (Sección 2.2.3).
Comparación de las actividades catalíticas de β-GalHist6 y β-GalE.coli
Efecto de la temperatura.
Figura. 4 Efecto de la temperatura de incubación sobre la actividad de β -Gal. Rango 22 a 66°C. Puntos
blancos: β-GalE.coli, Puntos negros: β-GalHist6.
La enzima recombinante presentó menor actividad catalítica en todo el rango de temperatura estudiado, sin
embargo presentó mayor tolerancia al cambio de temperatura con respecto a la enzima nativa entre 37 y
50ºC. Para ambas enzimas la actividad fue muy baja a temperaturas menores de 30°C, pero comenzó a
aumentar inmediatamente después de este valor, y fue máxima a 50°C. Cuando se superaron estos máximos,
la actividad específica disminuyó, de manera abrupta. Después de los 60°C ambas enzimas experimentaron
una actividad muy pequeña que desapareció totalmente a 66°C.
Efecto del pH
Figura. 5. Efecto de pH de incubación sobre la actividad de β -Gal. . Rango 3 a 9, buffers utilizados; ácido
cítrico/citrato de sodio (rango de pH 3,04 a 6,21), fosfato monobásico de sodio/fosfato dibásico de sodio
(rango de pH 5,90 y 8,18) y tris/ácido clorhídrico (rango de pH 7,15 a 8,93). Las líneas de puntos marcan un
límite aproximado (ya que hay solapamiento) del pH alcanzado por cada tipo de buffer. Puntos blancos: βGalE.coli, Puntos negros: β- GalHist6.
Se demostró que la actividad máxima de las dos enzimas està alrededor de pH 7 y que la actividad de βGalHis6 pareció ser menos susceptible al cambio de pH en un rango de 6,2 a 8,00. Se evidenció un efecto
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inactivador del ión citrato con respecto al ión fosfato el cual se observa claramente a pH 6, siendo muy
superior la actividad registrada en este último buffer. Si bien, se ha reportado al buffer Tris/HCl como
inactivador de β-Gal (Ullman, et al., 1967) no se observaron diferencias en el efecto de este buffer con
respecto a buffer fosfato en un rango de 7,3 a 8,00 para ninguna de las enzimas.
Efecto del tiempo de incubación
La cantidad de producto formado fue proporcional al tiempo de incubación en un lapso de tiempo de 10 a
330 minutos.
Figura. 6. Efecto del tiempo de incubación sobre la actividad catalítica de β -Gal. . Rango 10 a 330 minutos.
Puntos blancos: β-GalE.coli D. Puntos negros: β-GalE. coli ND. Se realizaron las regresiones lineales de las dos
curvas y se observó linealidad hasta los 180 minutos aproximadamente. En línea de puntos se muestra la
regresión lineal correspondiente.
La actividad específica mostró un comportamiento lineal con respecto al tiempo de incubación hasta los 180
minutos inclusive. El comportamiento fue muy similar, entre ambas enzimas y se observó mayor actividad
en la β-Gal nativa. En esta curva se observó que el tiempo de incubación de 20 minutos (utilizado en el resto
de los experimentos) se encuentra dentro del rango lineal y por lo tanto responde a la condición de velocidad
inicial.
Determinación de los parámetros cinéticos de β-Gal
Se midió la velocidad inicial en función de la concentración de lactosa con el fin de determinar los
parámetros cinéticos de ambas enzimas. Para ello se utilizaron condiciones estándar de pH, temperatura y
tiempo definidas anteriormente.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Figura. 7 Curvas de Lactosa. Loa puntos corresponden a los valores experimentales y la linea continua
indica el ajuste de la ecuación de Michaelis-Menten. Los parámetroscinéticos se determinaron por medio de
un análisis de regresión no lineal por el método de los cuadrados mínimos de las curvas de velocidad inicial.
Puntos blancos: β-GalE.coli. Puntos negros: β-GalHist6.
Tabla 1. Parámetros cinéticos de actividad de β-Gal.
-GalHist6
-GalE.coli
KM
Vmax
(media  sd) (mM) (media  sd) (µmol/min/mg)
4,3  0,2
4,1  0,2
4,1  0,4
9,1  0,1
Los parámetros cinéticos se determinaron por regresión no lineal por el método de cuadrados mínimos a
partir de los datos mostrados en la Fig.7..
Las KM de ambas enzimas fueron similares entre si, lo cual indicó que el agregado de residuos de histidinas
no afectó la afinidad de la enzima por el sustrato. La velocidad máxima (Vmax) fue mayor en la enzima
nativa.
En todas las curvas analizadas la actividad de la enzima nativa (β-GalE.coli) fue superior
a la actividad de la enzima recombinante (β-GalHist6). La Fig. 4 muestra que la mayor actividad en las dos
enzimas se logra a 50 ºC e inmediatamente después de superar esta temperatura ocurre una abrupta caída de
la actividad, por ello se recomienda trabajar en condiciones de temperatura por debajo de los 50 ºC. Según
estudios previos a partir de los 40ºC aproximadamente, se observan cambios conformacionales en β-Gal
inducidos por temperatura (Tmβ-GalE. coli = 60ºC) (Sanchez et al., 2013). Por esto la temperatura seleccionada
para estudiar el comportamiento de otros factores sobre la actividad fue 37ºC. Esto se debió, a que a esta
temperatura la actividad aumenta proporcionalmente.
β-Gal nativa presenta 3 aminoácidos de histidina (391, 418 y 540) conservados evolutivamente, que están
localizados en el sitio activo y parecen estar involucrados en la catálisis por la interacción con el
intermediario galactosil-enzima (la glucosa se libera y la galactosa continua retenida en la enzima, en la
primera etapa de la reacción de hidrólisis de la lactosa) de la reacción (Huber et al., 2001). Como muestra la
Fig.8, las histidinas adicionales en el extremo carboxilo terminal de cada monómero (círculo verde)
parecerían no interactuar con el sitio activo (círculo naranja). Sin embargo no se puede descartar algún efecto
relacionado con la interacción de estos aminoácidos con el intermediario galactosil-enzima. Por otra parte,
los 50 aminoácidos del extremo carboxilo terminal contribuyen a estabilizar el contacto entre los 4
monómeros de la estructura proteica, por lo tanto se podría especular que la presencia de las seis histidinas
adicionales en β-GalHist6 podrían tener algún efecto sobre esta interacción.
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Figura. 8. Estructura molecular de β -Gal. a) Tetrámero de β-Gal (forma activa de β-Gal). b) Monómero de
β-Gal. Verde: región del carboxilo terminal donde se incorporan las histidinas. Celeste: región donde se unen
los Mg2+ que aumentan la actividad. Anaranjado: región del sitio activo de β-Gal.
Algún efecto en la estabilidad/conformación del tetrámero inducido por estos aminoácidos nuevos podría
explicar el efecto sobre los valores observados de actividad/estabilidad.
.
Recuperación de la actividad de β-Gal frente al tratamiento térmico
Figura. 9. Reversibilidad de la actividad frente al tratamiento térmico. Se determinó la actividad enzimática
luego de la preincubación de las enzimas a distintas temperaturas. Puntos blancos: β-GalE.coli. Puntos negros:
β-GalHist6. NP en eje de abscisas indica la actividad de la enzima no preincubada.
Ambas enzimas soportaron hasta una temperatura de preincubación de 30°C. Esto se debió probablemente a
los cambios conformacionales que comienza a sufrir la proteína a partir de los 40 ºC (Sanchez et al,2013).
Las enzimas perdieron gran parte de su actividad cuando se las preincubó a 50°C y a 65°C su actividad fue
casi nula. A temperaturas mayores de 40°C se observó que la enzima recombinante presentó mayor
resistencia a la inactivación por temperatura denotado por un cambio más gradual en la actividad al aumentar
la temperatura. Se observó además que la enzima preincubada de β-GalE.coli presentó menor actividad (25%
menor) que el control con enzima no preincubada (condición NP, Fig. 9). En β-GalHist6 este efecto no se
observó.
Reversibilidad al efecto del pH.
Recuperación de la actividad de β-Gal frente a la preincubación en medio con diferentes pH
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Figura. 10 . Curvas de reversibilidad al pH. Se determinó la actividad enzimática luego de la preincubación
de las enzimas a distintos pH.Puntos blancos: β-GalE.coli, Puntos negros: β-GalHist6. NP en el eje de abscisas
indica la actividad de la enzima no preincubada.
El comportamiento frente a la preincubación a pH extremos es similar en ambas enzimas. Las enzimas
presentaron inactivación cuando se las colocó a pH menores de 4. Sin embargo, resultaron ser resistentes a
pH básicos y lograron actividades medibles hasta una preincubación a pH 13 (Fig. 10). Este efecto se
presentó de forma similar en ambas lactasas. Se demostró que las enzimas son bastante resistentes a la
inactivación por preincubación a pH moderadamente básicos.
CONCLUSIONES
Se logró sobreexpresar β -Gal con un alto grado de pureza. Se determinó la condición de cultivo que
presentó mayor eficiencia en la producción de proteína activa Si bien en todas las curvas analizadas la
actividad de la enzima nativa (β-GalE.coli) fue superior a la actividad de la enzima recombinante (βGal Hist6) esta última pareció demostrar mayor resistencia a la temperatura y al pH. Estos resultados son
alentadores para continuar explorando la posibilidad de utilizar la enzima recombinante por ejemplo en
procesos de deslactosado en condiciones de alta temperatura.
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AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por CONICET, SECyT, Universidad Nacional de Córdoba y ANPCyT. Argentina
220
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Pre-treatment with diatomaceous earth in the sugar cane molass and corn steep liquor
Machado W.R.C., Ramos J.J.M., Sa C.S., Rodrigues A.B., Burkert, J.F.M.
FURG - Federal University of Rio Grande. Brazil.
whallansfm@hotmail.com
Abstract: The use of coproducts as culture medium is a way to replace the synthetic media however, these
alternative substrates may exhibit high concentrations of heavy metals which may retard microbial growth.
The Heavy metals can be removed by suitable pre-treatments promoting an clarified aspect without
interfering in the submerged culture. The aim of this work was to study the conditions for pre-treatment of
corn steep liquor (CSL) and sugar cane molasses using diatomaceous earth, through two 2 3 rotational central
composite designs. For CSL and molasses, respectively, clarification of 87.94% and 68.11% was observed
with a reduction in total reducing sugars (TRS) of 16.43% and 56.85%, and a pH variation of 0.19 and 0.14
when compared to coproducts without pre-treatment. Thus, to obtain a satisfactory clarification for corn
steep liquor 6% diatomaceous earth at 60 °C for 80 min and molasses 6-7% diatomaceous earth at 60°C for
80 to 90 min are required.
Keywords: coproducts, pre-treatment, diatomaceous earth.
Resumo: A utilização de coprodutos como meio de cultivo é uma forma de substituir os meios sintéticos,
entretanto estes substratos alternativos podem apresentar altas concentrações de metais pesados, retardando o
crescimento microbiano, porém podem ser removidos através de pré tratamentos adequados promovendo
uma aspecto clarificado sem interferir no cultivo submerso. O objetivo desse trabalho foi estudar as
condições de pré tratamento da água de maceração de milho (AMM) e melaço de cana de açúcar utilizando a
terra diatomácea, através de dois delineamentos central composto rotacional 2 3. Para AMM e melaço,
respectivamente, foram observados uma clarificação de 87,94% e 68,11% com redução de açúcar redutor
total (ART) de 16,43% e 56,85%, e uma variação de 0,19 e 0,14 no pH quando comparados aos coprodutos
sem pré tratamento. Dessa forma, para obtenção de uma clarificação satisfatória para água de maceração de
milho são necessários 6% de terra diatomácea, a 60ºC por 80 min e para o melaço 6 a 7% de terra
diatomácea, a 60°C durante 80 a 90 min.
Palavras-chaves: coprodutos, pré tratamento, terra diatomácea.
INTRODUCTION
Brazil has a variety of co-products in abundance such as sugar cane molasses and corn steep liquor (CSL)
with great economic and ecological appeal that can be used as substrates for culture medium for different
micro-organisms, as alternative carbon and nitrogen sources for obtaining a bioproduct.
Substrates such as molasses are subproducts of the sugar industry which present certain nutrients such as
reducing sugars and minerals that can favor the submerged culture when used. However, the corn steep
liquor is a coproduct from moist corn milling, that presents vitamin B complex and a variety of minerals such
as K, P, Mg, Na, Ca, Fe, Zn, Mn, Cr, Cu (Yuan 2011). Thus, the use of these low cost substrates is an
alternative to minimize the volumes of industrial wastes (Nascimento et al. 2007).
On the other hand, agroindustrial media have a variable composition due to their complexity, which can be
responsible for the inhibition of yeasts (Treichel 2004). High concentrations of heavy metals in culture
medium can result in serious problems during culturing, such as retarding microbial growth, production of
other bioproducts which can cause intoxication of the inoculum and interference of the pH (Roukas 1998,
Berwanger 2005). However, these contaminants found in agroindustrial medium can be partially removed
with an appropriate pre-treatment which enables obtaining culture media with clarified aspect, causing no
interference in submerged culture and promoting a productivity greater than that of media without treatment.
Sulfuric acid, phosphoric acid, potassium ferrocyanide, tricalcium phosphate, ethylenediaminetetraacetic
(EDTA), disodium salt, active carbon, filtration (gases and cotton) cation exchange resin and modified
membrane are reported as pre-treatments to agroindustrial coproducts constituents of culture mediums such
as cane molasses, beet molasses, soy textured residue, corn steep liquor and rice straw at different process
conditions, achieving an increase in production compared to medium without pre-treatment.
221
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Thus the correct adaptation of these methods for the culture medium has great significance and may ensure
increased economic viability of the bioproducts obtained at the end of the culturing. In this context, the aim
of this study was to use a diatomaceous earth as a pre-treatment in the molasses and corn steep liquor so as to
promote better clarification and possible removal of metals to enhance efficiency in diverse productions of
different bioproducts.
MATERIALS AND METHODS
The corn steep liquor and sugar cane molasses were used at a concentration of 100 g.L -1. The experiments
were performed in flasks with agitation of 150 rpm (Valduga et al. 2007). After the pre-treatment the
substrates were centrifuged (1957 xg for 10min) and filtered through a funnel over a Kitasato flask
containing a filtration column, consisting of filter paper, 3.5 g of diatomaceous earth and a layer of cotton
coupled a vacuum pump. They were studied separately through two 2³ rotational central composite designs
(8 assays + 6 assays in the axial section + 3 center points) with the independent variables: concentration of
diatomaceous earth, contact time of diatomaceous earth with the agroindustrial substrate and temperature of
pre-treatment (Treichel 2004) shown in Table 1.
Analytical methodology
Determination of pH
The pH determination was performed by scanning the sample in a potentiometer according to AOAC (2000).
Optical Density
The determination of the optical density was performed by scanning the sample in a spectrophotometer
(Biospectro SP-220, China), with an absorbance reading at 620 nm (Roukas 1998).
Determination of the concentration of total sugars
The concentration of TRS was determined by the DNS method (Miller 1959).
Statistical Analysis
To evaluate the performance of diatomaceous earth in agroindustrial substrates, the assays will be conducted
in triplicate at center point and all statistical analysis using the Statistica software 7.0.
RESULTS AND DISCUSSION
Pre-treatment with diatomaceous earth for corn steep liquor
A 23 rotational central composite design, for each subproduct (coproduct) in a study was conducted to
evaluate the effect of independent variables in the clarification of the culture medium, through the optical
density responses, pH and total reducing sugar after pre-treatment, as shown in Table 1.
222
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Tabela 1: Second rotational central composite design ³ (actual values and coded) for the pre-treatment with
diatomaceous earth to corn steep liquor and molasses.
Matrix
AMM
Molasses
Y
Y2
Y3
Assay
X1
X2
X3
Y1
Y2
Y3
1
6 (-1)
64 (-1)
1,5 (-1)
4,12 0,148 4,04
70,03
0,679
4,2
1
8 (+1)
64 (-1)
1,5 (-1)
1,77 0,076 4,14
28,63
0,610
4,27
2
6 (-1)
76 (+1)
1,5 (-1)
2,39 0,121 4,05
26,37
0,471
4,00
3
8 (+1)
76 (+1)
1,5 (-1)
2,28 0,202 4,02
21,62
0,118
5,14
4
6 (-1)
64 (-1)
2 (+1)
1,61 0,094 4,12
32,74
0,638
4,14
5
8 (+1)
64 (-1)
2 (+1)
1,63 0,253 4,10
26,57
0,314
4,34
6
6 (-1)
76 (+1)
2 (+1)
1,27 0,281 4,11
24,84
0,426
4,26
7
8 (+1)
76 (+1)
2 (+1)
1,00 0,318 4,11
68,77
0,164
5,44
8
5,32 (-1,68)
70 (0)
1,75 (0)
1,65 0,101 4,12
38,94
0,149
5,33
9
8,68 (+1,68)
70 (0)
1,75 (0)
1,73 0,130 4,09
23,46
0,362
4,27
10
7 (0)
60 (-1,68)
1,75 (0)
1,65 0,094 4,13
71,63
0,187
5,33
11
7 (0)
80 (+1,68)
1,75 (0)
1,07 0,158 4,12
49,07
0,497
4,02
12
7 (0)
70 (0)
1,33 (-1,68)
1,42 0,137 4,15
73,19
0,433
4,36
13
7 (0)
70 (0)
2,17 (+1,68)
1,24 0,094 4,12
70,04
0,456
4,52
14
7 (0)
70 (0)
1,75 (0)
1,59 0,079 4,07
73,81
0,256
3,97
15
7 (0)
70 (0)
1,75 (0)
1,59 0,069 4,09
71,24
0,279
3,88
16
7 (0)
70 (0)
1,75 (0)
1,51 0,068 4,08
63,43
0,311
4,31
17
X1: Percent of diatomaceous earth; X2: Temperature (°C); X3: Contact time (h) Y1: Total reducing sugar (g.L1
); Y2: Optical density (O.D); Y3: pH. Corn steep liquor without pretreatment: Y1: 4,93 g.L-1, Y2: 0,63 e Y3:
3,9. Molasses without pretreatment: Y1: 164,12 g.L-1; Y2: 0,37 e Y3: 5.
In Table 1 it can be seen that in all sixteen trials there were losses of total reducing sugars, varying from 1.24
up to 4.12 g.L-1, compared to corn steep liquor without pretreatment (4.93 g.L-1), noting a loss of up to
16.43% (assay 1) of its total reducing sugars (TRS). The same behavior occurred with the optical density
which showed variations of 49.52% (assay 8) to 87.94% (assay 2) for clarification. However, the different
pre-treatment conditions induced a significant reduction in the pH of the coproduct, as shown in Table 2.
The main effect of an independent variable can be understood as the change caused in the response
(dependent variable) when one runs through all levels of variation of the independent variable being assessed
separately from other variables (Rodrigues and Iemma 2009).
For the response total reducing sugars (Table 2) increasing the concentration of diatomaceous earth,
temperature and contact time diatomaceous earth with corn steep liquor caused a decline of the sugars by
presenting a significant negative effect (p<0.10). However, for optical density the increase of the three
independent variables and their interactions, except percentage of land x temperature were statistically
significant (p<0.10) for the ranges studied, but for further clarification of the coproduct to occur these
variables should be in the lower level (-1).
223
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Table 2: Results of effects, standard deviation, toe for total reducing sugar, pH and optical density after pretreatment of corn steep liquor with diatomaceous earth.
Factor
Effect Standard deviation
t (2)
p*
1,887
0,014
135,595 <0,001
Mean
0,033
-20,744
0,002
(1) X1 (L)* -0,678
Total
0,033
-16,764
0,003
(2) X2 (L)* -0,548
reducing
-1,262
0,033
-38,656
<0,001
(3)
X
(L)*
3
sugar (g.L-1)
0,488
0,033
14,927
0,004
X1xX2*
0,553
0,033
16,917
0,003
X1xX3*
0,062
0,033
1,914
0,196
X2xX3
Factor
Effect Standard deviation
t (2)
p*
0,155
0,002
82,576 <0,001
Mean *
0,004
11,615
0,007
(1) X1 (L)* 0,051
0,004
19,961
0,003
(2) X2 (L)* 0,088
Optical
0,004
22,596
0,002
(3) X3 (L)* 0,100
density (O.D)
0,008
0,004
1,817
0,211
X1xX2
0,047
0,004
10,585
0,009
X1xX3*
0,038
0,004
8,735
0,013
X2xX3*
Factor
Effect Standard deviation
t (2)
p**
4,085
0,003
1354,690 <0,001
Mean *
0,007
1,768
0,219
(1) X1 (L) 0,012
0,007
-3,889
0,060
(2) X2 (L)* -0,027
0,007
6,718
0,0215
pH
(3) X3 (L)* 0,047
-0,027
0,007
-3,889
0,060
X1x X2*
-0,023
0,007
-3,182
0,086
X1x X3*
0,027
0,007
3,889
0,060
X2x X3*
** (p < 0,10); * (p < 0,05). X1: Percentage of land; X2: Temperature (°C); X3: Contact time (h).
Pre-treatment with diatomaceous earth for molasses
A 23 rotational central composite design with two central points was performed in order to evaluate the effect
of the variables; diatomaceous earth concentration, contact time with the coproduct and temperature of pretreatment for the sugar cane molasses so as to define the conditions leading to the clarification of the medium
without the bioproduction of carotenoids. The matrix of experimental designs with real and coded values, as
well as in responses in optical density reading and pH for molasses, are presented in Table 1.
In Table 1 one can see that the pre-treatment had an effect decreasing total reducing sugars with losses of
56.85% (assay 15), 86.83% (assay 4) compared to the one without pretreatment. For optical density it is seen
that there is a variation from 0.118 (assay 4) to 0.679 (assay 1); however, for some assay the earth was
inefficient, increasing turbidity in some assay. For some other experiments however, it promoted
clarification when compared to the one with no pre-treatment (0.37). The initial pH showed a range from
3.88 (assay 17) to 5.14 (assay 9 and 10) for the range studied. Table 3 presents the effects, standard
deviation and confidence limits for the variables that were statistically significant.
224
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Table 3: Results of effects, standard deviation, toe for total reducing sugar, pH and optical density after
pretreatment of molasses.
Factor
effect Standard Deviation
t (6)
p*
74,102
8,830
8,397 <0,001
Mean *
-5,042
6,782
-0,743
0,485
(1) X1 (L)
-36,692
8,242
-4,452
0,004
X1 (Q)*
-7,955
6,783
-1,172
0,285
Total
(2) X2 (L)
-16,0,36
8,242
-1,946
0,100
reducing
X2 (Q)
-1
0,143
6,783
0,021
0,984
sugar (g.L ) (3) X3 (L)
-8,054
8,242
-0,977
0,366
X3 (Q)
21,69
8,858
2,448
0,050
X1xX2*
20,978
8,858
2,368
0,056
X1xX3*
21,243
8,858
2,398
0,053
X2xX3*
Factor
Effect Standard Deviation
t (1)
p**
0,260
0,012
22,369 0,028
Mean *
-0,095
0,009
-10,665 0,595
(1) X1 (L)
0,027
0,011
2,470
0,245
X1 (Q)
-0,079
0,009
-8,878
0,071
(2) X2 (L)
Optical
0,088
0,011
8,145
0,078
X2 (Q)
density (O.D)
0,009
-4,897
0,128
(3) X3 (L)* -0,044
0,161
0,011
14,826 0,043
X3 (Q)
-0,056
0,012
-4,782
0,131
X1xX2
-0,041
0,012
3,505
0,177
X1xX3
0,084
0,012
7,245
0,087
X2xX3
Factor
Effect Standard Deviation
t (1)
p**
3,946
0,045
87,963 0,007
Média*
0,119
0,034
3,442
0,180
(1) X1 (L)
0,522
0,042
12,464 0,051
X1 (Q)*
-0,046
0,034
-1,322
0,412
(2) X2 (L)
0,433
0,042
10,348 0,061
pH
X2 (Q)*
0,123
0,034
3,568
0,174
(3) X3 (L)
0,267
0,042
6,371
0,099
X3 (Q)*
0,513
0,045
11,389 0,056
X1xX2*
0,043
0,045
0,944
0,518
X1xX3
0,138
0,045
3,056
0,201
X2xX3
** (p<0,10); * (p<0,05); X1: Percentage of land; X2: Temperature (°C); X3: Contact time (h)
Observing Table 3 for the total reducing sugars one realizes that only the variable percentage of earth was
significant (p<0.05), with a negative effect, removing more sugars present in the coproducts, thus this being
at a lower level (-1).
For the optical density of the substrate after pre-treatment it was noted that the variable contact time was
significant (p<0.1), but its effect was negative for clarification when the level was increased, increasing its
turbidity, Table 3.
The initial pH showed a significant difference (p<0.10) in which the variables percentage of earth,
temperature, temperature and interaction of these two variables had a positive effect when increasing its
level, Table 2.
Model checking for responses total reducing sugar and initial pH
Considering the three variables of the process: percentage of earth, temperature and contact time with the
substrate, a first order model was tested excluding the axial points, however the nonlinear second-order
model adjusted better to the experimental data, the total reducing sugar response was analyzed according to
the dependent variables.
225
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
For the verification of the model, regression coefficients were calculated and ANOVA performed. Results
are shown in Table 4. The terms that were not significant were added to the lack of fit to calculate the
analysis of variance.
Table 4: Analysis of variance for the central composite rotational design 23 for the total reducing sugar
Source of
Sum of
Degrees of
variation
squares
freedom
3728,12
2
Regression
3625,88
13
Rresidue
7254,0
15
Total
Total reducing sugar (R: 0,71, P2; 13 0,95= 3,81).
Mean
square
1864,06
278,91
pvalue
6,68
The correlation coefficients (R): 0.71 was calculated by ANOVA (Table 4) for the total reducing sugar;
therefore, it can be concluded that the model fitted well to the experimental data. The p-value/p-table ratio
was 1.7 for total reducing sugar, making the model predictive and meaningful for the response studied in this
range.
Thus it was possible to generate the model equation with the coded variables representing the responses of
the RCCD as a function of variables percentage of earth, temperature and contact time, as shown in Equation
1.
ART (g.L-1): 60 -14,78.X2² + 10,84.X1.X2 (1)
(1)
where: X1: percent diatomaceous earth; X2: Temperature; X3: Contact time with the substrate.
2,17
2,17
80
A1)
2
76
1,75
70
7
8
Percentage of land
8,68
1,5
1,33
5,32
6
7
8
percentage of land
8,68
60
50
40
30
20
10
0
A3)
2
1,75
Time (h)
6
60
50
40
30
20
10
0
Time (h)
Temperature (°C)
64
60
5,32
A2)
1,5
1,33
60
64
70
76
Temperature (°C)
80
90
80
70
60
50
40
Figure 1: Contour curves for total reducing sugar response (A1, B2, and A3) for pre-treated molasses.
Using the model it was possible to construct contour curves (Figure 1), obtaining concentrations of the
variables: the percentage of earth, temperature and time of contact with the substrate.
With the contour curves shown in Figure 1 it is verified that to keep a high sugar rate on the substrate one
can work with a low temperature 60 to 64°C and percentage of earth of 6 to 7% or high temperatures 7680°C with earth percentage of 7-8% (Figure 1 A1). Percentage of earth should be 6-7% with a contact time
from 1.33 to 1.5 h, or one can work at high earth percentage from 7 to 8% and contact time from 2 to 2.17h
(Figure 1 A2).
In the use of a temperature of 60°C one should work with time of 1.33 h, or high temperature of 80°C with a
time of 2.17 hours (Figure 1 A3). Therefore the best condition for the sugars present in the substrate must
work with 6-7% diatomaceous earth at 60°C and contact time from 1.33 to 1.5 h under stirring at 150 rpm in
a reactor (300 mL) cased to remove heavy metals and possibly increase various types of bioproduction when
working with this type of coproducts. According to Machado (2013) who used Sporidiobolus
pararoseus for production of carotenoids in medium formulated corn steep liquor (6.5 g.L-1) and
sugar cane molasses (40 g.L-1) pre-treated with these coproducts land diatomaceous obtained a gain
of approximately 9% increase in production in carotenoids (570.95 µ.L-1), besides an increase in
biomass of 20% (9.43 g.L-1) when compared to the culture medium without prior treatment.
226
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
CONCLUSION
The most adequate pretreatment with diatomaceous earth for corn steep liquor was 6% diatomaceous earth at
60°C for 80 min. and for the cane molasses was 7 to 8% diatomaceous earth at 60°C for 80 to 90 min. Thus
in these conditions there was a satisfactory clarification of 87.94% and 68.11% for CSL and molasses,
respectively, compared to coproducts with no pretreatment. From these results a new 2 3 rotational central
composite design will be carried out with the range of diatomaceous earth studied being from 3.33 to 6.67%,
temperature 25 to 39°C and 0.5 to 1.5 hours of contact time to promote better clarification and remove less
sugar present in the coproducts and decrease the contact time to achieve a satisfactory pre-treatment for
bioproduction.
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production of proteases by a Bacillus sp. Termofílico. Science and Food Technology, 27:417-421, 2007.
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Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas.
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maceration for the bioproduction of carotenoids. Química Nova, 30:1860-1866.
ACKNOWLEDGMENT
CNPq and CAPES for financial support.
227
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Production of carotenoids by yeast Sporidiobolus pararoseus using coproducts
Machado W.R.C., Ramos J.J.M., Sá C.S., Rodrigues A.B., Burkert J.F.M.
FURG - Universidade Federal do Rio Grande. Brasil.
whallansfm@hotmail.com
Abstract - An important characteristic of the production of a bioproduct is the formulation of a promising
industrial culture medium which can utilize low cost raw material. For bioproduction of carotenoids which
exert an important biological function, carbon sources of the molasses from sugarcane (1.8 to 58.2 g.L-1) and
nitrogen from corn steep liquor (2.27 to 10.73 g.L-1) were combined through central composite rotational
design 22, seeking to increase the production of carotenoids by Sporidiobolus pararoseus yeast, at 25°C, 180
rpm and initial pH 6. With culture medium containing 30 to 50 g.L-1 of molasses and 5.3 to 8.9 g.L-1 corn
steep liquor in 120 h, obtaining a carotenoids volumetric production of 500 µg.L -¹, a specific carotenoids
production of 60.23 μg.g-1, a cell concentration of 8.12 g.L-1, a carotenoid productivity of 4.08 g.L-1.h-1 (0.5
μg.g-1.h-1) and biomass productivity in 0.07 g.L-1.h-1. Thus, it was demonstrated the potential of
Sporidiobolus pararoseus as a source of microbial carotenoids using agroindustrial coproducts.
Keywords: carotenoids, coproducts, Sporidiobolus pararoseus.
Resumo - Uma característica importante da produção de um bioproduto é a formulação de um meio de
cultivo industrial promissor que possa utilizar matéria prima de custo inferior. Para a bioprodução de
carotenoides que exercerem função biológica importante, foram combinadas às fontes de carbono do melaço
de cana de açúcar (1,8 a 58,2 g.L-1) e nitrogênio da água de maceração de milho (2,27 a 10,73 g.L-1) através
de um delineamento composto central rotacional 22, buscando o incremento na produção de carotenoides
pela levedura Sporidiobolus pararoseus, a 25°C, 180 rpm e pH inicial 6. Com o meio de cultivo contendo de
30 a 50 g.L-1 de melaço e 5,3 a 8,9 g.L-1 de água de maceração de milho em 120 h, obtendo uma produção de
carotenoides volumétricos 500 µg.L-¹, uma produção específica de carotenoides de 60,23 µg.g-1, uma
concentração celular de 8,12 g.L-1, uma produtividade em carotenoides de 4,08 g.L-1.h-1 (0,5 µg.g-1.h-1) e
produtividade em biomassa 0,07 g.L-1.h-1. Dessa forma demostrando o potencial da Sporidiobolus
pararoseus como fonte de carotenoides microbianos utilizando coprodutos agroindustriais.
Palavras-chaves: carotenoides, coprodutos, Sporidiobolus pararoseus.
INTRODUCTION
Carotenoids are natural pigments used in cosmetics, food and animal rations. Their physiological properties
are numerous therefore, it has recently gained wide consumer adoption. The extraction of microbial
carotenoids is not dependent on factors such as climatic seasonality, availability of raw materials, when
compared to extraction methods in which these plants exhibit less variability in their chemical composition.
Yeasts, in turn, stand out among the producer micro-organisms due to its high growth rate, low utilization of
space for production and culturing ability in alternative mediums such as agroindustrial coproducts (Silva
2004, Valduga et al. 2009).
The dyes obtained microbially have been an alternative and are attracting increasing interest, together with
the use of coproducts as the culture medium to minimize production costs and also allowing a reduction in
the volumes of agroindustrial waste. The aim of this work was to produce, through submerged cultures, a
biomass rich in carotenoids by leveraging Sporidiobolus pararoseus sugar cane molasses and corn steep
liquor, respectively from the production of sugar and corn wet milling.
MATERIALS AND METHODS
Micro-organism
Sporidiobolus pararoseus yeast previously isolated and identified by Otero (2011) was used. The strain was
maintained on agar GYMP (2 g.L-1 glucose, 1 g.L-1 malt extract, 0.5 g.L-1 yeast extract, 0.2 g.L-1 NaH2PO4
and 1.8 g.L-1 agar) stored under refrigeration and reactive in YM agar (3 g.L-1 yeast extract, and 3 g.L-1 malt
extract, 5 g.L-1 peptone, 10 g.L-1 glucose, 0.2 g.L-1 agar) (Coelho , 2005) 72h at 25°C.
228
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Preparation of inoculum
From the tubes containing the micro-organisms in inclined YM agar, the cell suspension was performed in 1
ml of sterile peptone water (0.1%) and added to 9 ml of YM broth and incubated at 25°C for 48h. The
inoculum was carried out in Erlenmeyer flasks of 250 ml containing 90 ml of YM medium previously
sterilized at 121 °C for 15 min added with the cell suspension and incubated at 25°C, 150 rpm for 48h or the
time required to reach 1x108 cells.mL-1, counted using a Neubauer chamber (Silva, 2010).
Culture
Assays were performed in 500 mL Erlenmeyer flasks with 225 mL of medium, initial pH of 6.0 added with
10% of inoculum, initiating culturing with 1x107 células.mL-1, and the process operating conditions being
25°C, 180 rpm for 168h (Silva, 2009). In the first 48 hours of culture, the samples were taken at intervals of
12 hours, and then later at regular intervals of 24 hours until the end of the process (168h) to monitor
biomass, pH, total sugars and carotenoids.
Optimization of agroindustrial mediums
The effect of agroindustrial medium composition without pretreatment was studied from the 2² rotational
central composite design (RCCD), shown in Table 1, with the total carotenoid responses (µg.L -1) and
specific carotenoids (μg.g-1), yields, biomass and C/N ratio. For each assay the carbon (C) and nitrogen (N),
ratio was determined identifying the best C/N ratio for best production.
Determination of pH
The pH determination was performed by scanning the sample in a potentiometer according to AOAC (2000).
Determination of biomass concentration
Cell concentration along the bioproduction of carotenoids was estimated by reading the absorbance at 620
nm using a standard biomass curve (Kusdiyantini et al. 1 998).
Determining the concentration of total carotenoids
To determine the total carotenoids, biomass was first dried for 48h at 35°C, macerated and screened with
mesh 115 (Cipollatti 2012). Later on, 0.05 g of this dry biomass was removed, reserved in a test tube and
frozen for 48 hours. After the freezing period, the tube was coated with protection from light and thereby
initiate the process of chemical disruption with 2 mL of dimethyl sulfoxide - DMSO ((CH3)2SO) - ,
homogenized in vortex, and each 15 min time interval, it was again homogenized in vortex for 1 min until a
complete contact period of 1h (Fonseca et al. 2011). In the same tube, 6 ml of acetone was added to facilitate
the extraction. The sample was then centrifuged for 10 min at 1957 xg, part of the solvent was reserved, and
the chemical disruption process repeated until total bleaching of the cell.
At the end of the chemical disruption, 10 ml of 20% NaCl solution (p.v-1) and 10 ml of petroleum ether were
added to the previously reserved solvent phase. After the formation of the two phases the polar phase was
collected and the excess water was removed with sodium sulfate (Na2SO4), yielding carotenogenic extracts
(Michelon et al. 2012). The determination of the total carotenoids in the extracts was performed on a
spectrophotometer (Biospectro SP-220, China) through the average value of the maximum absorbance at 448
nm (Cabral et al. 2011), using equation 1 (Davies, 1976), and expressed in terms of its major carotenoid (βcarotene in petroleum ether with a specific absorptivity %
 = 2592) according to Davies (1976).
 =
∗∗106
1%
1  ∗100∗
(1)
where: CT = specific concentration of total carotenoids (µg.g-1); A = absorbance; V = volume (mL);
 = dry cell mass (g); 1%
1 = specific absorptivity.
To calculate the volumetric production of total carotenoids (µg.L-1) a unit conversion using the result of the
total carotenoids (μg.g-1) and biomass concentration (g.L-1) was performed.
Determination of the concentration of total sugars
The concentration of non-reducing sugars was determined by the DNS method (Miller 1959).
Statistical Analysis
229
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
For performance assessment of agroindustrial substrates, the analyses were conducted in triplicate at the
midpoint, and the results were statistically analyzed using the software Statistica 7.0 (Statsoft).
RESULTS AND DISCUSSION
The responses evaluated were the maximum values achieved in the volumetric production of carotenoids
(µg.L-1) in each assay, and at the same time their respective values achieved in specific production of
carotenoids (μg.g-1), the biomass (g.L-1), the productivity (g.L-1.h-1) and C/N ratio of each medium.
Table 1 presents a planning matrix with the actual and coded values of the variables under study, as well as
their responses. Figure 1 shows the accompaniment of this bioproduction of carotenoids, involving the
production of volumetric carotenoid (A), specific carotenoid (B), cell production (C), pH (D) and total
reducing sugar (E) for factorial design assays.
In Table 1, a variation in responses due to different compositions of the production mediums can be seen,
the maximum volumetric production of carotenoids ranged from 89.52 µg.L-1 (assay 5) to 555.52 µg.L-1
(assay 6), the biomass concentration from 1.03 g.L-1 (assay 5) to 8.12 g.L-1 (assay 10) and the C/N ratio of
the production mediums from 7.70 (assay 5) 38.41 (assay 2). The volumetric productivity of carotenoids
ranged from 0.75 g.L-1.h-1 (assay 2) to 4.08 g.L-1.h-1 (assay 10) and the biomass productivity from 0.01 g.L1 -1
.h (assay 5) to 0.07 g.L-1.h-1 (assay 10).
Note in Table 1 that the condition of the assay 6, formulated with 58.2 g.L-1 of molasses and 6.50 g.L-1 corn
steep liquor, with a C/N ratio of 34.79 resulted in the greatest volumetric bioproduction (555.52 g.L-1) in
168h of culture, from 7.70 g.L-1 biomass, presenting carotenoids productivity of 3.31 g.L-1.h-1 and biomass
productivity of 0.05 g.L-1.h-1.
The pH profile of the cultures (Figure 1 D) of all assays for S. pararoseus fell in the early hours of culture,
with the exception of experiment 3 and 5. This behavior is due to the release of metabolic compounds within
the cell that are excreted and subsequently incorporated by the yeast promoting a progressive increase of pH
in the culture medium. (Bonfim 1999, Zeni 2011) A Factor already observed previously by Otero (2011) and
Cipolatti (2012) for this same micro-organism in other mediums formulated with these agroindustrial
coproducts.
Valduga et al. (2008) optimized a medium containing molasses (10 to 40 g.L-1) and corn steep liquor (0 to 10
g.L-1), to produce carotenoids by Sporidiobolus salmonicolor yeast, where they found that the maximum
production was with 40 g.L-1 of molasses and 10 g.L-1 of CSL, reaching a production of 479.12 µg.L-1 (71.19
μg.g-1) at 25°C, 180 rpm for 120 hours of cultire and initial pH of 4. Cipolatti (2012) used cane molasses (6
g.L-1) and corn steep liquor (36.5 g.L-1) with a C/N ratio of 6.2, for production of carotenoids by the yeast S.
pararoseus, where the carotenoid production achieved was 830 µg.L-1 (68.1 µg.L-1) at 25 °C, 180 rpm for
168 h with an initial pH of 6.
Referring to Figure 1, one can see that the yeast consumed nearly all of the sugars available in the culture
medium at the end of the process having less than 1.5 g.L-1 glucose after 168h of culture.
Studies using crude molasses and CSL compared to synthetic mediums for bioproduction of carotenoids
allow replacement of all components because these coproducts such as sugar cane molasses have 36.5%
carbon, 1.05% nitrogen, and CSL having 17.83% carbon and 3.80% nitrogen (Mendes 2006, Valduga 2009,
Otero 2011, Cipolatti 2012).
230
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Table 1: DCCR 2² (actual values and coded) means for agro with molasses and AMMM.
Assay
X1
X2
Y1
Y2
Y3
Y4
10 (-1)
3,5 (-1)
209,40 (168h) 4,41 23,34 1,25
1
50 (+1)
3,5 (-1)
340,22 (168h) 5,87 38,41 2,03
2
10 (-1)
9,5 (+1)
125,92 (168h) 4,80 14,21 0,75
3
50 (+1)
9,5 (+1)
382,66 (168h) 6,81 29,73 2,28
4
1,8 (-1,41)
6,5 (0)
89,52 (168h) 1,03 7,70 0,53
5
58,2 (+1,41)
6,5 (0)
555,52 (168h) 7,70 34,79 3,31
6
30 (0)
2,27 (-1,41) 403,29 (168h) 4,68 37,87 2,4
7
30 (0)
10,73 (+1,41) 366,16 (168h) 6,20 23,11 2,18
8
30 (0)
6,5 (0)
476,51 (120h) 7,93 28,38 3,97
9
30 (0)
6,5 (0)
489,26 (120h) 8,12 28,38 4,08
10
Y5
0,03
0,03
0,3
0,04
0,01
0,05
0,03
0,04
0,07
0,07
X1 = Molasses (g.L-1); X2 = Corn steep liquor (g.L-1); Y1 = Volumetric production (µg.L-1); Y2 = Biomass (g.L-1); Y3 = C/N
(carbon and nitrogen ratio in the culture medium); Y4 = Volumetric productivity in carotenoids. (g.L-1.h-1) e
Y5 = Biomass Productivity (g.L-1.h-1).
100
400
200
100
Carotenoides Volumétrico
) (µg.L
9
0
36 48 60 72
96
120
140
160
Tempo
(h)
Time (h)
7
-1
Biomass (g.L-1)
70
60
50
40
30
20
10
36 48 60 72
96
120
140
160
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tempo(h)
(h)
Time
8,5
C)
8
D)
8,0
7,5
6
7,0
5
4
3
Biomassa (g.L
2
1
0
B)
)
90
80
Carotenoides Específicos (µg.g pH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
300
Specific carotenoid (µg.g-1)
500
) -1
A)
) -1
Carotenoids volumetric (µg.L1)
600
0 12 24 36 48 60 72
96
140
160
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
0 12 24 36 48 60 72
96
120 140 160
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tempo (h)
Time (h)
4,0
E)
3,5
) -1
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
Açúcar redutor total (g.L
Total reducing sugar (g.L-1)
Tempo
(h)
Time (h)
120
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,5
0,0
0 12 24 36 48 60 72
96
120 140 160
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tempo(h)
(h)
Time
Figure 1: Kinetics of volumetric production of carotenoids (A), production specifies carotenoids (B)
biomass (C), pH (D) and total reducing sugar (E) by S. pararoseus over 168h at 25°C and 180 rpm on
rotational central composite design with 2² culture medium containing molasses and corn steep liquor.
231
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
For the construction of empirical models regression coefficients were calculated and ANOVA performed
(Table 3). With the ratio p-value/p-table exceeding 3 (Rodrigues and Iemma 2011) it was possible to obtain
predictive and significant models for all the responses in terms of the variables molasses and corn steep
liquor (equations 02-06), allowing the construction of contour surfaces shown in Figure 2.
Vol. prod. of car. (µg.L-1): 483,41+130,97.MEL -103,13.MEL² - 71,84.AMM² +31,48.MEL.CSL (2)
Biomass (g.L-1): 8,02 + 1,61.MEL – 1,69.MEL² + 0,44.CSL – 1,15.CSL²
(3)
C/N: 29,75 + 8,62.MEL² – 3,96.MEL² – 4,84.CSL
(4)
Prod. Vol. In car. (µg.L-1.h-1): 4,03+0,78*MEL – 1,19.MEL² - 1,00.CSL²
(5)
Prod. Bio. (g.L-1.h-1): 0,07 + 0,01.MEL – 0,02.MEL² - 0,02.CSL²
(6)
Where: MEL: Sugar cane molasses, CSL: Corn steep liquor.
Table 3: Analysis of variance for the central composite rotational design 22
Degrees of
Sum of squares
Mean square
p-value
freedom
Source of
PVC
Biomass
PVC Biomass
PVC
Biomass
PVC Biomass
variation
Regression
193342
36,29
4
4
48335,5
9,07
9,29
8,48
Residual
5,34
5
1,07
2609,2
5
5201,84
Total
219351,2
41,63
9
9
Degrees of
Sum of squares
Mean square
p-value
freedom
Source of
Pro.
Pro.
Pro.
C/N
C/N Pro. Vol.
C/N
C/N
variation
Vol.
Vol.
Vol.
Regression
867,04
12,66
4
3
216,76
216,76
80,28
23,44
Residual
16,19
6
6
2,7
1,05
2,7
Total
883,23
9
9
13,71
Degrees of
Sum of squares
Mean square
p-value
freedom
Source of
Pro. Bio.
Pro. Bio.
Pro. Bio.
Pro. Bio.
variation
Regression
2,83.10-3
4
7,07.10-4
11,74
-4
Residual
6
3,72.10
6,02.10-5
Total
9
3,20.10-3
PVC = Volumetric production in carotenoids; C/N = The carbon and nitrogen, Prod. Vol. = Volumetric
productivity in carotenoids and Prod. Bio. = Biomass productivity. PVC (R: 0,94, F3; 6; 0,95 = 3,52); Biomass
(R: 0,93, P4; 5; 0,90 = 3,52), C/N (R: 0,99 P4; 6; 0,90 = 3,18); Pro. Vol. (R: 0,96, P3; 6; 0,95 = 4,92) e Prod. Bio. (R:
0,94, P4; 6; 0,95 = 4,53).
Figures 2 A and 2 B show the contour curve, where it is well-known that one can obtain high production of
volumetric carotenoids and biomass using a concentration range 30-50 g.L-1 of molasses together with 5.3 to
8.9 g.L-1 Corn steep liquor. As for the increase of the carbon and nitrogen of the culture medium one must
work with high concentrations of molasses (50 to 58.2 g.L-1) and low concentration of corn steep liquor (2.27
to 3.5 g.L-1 ), as seen in Figure 2 C.
To have a high production of volumetric carotenoid one must work with 30-42 g.L-1 of molasses and 5.3 to
7.7 g.L-1 of corn steep liquor (Figure 2 D). To achieve high productivity in biomass the concentration of
molasses must be 30-42 g.L-1 and corn steep liquor 5.9 to 7.7 g.L-1 (Figure 2 E).
Therefore, to obtain the maximum possible for all responses, 30-50 g.L-1 of molasses and 5.3 to 8.9 g.L-1 of
corn steep liquor are required.
232
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
10,73
10,73
9,5
A)
10,73
B)
9,5
6,5
30
50
58,2
6,5
3,5
2,27
1,8
10
30
-1
Melaço (g.L ) -1
Molasses
(g.L )
50 58,2
Melaço
(g.L-1
) -1)
Molasses
(g.L
10,73
AMM (g.L
10
AMM (g.L
AMM (g.L
500
400
300
200
100
0
3,5
2,27
1,8
) -1
) -1
) -1
6,5
C)
9,5
8
6
4
2
0
3,5
2,27
1,8 10
30
50 58,2
40
35
30
25
20
15
10
5
-1 -1
Melaço
(g.L(g.L
) )
Molasses
10,73
D)
9,5
E)
9,5
) -1
) -1
6,5
6,5
2,27
1,8
10
30
50 58,2
-1
Melaço
(g.L(g.L
) -1)
Molasses
AMM (g.L
AMM (g.L
3,5
4
3
2
1
0
3,5
2,27
1,8 10
30
50 58,2
0,07
0,05
0,03
0,01
Melaço
(g.L-1(g.L
) -1)
Molasses
Figure 2: contour Curve for responses volumetric production in carotenoids (A) biomass (B), the C/N (C)
volumetric productivity of carotenoid (D) and biomass productivity (E) by the yeast S. pararoseus, 25°C,
180 rpm for 168 h with an initial pH of 6. AMM = corn steep liquor
CONCLUSION
The use of 30-50 g.L-1 of molasses in combination with 5.3 to 8.9 g.L-1 of corn steep liquor obtained a
carotenoids yield of 82.1% (500 µg.L-1) when compared with the lowest experimental result, besides the
cellular concentration of 8.12 g.L-1, a carotenoid productivity of 4.08 g.L-1.h-1 (0.5 μg.g-1.h-1) and biomass
productivity in 0.07 g.L-1.h-1 demonstrates the potential of Sporidiobolus pararoseus as a source of microbial
carotenoids using agroindustrial byproducts.
BIBLIOGRAPHY
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Silva DA. 2009. Maximizing production of astaxanthin by Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces
dendrohous) using water of rice parboiling. Rio Grande, RS, 92 pag. Thesis (MA in Engineering and Food
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Rodrigues MI., Iemma AF. 2011. Design of Experiments and Optimization processes: a strategy of
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Valduga E., Valéria A., Treichel H., Luccio M., Júnior AF. 2008. Study of the bio-production of carotenoids
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Biotechnol, 83:1267-12774.
ACKNOWLEDGMENT
CNPq and CAPES for financial support.
234
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Efecto del procesamiento sobre la estabilidad de un producto vegetal (Cucurbita moschata, Duchesn ex
Poiret) enriquecido con probióticos
Miletti A. E.1, de Escalada Pla M. F. 2, 3, Flores S. K. 2, 3
1. Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ingeniería.
2. Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
3. Miembro del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)
sflores@di.fcen.uba.ar
Resumen: El presente trabajo tuvo como objetivos analizar la aptitud de un alimento vegetal (Cucurbita
moschata Duchesne ex Poiret), procesado con diferentes tratamientos: deshidratado al vacío (S1);
deshidratado osmóticamente (S2) y deshidratado osmóticamente y posterior secado al vacío (S3), como
matriz soporte de Lactobacillus casei y estudiar la viabilidad del probiótico soportado y el efecto de su
presencia sobre el color del producto final. Luego de su almacenamiento en bolsas de polipropileno a 1820ºC por 28 días, los productos obtenidos mostraron una carga de ≈107 UFC/g estable, con excepción del S3
que presentó disminuciones de 1 a 3 ciclos log después de 15 días. En cuanto al color, S1 fue más luminoso
(p<0,001) que S2 y S3 en todo momento. En cuanto al parámetro a*, se observaron disminuciones
significativas para el S2 después de 15 días. A través del parámetro b*, pudo observarse que S1 fue el
producto más amarillo (p<0,001) de todos. Se pudo observar que el efecto de la presencia del probiótico
sobre el color de la matriz se evidenció sólo para S1 a través del parámetro b* mientras que sobre los
parámetros a* y L* de ese sistema, recién se notaron diferencias a los 28 días de almacenamiento.
Palabras clave: alimento funcional, probióticos, viabilidad de Lactobacillus casei, matriz vegetal.
Abstract: this study aimed to analyze the suitability of a vegetable food (Cucurbita moschata Duchesne ex
Poiret), processed with different treatments: vacuum dehydrated (S1); osmotically dehydrated (S2) and
osmotically dehydrated followed by vacuum drying (S3), as a Lactobacillus casei support matrix, and to
study the viability of the supported probiotic and the effect of its presence on the color of the final product.
After storage in polypropylene bags at 18-20° C for 28 days, the obtained products showed a load of ≈ 107
UFC/g stable, except for S3 that presented reductions of 1-3 log cycles after fifteenth days. Regarding the
color, S1 showed highest lightness (p <0.001) than S2 and S3 at any time. Regarding a* parameter,
significant decreases for S2 were observed after 15 days. It could be seen through parameter b *, that S1 was
the greatest yellow product (p <0.001). It could be observed that the probiotic presence effect on the color of
the matrix was evidenced only for S1 through parameter b *, while on parameters a * and L * of that system,
differences were just noted after 28 days of storage.
Keywords: functional food, probiotics, Lactobacillus casei viability, vegetal matrix.
INTRODUCCIÓN
De acuerdo a la Organización Mundial de Salud y a la Organización de Alimentos y Agricultura, varios
patrones dietarios junto con los hábitos en el estilo de vida constituyen los mayores factores de riesgo
modificables para el desarrollo de enfermedades coronarias, cáncer, diabetes de tipo 2, obesidad,
osteoporosis y enfermedades periodontales (WHO 2003). En este sentido, la posibilidad de acceder a una
mejor calidad de vida a través de una alimentación variada y equilibrada, es un concepto en creciente
aceptación y arraigo en las sociedades modernas (Siró et al. 2008). En este aspecto, los alimentos funcionales
aportan un plus por contener ingredientes que han probado ser beneficiosos para la salud: prebióticos,
probióticos, fibra dietaria, aceites de pescado, esteroles de plantas, minerales y compuestos antioxidantes
(Acosta 2011). La industria de los alimentos tiene en consideración muchas variables a la hora de desarrollar
o rediseñar productos funcionales, tales como la aceptación sensorial, estabilidad, precio, conveniencia,
propiedades químicas y funcionales (Granato et al. 2010). Se requiere una gran variabilidad de técnicas a fin
de satisfacer las necesidades y expectativas en el área de alimentos funcionales (Betoret et al. 2011). Los
alimentos son mayoritariamente mezclas complejas de macro – y micro- componentes que pueden atrapar el
principio activo, modular su liberación o inhibir su actividad (Chen et al. 2006; Chen y Subirade, 2007). Es
así como la matriz alimentaria en estado crudo y después del proceso y almacenamiento puede tener una
235
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
influencia significativa en cuanto a la actividad o liberación de componentes claves. La selección y el
desarrollo de un alimento que sea un vehículo apropiado que mantenga el principio activo hasta el momento
del consumo y liberación para lograr el efecto fisiológico en el organismo, es un paso importante para el
desarrollo exitoso de un alimento funcional (Betoret et al. 2011).
Una extensa bibliografía respalda el accionar de los probióticos en cuanto a mantener el equilibrio de la flora
intestinal, potenciar el sistema inmunológico (Oelschlaeger 2010) y más recientemente también se ha
reportado evidencia del beneficio que estos microorganismos podrían ocasionar sobre el sistema nervioso
central (Bravo et al. 2011). Los efectos beneficiosos de las bacterias ácido lácticas en la salud y el bienestar
humano están documentados en estudios experimentales y clínicos, ofreciendo a los consumidores tres
beneficios principales para la salud: la mejora de la salud intestinal, la disminución de colesterol en la sangre
y la mejora de los mecanismos de defensa naturales del cuerpo (Betoret et al. 2001).
En la actualidad, los alimentos probióticos industriales corresponden, fundamentalmente, a la industria
láctea. La intolerancia a la lactosa y el contenido de colesterol de dichos productos lácteos suelen ser
ejemplos de los inconvenientes relacionados con el consumo de estos alimentos. Por otro lado, existen pocos
datos reportados acerca del enriquecimiento de matrices vegetales con microorganismos probióticos. De esta
forma, el interés está puesto en la innovación de tecnologías que permitan obtener alimentos de origen
vegetal portadores de cepas probióticas, como así también, en el estudio de las interacciones entre probiótico
y tejidos vegetales, y su influencia en la viabilidad y funcionalidad (do Espírito Santo et al. 2011).
Se destaca que el desarrollo de alimentos funcionales a partir de tejido de calabaza permitiría aumentar el
valor agregado a la producción de frutihortícolas poco explotados a través de procesos biotecnológicos.
Los objetivos del presente trabajo fueron desarrollar un alimento vegetal (calabaza) procesado como matriz
soporte de probióticos y estudiar la viabilidad del microorganismo probiótico en la formulación de la matriz
vegetal enriquecida, así como los efectos de dicha fortificación sobre el color del producto que los soporta.
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de la calabaza
Como matriz vegetal se utilizó tejido de calabaza (Cucurbita moschata Duchesne ex Poiret), previamente
lavado, cortado con geometría cilíndrica de 30 mm de diámetro y 10 mm de espesor. Para lograr la textura
adecuada, los cilindros fueron escaldados por 8 minutos, y, posteriormente, enfriados en baño de hielo
durante 2 minutos. Se reservó una fracción del lote para realizar los controles respectivos a los diferentes
procesos, a fin de poder evaluar el efecto de la presencia del probiótico sobre el color del tejido.
Enriquecimiento con probióticos
Los cilindros escurridos restantes, se sumergieron por 20 minutos, a 18-20ºC, en un líquido de impregnación
elaborado con solución fisiológica glucosada (0,9% NaCl; 5% glucosa) y conteniendo Lactobacillus casei
(ATCC 393) con una carga microbiana de 108 UFC/ml.
Procesamiento de los sistemas en estudio
Los trozos impregnados con L. casei se escurrieron y se fraccionaron en 3 lotes los cuales se sometieron a
diferentes tratamientos.
Deshidratado al vacío “Sistema 1 (S1) “
Los cilindros se colocaron en bandejas y fueron sometidos a una deshidratación al vacío (presión de 0,011
mbar) por 24 hs (Christ, Alemania).
Deshidratado osmóticamente “Sistema 2 (S2)”
Se realizó la impregnación de los cilindros con sacarosa (26g/100g calabaza), glucosa (37g/100g calabaza),
ácido cítrico (0,17g/100 calabaza) y sorbato de potasio (0,11g/100g calabaza), a 18-20ºC. Luego de 24 hs se
escurrieron los cilindros.
Deshidratado osmóticamente y posterior secado al vacío “Sistema 3 (S3)”
Primero, los cilindros se impregnaron, de la misma manera que el sistema S2, y luego, fueron sometidos a un
proceso de secado al vacío, en las mismas condiciones que el sistema S1.
Sistemas control (SC)
En paralelo se prepararon lotes equivalentes de producto, en ausencia de L. casei como sistemas control de
cada procesamiento (SC1; SC2 y SC3).
236
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Empaquetamiento y almacenamiento
Todos los sistemas fueron empaquetados en bandejas plásticas cubiertas con bolsas de polipropileno
impermeables al vapor de agua y al oxígeno, siendo almacenados a 18-20ºC durante 28 días.
Análisis microbiológico
Estabilidad del Lactobacillus casei
Para evaluar la estabilidad del L.casei, se determinó la cantidad de células viables a lo largo del
almacenamiento. El recuento se realizó en profundidad a partir de diluciones apropiadas de un homogenato
de las muestras, utilizando agar MRS e incubando a 37ºC por 48 hs.
Caracterización físico-química
Actividad de agua (aw): se midió la actividad de cada sistema con un higrómetro de punto de rocío Aqualab
(Italia), previamente calibrado.
Color: para evaluar los cambios en el color se midieron los parámetros CIE L* (Luminosidad: 0 (negro) a
100 (blanco)), a* (rojo/verde: +a (rojo) a -a (verde)) y b* (amarillo/azul: +b (amarillo) a –b (azul)) durante el
almacenamiento, para cada sistema, utilizando un colorímetro CM-Modelo 508 d, Minolta, (Japón). Se
seleccionó el iluminante D y un ángulo de observador de 2º.
Análisis estadístico
Todas las determinaciones fueron realizadas al menos por triplicado. Las diferencias entre sistemas se
establecieron mediante análisis de la varianza (ANOVA) y el test a posteriori LDS, con un nivel de
significancia del 95% (Sokal & Rohlf, 1969).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Viabilidad del L. casei
Luego de la impregnación con L. casei, y antes del procesamiento de cada sistema, el tejido de calabaza
registró un recuento aproximado de 1,2.106 UFC/g.
Una vez realizado el proceso de deshidratación, la aw resultante de los sistemas S1, S2 y S3 fue de 0,37; 0,94
y 0,58 respectivamente.
En la Figura 1 se representa la viabilidad del L.casei, soportado en la matriz vegetal, en función del tiempo
de almacenamiento, para los sistemas S1, S2 y S3.
Se observa que, desde el inicio y hasta los 15 días de almacenamiento, los sistemas S2 y S3 presentaron un
recuento de 106 UFC/g de producto, mientras que S1 presentó un recuento de 107 UFC/g de producto. Cabe
destacar que el procesamiento de S1 provocó una concentración inicial de las UFC/g de producto mayor
respecto a los sistemas S2 y S3, debido a la pérdida de agua por el proceso de deshidratación aplicado, y el
consecuente aumento de sólidos por gramo de producto.
Luego de 15 días, S3 sufrió una reducción en la concentración de células viables de L.casei de 1 a 3 ciclos
log, respecto de los sistemas S1 y S2, paulatinamente hasta el final del almacenamiento. El recuento de
células probióticas se mantuvo en 106 – 107 UFC/g para los sistemas S1 y S2 durante todo el ensayo.
237
Log UFC/g
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Figura 1: Viabilidad de L.casei en función del tiempo de almacenamiento. “Sistema 1 (S1)” Deshidratado al
vacío, “Sistema 2 (S2)” Deshidratado osmóticamente, “Sistema 3 (S3)” Deshidratado osmóticamente y
posterior secado al vacío.
En la Tabla 1 se observan los parámetros de color de los sistemas estudiados. Inicialmente, todos los
sistemas presentaron valores aproximadamente iguales de a*. Luego de los 15 días de almacenamiento, S2
presentó una disminución significativa de este parámetro. En general, b* tiende a disminuir con el tiempo de
almacenamiento, siendo este descenso más notorio y significativo para S2, mientras que S1 fue el producto
más amarillo (p<0,001) de todos. Varios factores son los responsables de la pérdida de pigmentos y de color
durante el procesamiento de los alimentos. Los pigmentos que le otorgan a la calabaza su característico color
naranja son, mayoritariamente,  y -carotenos y licopeno (Seo et al. 2005). La caída de los valores de a* y
b* para los sistemas señalados anteriormente correspondería, entonces, a una importante degradación de los
carotenoides presentes en el tejido de calabaza (Dutta et al. 2006). Cuando se compararon los sistemas con
sus respectivos controles se pudo observar que el efecto de la presencia del probiótico sobre el color de la
matriz se evidenció sólo para S1 a través del parámetro b* mientras que sobre los parámetros a* y L* de ese
sistema, recién se notaron diferencias a los 28 días de almacenamiento. Otros factores, tales como la pérdida
de agua, condiciones de almacenamiento en cuanto a temperatura y material de empaquetamiento, entre
otros, pueden además participar en la pérdida de pigmentos y de color evidenciados durante el ensayo.
Allegre et al. 2011 estudiaron los cambios en el color en rodajas de manzanas sin inocular e inoculadas con
Lactobacillus rhamnosus GG y almacenadas en refrigeración durante 28 días. Estos autores reportaron un
incremento del parámetro L* y una reducción del parámetro a* durante los primeros 4 días tanto para los
sistemas tratados como para los controles, tomando valores desde 73 a 83 y de -2,5 a -3,8 respectivamente.
Por otro lado, indicaron que el parámetro b* no sufrió cabios significativos durante el almacenamiento y que
tampoco se observaron diferencias significativas entre los tratamientos.
Tabla 1: Parámetros de color de cilindros de calabaza impregnados con L.casei.: “Sistema 1 (S1)”
Deshidratado al vacío, “Sistema 2 (S2)” Deshidratado osmóticamente, “Sistema 3 (S3)” Deshidratado
osmóticamente y posterior secado al vacío y los respectivos controles sin enriquecimiento del probiótico:
“SC1”control para el S1, “SC2”control para el S2, “SC3”control para el S3.
L*
a*
b*
Tiempo (días)
Sistemas 0
15
28
0
15
28
0
15
28
SC1
75 ± 2 77 ± 2 73 ± 2 20 ± 3 15 ± 3 22 ± 2 86 ± 7 73 ± 15 90 ± 4
S1
73 ± 5 79 ± 1 79 ± 1 17 ± 3 13 ± 2 13 ± 2 102 ± 6 89 ± 4 87 ± 5
SC2
44 ± 1 46 ± 1 49 ± 3 22 ± 2 10 ± 2 6 ± 5 73 ± 1 52 ± 8 37 ± 7
S2
44 ± 1 44 ± 1 50 ± 1 22 ± 3 12 ± 3 6 ± 8 73 ± 1 52 ± 2 35 ± 4
SC3
45 ± 3 38 ± 2 40 ± 5 23 ± 2 25 ± 2 24 ± 1 70 ± 2 60 ± 3 63 ± 3
S3
46 ± 4 39 ± 1 36 ± 2 23 ± 3 25 ± 3 25 ± 1 70 ± 4 64 ± 1 60 ± 2
Cada valor es el promedio y la desviación estándar de por lo menos tres determinaciones.
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CONCLUSIONES
El tejido vegetal de calabaza demostró ser una eficiente matriz soporte de L. casei. Los resultados arrojados
por todos los sistemas procesados muestran una carga de probióticos de alrededor de 106-107 UFC/g de
producto durante los primeros 15 días de almacenamiento. Las muestras que recibieron un tratamiento de
deshidratación al vacío presentaron el mayor valor de la carga, el cual se mantuvo aproximadamente
constante hasta el final del ensayo (28 días). Este nivel concuerda con los valores promedio que normalmente
se encuentran en los productos lácteos comerciales (Betoret et al. 2001), lo que pone en evidencia la
posibilidad de optimizar y diversificar la producción de alimentos probióticos utilizando como base matrices
frutihortícolas.
Los cambios observados en la coloración de los cilindros de calabaza pueden adjudicarse solo en parte a la
presencia de probióticos. Los tratamientos efectuados sobre las muestras posteriores a la fortificación con
probióticos fueron los mayores responsables en el cambio de coloración observado, posiblemente debido a
una degradación de los pigmentos. En este aspecto, debe seguir investigándose para conseguir parámetros de
procesos que permitan lograr mejores resultados.
Los datos del presente trabajo contribuyen para la formulación de alimentos funcionales enriquecidos con
probioticos de origen no lácteo. Adicionalmente, esto evidencia una prometedora contribución a la
optimización de matrices frutihortícolas, a través de la obtención de productos elaborados con mayor valor
agregado.
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AGRADECIMIENTOS
Universidad de Buenos Aires (UBA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de la
República Argentina (CONICET), MINCYT (Argentina).
240
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Bioactividad de β-galactosidasa en un ambiente que simula la superpoblación molecular de los
alimentos y del quimo.
Ledesma D., Perillo, M.A., Nolan, V.
IIBYT (CONICET-UNC)- ICTA, FCEFyN,UNC
vnolan@efn.uncor.edu
Resumen: El objetivo del presente trabajo fue investigar el efecto de la superpoblación macromolecular
(SPM) sobre la cinética de hidrólisis de o-nitrofenil galactopiranósido (ONPG) catalizada por β galactosidasa de E.coli (β -Gal). Para esto se aplicaron dos técnicas, espectroscopia UV-Visible (EF) y
Calorimetría de titulación isotérmica (ITC), las cuales están basadas en principios físicos diferentes. La
condición de SPM se simuló con disoluciones de polietilenglicol PM 6000 (PEG6000) a distintas
concentraciones (0 a 35 % P/V). Los resultados arrojados por ambas técnicas (EF e ITC) no mostraron
diferencias significativas, permitiéndonos: a) validar el uso del ITC para estudios cinéticos de reacciones
catalizadas por enzimas en condiciones de SPM y b) aceptar que la SPM no interfirió sobre el
comportamiento espectroscópico del producto de la reacción estudiada. El principal hallazgo fue que la
velocidad de reacción (Vmax) no se vio afectada, mientras que la afinidad de la enzima por su sustrato (K M)
sufrió una disminución significativa (KM aumentó de 0,14 a 1 mM para 0 y 35 % P/V PEG6000,
respectivamente) a medida que aumentó la concentración del agente superpoblante. Esta disminución en la
afinidad a altas concentración de PEG6000 podría deberse a la restricción difusional que impone la alta
densidad molecular presente en estas condiciones. Este resultado es importante para el diseño de sistemas
terapéuticos de sustitución enzimática.
Palabras clave: -Galactosidasa, cinética enzimática, superpoblación molecular, Calorimetría de titulación
isotérmica.
Abstract: The aim of this study was to investigate the effect of macromolecular crowding (MC) on the
kinetics of hydrolysis of o-nitrophenyl galactopyranoside (ONPG) catalyzed by -Gal. Two techniques based
on different physical principles, UV-visible absorption spectroscopy (AS) and Isothermal Titration
Calorimetry (ITC), were applied. MC was simulated with solutions of polyethylene glycol at different
concentrations. The results obtained by both techniques (AS and ITC) were not significantly different from
one another, allowing us to: a) validate the use of ITC for kinetic studies of enzymtically catalized reactions
in MC conditions and b) to accept that MC did not interfer with the spectroscopic behavior of the reaction
product. The main finding was that, upon rising the MC level, V max was not affected while the affinity of the
enzyme for the substrate (KM) suffered a significant decrease . The latter may be due to diffusional
restrictions imposed by the high molecular density in MC conditions. This result is relevant for the design of
enzymatic substitution therapeutic systems.
Keywords: β -Galactosidase, enzymatic kinetic, molecular crowding, Isothermal Titration Calorimetry
INTRODUCCIÓN
La -galactosidasa (-Gal) es una enzima ampliamente distribuida, que cataliza la hidrólisis de un enlace galactosídico terminal presente en carbohidratos, glicolípidos, glicoproteínas y glicosaminoglicanos (Tanaka
et al. 2005). La β -Gal conocida como lactasa-floricina-hidrolasa, LPH o lactasa, cataliza la hidrólisis de
lactosa, el azúcar de la leche, en glucosa y galactosa. Ésta se encuentra localizada en las células epiteliales
del intestino delgado y su ausencia o baja actividad produce la denominada “intolerancia a la lactosa”,
enfermedad que se manifiesta con problemas gastrointestinales, cólicos e hinchazón abdominal. Una forma
de revertir estos efectos es evitando el consumo de productos lácteos (pudiendo incurrir en algún déficit
alimentario) o utilizando productos previamente deslactosados (lo cual puede originar cambios en las
características organolépticas de estos alimentos).
Otra forma de mitigar esta intolerancia sería por medio del consumo de alimentos que contuvieran
incorporada a la enzima en forma encapsulada e inactiva en el alimento, en la b oca y en el estómago
pero que, al liberarse en el intestino, pudiera expresar su actividad. Ésta última opción genera la
necesidad de diseñar sistemas de encapsulamiento y activación para lo cual es necesario conocer el
241
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
comportamiento de la enzima en sistemas que se caracterizan por su superpoblación macromolecular
(SPM) como lo son los alimentos y el quimo, la masa de alimentos digeridos que se transporta por el
tubo digestivo.
Los sistemas con SPM se caracterizan por poseer alta concentración de diferente s tipos de
macromoléculas que en conjunto ocupan una importante fracción del volumen total (Zimmerman and
Minton 1993). En estas condiciones, las moléculas son sometidas a restricciones estéricas y difusionales
que afectan sus propiedades. El efecto de la SPM sobre las velocidades de reacciones bioquímicas es
complejo ya que mientras que las velocidades de difusión disminuyen (Luby-Phelps 2000), la actividad
termodinámica de los distintos componentes aumenta (Zimmerman and Minton 1993, Minton 1995). El
resultado dependerá de la naturaleza de cada reacción (Ellis 2001). La teoría de volumen de exclusión
predice que la superpoblación molecular tendrá efecto sobre el plegamiento de la proteína estabilizando
el estado nativo (Minton 1995, Zimmerman and Minton 1993). Así, la actividad de una enzima puede
entonces estar afectada por cambios en su conformación debidos a la superpoblación molecular. Los
ambientes superpoblados se caracterizan por presentar grandes superficies en contacto con el solvente,
cuya estructura se ve afectada (Clop, Perillo and Chattah 2012). Esto puede modificar el plegamiento de
la proteína y, por medio de ese mecanismo, la actividad enzimática (Matsue and Miyawaki 2000). La
estructura del agua además puede modificar la cinética de una enzima por afectar la interacción
hidrofóbica enzima-sustrato.
La mayoría de las metodologías utilizadas para caracterizar la cinética de una reacción catalizada por
enzima se basan en la utilización de algún método espectroscópico que permita visualizar un producto
artificial coloreado de la reacción (Wallenfels and Malhota 1961), en la cuantificación de los productos
por métodos cromatográficos (Atanasov et al. 2005) e inclusive en la cuantificación de los productos de
reacción midiendo la actividad de otra enzima sobre esos productos (Marrakchi et al. 2008). Este tipo de
cuantificaciones pueden resultar muy imprecisas y/o engorrosas si se utilizan sistemas SPM como medio
de reacción. (Olsen 2006). La calorimetría de titulación isotérmica (ITC su sigla en inglés, Isothermal
Titration Calorimetry) mide el calor asociado con una dada reacción química (Freire, Mayorga and
Straume 1990). Prácticamente todas las reacciones químicas ocurren con la toma o liberación de c alor;
la velocidad de reacción catalizada por una enzima es proporcional a este flujo de calor, siendo así
fácilmente cuantificable por ITC (Todd and Gomez 2001, Olsen 2006). Otra ventaja, es que se podría
utilizar el sustrato natural de la enzima (lactosa en este caso), debido a que no se necesita “detectar” los
productos de la reacción.
Los objetivos del presente trabajo fueron: i) investigar el efecto de la superpoblación macromolecular
sobre la cinética de hidrólisis de o-nitrofenil galactopiranósido (ONPG) catalizada por β -galactosidasa
de E.coli (β-Gal); ii) comparar los datos de hidrólisis de ONPG catalizada por β -Gal obtenidos por
espectroscopia UV-Visible (EF) y por ITC, para poder validar la técnica de ITC para estudiar la cinética
de enzimas en condiciones de SPM en general y la aplicabilidad de la EF en este sistema en p articular.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Materiales
Se utilizó β-Gal de E. coli comercializada por Sigma Co., Polietilenglicol PM 6000 (PEG 6000) como
agente superpoblante y o-nitrophenyl--D-galactopiranósido (ONPG) como sustrato. Todos los
reactivos utilizados fueron de grado analítico.
Métodos
Determinación de la actividad enzimática por métodos espectroscópicos
La actividad de β-Gal se determinó por el método de Wallenfels y Malhota (Wallenfels and Malhota 1961).
El sistema de incubación contuvo la enzima, buffer fosfato 0,1 M pH 6,8 y ONPG. Se incubó durante 10
min. a 37ºC. La reacción se detuvo por el agregado de NaOH 0.2 M. El producto formado (ONP) se
cuantificó por espectrofotometría midiendo la absorbancia a 420 nm. La ecuación de Michaelis-Menten se
ajustó, por el método de los cuadrados mínimos, a los datos experimentales obtenidos a diferentes
concentraciones de PEG6000 para determinar el valor de los parámetros cinéticos.
Determinación de la actividad enzimática por ITC
Se determinaron por ITC (Bianconi 2003) los parámetros cinéticos de la hidrólisis de ONPG catalizada por β
-Gal, así como la función termodinámica de estado ΔH a distintas concentraciones de PEG6000. La variable
242
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
experimental observable por ITC es el flujo de calor (dQ/dt) que se toma o libera durante una reacción. Este
flujo es proporcional a la velocidad de la reacción (v). Para poder calcular la velocidad es necesario
conocer la entalpía de la reacción (ΔHr) y el volumen de la celda (V). El cambio en la entalpía se calcula
midiendo el calor total y el número total de moles de sustrato convertidos en producto (n sub).
(1)
La velocidad de la reacción se calcula entonces como
(2)
La concentración de sustrato en función del tiempo se calcula usando el calor integrado en función del
tiempo
(3)
Usando (2) y (3) es posible calcular la velocidad de reacción y la concentración de sustrato en función del
tiempo y determinar parámetros cinéticos ajustando a una curva de Michaelis-Menten (Todd and Gomez
2001).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación de los parámetros cinéticos para la hidrólisis de ONPG catalizada por β-Gal por
espectroscopia de absorción UV-Vis
Se determinó la actividad de β-Gal en la reacción de hidrólisis de ONPG y se cuantificó el producto
obtenido, ONP, por espectrofotometría UV-Visible midiendo la absorbancia a 420 nm. Se graficó la
actividad de la enzima en función de la concentración de sustrato (ONPG) para las distintas condiciones de
superpoblación molecular (0, 15, 25 y 35 % PEG6000). Los resultados se muestran en la figura 1:
0.00022
0.00022
a)
b)
0.00020
0.00018
0.00018
0.00016
0.00016
0.00014
0.00012
0.00010
0.00008
0 % PEG6000
15 % PEG6000
0.00006
0.00004
0.00002
V0 (mmol/l/seg)
0.00014
0.00012
0.00010
0.00008
0 % PEG6000
25 % PEG6000
0.00006
0.00004
0.00002
0.00000
0.00000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0.0
0.5
1.0
[ONPG] (mM)
0.00022
0.00020
2.0
2.5
3.0
0.9
c)
0.8
0.00022
d)
0.00020
0.7
0.00016
0.00014
0.00012
0.00010
0.00008
0.00006
0 % PEG6000
35 % PEG6000
0.00004
0.00002
[ONPG] (mM)
V0 (mmol/l/seg)
0.00018
1.5
[ONPG] (mM)
0.00000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.6
0.00018
0.5
0.00016
0.4
0.3
Km
0.2
Vmax
0.1
3.0
[ONPG] (mM)
0.00014
0.00012
0
5
10
15
[PEG
6000
V0 (mmol/l/seg)
V0 (mmol/l/seg)
0.00020
6000
20
25
30
35
] (% P/V)
Fig. 1. Efecto del PEG
-Gal: a), b) y c)
corresponden a curvas de sustrato a concentraciones crecientes de PEG6000; d) efecto del PEG6000 sobre los
parámetros cinéticos (Vmax y KM) de la hidrólisis de ONPG catalizada por β-Gal, Los puntos corresponden a
la media  s.e.m. de triplicados. Las líneas representan el ajuste de la ecuación de Michaelis-Menten
243
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
La figura 1 muestra el comportamiento de la enzima a distintas concentraciones de agente superpoblante. A
partir de los gráficos obtenidos, se calcularon los parámetros cinéticos K M y Vmax de la reacción de
hidrólisis. Los datos obtenidos se resumen en la Tabla 1:
Tabla 1. Representación de los valores obtenidos para los parámetros cinéticos por medio de espectroscopía
UV-Visible.
Espectroscopia UV-Visible
[PEG6000] (%P/V)
Sustrato
KM (mM)
Vmax (mmol/l/seg)
0
ONPG
0,14 ± 0,01
0,00020±0,00001
15
ONPG
0,25 ± 0,02 b
0,00019±0,00001 a
25
ONPG
0,52 ± 0,06 b
0,00017±0,00001 a
b
35
ONPG
1,0 ± 0,2
0,00018±0,00001 a
Los valores representados son un promedio de todos los experimentos realizados para cada una de las condiciones estipuladas. El
número de valores tomados para el cálculo de los distintos parámetros cinéticos fue de 12. En la Tabla se representan los valores
promedio con su respectivo error. a diferencias no significativas respecto al control; b diferencias significativas respecto al control
(Test post-hoc LSD)
Como puede observarse en la Tabla 1, a medida que aumenta la concentración de agente superpoblante
ocurre una disminución en la afinidad enzima-sustrato (aumenta KM). Este efecto podría deberse a una
dificultad del sustrato para acceder a la enzima debido a que su difusión se encuentra dificultada por la SPM.
Se observó también que a medida que la concentración de PEG6000 aumenta, la Vmax de la reacción se
mantuvo prácticamente constante.
Determinación de los parámetros cinéticos para la hidrólisis de ONPG catalizada por β-Gal utilizando
Calorimetría de Titulación Isotérmica.
Cálculo del ΔHapp de reacción
app de la reacción de
hidrólisis de ONPG, se realizó una única inyección de sustrato a la celda de muestra, que en este caso
contiene la enzima, y se dejó actuar un tiempo suficientemente largo como para que la reacción se
completara. La curva obtenida en un experimento de este tipo se muestra en el panel izquierdo de la figura 2,
la cual muestra el flujo de calor liberado (reacción exotérmica) en función del tiempo. Integrando el área
sobre la curva se obtiene el calor total de la reacción de acuerdo a la ecuación 2.
Para asegurarnos que no ocurra inhibición por producto, se realizó una segunda inyección de sustrato y se
dejó actuar. Un experimento de este tipo es mostrado como un inserto en el panel izquierdo de la figura 2.
Como puede observarse, el calor obtenido en ambas inyecciones es el mismo, lo cual nos indica que este tipo
de inhibición no estaría presente.
-3000
0
-3200
Happ(cal/mol)
10
-2
9
dq/dt (cal/seg)
dq/dt (cal/seg)
-1
-3
-4
8
7
-3400
-3600
6
5
4
-3800
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
tiempo (seg)
-5
-4000
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0
5
10
15
6000
tiempo (seg)
[PEG
20
25
30
] (% P/V)
Fig.2. Panel derecho: calor liberado en función del tiempo en un experimento de una inyección. Como
inserto en este panel se muestra un experimento que se realiza para descartar inhibición por sustrato (ver
texto). Panel izquierdo: ΔHapp
-Gal en función de la
concentración de agente superpoblante PEG6000.
244
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Se determinaron los valores de ΔHapp de la hidrólisis de ONPG catalizada por β-Gal para las distintas
condiciones de SPM. Los datos obtenidos para las distintas concentraciones de PEG6000 se muestran en el
panel derecho de la figura 2 y se resumen en la Tabla 2:
Tabla 2. Representación de los valores obtenidos de ΔHapp para las distintas condiciones de superpoblación
en la reacción de hidrólisis de ONPG catalizada por β-Gal.
[PEG6000] (% P/V)
ΔHapp (cal/mol)
0
-3823±13
15
-3338±47
25
-3261±42
35
------Los valores representados fueron obtenidos a partir del promedio de 5 experimentos para cada una de las
condiciones estipuladas. Los resultados para todos los casos coincidieron en valores negativos de ΔH, lo cual
indica que este cambio entálpico corresponde a una reacción exotérmica, en donde en el transcurso de la
reacción se produjo una liberación de calor por parte del sistema.
Se observó que a medida que la concentración de agente superpoblante fue mayor, el cambio entálpico
disminuyó (el ΔHapp de la reacción fue tomando valores cada vez menos negativos). Para el caso en que la
concentración de PEG6000 fue de 35% no se muestran valores debido a que los resultados obtenidos no fueron
confiables, ya que no se encontró reproducibilidad en los perfiles de las curvas de calor en función del
tiempo.
Determinación de los parámetros cinéticos KM y Vmax para la reacción de hidrólisis de ONPG
catalizada por β-Gal
Se realizaron experimentos de múltiple inyección por Titulación Calorimétrica Isotérmica a fines de obtener
los parámetros cinéticos, KM y Vmax de la reacción de hidrólisis de ONPG catalizada por β-Gal. El panel
superior de la Figura 3 muestra los datos obtenidos en ausencia de PEG6000. El flujo de calor medido (dQ/dt)
se grafica en función del tiempo. La entalpía molar de la reacción, valor necesario para el cálculo de la
velocidad de reacción fue determinada en un experimento independiente de una inyección (inserto en panel
superior de la Figura 3).
Los datos obtenidos en experimentos de múltiples inyecciones como el mostrado en la Figura 3 se convierten
en velocidad de reacción, v, usando las ecuaciones 3 y 4 (ver sección Materiales y Métodos). La velocidad de
reacción en función de la concentración de sustrato se muestra en el panel inferior de la Figura 3. El ajuste de
la ecuación de Michaelis-Menten (ecuación 5) se muestra como una línea sólida.
245
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
0.1
0
dq/dt (cal/seg)
0.0
dq/dt (cal/seg)
-0.1
-0.2
-0.3
-1
-2
-3
-4
-5
0
-0.4
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
tiempo (seg)
-0.5
-0.6
-0.7
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Tiempo (seg)
0.00014
0.00012
V0(milimol/l/seg)
0.00010
0.00008
0.00006
0.00004
0.00002
0.00000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
[ONPG] (mM)
0.6
0.7
0.8
0.9
Fig. 3. El panel superior muestra los datos medidos por ITC para la titulación de β-Gal con ONPG en buffer
fosfato pH 6,8 a 37ºC. Para la determinación del ΔHapp se realizó un experimento de una sola inyección. Los
datos de este experimento se muestran como inserto en el panel superior. El panel inferior representa la
velocidad de reacción en función de la concentración de sustrato calculada a partir de los datos del panel
superior (círculos). La línea sólida representa el ajuste de los datos experimentales a una cinética
michaeliana.
El mismo tipo de experimentos y análisis se realizaron para distintas concentraciones de agente
superpoblante. Los parámetros cinéticos obtenidos para las distintas condiciones se resumen en la Tabla 3:
Tabla3. Representación de los resultados obtenidos por Titulación Calorimétrica Isotérmica para la
Hidrólisis de ONPG catalizada por β-Gal.
ITC
[PEG6000] (% P/V)
Sustrato
KM (mM)
Vmax (mmol/l/seg)
0
ONPG
0,157 ± 0,007
0,000158 ± 0,000004
15
ONPG
0,30 ± 0,03 b
0,00021 ± 0,00002 a
25
ONPG
------------------------------35
ONPG
------------------------------a
diferencias no significativas respecto al control;
b
diferencias significativas respecto al control (Test post-hoc LSD).
Los valores que se muestran son un promedio de los resultados de 10 ensayos. Como se mencionó
anteriormente, no se pudieron obtener datos confiables para las mayores concentraciones de agente
superpoblante utilizado. Para la condición 25% PEG6000
app de la
reacción de hidrólisis, no pudieron obtenerse resultados reproducibles en experimentos de múltiples
inyecciones que permitieran calcular los parámetros cinéticos en esta condición. Esto podría ser debido a que
en los experimentos para determinar ΔHapp, la concentración de enzima que se utiliza es mucho mayor, y por
lo tanto el calor liberado en la reacción es más grande que en los experimentos de múltiples inyecciones, en
los cuales es indispensable utilizar una baja concentración de enzima de modo que en cada inyección el
sustrato consumido sea el mínimo posible. Debido a esto, los errores en las mediciones que introduce la alta
concentración de superpoblante, serían despreciables en el caso de los experimentos de una inyección, pero
no en los de múltiples inyecciones.
Comparación de los datos obtenidos por Espectroscopia UV-Visible y por Titulación Calorimétrica
Uno de los objetivos del presente trabajo era comparar los datos de hidrólisis de ONPG catalizada por β-Gal
obtenidos por espectroscopia UV-Visible con aquellos que se obtienen por Calorimetría de Titulación
246
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Isotérmica. Los datos obtenidos por ambas metodologías se resumen para un mejor entendimiento en la
Tabla 4:
Tabla 4. Comparación del ajuste a una cinética michaeliana de los datos experimentales obtenidos por
espectroscopia UV- Visible y por ITC.
UV- Visiblea
ITCa
PEG6000 Sustrato
KM (mM) Vmax (mmol/l/seg)
KM (mM)
Vmax (mmol/l/seg)
0%
ONPG 0,14 ± 0,01 0,00020±0,00001 0,157 ± 0,007 0,000158 ± 0,000004
0,30 ± 0,03
15 %
ONPG 0,25 ± 0,02 0,00019±0,00001
0,00021 ± 0,00002
25 %
ONPG 0,52 ± 0,06 0,00017±0,00001
------------------35 %
ONPG
1,0 ± 0,2
0,00018±0,00001
------------------Los valores mostrados corresponden a la media ± sem de 10 determinaciones. aNo hay diferencias significativas entre técnicas
(ANOVA P< 0.00001)
Como puede observarse, a diferencia de lo que se esperaba, por espectrofotometría UV-Visible pudo medirse
la cinética a concentraciones elevadas de agente superpoblante, lo que no pudo llevarse a cabo con éxito
mediante ITC.
En cuanto a los valores de los parámetros cinéticos obtenidos por ambas metodologías, se observa lo que se
describe a continuación. El valor de KM mostró la misma tendencia para ambas técnicas: una disminución en
la afinidad enzima-sustrato (aumento de KM) a medida que la concentración de agente superpoblante
aumenta. Si bien los valores de KM para cada condición de PEG6000 fueron levemente superiores cuando se
calcularon a partir de datos de ITC con respecto a los obtenidos por espectrofotometría UV-Visible, el
análisis estadístico mostró que estas diferencias no fueron significativas.
Este efecto de la SPM sobre la afinidad de la enzima por el sustrato podría ser debido al impedimento
difusional que la presencia de la alta concentración de moléculas impone al sustrato. Esto también podría
deberse a cambios sutiles que pueden ocurrir en la conformación de la enzima, y que pueden explicar que
esta exhiba una menor afinidad por el ONPG. Estudios de dicroísmo circular realizados en nuestro
laboratorio muestran que la enzima sufre un leve cambio en su estructura conformacional cuando es
sometida a concentraciones crecientes de PEG6000.
En cuanto a los valores de Vmax, por ambas técnicas se encontró que este parámetro no mostró variaciones
estadísticamente significativas debidas al aumento en la concentración de PEG6000.
Las diferencias entre los valores tanto de KM como de Vmax encontrados por ambas técnicas no fueron
estadísticamente significativas. Estas diferencias son similares a las encontradas con estas dos metodologías
por Henzler et al. estudiando la actividad de enzimas inmovilizadas (Henzler, Haupt and Ballauff 2008).
Finalmente, el efecto de la SPM sobre la afinidad de la interacción enzima-sustrato debe ser tomada en
cuenta a la hora de desarrollar sistemas terapéuticos de sustitución enzimática para el tratamiento por vía
oral.
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248
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Interesterificación enzimática de aceite de soja: estudio de la reacción química de migración
Pacheco C., Crapiste G.H., Carrín M.E.
PLAPIQUI (UNS-CONICET), Bahía Blanca, Argentina.
mcarrin@plapiqui.edu.ar
Resumen: La interesterificación entre aceites y grasas permite obtener productos grasos semisólidos con
características fisicoquímicas y/o nutricionales distintivas. La interesterificación enzimática llevada a cabo
con lipasas sn-1,3 específicas permitiría mantener invariable el patrón de ácidos grasos de la posición sn-2 de
los triglicéridos originales, hecho que incorporaría un valor nutricional adicional al producto. Sin embargo,
existe evidencia que indicaría que esta condición podría no cumplirse, aún utilizando lipasas comprobadas
como sn-1,3 específicas. En este trabajo se estudió la reacción de interesterificación entre aceite de soja y el
mismo totalmente hidrogenado, catalizada por lipasas sn-1,3 específicas inmovilizadas comerciales
(Lipozyme RM IM y TL IM). Mediante el análisis de la composición de los productos de reacción se
comprobó la ocurrencia del fenómeno de acil migración. En particular, se concluyó que Lipozyme TL IM
posee un efecto acelerador de la misma y que un aumento en la concentración de biocatalizador y una mayor
proporción de ácidos grasos insaturados también promovieron dicho fenómeno. Por el contrario, el agregado
de hexano, en combinación con una disminución de la temperatura, disminuyeron su desarrollo. Finalmente,
la temperatura, evaluada sobre muestras interesterificadas en presencia de hexano, mostró una correlación
positiva con la velocidad de acil migración.
Palabras clave: interesterificación, lipasas, Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, especificidad sn-1,3, acil
migración.
Abstract: The interesterification between oils and fats permits to obtain semisolid products with distinctive
physicochemical and/or nutritional characteristics. The enzymatic interesterification performed with sn-1,3
specific lipases would permit to maintain unaltered the sn-2 fatty acid profile of the original triglycerides,
increasing the nutritional value of the product. However, there is evidence indicating that this condition
could be unfulfilled, even making use of proven sn-1,3 specific lipases. In this work, the interesterification
between soybean oil and the same one fully hydrogenated, catalyzed by commercial immobilized sn-1,3
specific lipases (Lipozyme RM IM y TL IM) was studied. Through the analysis of the composition of the
reaction products the occurrence of acyl migration reaction was demonstrated. In particular, Lipozyme TL
IM showed an accelerating effect over this reaction, as well as the biocatalyst concentration and the
unsaturated fatty acids concentration. On the contrary, the addition of hexane, in combination with a
decrease in temperature, reduced the extent of development of the reaction. Finally, the reaction temperature,
evaluated in presence of hexane, showed a positive correlation with the acyl migration reaction rate.
Keywords: interesterification, lipases, Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, sn-1,3 specificity, acyl
migration.
INTRODUCCIÓN
La posición en la cual se encuentran esterificados los ácidos grasos en la molécula de triglicérido (TAG)
juega un papel crucial, tanto en la funcionalidad de los productos grasos como en la forma en que dichos
residuos acilo se metabolizan al ser ingeridos. En cuanto a sus implicancias nutricionales, éstas se encuentran
relacionadas con la actividad de la lipasa pancreática, cuya acción en el organismo consiste en hidrolizar los
ácidos grasos de las posiciones sn-1 y sn-3 durante el proceso de digestión de los triglicéridos (Ray y
Bhattacharyya 1995). El destino metabólico de los ácidos grasos retenidos en la posición sn-2, el cual
depende del largo de la cadena carbonada de los mismos, es diferente al de los ácidos grasos liberados. Los
aceites y grasas naturales de origen vegetal son ricos en ácidos grasos insaturados (principalmente
esenciales) en la posición central del glicerol, mientras que los saturados se ubican generalmente en las
posiciones externas del mismo (Ray y Bhattacharyya 1995).
En el caso de la interesterificación enzimática orientada a la obtención de productos grasos con propiedades
funcionales mejoradas utilizando lipasas sn-1,3 específicas, la elección de este tipo de enzimas se basa
principalmente en la intención de mantener inalterado el perfil acídico de la posición sn-2 de los sustratos
249
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
naturales. Diversas publicaciones científicas indican que las lipasas utilizadas en el presente trabajo pueden
considerarse estrictas respecto a su acción exclusiva sobre las posiciones sn-1 y -3 del glicerol (Ferrari et al.
1997, Du et al. 2005, Rodriguez et al. 2008, Wang et al. 2008, Fernandez-Lafuente 2010).
Este objetivo, así como también el rendimiento de la reacción, puede verse amenazado por un mecanismo no
enzimático conocido como acil migración. En las reacciones de interesterificación este fenómeno espontáneo
se presenta debido a la aparición de glicéridos parciales, especialmente diglicéridos (DAG) (Xu et al. 1998).
La acil migración en este grupo de glicéridos consiste en la isomerización de los 1(3),2-DAG, generados por
las lipasas sn-1,3 específicas, a la forma termodinámicamente más estable de 1,3-DAG. La fuerza impulsora
principal para esta reacción radica en un efecto estérico. El grupo éster en la posición sn-2 del 1(3),2-DAG
presenta mayores interacciones con el grupo éster adyacente en posición sn-1(3) y con el hidroxilo en
posición sn-3(1) que los correspondientes al 1,3-DAG. Por otro lado, este efecto es parcialmente
contrarrestado por la atracción entre las cadenas de ácidos grasos no polares debido a fuerzas de tipo van der
Waals (Serdarevich 1967). La relación de equilibrio 1(3),2-DAG:1,3-DAG depende del grado de
insaturación de los grupos acilo, así como también del largo de sus cadenas carbonadas (Serdarevich 1967,
Laszlo et al. 2008). Para el caso de DAG de cadena larga se han reportado valores de porcentaje de 1,3-DAG
respecto al total de DAG de 56% para la acil migración en 1,2-dipalmitina (Kodali et al. 1990); sin embargo
el rango generalmente aceptado es de 60 - 70% (Freeman y Morton 1966, Serdarevich 1967, Xu et al. 1998,
Laszlo et al. 2008). Para los monoglicéridos (MAG), esta relación aumenta considerablemente, siendo de
aproximadamente 1:9 (2-MAG:1(3)-MAG) debido a la ausencia de compensación del efecto estérico por
parte de las fuerzas de van der Waals mencionadas (Boswinkel et al. 1996).
La reducción en el rendimiento de la reacción como consecuencia de la acil migración de DAG se produce
debido a que la enzima sn-1,3 específica no es capaz de reesterificar un grupo acilo en la posición sn-2,
aumentando en principio el contenido de 1,3-DAG en el medio de reacción.
Existen diversos factores que pueden afectar la acil migración. La presencia de ácidos o bases en el medio
catalizarían la reacción. En el caso de las reacciones de interesterificación, los ácidos grasos podrían ejercer
este efecto; sin embargo, al tratarse de ácidos débiles su efecto sería mínimo (Xu et al. 1998). Por otro lado,
existen estudios contradictorios con respecto al efecto del agua. Oda et al. (2005) y Kaieda et al. (1999)
encontraron que el contenido de agua aceleraba la acil migración en reacciones de metanólisis de aceites
vegetales. Sin embargo, Xu et al. (1998) aseguran que, en medios libres de solvente, el agua no induce la
migración, alegando que los efectos reportados por otros autores probablemente se deban a diferentes niveles
de DAG generados a diferentes contenidos de agua. Existe controversia también respecto al rol del solvente
en la acil migración. Xu et al. (1998) indicaron que los solventes no polares aceleraban la migración,
referenciando un trabajo de Goh et al. (1993) en el que se analizó el efecto del agregado de dos solventes no
polares, hexano y dietil éter, en la transesterificación de manteca de cacao. Estos últimos autores
concluyeron que la presencia de hexano en el medio de reacción produjo un aumento significativo del
fenómeno de acil migración. Sin embargo, dicha conclusión surgió de la comparación de ambos sistemas, sin
reportar datos respecto al comportamiento que tendrían los mismos en medios libres de solvente. Más aún,
en un trabajo posterior de Xu (Yang et al. 2005) se arriba a la conclusión que el hexano podría inhibir la acil
migración en reacciones de acidólisis de tripalmitina con ácido linoleico conjugado y ácido cáprico.
A diferencia de los posibles efectos de los contenidos de agua y solvente en el medio, se encuentra fuera de
discusión la acción aceleradora de la acil migración que poseen ciertos soportes sobre los cuales se realiza la
inmovilización de las enzimas, o incluso sales que se adicionan a los mismos (Kodali et al. 1990, Sjursnes et
al. 1995, Du et al. 2005). Debido al origen termodinámico del proceso de isomerización, la temperatura
posee una gran influencia sobre las velocidades de migración (Yang et al. 2005). Por último, se sabe que la
velocidad de isomerización y la relación de equilibrio 1(3),2-DAG:1,3-DAG dependen del tamaño y
naturaleza de los ácidos grasos involucrados en el proceso (Serdarevich 1967, Boswinkel et al. 1996, Laszlo
et al. 2008).
El presente trabajo se comenzó con un estudio del perfil acídico en la posición sn-2 tanto de los sustratos
como de los productos de la interesterificación enzimática de aceite de soja (SO) y el mismo completamente
hidrogenado (FHSO). Se realizaron predicciones a partir de consideraciones teóricas, para luego comparar
las mismas con los datos experimentales obtenidos con diferentes relaciones de sustratos y tipos de enzima.
Luego, se llevó a cabo un estudio de la ocurrencia del fenómeno de acil migración en la reacción de
interesterificación en estudio considerando al porcentaje molar de 1,3-DAG respecto al total de DAG como
indicador del grado de acil migración alcanzado en los diferentes productos. Se evaluó en particular el efecto
250
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
del tipo y concentración de enzima, grado de insaturación de los residuos acilo de las mezclas reactivas,
presencia de hexano en el medio de reacción e influencia de la temperatura en estos últimos sistemas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
El SO (composición aproximada de ácidos grasos predominantes como FAMEs: 53.0% C18:2, 20.0% C18:1,
11.0% C16:0, 6.0% C18:3, de acuerdo al Método Oficial AOCS Ce 2-62 y Ce 1e-91 (2006)) fue provisto por
Molinos Río de la Plata S.A. (Buenos Aires, Argentina) y el FHSO (composición aproximada de ácidos
grasos predominantes como FAMEs: 83.8% C18:0, 12.3% C16:0, 1.4% C18:1) fue amablemente provisto
por Calsa S.A. (Buenos Aires, Argentina). La enzima inmovilizada de Rhizomucor miehei (Lipozyme RM
IM, inmovilizada en una resina de intercambio iónico) y Thermomyces Lanuginosa (Lypozyme TL IM,
inmovilizada en sílica gel granulada) fueron un generoso obsequio de Novozymes Latin America Ltd.
(Brazil). La lipasa pancreática (20.3 U/mg) y el N-Metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA) fueron
obtenidos de Fluka (Buchs, Switzerland). Todos los estándares (1,3-dipalmitina, tricaprina), con pureza
superior a 98%, fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA). La piridina utilizada fue
comprada a J.T. Baker (Philipsburg, USA). Los restantes reactivos, gases y solventes fueron de grado
analítico o cromatográfico.
Métodos
Protocolo de reacción
Las reacciones se llevaron a cabo en sistemas cerrados provistos de agitación magnética y mantenidos a
temperatura constante por medio de un fluido calefactor. La mezcla de grasa y aceite (1 g total) fue
precalentada y homogeneizada previo al agregado de la enzima inmovilizada, momento en el que se
comenzó a desarrollar la reacción. En los sistemas con solvente, se adicionaron 3 mL de hexano
cromatográfico (previamente deshidratado con tamices moleculares, 20 g en 300 mL (Maruyama et al.,
2000)) a la mezcla de reacción. La interrupción de la reacción fue realizada mediante el filtrado de la mezcla
con papel de filtro Whatman grado 1. Los productos de reacción fueron inmediatamente almacenados a
temperaturas inferiores a 0 ºC. En el caso de los sistemas con solvente se procedió a evaporar el mismo bajo
corriente de nitrógeno hasta peso constante previo a su almacenamiento. Cabe aclarar que la totalidad de las
muestras se obtuvieron de ensayos independientes con el objetivo de evitar la propagación de posibles
errores experimentales.
Análisis de subproductos
Los DAG fueron preparados y analizados por GC de acuerdo a Gutiérrez-Ayesta et al. (2007) con
modificaciones. Se utilizó un cromatógrafo de la serie 4890D (Agilent, Hewlett-Packard), con una columna
capilar (MXT-65TG, 30 m x 0.25 mm x 0.10 m espesor de película; Restek, Bellefonte, USA). Hidrógeno a
41 cm/s fue utilizado como gas carrier. Durante la inyección se utilizó el modo split con una relación 1:60.
La temperatura del horno fue programada de la siguiente manera: 40 ºC durante 4 min, luego incrementada
hasta 350 ºC a 25 ºC/min, y finalmente mantenida a esta temperatura por 15 min. Las temperaturas del
inyector y FID fueron 360 y 380 ºC, respectivamente. Para cuestiones de cuantificación, el método del
estándar interno fue implementado, siendo la dipalmitina el estándar considerado y la tricaprina el estándar
interno utilizado. La adquisición de datos e integración de los picos fue llevada a cabo utilizando el software
HP 3398A GC Chemstation Software (Hewlett-Packard, 1998).
Composición de ácidos grasos en posición sn-2
Se implementó la técnica de la lipasa pancreática, siguiendo el Método Oficial AOCS Ch 3-91 (2006) con
modificaciones . Éste Método recomienda desarrollar la reacción de la lipasa pancreática a 40 ºC. Debido a
que ciertos productos de reacción obtenidos poseen puntos de fusión por encima de esta temperatura, la
reacción fue desarrollada a 52 ºC (temperatura a la cual una mezcla 50:50 (SO:FHSO, %w/w) es totalmente
solubilizada en hexano). Se utilizó un aceite de composición acídica en posición sn-2 conocida, de manera de
asegurar similares resultados a 52 y 40 ºC.
En el caso del aceite de soja hidrogenado, dado su alto punto de fusión, su perfil acídico en posición sn-2 fue
calculado teóricamente a partir de las distribuciones determinadas experimentalmente para ciertas mezclas de
sustratos.
Análisis estadístico
251
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Los datos se expresan como medias ± desviación estándar. El análisis estadístico fue llevado a cabo por test t
con un nivel de significación de 0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estudio del perfil de TAG y residuos acilo en la posición sn-2
Sustratos
A continuación se presentan las distribuciones de los residuos acilo, clasificados según estos sean saturados o
insaturados, en las posiciones sn-2 y sn-1,3 en las mezclas de reacción utilizadas (Tabla 1).
Tabla 1: Distribución global y posicional de los ácidos grasos correspondientes a las mezclas reactivas
iniciales (% mol/mol)
Relación de sustratos SO:FHSO (m/m)
50:50
GlobalA
Posición sn-2
%S
%U
%S2
%U2
60:40
65:35
70:30
58.44 ± 0.01
41.56 ± 0.01
50.30 ± 3.37
49.70 ± 3.06
50.53 ± 0.01
49.47 ± 0.01
41.00 ± 1.77
59.00 ± 1.11
46.57 ± 0.02
53.43 ± 0.02
36.35 ± 2.86
63.65 ± 1.25
42.62 ± 0.02
57.38 ± 0.02
31.70 ± 0.98
68.30 ± 1.12
%U2
(
) 0.99 ± 0.10
%S2
1.44 ± 0.11
1.75 ± 0.24
2.15 ± 0.14
Posición sn-1,3
%S1,3
62.51 ± 3.37 55.30 ± 1.77 51.69 ± 2.86 48.08 ± 0.98
%U1,3
37.49 ± 3.06 44.70 ± 1.11 48.31 ± 1.25 51.92 ± 1.12
SO: aceite de soja refinado.
FHSO: aceite de soja totalmente hidrogenado.
S: ácido graso saturado, U: ácido graso insaturado.
A
porcentajes calculados teóricamente a partir de la composición de los sustratos.
Predicción de la Relación (%U2/%S2) en Productos Interesterificados
La interesterificación química produce un reacomodamiento totalmente al azar de los residuos acilo en la
mezcla de TAG reaccionante, considerando que todos los ácidos grasos presentan la misma reactividad. Por
lo tanto, a partir de las composiciones acídicas de los sustratos, y aplicando conceptos básicos de
probabilidad (Hustedt, 1976), es posible predecir el patrón de TAG y, en consecuencia, la relación
(%U2/%S2) que la mezcla reactante alcanzará en el equilibrio.
Realizando un análisis análogo, es posible obtener la relación (%U2/%S2) considerando un reacomodamiento
al azar de los residuos acilo correspondientes a las posiciones sn-1 y sn-3, manteniendo invariables las
posiciones sn-2.
En las Tabla 2 se muestran ambas predicciones.
252
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Tabla 2: Relación (%U2/%S2) calculada suponiendo diferentes patrones de aleatorización de los residuos
acilo para diferentes mezclas reactivas iniciales
(%U2/%S2)
SO:FHSO
Aleatorización de
(m/m)
Aleatorización total los residuos acilo en
de los residuos acilo posiciones sn-1 y
sn-3
50:50
0.53
0.99
60:40
0.66
1.44
65:35
0.73
1.75
70:30
0.81
2.15
80:20A
1.02
3.47
Para la nomenclatura ver Tabla 1.
A
Calculada teóricamente a partir de las composiciones de los sustratos.
Perfiles Experimentales de la Relación (%U2/%S2) en Productos Interesterificados
En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos para muestras interesterificadas con diferentes relaciones
de sustratos iniciales y catalizadas por ambas enzimas, en el equilibrio (después de 48 horas de reacción).
Tabla 3: Relación (%U2/%S2) en el equilibrio para muestras interesterificadas (% mol/mol)
SO:FHSO
(m/m)
Tipo de Enzima
(%U2/%S2)
50:50
RM IM
TL IM
0.69 ± 0.05
0.58 ± 0.03
60:40
RM IM
1.14 ± 0.11
65:35
TL IM
0.96 ± 0.05
70:30
RM IM
1.13 ± 0.07
Para la nomenclatura ver Tabla 1.
Condiciones de reacción: 70ºC, 230 rpm, 5% (m/msustratos) de enzima.
Se puede observar que los valores para los productos obtenidos se encuentran entre los mínimos y máximos
posibles, presentados en la Tabla 2. Zhang et al. (2001) encontraron un comportamiento similar al
interesterificar química y enzimáticamente una mezcla 75:25 (% m/m) de estearina de palma y aceite de coco
con Lipozyme TL IM. Las relaciones (%U2/%S2) que obtuvieron fueron de 1.02, 0.33 y 0.69 para las
mezclas iniciales y los productos de interesterificación química y enzimática, respectivamente.
La modificación del cociente (%U2/%S2) puede ser justificada únicamente por la ocurrencia de la reacción de
acil migración que indudablemente debe tener lugar en los sistemas de reacción estudiados.
253
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Estudio de Acil Migración
Sustratos
En la Tabla 4 se presentan las composiciones en DAG del SO y del FHSO, así como también las
correspondientes a las mezclas a partir de las cuales se realizaron las reacciones para llevar a cabo el estudio
presentado en la presente sección.
Tabla 4: Composición en DAG de ambos sustratos y mezclas iniciales de reacción (SO:FHSO)
FHSO
Mezcla 50:50
(m/m)
Mezcla 80:20
(m/m)
0.30 ± 0.03
1.00 ± 0.09
76.63 ± 2.83
0.37 ± 0.07
0.83 ± 0.08
68.40 ± 3.21
0.41 ± 0.10
0.73 ± 0.08
63.45 ± 3.44
SO
1(3),2-DAG (mM)
0.44 ± 0.12
1,3-DAG (mM)
0.67 ± 0.07
% 1,3-DAG (mol/mol)
60.18 ± 3.59
Para la nomenclatura ver Tabla 1.
Productos de Interesterificación
Efecto del tipo y concentración de enzima
En la Figura 1 se grafica la evolución de la proporción molar de 1,3-DAG respecto al total de DAG durante
la interesterificación de mezclas con una relación másica SO:FHSO de 50:50 utilizando ambas enzimas en
concentración de 5% (m/msust.).
70
TL IM
RM IM
60
% 1,3-DAG
50
40
30
20
10
0
0.75
3
6
12
24
48
t (h)
Figura 1: Evolución en el tiempo del porcentaje (mol/mol) de 1,3-DAG respecto al total de DAG
(SO:FHSO: 50:50 (m/m), 5% (m/msust.) de enzima y 70ºC).
Analizando los valores obtenidos para las muestras interesterificadas con Lipozyme TL IM, se observa que,
alcanzadas las 3 h de reacción, el porcentaje de 1,3-DAG ya se encuentra estabilizado en su valor final,
indicando que la reacción de isomerización de los grupos acilo alcanzó su condición de equilibrio. Esto no
significa que la reacción global enzimática + química haya alcanzado el equilibrio, ya que las composiciones
de 1,3-DAG y DAG totales continúan modificándose con el transcurso del tiempo (datos no mostrados), pero
lo hacen manteniendo la relación entre ellas. En cuanto al valor alcanzado, el porcentaje de equilibrio
promedio fue de 51.2%. En el caso de Lipozyme RM IM, recién a las 12 h de reacción se observa un nivel de
1,3-DAG estable, del orden de 55.1%. En este caso, el equilibrio de la reacción de isomerización de DAG se
alcanza en un tiempo similar al equilibrio global del sistema (datos no mostrados).
El hecho de que se hayan obtenido velocidades de acil migración (relativas respecto a la velocidad de
formación de DAG totales), notablemente mayores con Lipozyme TL IM que con Lipozyme RM IM puede
ser explicado en términos de los soportes de inmovilización correspondientes. Esta última se encuentra
254
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inmovilizada sobre una resina de intercambio iónico, mientras que el gel de sílice constituye el material de
soporte para la primera. Si bien las resinas han sido reportadas como potenciales catalizadoras de la acil
migración (Xu et al. 1998), existe aún mayor consenso respecto al alto poder acelerador de este fenómeno
por parte del gel de sílice (Kodali et al. 1990, Goh et al. 1993, Du et al. 2005).
Para una concentración de 10% de enzima (m/msust.) en el medio, los resultados se presentan en la Figura 2.
Puede observarse que para el caso de Lipozyme TL IM, en una concentración de 10% (m/msust.), ya a los 45
minutos de comenzada la reacción ambos isómeros de DAG se encontrarían en equilibrio. Du et al. (2005)
estudiaron el efecto del contenido de agua de dicho catalizador comercial sobre la velocidad de acil
migración en DAG encontrando que éste no aceleraba dicha isomerización. Por lo tanto, el resultado
obtenido aquí al aumentar la concentración de enzima de 5 a 10% reafirma el concepto de la importancia del
efecto catalizador de la acil migración por parte del gel de sílice. En el caso del biocatalizador Lipozyme RM
IM utilizado a una concentración de 10%, probablemente entre las 6 y 12 h de reacción se equilibren las
concentraciones de los 1,3- y 1(3),2-DAG, alcanzando en dicha relación niveles comparables a los de
Lipozyme TL IM. En este caso, si bien la velocidad relativa de migración aumenta respecto a la
correspondiente a las muestras con la mitad de enzima, el efecto no resulta tan importante.
90
TL IM
RM IM
80
70
% 1,3-DAG
60
50
40
30
20
10
0
0.75
3
6
12
24
48
t (h)
Figura 2: Evolución en el tiempo del porcentaje (mol/mol) de 1,3-DAG respecto al total de DAG
(SO:FHSO: 50:50 (m/m), 10% (m/msust.) de enzima y 70ºC).
Efecto de la relación de sustratos
Se analizaron las consecuencias de un cambio en la relación de sustratos de la mezcla de reacción sobre la
acil migración en reacciones llevadas a cabo con Lipozyme RM IM y una concentración de enzima de 10%.
Se analizaron muestras con relaciones SO:FHSO de 50:50 y 80:20, para las cuales los contenidos de ácidos
grasos insaturados se ubicaron en 42.1 y 65.3% (mol/mol). En la Figura 3 se presentan los resultados
obtenidos.
255
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
90
50:50
80:20
80
70
% 1,3-DAG
60
50
40
30
20
10
0
0.75
3
6
12
24
48
t (h)
Figura 3: Evolución en el tiempo del porcentaje (mol/mol) de 1,3-DAG respecto al total de DAG (10% de
Lipozyme RM IM, SO:FHSO: 50:50 y 80:20 (m/m), 70ºC).
Para ambas relaciones de sustrato el equilibrio entre los isómeros de DAG ya se habría alcanzado para las 12
h de reacción, aunque en el caso de la relación 50:50 el porcentaje de 1,3-DAG se estabiliza en valores
menores (P < 0.03).
Mattson y Volpenhein (1962) estudiaron la isomerización de diferentes tipos de monoglicéridos (2monooleína, 2-monopalmitina y 2-monoestearina) y demostraron que el grado de insaturación y el largo de
cadena del residuo acilo influyen sobre la velocidad de isomerización, así como también sobre la relación de
equilibrio, siendo considerablemente mayor el efecto del grado de insaturación que el de la longitud de la
cadena carbonada. Los resultados obtenidos aquí con respecto al nivel de insaturación concuerdan con dicha
evidencia.
Efecto del agregado de solvente y de la temperatura
Por último, se propuso evaluar el efecto del agregado de hexano al medio de reacción sobre la cinética de la
acil migración. Se analizaron los productos de la interesterificación a 55 y 60ºC de mezclas con una relación
másica SO:FHSO de 50:50 tratadas con 5% (m/msust.) de Lipozyme RM IM y el agregado de 3 mL/gsust. de
hexano. En la Figura 4 se pueden observar los resultados obtenidos.
90
55ºC, con hexano
60ºC, con hexano
70ºC, sin hexano
80
70
% 1,3-DAG
60
50
40
30
20
10
0
0.75
3
12
24
48
t (h)
Figura 4: Evolución en el tiempo del porcentaje (mol/mol) de 1,3-DAG respecto al total de DAG (5%
(m/msust.) de Lipozyme RM IM, SO:FHSO: 50:50 (m/m), en ausencia y presencia de hexano, a diferentes
temperaturas).
256
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Analizando los resultados obtenidos para las muestras interesterificadas en presencia de hexano a 55 y 60ºC
es posible apreciar que existiría un aumento en la velocidad relativa de isomerización con la temperatura, así
como también se observa una leve disminución en el tiempo al cual se alcanza el equilibrio de isomerización.
Como se mencionó anteriormente, la acil migración consiste en un proceso termodinámico, el cual se ve
influenciado de manera significativa por la temperatura. Los resultados obtenidos aquí concuerdan con dicha
afirmación.
Por otro lado, si se planteara realizar un análisis del efecto del hexano sobre el fenómeno en estudio, la
comparación debería realizarse necesariamente sobre muestras interesterificadas a igual temperatura, de
manera de anular el comprobado efecto que la misma posee. No fue posible realizar experiencias
manteniendo dicha condición de reacción debido a limitaciones propias del sistema. Por un lado, debido al
elevado punto de fusión del FHSO utilizado, la mínima temperatura a la cual fue posible realizar las
reacciones sin el agregado de solvente fue precisamente 70ºC, el punto de fusión de la misma. De esta forma
es posible asegurar que la totalidad de las especies en solución se encuentran en estado líquido, evitando
potenciales problemas de limitaciones difusionales en el sistema. Por otro lado, la mayor temperatura
utilizada en los sistemas con hexano fue de 60ºC, tomándose un margen considerado aceptable por debajo
del punto de ebullición de dicho solvente (69ºC). Si los porcentajes de 1,3-DAG obtenidos en ausencia de
hexano hubieran sido menores que los correspondientes a los sistemas con hexano a ambas temperaturas, se
podría haber concluido que la presencia de este solvente disminuye la velocidad de isomerización. Sin
embargo, los resultados obtenidos no permitirían evaluar de manera independiente el efecto del mismo.
CONCLUSIONES
Se realizó una comparación entre las predicciones teóricas de los ácidos grasos en la posición sn-2 según
diferentes teorías de distribución de los residuos acilo y los obtenidos experimentalmente luego del proceso
de interesterificación enzimática de SO y FHSO. La relación U/S en la posición sn-2 varía
considerablemente con el mecanismo de redistribución de los residuos acilo. Los resultados reflejan que la
relación U2/S2 no se mantiene luego de la reacción enzimática, lo que evidencia la ocurrencia en simultáneo a
la misma de una reacción química, la acil migración. También fue posible demostrar que los productos
obtenidos en distintas condiciones (relación de sustratos, tipo de biocatalizador, concentración de
biocatalizador, y fundamentalmente tiempo de reacción) evidencian distintos cambios en la composición
acídica sn-2 de sus glicéridos.
A partir de los resultados obtenidos del estudio del mecanismo de acil migración en los diglicéridos
generados mediante la interesterificación enzimática se puede concluir que la enzima Lipozyme TL IM
posee un efecto acelerador de dicho fenómeno, el cual se cree se correlaciona con el material sobre el que se
inmovilizó la lipasa (gel de sílice). Por otro lado, un aumento en la concentración de enzima y una mayor
proporción de ácidos grasos insaturados en las mezclas reactivas también promovieron la acil migración. Por
el contrario, el agregado de hexano en el medio con la consecuente disminución de la temperatura de
reacción, disminuyeron el desarrollo de este fenómeno indeseable. En cuanto a la temperatura, su efecto se
evaluó sobre muestras interesterificadas en presencia de hexano, y los resultados permitieron corroborar el
importante efecto que posee sobre la cinética de la reacción en cuestión, mostrando una correlación positiva
con la velocidad de acil migración.
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AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
(CONICET), la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT), y la Universidad
Nacional del Sur (UNS) de Argentina.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Marine microalgae as a source of lipids: a comparison between autotrophic and mixotrophic
cultivation
Paludo M.P., Menestrino B.C., Peçanha S.G., Burkert, C. A. V.
Bioprocess Engineering Laboratory. Universidade Federal do Rio Grande (FURG), Rio Grande do Sul,
Brasil.
michepaludo@gmail.com
Resumen: Las microalgas han sido estudiadas en la investigación biotecnológica debido a su importancia
nutricional, económica y ecológica. Los lípidos son componentes importantes de las microalgas pueden
variar de 1-70% (de materia seca). El objetivo de este estudio fue evaluar los parámetros de crecimiento y el
contenido de lípidos de microalgas marinas Dunaliella tertiolecta y Tetraselmis suecica en un medio que
contiene glicerol como fuente de carbono adicional. La máxima concentración de biomasa y la productividad
en el cultivo autótrofa de D. tertiolecta fueron 0.25±0.04 g L-1 y 0.021±0.002 g L-1d-1, mientras que en el
cultivo mixotrófico los valores obtenidos fueron de 0.29±0.01 g L-1 y 0.028±0.001 g L-1d-1. En el cultivo
autotrófico de T. suecica, la concentración máxima de biomasa y la productividad fueron 0.43±0.02 g L-1 y
0.043±0.002 g L-1d-1, respectivamente, mientras que en el cultivo mixotrófico se alcanzó 0.41±0.02 g L -1 y
0.06±0.001 g L-1d-1. Además, se observó un aumento en el contenido de lípidos de las microalgas D.
tertiolecta y T. suecica del cultivo mixótrofo con respecto a aquellas del cultivo autótrofo (desde 22.70% a
34.91% para D. tertiolecta y desde 8.84% a 21.12% para T. suecica).
Palabras claves: Biomasa, Glicerol, Microalgas, Lipídos.
Abstract: Microalgae have been studied in biotechnological research due to their nutritional, economic and
ecological importance. The lipids are important constituents of microalgae contents and they may vary from
1-70% (of dry matter). T he aim of this study was to evaluate the growth parameters and lipid content of
marine microalgae Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis suecica in a medium containing glycerol as an
additional carbon source. Maximum biomass concentration and productivity in the autotrophic cultivation of
D. tertiolecta were 0.25±0.04 g L-1 and 0.021±0.002 g L-1d-1, while in the mixotrophic cultivation the values
obtained were 0.29±0.01 g L-1 and 0.028±0.001 g L-1d-1. In the autotrophic cultivation of T. suecica,
maximum biomass concentration and productivity were 0.43±0.02 g L-1 and 0.043±0.002 g L-1d-1,
respectively, while in the mixotrophic cultivation it was reached 0.41±0.02 g L-1 and 0.06±0.001 g L-1d-1. In
addition, an increase in lipid content was observed for both microalgae from the mixotrophic cultivation
compared to those from the autotrophic cultivation (from 22.70% to 34.91% for D. tertiolecta and from
8.84% to 21.12% for T. suecica).
Keywords: Biomass, Glycerol, Microalgae, Lipid.
INTRODUCTION
Microalgae are prokaryotic or eukaryotic photosynthetic microorganisms that can grow rapidly and live in
harsh conditions due to their unicellular or simple multicellular structure. Microalgae are present in all
existing earth ecosystems, not just aquatic but also terrestrial, representing a big variety of species living in a
wide range of environmental conditions. It is estimated that more than 50.000 species exist, but only a
limited number, of around 30.000, have been studied and analyzed (Richmond 2004).
Microalgae have been studied in biotechnological research due to their nutritional, economic and ecological
importance (Costa et al. 2006). In this sense, microalgae cultivations have been developed aiming at the
biomass production not only for use in the food elaboration but also for the obtainment of natural compounds
with high value in the world market. Among the main extracted substances, or with potential of commercial
exploration, can be related carotenoids, phycobilins, polysaccharides, vitamins, sterols and lipids (Derner et
al. 2006). Another important application of microalgae is the production of different types of renewable
biofuels. These include methane produced by anaerobic digestion of the algal biomass; biodiesel derived
from microalgal oil; and photobiologically produced biohydrogen (Chisti 2007).
The lipid content of the microalgae can range from 1-70%, reaching up to 90% of the dry weight, when
subjected to certain cultivation conditions (Spolaore et al. 2006). The fatty acids in microalgae correspond to
259
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
higher lipid fraction and in some species the polyunsaturated represent between 25 and 60% of total lipids.
Compared to higher plants, microalgae have higher photosynthetic efficiency and can be grown in saline
environments (Radmann and Costa 2008). The major polyunsaturated fatty acids (PUFAs) components of
microalgal biomass are linoleic acid, linolenic acid, arachidonic, eicosapentaenoic acid (EPA) and
docosahexaenoic acid (DHA) (Alonso and Maroto 2000). In addition to PUFA 's, microalgae also synthesize
saturated fatty acids, raw material for the production of biofuels, especially biodiesel (Khan et al. 2009).
Some authors have reported an increase in dry weight and increased production of lipids by the microalga
Phaeodactylum tricornutum using as carbon sources rye, wheat or potato extract (Fábregas et al. 1997),
glucose and glycerol (Garcia et al. 2000). Garcia et al. (2000) added glycerol to the medium during the
cultivation of this microalga and had a higher biomass production and a percentage of lipids about three
times higher than in the autotrophic culture. Factors such as light intensity, temperature and nutrients present
in the culture medium may influence the synthesis of these compounds (Radmann and Costa 2008). Fatty
acids from microalgae may be used as food, drugs or transformed into biofuels (Derner et al. 2006, Amaro et
al. 2012).
The cultivation of microalgae can be divided into four types: autotrophic, heterotrophic, mixotrophic and
photoheterotrophic cultivation. The difference between each of the cultivation is based on the carbon source
used and on the use or non-use of light energy. In autotrophic cultivation there is the exclusive use of light as
an energy source for CO2 fixation and release of O2. Already mixotrophic cultivation uses both light and
organic compounds as a source of energy and carbon (Chen et al. 2011). Thus, the mixotrophic cultivation is
an alternative for production of biomass and lipids when compared to the autotrophic cultivation. The growth
rates and increased biomass concentration apparently are linked to synergistic effect of light and organic
substrate (Garcia et al. 2005).
Among the various organic substrates used in mixotrophic cultivation of microalgae are glucose (Muliterno
et al. 2005), molasses (Andrade and Costa 2007) and glycerol (Garcia et al. 2000, Chi et al. 2007, Liang et
al. 2010). Glycerol has the potential to be used as a carbon source for the cultivation of microorganisms,
since it is a byproduct of the biodiesel industry, resulting in the amount of approximately 0.3 kg for each
gallon of biodiesel produced (Thompson and He 2006). However, glycerol obtained presents a low
commercial value due to the presence of impurities, such as soaps, methanol, free fatty acids, esters, Ca, Mg,
P, S, among other elements (Santibáñez et al. 2011, Thompson and He 2006, Liang et al. 2010). In this way,
the presence of such impurities limits the application of glycerol in several processes, increases the cost of
purification and restricts their use in chemical and pharmaceutical industries (Amaral et al. 2009).
In view what has been reported it is observed that the microalgae have a high capacity production of lipids,
and may be favored by mixotrophic cultivation. The objective of the study was to evaluate the growth
parameters and lipid content of marine microalgae Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis suecica in medium
containing glycerol as an additional source of carbon.
MATERIALS AND METHODS
Strains
The marine microalgae used in the study were Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis suecica. Microalgae
were obtained from LABIOMAR (Universidade Federal da Bahia, Brasil).
Culture conditions
Microalgae were cultivated in photobioreactors type one-liter Erlenmeyer flask containing 900 ml Conway
medium (Walne 1966), salinity 28 psu (pratical salinity unit) temperature 24±1°C, illuminance of 3000 Lx,
constant stirring and integral photoperiod (24:0). The photobioreactors were arranged in an incubator with
photoperiod (Eletrolab, Brazil).
The Conway medium (Walne 1966) was prepared with natural sea water previously treated and sterile, with
addition of 1 mL of main solution and 0.1 mL of vitamins solution. Table 1 presents the composition and
preparation of the medium.
We evaluated two types of cultivation: autotrophic cultivation (Conway medium without glycerol); and
mixotrophic cultivation (Conway medium added glycerol 0.05M). In mixotrophic experiments, glycerol PA
was sterilized separately from culture medium in an autoclave at 121°C for 15 min.
The inoculum concentration corresponded to 10% of the culture medium used.
260
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Table 1: Composition and preparation of the medium Conway (Walne, 1966)
Main solution
Components
Amount (g L-1)
C10H14O8Na2.2H2O
45
H3BO3
33.60
NaNO3
100
MnCl2.4H2O
0.36
FeCl3.6H2O
1.30
NaH2PO4.2H2O
20
Dilute all components in 1 L of distilled water and sterilize at 121° C for 15 min.
Trace metals solution
ZnCl2
0.21
CoCl2.6H2O
0.20
(NH4)6Mo7O24.4H2O
0.09
CuSO4.5H2O
0.20
Dilute all components in 10 mL of distilled water. Take 1 mL of this solution and add to the main
solution, pre-sterilized. Discard the remaining 9 mL.
Vitamins solution
Vitamina B12
0.005
Vitamina B1
0.1
In an aseptic chamber, dilute the vitamins in 100 mL of distilled water, pre-sterilized.
Analytical determinations
Daily aliquots of the autotrophic and mixotrophic cultures were removed and centrifuged at 3640g for 10
min for analytical determinations in the supernatant (pH and glycerol concentration) and biomass (biomass
concentration). The cell concentration was estimated by absorbance at 680 nm (spectrophotometer
Biospectro SP-220, China), using a standard curve previously determined with dry biomass. The pH was
determined using a digital potentiometer (Marte MB-10, Brazil).
In mixotrophic cultivation, consumption of glycerol was accompanied from an enzymatic-colorimetric kit for
triacylglycerols (Labtest, Brazil). Samples of the supernatant (0.03 mL) were added to 3 mL of reagent and
maintained at 37°C for 10 min. The absorbance was measured at 505 nm using glycerol as the standard
(Rosa et al. 2010).
All experiments were conducted in triplicate. The results were submitted to analysis of variance (ANOVA)
and Tukey's test in order to verify significant differences regarding the presence or absence of glycerol in the
medium culture, at 95% confidence level (p ≤ 0.05).
Lipid content
At the end of autotrophic and mixotrophic cultivation, the supernatant was separated from biomass for the
determination of total lipids. The analysis was performed on dry biomass, which was centrifuged, washed
with distilled water and dried at 50°C to constant weight. The total lipid content was determined by Bligh
and Dyer (1959), using the amounts suggested by Manirakiza et al. (2001).
The determinations were performed in duplicate and the results were evaluated by Student's t test at 95%
confidence level (p ≤ 0.05) in order to verify the existence of significant differences between the lipid
content of the autotrophic and mixotrophic cultivation.
RESULTS AND DISCUSSION
Growth parameters
Figure 1 shows the growth curves of microalgae Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis suecica of
autotrophic and mixotrophic cultivation.
261
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
0,35
9,5
0,30
9,0
0,25
8,5
0,50
9,2
0,45
9,0
(c)
8,8
8,6
0,20
Biomass (g L-1)
0,35
8,0
pH
Biomass (g L-1)
0,40
0,15
7,5
0,10
7,0
0,05
6,5
8,4
0,30
8,2
0,25
8,0
0,20
7,8
0,15
7,6
0,10
7,4
0,05
0,00
6,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
7,2
0,00
12
7,0
0
1
2
3
Time (Days)
4
5
6
7
8
9
10
Time (Days)
0,35
(b)
pH
(a)
0,5
9
9
(d)
0,30
8
8
0,4
0,3
6
0,2
pH
Glycerol (g L-1)
6
0,15
Biomass (g L-1)
7
7
0,20
pH
Glycerol (g L-1)
Biomass (g L-1)
0,25
5
5
0,10
0,1
4
0,05
0,00
3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Time (Days)
4
0,0
3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Time (Days)
Figure 1: D. tertiolecta (a) Autotrophic cultivation (b) Mixotrophic cultivation; T. suecica (c) Autotrophic
cultivation (d) Mixotrophic cultivation () Biomass (g L-1); (▪) pH; () Glycerol (g L-1)
The growth curves of Figure 1 shows an increase in maximum concentration of biomass of microalgae D.
tertiolecta in mixotrophic cultivation, reaching 0.29 g L-1 at 10th day, while the autotrophic cultivation was
0.25 g L-1 on day 12. The growth of microalgae T. suecica in autotrophic and mixotrophic cultivation did not
present a statistically significant difference, obtaining maximum biomass concentration of 0.43 g L -1 on the
9th day and 0.41g L-1, on day 6, respectively.
The consumption of glycerol by D. tertiolecta was 18.2% while T. suecica corresponded to 24.8%.
Table 2 shows a comparison of autotrophic and mixotrophic cultivation of microalgae D. tertiolecta and T.
suecica in relation to growth parameters evaluated.
Table 2: Mean values ± standard deviation for maximum biomass concentration, productivity and maximum
specific growth rate of microalgae D. tertiolecta and T. suecica and statistical analysis of the data
Parameters (mean
± standart
deviation)
Autotrophic cultivation
Mixotrophic cultivation
Dt
Ts
Dt
Ts
Xmáx (g L-1)
0.25 ± 0.04b
0.43 ± 0.02ª
0.29 ± 0.01ª
0.41±0.02a
Prod. (g L -1 dia -1)
0.021 ±0.002b
0.043±0.002b
0.028 ± 0.001ª
0.06±0.001a
µmáx (dia-1)
0.50 ± 0.01b
0.30±0.03b
0.56 ± 0.01ª
0.38±0.01a
Dt – Dunaliella tertiolecta; Ts – Tetraselmis suecica; Xmax – Maximum biomass concentration; P –
Productivity; μmax – Maximum specific growth rate.
*
Equal small letters indicate that there is no meaning difference between lines, at 95% of confidence
(p<0.05).
Note that the mixotrophic cultivation of D. tertiolecta and T. suecica also contributed in increasing
productivity and maximum specific growth rate. Thus, it was observed that the addition of glycerol to the
culture medium contributed positively in the increment of the parameters studied, with emphasis on
microalgae T. suecica.
According to Garcia et al. (2000) increased biomass possibly associated with this synergistic effect of light
and organic substrate (glycerol).
Studies reporting the mixotrophic cultivation D. tertiolecta and T. suecica are not found in the literature.
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IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Lipid content
Table 3 presents the lipid content of microalgae D. tertiolecta and T. suecica cultivated in autotrophic and
mixotrophic conditions.
Table 3: Lipid content of microalgae D. tertiolecta e T. suecica in autotrophic and mixotrophic cultivation
Microalgae
Lipid content (%)
Autotrophic cultivation
Mixotrophic cultivation
D. tertiolecta
22.70b
34.91a
b
T. suecica
8.84
21.12a
*
Equal small letters indicate that there is no meaning difference between lines, at 95% of confidence
(p<0.05).
According to Table 3, the mixotrophic cultivation contributed in increasing the lipid content of microalgae
D. tertiolecta and T. suecica, denoting difference statistically significant (p <0.05) compared to autotrophic
cultivation. Note that the increment of lipids of T. suecica was approximately 2 times higher in mixotrophic
cultivation.
The increase in the lipid content of microalgae D. tertiolecta and T. suecica in mixotrophic cultivation may
be related to the presence of glycerol in the culture medium. According to Garcia et al. (2000), under
mixotrophy conditions, some microalgae may increase their growth rate, in addition to producing a higher
concentration of fatty acids.
Another important contributing factor in the increase of the lipid content of microalgae is limiting the
availability of nitrogen. This is explained by the fact that lack of nitrogen metabolism directs the microalgal
before directed to cell multiplication, for the production of reserve components such as saturated fatty acids
in order to prepare the cell for a period of deprivation (Alonso and Maroto 2000).
The values obtained are promising when compared to those reported in the literature. In the work of Gouveia
and Oliveira (2009) the lipid content obtained for microalgae D. tertiolecta was 16.7%, thus demonstrating
the results of this study are superior (34.91%).
CONCLUSION
The maximum biomass concentration of microalgae T. suecica did not show difference between autotrophic
and mixotrófico cultivation. However it was observed that the organic substrate - glycerol - acted positively
on productivity and maximum specific growth rate. Mixotrophic cultivation of D. tertiolecta promoted the
increase in all growth parameters evaluated (maximum biomass concentration, productivity and maximum
specific growth rate).
The lipid content of microalgae D. tertiolecta and T. suecica increased in mixotrophic cultivation, obtaining
34.91% and 21.12%, respectively.
The results showed that the mixotrophic cultivation of microalgae D. tertiolecta and T. suecica using a
glycerol-based medium presented important advantages in relation to the autrotrophic cultivation, in order to
obtain microalgae biomass as an alternative source of lipids. In addition, there was the potential use of
glycerol as organic substrate in the cultivation of microalgae, showing the possibility of exploring a
byproduct of biodiesel as a way to increase the production of lipids.
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Ser. pag 53.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank the Brazilian funding agency CAPES, CNPq and PDE/FURG.
264
IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos - Córdoba, Argentina 14 a 16 de Noviembre de 2012
Crecimiento celular y producción de carotenoides de Haematococcus pluvialis en condiciones
autotróficas y mixotróficas de cultivo en diferentes pHs
Reis D.F., Machado Jr. F.R.S., Oliveira K.S.D., Trevisol T.C., Remedi R.D.,
Burkert C.A.V., Burkert J.F.M.
FURG – Universidade Federal de Rio Grande. Escola de Química e Alimentos. Laboratório de Engenharia
de Bioprocessos, Brasil.
daiane.felixreis@gmail.com
Resumen: De los pigmentos existentes en micro algas, los carotenoides han sido los más explorados
comercialmente y se destacan por actuar como colorantes y por tener funciones biológicas importantes, como
la actividad antioxidante. La micro alga Haematococcus pluvialis se destaca por ser una fuente natural de
astaxantina, un carotenoide que se caracteriza por presentar tonalidad rojo-anaranjado y ser responsable por
actuar como agente nutricional y de coloración en alimentos, en la acuicultura y en la avicultura. El objetivo
de este trabajo fue evaluar la influencia del crecimiento celular y de la bioproducción de carotenoides totales
en los cultivos de H. pluvialis utilizando medio autotrófico BG-11 y medio mixotrófico BBM con acetato de
sodio en diferentes pHs (6, 7 y 8). El medio BBM y acetato de sodio presentó concentración celular máxima
de 1,29+0,07 g.L-1 en pH inicial de 7 y el medio BG-11, 0,86+0,24 g.L-1 en pH 6, no presentando diferencia
significativa entre ellos (p<0,05). Analizando la bioproducción de carotenoides, el medio BBM y acetato de
sodio se destacó por presentar un valor significativamente mayor (5653,56+235,27 µg.g-1) en pH 7
comparado con el medio BG-11, que obtuvo 3