Zanussi | DR 50/2 - DR 56/2 | Multiplex szérum-citokinszint vizsgálatok jelentősége különböző

Multiplex szérum-citokinszint vizsgálatok
jelentősége különböző kórképekben
Doktori értekezés
Dr. Bekő Gabriella
Semmelweis Egyetem
Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezetők:
Hivatalos bírálók:
Dr. Blázovics Anna igazgató, egyetemi docens
Prof. Dr. Szalay Ferenc egyetemi tanár
Dr. Szőllősiné Dr. Varga Ilona egyetemi docens
Dr. Vannay Ádám Ph.D. MTA tudományos
munkatárs
Szigorlati bizottság elnöke:
Szigorlati bizottság tagjai:
Prof. Dr. Szabó Antal egyetemi tanár
Dr. Lugasi Andrea Ph.D. főigazgató
Dr. Kenesei Éva Ph.D. tudományos
főmunkatárs
Budapest
2009
Tartalomjegyzék
Tartalomjegyzék .......................................................................................................... 2
Rövidítésjegyzék.......................................................................................................... 4
1 Előszó ...................................................................................................................... 6
2 Bevezetés................................................................................................................. 8
2.1 A citokinek ........................................................................................................... 8
2.2 Citokinszint-mérési módszerek.............................................................................17
3 Célkitűzések............................................................................................................21
4 Betegek, módszerek és anyagok ..............................................................................24
4.1 Mérőmódszereket összehasonlító vizsgálatokban résztvevők................................24
4.2 Klinikai vizsgálatokban résztvevő személyek .......................................................24
4.2.1 Perinatális vizsgálatok .......................................................................................24
4.2.1.1 Aszfixiás újszülöttek ......................................................................................24
4.2.1.2 Kissúlyú koraszülöttek ...................................................................................25
4.2.1.3 Perinatális szepszisben szenvedő koraszülöttek ..............................................26
4.2.2 Citokinek májbetegségekben. ............................................................................26
4.2.2.1 Vörösbort fogyasztó önkéntesek .....................................................................26
4.2.2.2 Krónikus májbetegségben szenvedők..............................................................27
4.2.2.3 Wilson-kóros betegek.....................................................................................27
4.2.3 Citokinek egyéb belgyógyászati kórképekben ...................................................28
4.2.3.1 Prosztatakarcinóma és citokinprofil ................................................................28
4.2.3.2 Vesetranszplantációt követő állapot................................................................28
4.3 Módszerek ...........................................................................................................31
4.3.1 Citokinszint-mérési eljárások ............................................................................31
4.3.1.1 Citokinszintek mérése Bioplex rendszerrel .....................................................31
4.3.1.2 Citokinszintek mérése Biochip rendszerrel .....................................................33
4.3.1.3 Egyedi citokinszint-mérések...........................................................................35
4.3.1.3.1 IL-6-szint mérése Roche Modular E170 analizátorral .................................35
4.3.1.3.2 IL-6-szint mérése R&D ELISA módszerrel .................................................36
4.3.1.3.3 TNFα-szint mérése R&D Elisa módszerrel ..................................................37
4.3.2 Egyéb vizsgálatok .............................................................................................37
4.3.2.1 Fémion-meghatározások.................................................................................37
4.3.2.2 Antioxidáns aktivitás meghatározási módszerek .............................................38
4.3.2.3 Transzmetilálás vizsgálata ..............................................................................39
4.3.2.4 Zn-protoporfirin és protoporfirin meghatározás ..............................................39
4.4 A vizsgálatokhoz felhasznált vegyszerek és kitek .................................................40
4.5 Statisztikai elemzés ..............................................................................................40
5 Eredmények ............................................................................................................41
5.1 Összehasonlító vizsgálatok...................................................................................41
5.2 Klinikai vizsgálatok .............................................................................................44
5.2.1 Citokinszintek perinatális jelentősége ................................................................44
5.2.1.1 Aszfixia, teljes testhűtés és citokinkinetika .....................................................44
5.2.1.2
Endogén kortizol hatása a szisztémás citokinszintekre koraszülött és
újszülöttkorban
50
5.2.1.3 Perinatális szepszis és citokinprofil.................................................................59
5.2.2 Citokinek májbetegségekben. A fémion-koncentrációk összefüggése a szisztémás
citokinszintekkel .........................................................................................................62
2
5.2.2.1 A vörösborfogyasztás hatása a citokinszintekre .............................................62
5.2.2.2 Citokinprofil és májcirrhosis...........................................................................67
5.2.2.3 Wilson-kór és citokinek..................................................................................68
5.2.3 Citokinek egyéb belgyógyászati kórképekben ...................................................72
5.2.3.1 Vesetranszplantáció, malnutríció és gyulladás ................................................75
6 Megbeszélés............................................................................................................82
6.1 Összehasonlító vizsgálatok...................................................................................82
6.2 Citokin-profil vizsgálata fiziológiás és patológiás körülmények között.................83
6.2.1 Citokinszintek perinatális jelentősége ................................................................83
6.2.2 Citokinek májbetegségekben. A fémion-koncentrációk összefüggése a szisztémás
citokinszintekkel .........................................................................................................90
6.2.3 Citokinek egyéb belgyógyászati kórképekben ...................................................97
Tézisek .....................................................................................................................103
Összefoglalás ............................................................................................................104
Summary ..................................................................................................................105
Irodalomjegyzék .......................................................................................................106
A dolgozathoz kapcsolódó közlemények...................................................................123
Disszertációtól független közlemények .....................................................................127
Köszönetnyilvánítás..................................................................................................130
3
Rövidítésjegyzék
ALAT
alanin-aminotranszferáz
ALP
alkalikus foszfatáz
ASAT
aszpartát-aminotranszferáz
APC
antigénprezentáló sejt
BMI
testtömeg-index
BV
baseline value
CD4
a segítő T-sejtek (Th) felszínén kifejeződő
koreceptor molekula
CD8
a citotoxikus (Tc) lymphocyták felszínén
kifejeződő molekula
CRP
C-reaktív protein
EGF
epidermal growth factor
epidermális növekedési faktor
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
enzimhez kötött szendvics immunoassay
EV
end value
fPSA
free (szabad) PSA
FVS
fehérvérsejtszám
eGFR
estimated (becsült) glomeruláris filtrációs
ráta
GSH-Pox
glutation-peroxidáz
HCV
hepatitis C vírus
HDON
hidrogén-donor aktivitás
ICP-OES
inductively coupled plasma optical emission
spectrometry
induktíven
csatolt
plasma
emissziós
spektrometria
IFNγ
interferon gamma
IL
interleukin
IL-1α
interleukin-1 alfa
IL-1β
interleukin-1 béta
IL-2
interleukin-2
IL-4
interleukin-4
IL-6
interleukin-6
4
IL-8
interleukin-8
IL-10
interleukin-10
IL-12
interleukin-12
IQR
interkvartilis tartomány
LAK-sejt
Limfokin Aktivált Killer-sejt
LPS
lipopoliszacharid –
nyerhető endotoxin
MCC
major komorbid állapot
MCP
monocita kationos protein
MHC
major hisztokompatibilitási komplex
MICS
malnutríció-gyulladásos komplex szindróma
MIS
Malnutrition
Inflammation
malnutríció-gyulladásos pontérték
MCP-1
monocyte chemoattractant protein-1
NK- sejt
Natural Killer-sejt „természetes ölő” sejt
OLD
over the level of detection
PBC
primer biliáris cirrhosis
PCT
procalcitonin
PSA
prosztata specifikus antigén
REV
relatív hatás értékek
RFU
relatív fluoreszcens egység
RLU
relative light unit
SEM
Structural Equation Model
strukturális egyeneletek modellezese
SOD
szuperoxid-dizmutáz
Th
T helper
TNFα
tumor nekrózis faktor alfa
TSC
totál scavanger kapacitás
baktériumok
falából
Score
VEGF
Vascular endothelial growth factor
vaszkuláris endoteliális növekedési faktor
A dolgozatban található egyéb rövidítéseket a jobb érthetőség kedvéért a
szövegkörnyezetben megmagyaráztam.
A dolgozat megírásánál a IUPAC nómenklatúrát alkalmaztam. Az orvosi kifejezéseket
az orvosi helyesírási szótár szabályai szerint írtam.
5
1
Előszó
A Semmelweis Egyetem Központi Laboratóriumának vezetőjeként számos olyan
kérdéssel, megoldandó problémával találkozom, melynek kapcsán a rendszerszintű
megközelítés segít, azaz, amikor a klinikus részéről feltett kérdésre a klinikai adatok,
laboratóriumi vizsgálatok és egyéb diagnosztikus eljárások tükrében összességében kell
választ adni. Tapasztalataim szerint különösen akkor van ennek a szemléletnek nagy
jelentősége, amikor valamilyen immunmediált (kór)folyamat megítéléséről, a terápia
hatásáról, esetleg a progresszióról kell nyilatkozni. Az immunrendszert érintő
zavarokban ugyanis egyszerre számos komponens – fehérvérsejtek, citokinek, akut fázis
fehérjék – vesz részt, melyek egymás hatásait erősítik, vagy éppen gyengítik.
A méréstechnika körülményessége, a mintaigény és nem utolsósorban a
vizsgálatok ára miatt eddig egy-egy betegségben csak néhány kiragadott citokin vagy
más gyulladásos analit szintjét tudtuk monitorozni, ezek komplexitását nem lehetett
leírni. Ezért tartom az utóbbi évek egyik legnagyobb technikai vívmányának, hogy
egyazon mintából egyidejűleg számos gyulladásos válaszban szerepet játszó faktor
szintje vizsgálható és meghatározható. A ma már Magyarországon is rendelkezésre álló
és elérhető mérési rendszerek segítségével minden korábbinál pontosabb képet
kaphatunk az egyes kórfolyamatokban a gyulladásos válasz milyenségéről.
Ph.D. munkám célja egyrészt az volt, hogy különböző módszerekkel kapott
citokinszinteket összehasonlítsam, másrészt, hogy különböző klinikai állapotokban
vizsgáljam a citokinszintek kinetikáját, az egészséges referenciacsoporttól való eltérését.
Mivel a szisztémás gyulladás intenzitását és a citokinszinteket a szervezetben zajló
szabadgyökös reakciók, illetve a szabadgyökös reakciók intenzitását meghatározó
fémion-szintek alapvetően befolyásolják, vizsgálataim egy részében kapcsolatot
kerestem a citokinszintek, a szervezet antioxidáns védelme és a szérum / szöveti
fémionok koncentrációi között is.
Kutatómunkám
kórfolyamatokban
kapcsán
(perinatális
a
citokinszinteket
aszfixia,
veleszületett
különböző
szepszis,
perinatális
koraszülöttség);
májbetegségekben (alkoholos májkárosodás, Wilson-kór, különböző cirrhosis-típusok),
prosztatakarcinómában és vesetranszplantációt követően mértem. Számos esetben
munkatársaimmal együtt szembesültem azzal, hogy a jelenleg széles körben alkalmazott
statisztikai eljárások nem alkalmasak a citokinszintek összefoglaló módon való
6
jellemzésére, kinetikájuk leírására, ezért erőfeszítéseket tettünk új, a citokinszintek
komplex értelmezését lehetővé tevő statisztikai modellek kidolgozására.
Vizsgálati
módszereink
–
multiplex
citokinszint-mérés,
fémion-profil
meghatározás, szabadgyökös reakciók vizsgálata – részletekben csak néhány kiemelt
magyar laboratóriumban érhetők el. Ennyire összetett rendszerként pedig nemcsak
Magyarországon, de világszerte sem alkalmazták még ezeket klinikai kérdések
megválaszolására. Az általunk használt technikák a rutinlaboratóriumi diagnosztika
számára komplexitásukban jelenleg nem elérhetőek, illetve nagy valószínűséggel a
közeljövőben sem kerülnek bevezetésre, mivel igen költségigényes meghatározásokról
van szó. Ezért sok klinikai adatra van szükség a diagnosztikus relevancia
meghatározásához. Meggyőződésem, hogy az adott technikai színvonal mellett a
klinikai adatgyűjtés az a pont, ami meghatározza, hogy később milyen irányba érdemes
a klinikai laboratóriumi vizsgálatokat fejleszteni.
Bízom benne, hogy Ph.D. kutatómunkám során elért eredmények és a
megszerzett tapasztalat ezt a munkát is segíteni fogja.
7
2
2.1
Bevezetés
A citokinek
Az immunrendszer sejtjei között a kommunikáció citokineken, kis, 8 -40 kDa
nagyságú fehérjemolekulákon keresztül valósul meg. A legtöbb citokint egészséges
körülmények között nem termelik a sejtek, csak speciális hatásokra, melyek
gyakorlatilag azonosak a „sejt stresszorokkal” (például UV fény,
hőhatás,
hiperozmolalitás, vagy az idegen felszín). A szintézis után a citokinek azonnal
kiválasztódnak a sejtből, ezáltal biztosítva a gyors hatás kialakulását [Cavaillo 2001].
A citokinek fokozzák vagy gátolják az immunkompetens sejtek aktiválását,
proliferációját és differenciálódását, ezáltal szabályozzák az immunfolyamatokat, az
immunválasz intenzitását, tartamát, az ellenanyagok szintézisét és további citokinek
termelését. Valamennyi immunsejt képes citokinek termelésére, illetve rendelkezik
citokin receptorokkal. Immunmoduláló hatásuk autokrin, parakrin, pleiotróp és ritkán
endokrin. Autokrin hatásuk révén maga a termelő sejt a célpont. Parakrin módon
közvetlen környezetükben található sejteket késztetik citokin termelésre. Az endokrin
hatás pedig távoli sejtcsoportok aktiválását is eredményezheti. Pleiotróp sajátságuk
következtében egyszerre sokféle hatást válthatnak ki a különböző targetsejteken.
Ugyanakkor redundásak is, mert többféle citokin képes azonos választ kiváltani. Ismert
a citokinek közötti szinergista és antagonista kölcsönhatás is. (1. ábra).
8
Indukáló stimulus
a citokint termelő sejt
Citokin
gén
Citokintermelő sejt
Citokin
Autokrin hatás
Receptor
Parakrin hatás
Signal
Génaktiváció
közeli sejt
Célsejt
keringés
Endokrin hatás
Biológiai
hatások
távol lévő sejt
1. ábra: A kiváltó stimulus hatására termelődő citokin (a) autokrin, parakrin és endokrin
hatásokkal (b) rendelkezik ( Berki Tímea Immunológiai Továbbképző 2008)
A citokineket biológiai tulajdonságaik alapján osztályozzák, mivel nincs olyan
aminosav-szekvencia vagy térbeli struktúra, mely mindegyikre egyaránt jellemző lenne.
A csoportosításra az egyik lehetőség a gyulladásra gyakorolt hatásuk. Bizonyos
citokinek egyértelműen fokozzák a gyulladást, ezeket proinflammatorikus citokineknek
[Dinarello 2000] nevezik, míg más citokinek ellensúlyozzák a proinflammatorikus
citokinek aktivitását, ezek az antiinflammatorikus citokinek [Opal és DePalo 2000]. A
kettő közötti határ sokszor nem egyértelmű [Cavaillo 2001].
Döntően proinflammatorikus hatású citokinek
Interleukin-1
Az IL-1 családot az IL-1α, IL-1β, és a hatásukat gátló IL-1 receptor antagonista
(IL-1ra) alkotja [Dinarello 1998]. Az IL-1α-t és az IL-1β-t (a továbbiakban: IL-1) a
mononukleáris sejtek termelik gyulladásos folyamatokban és baktériumok hatására.
Mindkét citokin 31000 Da molekulatömegű prekurzor molekulákból képződik; a
hatékony fehérjék molekulasúlya 17000 Da [Edelson és mtsai 1999].
9
A legtöbb IL-1α molekula a sejt citoszoljában marad, ahol valószínűleg az IL-1
termelődés autokrin szabályozásában van szerepe. A prekurzor a sejt felszínéhez kerül
és ott a membránnal asszociálódik. A membránkötött prekurzor biológiailag aktív, a
szomszédos sejtek parakrin szabályozásában játszhat szerepet.
Az ILα-val szemben nagy mennyiségű IL-1β szecernálódik az extracelluláris
térbe és kerül a keringésbe. Az IL-1β prekurzorát az intracellulárisan elhelyezkedő
interleukin-1β konvertáló enzim (ICE) alakítja aktív fehérjévé [Tocci 1997].
Az IL-1alfát és bétát (továbbiakban IL-1) kétféle sejtfelszíni receptor köti. A 80
kDa méretű, I. típusú receptor a legtöbb sejten megtalálható, az IL-1 hatásának
transzdukciójában tölt be fontos szerepet. A 68 kDa-os, II. típusú receptor elsősorban
neutrofil granulociták, monociták, csontvelői sejtek és B-limfociták felszínén található.
Leírtak emellett egy, a receptor működéséhez szükséges fehérjét, az IL-1 receptor
akcesszor fehérjét is (IL-1R-AcP) [Dayer 2002]. A receptorok és az akcesszor fehérje
extracelluláris részei az immunglobulin-családba tartoznak, három IgG szerű doménből
állnak, az IL-1 kötő helyeik hasonlóak.
Az IL-1 stimulálja a T- és a B-limfocitákat. Az IL-1 a TNFα-val szinergista
módon hatva fokozza a foszfolipáz A2, az iNOS aktivitását, az endoteliális adhéziós
molekulák expresszióját és a kemokin szintézisét. Ennek eredménye vazoaktív és
gyulladásos mediátorok termelődése. [Dunn 2001]
Interleukin-2
Az IL-2 egy 14 – 17 kD méretű glikoprotein, térszerkezeteként négy alfa-hélixet
tartalmazó globuláris fehérje [Abbas .2003]
Az IL-2 a T-sejt mediálta immunválasz indukciójához és regulációjához
szükséges citokin. Az IL-2-t antigén-aktivált T sejtek – elsősorban CD4+, kisebb
arányban CD8+ sejtek – termelik. Autokrin módon fokozza a T-sejt proliferációt és
potencírozza az antigén-aktivált T sejtek apoptózisát. Ezen túl egyéb immunsejtek
proliferációját és differenciációját is elősegíti. Az NK- sejtek növekedését serkenti,
fokozza citolitikus hatásukat. A B-sejtek esetében növekedési faktorként hat, illetve az
antitest-szintézist stimulálja. Az IL-2 központi szerepet játszik az antigén-aktivált CD4+
sejtek apoptózisában akkor, ha az immunválasz perzisztál és a T sejtek egyre nagyobb
IL-2 szinteknek vannak kitéve. [Thornton 1998]
10
Interleukin-6
Az IL-6-ot monociták, makrofágok és endotélsejtek termelik. Sokáig
proinflammatorikus citokinnek tekintették, mely LPS hatására a TNFα-val és az IL-1gyel együtt aktiválódik [Luheshi 1998].
Az IL-6 hatásait az egyetlen transzmembrán fehérjéből álló IL-6 receptoron
keresztül fejti ki. A citokin hatására a receptor egy másik transzmembrán receptort, a gp
130-at homodimerizálja és ez indítja el a szignál-transzdukciót. Az IL-6 receptor Tsejteken, aktivált B-sejteken, valamint perifériás monocitákon és makrofágokon
található meg. Az IL-6-nak van szolubilis formája is, mely a membránreceptor
extracelluláris doménjéből áll. A citokin a gp 130-at még a szolubilis receptoron át is
képes aktiválni, még akkor is, ha a sejtek felszínén nincs is transzmembrán receptor
[Lorenz, 2002].
Az IL-6 csökkenti a TNFα és az IL-1 termelődését. Ugyancsak csökkenti egyéb,
proinflammatorikus hatású fehérjék (GM-CSF, IFNγ) szintézisét, viszont nem
befolyásolja más antiinflammatorikus citokinek, mint az IL-10 és a transforming growth
factor-β
(TGF-
β)
termelődését
[Romagnoli,
2001].
Az
IL-6
fokozza
az
antiinflammatorikus IL-1ra és a solubilis TNFα receptorok elválasztását. A citokin
limfoid és nem-limfoid sejtekben is képződik és befolyásolja T és B-sejtek
differenciálódását és proliferációját. Emellett az IL-6-nak igen sokrétűek a hatásai, részt
vesz az endokrin és a metabolikus folyamatok szabályozásában is.
Az IL-6-nak pro- és antiinflammatorikus tulajdonsága is van, emiatt besorolása
is változó. Az esetek egy részében pro-, másik részében antiinflammatorikus hatású
citokinként írják le. Hatásait az IL-6 receptoron keresztül fejti ki, ami T-sejteken,
aktivált B-sejteken, valamint perifériás monocitákon és makrofágokon van jelen
[Luheshi, 1998].
Interleukin-8
A 8 kD méretű IL-8 kemokint a makrofágok és más sejttípusok, így epiteliáls
sejtek termelik. [Utgaard és mtsai 1998, Wolff és mtsai 1998] Hatását G-protein mediált
módon, a CXCR1 és CXCR2 receptorokon keresztül fejti ki.
A kemokin kemoattraktáns, illetve hatékony angiogenetikus tulajdonságokkal
rendelkezik. Elsődleges hatásaként a célsejtekben, például a neutrofil granulocitákban
kemotaxist idéz elő, IL-8 hatására ezek a sejtek aktiválódnak, bioaktív anyagok
11
szabadulnak fel belőlük, megindul a légzési burst. Fagocitózist indukál, a fagocitált
antigén hatására toll-like receptor képződés kezdődik. A neutrofil granulociták mellett
számos egyéb sejt is reagál az IL-8 hatásaira, így az endotél sejtek, makrofágok,
hízósejtek, keratinociták. [Kőhidai 1998]
Interleukin-12
Az IL-12 teremti meg a kapcsolatot a veleszületett és az adaptív immunitás
között. A veleszületett immunitás alapvető mediátora, aktiválja a sejt közvetített szerzett
immunitást. Az IL-12-t az antigénprezentáló sejtek (APC), azaz a makrofágok és
dendritikus sejtek termelik, bakteriális endotoxin (LPS), intracelluláris kórokozók, és
antigénnel stimulált T sejtek hatására. Az IL-12 egyedi szerkezetű citokin, 70 kD
tömegű heterodimerek alkotják, melyek egy 35kD és egy 40 kD tömegű alegységből
épülnek fel. A p35 alegység 4 α-helikális szerkezettel jellemzett citokinekkel homológ.
A 40 kDa-os lánc az IL-6 receptorral mutat szerkezeti rokonságot. Ennek alapján az
aktív dimer egy szolubilis citokinreceptor komplexnek is tekinthető. A p40 alegység Ies típusú citokinreceptor szerű, de Ig-like domént is tartalmaz, csak az APC sejtek
képesek szintetizálni, így csak ezekben alakul ki aktív IL-12 heterodimer. Hatását I-es
típusú wsxws szekvenciát tartalmazó citokinreceptoron keresztül fejti ki [Bokodi, 2007].
Az IL-12 fokozza az NK és T sejtek IFNγ termelését, ami makrofág
aktivációhoz vezet. Hatására a CD4 pozitív T sejtek Th1 sejtekké differenciálódnak, (T
sejt növekedési faktor). A Th1 sejtek az adaptív immunitás fagocitáit aktiválják. Az NK
sejtek IL-12 hatására limfokin aktivált ölő (LAK) sejtekké alakulnak, aktiválódnak a
CD8 pozitív citotoxikus limfociták is. [Kathy, 2000]
Tumor nekrózis faktor-α
A TNFα prekurzora egy 230 aminosavból álló 25 kDa-os molekula, ami a TNFα-t termelő sejtek membránjában helyezkedik el. Bár ennek is lehet biológiai hatása,
mivel befolyásolja a sejtek közötti kapcsolatot, az aktív forma proteolízis során
keletkezik. Az így létrejövő, 157 aminosavból álló 17 k Da-os monomerek hármasával
összekapcsolódva alkotják az aktív trimer TNF-α molekulákat
A TNF-α-t döntően a makrofágok termelik, elsősorban endotoxin-stimuláció,
vagy migrációgátló faktor hatására. Az IFNγ a TNFα termelés egyik fontos, szinergista
hatású stimulánsa, az IL-10 viszont csökkenti a TNFα szintézist.
12
A citokin termelésében részt vesznek az aktivált T-sejtek, hízósejtek,
természetes ölő sejtek (natural killer-sejtek), Kupffer-sejtek, asztrociták, gliasejtek,
oszteoblasztok. A TNF-α termelés egyik legkifejezettebb stimulusát az endotoxint vagy
lipopoliszacharidot termelő Gram-negatív baktériumok jelentik [Treszl és mtsai 2000].
A Gram-pozitív baktériumok, vírusok és paraziták a makrofág sejtek serkentése révén
indukálnak fokozott TNF-α szintézist.
A TNF-α vérszintje egészséges emberben a jelenlegi metodikákkal a
kimutathatósági küszöböt nem éri el. Aktiváció, pl. gyulladás hatására a TNF-α-mRNS
szintje 15-30 percen belül kezd emelkedni, de ezt proteinszintézis egyelőre nem kíséri.
Az mRNS-ről átíródó, a membránba kihelyeződő 25 kDa-os prekurzor molekula
hasítását egy metalloproteáz enzim, a TNF-α konvertáló enzim végzi. Az enzim
aktivitását, ezáltal az aktív forma képződését lipopoliszacharidok és citokinek, többek
között maga a TNF-α is befolyásolja. [Black 1997].
A TNF-α hatásait specifikus
receptorcsalád közvetíti. A TNF-α két receptorhoz, az 55 kDa-os és a 75 kDa-os
receptorhoz egyforma affinitással kapcsolódik. Közös jellemzőjük, hogy két egyforma
transzmembrán doménből állnak, melyekben a receptorcsaládra jellemző módon
ciszteinben gazdag extracelluláris láncszakaszok vannak. Ezek az aminosavszekvenciák általában 3-6-szor ismétlődnek. Egyes receptorokban egy 60 aminosavból
álló citoplazmatikus szekvencia is jelen van, ami felelős az apoptotikus szignál
közvetítéséért. Ezen receptorok a szervezet szinte valamennyi testi szomatikus sejtjén
megtalálhatók. A 75 kDa-os típus nagyobb mennyiségben van jelen az endotél- és
hemopoetikus sejteken. A receptorok apoptotikus, illetve proliferatív szignált
közvetítenek. [Wajant] 2003] Kis koncentrációban a TNFα aktiválja a gyulladásos
reakciókat. Elősegíti az érendotél sejteken az adhéziós molekulák expresszálódását,
fokozza a neutrophil és eozinofil sejtek, makrofágok bactericid hatását. Részt vesz a
specifikus immunválasz koordinálásában is: hatására fokozódik a B-limfociták
immunglobulin- és a fibroblasztok kolóniastimuláló faktor termelése. Akutan, nagy
koncentrációban a TNFα pirogén. Aktiválja az alvadási rendszert és ennek révén
szövetkárosodást vált ki. [Old 1995]
Interferon-gamma
Az IFNγ (II típusú interferon) a legfontosabb makrofág aktiváló citokin
[Schroder, 2004]. Az IL-12-vel stimulált NK és T sejtek termelik. Homodimer
13
formában fordul elő. Hatását II-es típusú citokinreceptoron keresztül STAT1 kinázon
keresztül fejti ki. Az aktivált makrofágok kórokozó elimináló képességét fokozza
azáltal, hogy fokozódik a szöveti faktor, a fagocita-oxidáz, az iNOS, a növekedési
faktorok, a citokinek (pl. IL-12) és a mikrobicid enzimek szintézise és expressziója.
Ugyancsak fokozódik az MHC I és II expressziója az APC sejteken. Az IFNγ az adaptív
immunitást Th1 irányba tolja, fokozza a Th1 és gátolja a Th2 sejtek képződését. Az IFNγ
hatással van a B-sejtek immunglobulin termelésére is, gátolja az IL-4 függő
immunglobulinok képződését. Az IFNγ a neutrofil és NK sejteket is aktiválja [Bokodi
2007, Schroder 2004] .
Döntően antiinflammatorikus hatású citokinek
Interleukin-4 (IL-4)
Az IL-4 20 kDa-os glikoprotein. Pleiotrop hatású citokin, mely befolyásolja a T
helper (Th) sejtek differenciálódását. Érett Th2 sejtek, valamint a hízósejtek és a bazofil
sejtek termelik [Delespesse és mtsai 1997]. Hatására a Th prekurzor sejtek Th2 irányba
differenciálódnak [Haas és mtsai 1999]. A Th2 sejtek ugyancsak termelnek IL-4-et,
mely így a citokin autokrin termelődése révén tovább erősíti a sejtproliferációt. A Th2
sejtek termelte IL-4 és IL-10 a makrofág eredetű IL-12 termelés csökkentése révén a
Th1 válasz szuppressziójához vezet.
Az IL-4 részt vesz a Th2 válasz irányításában is, gátolja a gyulladásos citokinek
expresszióját és elválasztását. A monocita eredetű citokinek (például az IL-1, TNFα, IL6) hatását blokkolja. Emellett gátolja a makrofágok citotoxikus tevékenységét és
nitrogénmonoxid termelését. Fokozza viszont az antiinflammatorikus IL-1receptor alfa
termelődését.
Az IL-4 több strukturális sejt működését is befolyásolja. Bakteriális fertőzés
esetén hatása a kórokozó típusától függ; úgy tűnik, Gram-negatív fertőzésben fokozza,
Gram-pozitív baktériumok okozta fertőzésben csökkenti a védekezőképességet. Az IL-4
hatását az IL-4 receptor közvetíti [Nelms és mtsai 1998, Nelms és mtsai 1999].
Az IL-4 gátolja a gyulladásos citokinek expresszióját és elválasztását. A
monocita eredetű citokinek (például a IL-1, TNF-α, IL-6) hatását blokkolja. Emellett
gátolja a makrofágok citotoxikus tevékenységét és nitrogénmonoxid termelését.
Fokozza viszont az IL-1ra termelődését. Az IL-4 az allergiás gyulladás egyik kulcscitokine. Az IL-4 indukálta IgE-függő hízósejt-aktiváció kiemelkedő szerepet játszik az
14
azonnali allergiás reakciók mediálásában. Az IL-4 emellett a mucin-gén expressziójának
fokozásával hajlamosít a légúti obstrukció kialakulására. IL-4 hatására fokozódik a
VCAM-1 molekulák expressziója a vaszkuláris endotél sejteken, ami meghatározza a Tlimfociták, monociták, bazofilek és eozinofilek migrációjának irányát. Emellett az IL-4
gátolja az eozinofil sejtek apoptózisát és az eotaxin fokozott expressziója révén fokozza
az eozinofil-sejtek túlsúlyával járó gyulladást [Dabbagh és mtsai 1999, Wang és mtsai
2001, Wedi és mtsai 1998].
Interleukin-10
Az IL-10-et a CD4+ és CD8+ T-sejtek, B-sejtek, makrofágok, aktivált hízósejtek
és keratinociták termelik. Az IL-10 a humán immunválasz legfontosabb antiinflammatórikus hatású citokinje; gátolja a Th1 eredetű gyulladásos fehérjék szintézisét
[Mocellin
és
mtsai
2003].
Gátolja
emellett
a
monocita/makrofág
eredetű
proinflammatórikus proteinek termelődését. A makrofágokra kifejtett hatékony
immunszuppresszív hatásával ellentétben az IL-10 stimulálja a B-sejtek proliferációját,
differenciálódását és antitesttermelését [Conti és mtsai 2003].
Az IL-10 két, 160 aminosavból álló, szorosan összekapcsolódó 18 kDa-os
homodimer formájában van jelen a keringésben. A citokin receptora egy 110 kDa-os
sejtfelszíni molekula, mely közvetíti a TNF-α, IL-1, IL-6, GM-CSF termelődését gátló
hatást. Csökkenti emellett a TNF-α receptorok sejtfelszíni expresszióját.
Szisztémás fertőzésekben az IL-10 szintje a plazmában is mérhetővé válik és
jelentősen befolyásolja az immunválaszt. Megfigyelték például, hogy magas IL-10 és
kis TNF-α szérumszintű betegek kisebb valószínűséggel halnak meg meningococcusokozta fertőzésekben. Állatkísérletben az IL-10 adására javult az endotoxémia túlélése.
[Moore és mtsai 2001] Az egyes citokinek szövetekre gyakorolt hatásukat nem
önmagukban, hanem komplex citokin- és endokrinkörnyezet részeként fejtik ki (lásd
2.1.B
ábra)
[Abbas
2003].
Az
egyes
stimulusokra
bekövetkező
pro-
és
antiinflammatorikus citokintermelés, a termelődő citokinek aránya meghatározza a
kialakuló immunválasz jellegét (Th1 és Th2 típusú; lásd 3. ábra)
15
IFN
CSF
IL-4, IL-5
LDCF
IL-2
limfokintermelés ↑
IL-2- és IFNγ−
receptorok ↑
proliferáció,
IL-6, IL-8, TNF, GM-CSF ↑
prosztaglandinok ↑
kollagenáz ↑
PDGF
IL-2, IL-4
T-sejt
proliferáció,
ellenanyag-termelés ↑
fibroblaszt
B-sejt
ellenanya
glukokortikoidok ↑
gk
ép
s
zé
akutfázis proteinek
P450 ↓
C3 ↑
IL-6
gyulladás
mellékvese
IL-1
aktiváció
IL-1, IL-6, IL-8 ↑
neutrofil
granulocita
TNFα
tumorsejtölő
aktivitás
májsejtek
epitélsejtek
prosztaglandinok ↑
kollagenáz ↑
proliferáció
makrofág PDGF
proliferáció,
IV típusú kollagén ↑
endotél- és
simaizomsejtek
proliferáció,
prosztaglandinok ↑
integrinek ↑
véralvadás fokozása,
IL-6, IL-8, TNF,
GM-CSF, ICAM-1 ↑
agy
láz,
fájdalomérzet ↓
prosztaglandinok ↑
CRF → ACTH ↑
2. ábra: A főbb proinflammatorikus citokinek szerepe az akut fázis reakcióban és annak
szövetspecifikus hatásaiban (Gergely J, Erdei A. Immunbiológia 1998: 32. oldal)
16
3. ábra: A kiváltó ágens hatására reagáló sejtek citokineket termelnek, melyek meghatározzák
az immunreakció jellegét (Gergely J, Erdei A. Immunbiológia 1998:201. oldal)
2.2
Citokinszint-mérési módszerek
A citokinek élettani folyamatokban és betegségekben játszott szerepére
vonatkozóan több mint két évtizede gyűlnek az adatok. Ezek azonban sokszor nem
egyértelműek, vagy ellentmondásosak, amiben a metodikai problémák kulcsszerepet
játszanak.
A citokinszintek és növekedési faktorok meghatározását több tényező nehezíti.
A legfontosabbak:
(1)Az ugyanolyan néven, jellel jelzett citokin a szervezetben monomer és polimer
formában is jelen lehet; többféle alegységből áll, melynél az egyes alegységeket
külön sejttípusok termelik; illetve kémiailag sem mindig jól karakterizáltak. Mind
a citokin mind a növekedési faktorok meghatározásánál, mivel fehérjékről van szó,
amelyek esetleg több epitóppal rendelkeznek, a szintek mérése során alkalmazott
immunanalitikai módszerek szenzitivitását és specificitását, de a referencia
17
tartományt is alapvetően meghatározza a gyártás technológiája, a vegyszer
sorozatszáma. [Bekő és mtsai 2008]
2) Nyugalmi állapotban a citokinszintek a plazmában igen alacsony (pmol/l)
koncentrációban vannak jelen, azaz jelentős hányaduk nem is detektálható.
(3) Stimulus hatására a citokinszint többszörösére emelkedik, de ez a változás átmeneti,
citokinenként különböző kinetikát mutat.
(4) Mivel a citokinek hatásukat egy komplex rendszer részeként fejtik ki, sok esetben
az 1-1 citokin klinikai jelentőségére korlátozódó mérések eredménye nem
informatív.
A fenti problémák figyelembevétele mellett az alábbi mérési technikák terjedtek el.
ELISA módszer
A citokinek klasszikus ELISA-val való kimutatásakor a kettős szendvics
módszert alkalmazzák, melynek fajlagossága igen nagy. Ezzel a módszerrel a citokinek
mennyisége a biológiai aktivitásuktól függetlenül mérhető, ezért – főként a rövid
életidejű fehérjék esetében – az eredmény nem mindig jelzi a tényleges biológiai
aktivitást. A mérést az is befolyásolhatja, hogy a különböző citokinek oldott formájú
receptorokhoz vagy inhibitorokhoz kötött formában is előfordulhatnak.
Biochip és bioplex módszerek
A citokin funkciók komplexek, így egy citokin profil nagyon értékes információt
jelenthet egy adott immunválaszban. Nagy előrelépést jelentett a citokin biochip
panelek és a mikrogyöngyökhöz kötött citokin antitestek, a BioPlex panelek
megjelenése, amikor egyszerre tudunk 12 vagy akár 27 citokint, növekedési faktort
vizsgálni.
Biochip technika citokinek, kemokinek és növekedési faktorok kimutatására
Ez a protein array a nagyon kis koncentráció (pg/ml), és a zavaró tényezők
kizárása végett háromféle immunoassay-t alkalmaz egyszerre:
1. kompetitív immunoassay (enzimmel jelölt analitot használ)
2. sandwich immunoassay (enzimmel jelölt antitestet használ)
3. antibody capture immunoassay
Randox Biochip módszert (Randox Laboratories Ltd, Crumlin, United
Kingdom) használva a kemilumineszcens jeleket egyszerre méri egy készülék egy hűtött
18
CCD (charge couple device) kamerával és standard kalibrációs görbékhez hasonlítva
kiértékeli egy speciális programmal a teljes arrayn. Egy chip mérete, melyre a beteg 100
µl mintáját pipettázzuk, mindössze 9mmx9 mm. Ezzel a módszerrel 3-4 óra alatt 42
beteg 12 pro- és antiinflammatorikus citokinjét és növekedési faktorát (háromszintű
kontrollálást használva) tudjuk lemérni. A Randox teljes automata (EVIDENCE)
készülékkel is rendelkezik a biocipek méréséhez. Ebben a rendszerben egy chip
felületére maximum 23 analit (antitest) köthető. A citokinek mellett számos panelt
fejlesztettek ki. [Stephen és mtsai 2005]
Bio-Plex technika citokinek, kemokinek és növekedési faktorok kimutatására
A
Bio-Plex
technika
az
xMAP
(x(number)
Multi
–
Analyte
Profiling/Multiplexing) technológián alapul, melyet a Luminex ( Luminex Corporation;
Austin, USA) multiplex assay-vé fejlesztett az elmúlt néhány évben. A megoldás a
chiptechnikán (szendvics és kompetitív immunoassayt használva) és a flowcytometrián
alapul.
Mikrogyöngyöket (5 µm átmérőjű, polisztirén) vörös és infravörös festékkel
színezik. A két festék aránya 100-féle gyöngytípust eredményez, így egy plexen
egyszerre elméletileg 100 féle vizsgálat is mérhető. A gyöngyökhöz különböző
monoklonális antitesteket kötnek, melyek összekeverhetők és a microplate lyukaiból a
chiphez hasonlóan egyszerre mérhetők. A szendvics ELISA utolsó lépéseként
fluoreszcens jelölést használnak. A készülék kapillárisán áthaladó valamennyi gyöngyöt
2 színű lézer világítja meg. A piros fény a gyöngy típusát érzékeli, a zöld pedig a
fluoreszcens jel intenzitását méri. A speciális software összerendezi a jeleket, és a
standard görbékhez hasonlítva kiírja a plexben mért citokinek értékeit. [Desplat-Jego és
mtsai 2007] A módszer szenzitivitása és érzékenysége az ELISA tesztekhez hasonló. A
dinamikus range citokineknél lényegesen szélesebb (1,95-32 000 pg/ml) mint az ELISA
és a Biochip mérések esetén.
A módszer előnyei közül ki kell emelni a flexibilitást. Citokinek esetén ez azt
jelenti, hogy egy plexen tetszőleges válogatásban és számban (akár 27-féle) citokin,
kemokin, növekedési faktor mérhető (biochip módszernél mindig ugyanazt a 12-félét
mérjük). A minta a szérumon, plazmán és szöveti felülúszón kívül, bármely testnedv
vagy szöveti homogenizátum lehet. A szükséges mintamennyiség 50 µl. A vizsgálatok
19
költsége harmada az ELISA módszerrel mért tesztekének, ráadásul minél több tesztet
mérünk egy plexben, a fajlagos költség annál kisebb. [Bekő és mtsai 2008]
A flexibilis multiplexek nemcsak a citokinek mérésénél nyújtanak segítséget,
hanem más fehérje és génexpressziós profilok, autoimmun betegségek, genetikai
betegségek és HLA vizsgálatok terén is gyors, pontos, átfogó eredményekhez juthatunk.
A labordiagnosztika mai színvonala tehát lehetővé teszi azt, hogy ne izoláltan,
egy-két citokinre vonatkozóan lehessen adatokat gyűjteni, hanem meg lehessen
határozni az egy adott betegre, betegségre jellemző citokinprofilt. Az eredmények
értékelését azonban megnehezíti az a tény, hogy
(1)nem ismert, hogy a különböző multiplex rendszerek által mért adatok mennyire
állnak összhangban;
(2)kevés az arra vonatkozó adat, hogy az egy adott multiplex rendszerben mért értékek
mennyire reprodukálhatóak;
(3)a nagyszámú adat feldolgozása, az egy adott betegből ismételten végzett mérések
eredményének az értékelése új statisztikai megközelítéseket indokolnak – ezek pedig
nem adottak.
Ph.D. munkám során célom volt ezekre a metodikai kihívásokra választ találni, illetve
néhány belgyógyászati kórkép esetében a citokinprofilra vonatkozóan releváns adatokat
gyűjteni.
20
3
Célkitűzések
Ph.D. munkám során metodikai és klinikai kérdésekre kerestem választ. A
módszertani vizsgálatokon belül a citokinszintmérési módszerek összehasonlítása volt
az elsődleges célom.
Mivel a különböző mérési rendszerek között lényeges különbségek vannak, és ez
megnehezíti a kapott eredmények összehasonlítását, ezért a különböző multiplex
rendszerek alkalmazásával nyert értékek összehasonlítására vonatkozóan szükséges
annak a vizsgálata, hogy két multiplex rendszer (Biochip® és Bioplex®) eredményei
mennyire szorosan függnek össze, illetve, hogy az ezekkel mért egyik analit (IL-6) érték
összevethető-e az egyedi IL-6 szintet mérő kemilumineszcens immunkémiai (Roche)
teszttel kapott eredményekkel. Ph.D. munkám során ezért az első célkitűzésem az volt,
hogy az egyes citokinszint mérési módszereket összehasonlítsam. Ennek kapcsán két
multiplex rendszer (Biochip® és Bioplex®), valamint egy egyedi IL-6 szint-mérő
módszer eredményeit vetettem össze és határoztam meg a közöttük levő kapcsolat
erősségét.
A citokin-profil vizsgálata különösen jelentős fiziológiás és patológiás
körülmények
között,
perinatális
korban.
Az
újszülöttkori
posztaszfixiás
agykárosodásban illetve az aktivált immunsejtek okozta idegsejt-károsodásokban a
gyulladásos citokinek szintje perinatális aszfixiát követően ugrásszerűen nő. Nem
ismert, hogy a terápiás célú hipotermia hogyan módosítja a pro- és antiinflammatorikus
citokinek kinetikáját, ezért egyik célkitűzésünk a hipotermia ilyen irányú hatásainak a
jellemzése volt.
Vizsgálataink következő fázisában arra kerestük a választ, hogy milyen hatással
van az endogén kortizol a szisztémás citokinszintekre kora- és újszülöttkorban. A
magzati korban az immunrendszer generalizált aktivációja koraszülöttek egy részében
az adekvát terápia ellenére is súlyos gyulladásos szövődményeket, elsősorban
légzőszervi és idegrendszeri károsodásokat okoz. Kutatásaink során ezért arra voltunk
kíváncsiak, hogy milyen kapcsolat áll fenn koraszülötteknél az egyik legfontosabb
gyulladást befolyásoló hormon, az endogén módon szintetizált kortizol és a gyulladásos
citokinek szintje között.
Kutatásaink kiterjedtek a perinatális szepszis és citokinprofil közötti kapcsolat
felderítésére is, mert kora- és újszülöttkorban a szisztémás bakteriális fertőzés sokszor
21
rapid lefolyású, és a gyors diagnózis alapvetően fontos a hatékony terápia mielőbbi
bevezetése és a súlyos szövődmények megelőzése érdekében. Ezért elemezni kívántuk,
hogy a bioplex módszer segítségével meghatározott citokinszintek adnak-e járulékos
információt szeptikus újszülötteknél a prokalcitonin- és CRP-szintek mellett.
A következő témakör, amivel foglalkozni kívántunk, az a citokinprofil változása
májbetegségekben, és a fémionok összefüggése a szisztémás citokinszintekkel. Hazánk
közismerten élen jár az alkoholfogyasztás okozta súlyos májkárosodások terén. A
fiatalok körében egyre népszerűbb a vörösborfogyasztás, így munkám során a mérsékelt
de rendszeres vörösborfogyasztás hatását tanulmányoztuk a citokinszintekre.
Számos kísérleti adat és klinikai megfigyelés utal arra is, hogy a májkárosodás
kialakulásában a szabad gyökök által kiváltott toxikus hatásokkal, így a szabad gyök
indukálta gyulladással szembeni nemtől függő érzékenység is szerepet játszik.
A mérsékelt vörösborfogyasztás szisztémás gyulladásra, a fémionok szintjére és
a redox-homeosztázisra gyakorolt hatásait vizsgáltuk egészséges férfiakban és nőkben,
és elemezni kívántuk, hogy ezek a hatások mutatnak-e eltérést a nemek között.
A laboratóriumi vizsgálatok során tapasztalt „anomáliákra” kívántunk fényt
deríteni az egyes májcirrhosis megbetegedések kapcsán a citokinprofil tekintetében. A
májfibrózis és májcirrhosis ugyanannak a kórfolyamatnak a különböző állomásai. A
májcirrhosis kialakulásában számos pathobiokémiai folyamat játszik szerepet, többek
között a gyulladás. A gyulladás jellege és intenzitása a különböző eredetű
cirrhosisokban eltérő. Célkitűzésünk az egyes cirrhosis-típusokra jellemző szisztémás
citokinprofil meghatározása és az egyes kórformákra specifikus citokinek azonosítása
volt.
A Wilson-kór a májban zajló rézmetabolizmus autoszomális recesszív módon
öröklődő rendellenessége, aminek az eredményeként a hepatocitákban és egyes
extrahepatikus szervekben, így az agyban és a szaruhártyában réz rakódik le. Különösen
fontosnak tartottuk, e viszonylag ritka betegség esetében is elvégeni a citokinszintek
meghatárosát, tekintettel arra, hogy a Wilson-kór különböző stádiumaiban jelentős
eltérések mutatkoztak a fémionháztartásban és a redox-paraméterek alakulásában. Az
azonos pathomechanizmus ellenére a megjelenő tünetek nagymértékben változnak
interindividuális variabilitást mutatnak, ezért célkitűzésünk a kezelt, normalizált
rézszintű Wilson kóros betegeknél annak a vizsgálata volt, hogy az eltérő
22
tünetcsoportokban szenvedő betegeknél milyen különbségek lehetnek jelen a szisztémás
gyulladást jelző citokinszintek, a fémionszintek és redox-folyamatok esetében.
Kutatásaink egyéb belgyógyászati kórképekre is kiterjedtek, a klinikai
betegellátás igényének megfelelően. A prosztata adenocarcinomája a gazdaságilag
fejlett társadalmakban az egyik leggyakoribb rákos megbetegedés a tüdő daganata után
a férfiak daganatos halálozásában. Rosszindulatú daganatos betegségekben szenvedő
betegeknél általános gyakorlat, hogy a beteg vény nélkül szed különböző bioaktív
készítményeket, például vitaminokat, gyógynövénykivonatokat, antioxidánsokat. Ezek
több esetben is enyhítik a kemoterápia kedvezőtlen mellékhatásait, sőt, akár még a
kezelés eredményét is javíthatják. Célkitűzésünk áttétes prosztata karcinómás
betegeknél annak a vizsgálata volt, hogy egy antioxidánsban gazdag étrendkiegészítő
(céklapor) milyen hatást gyakorol szisztémásan a redox rendszerek aktivitására, a
citokinszintekre és növekedési faktorokra.
Hasonló megkeresés miatt foglakoztunk a vesetranszplantáció, malnutríció és
gyulladás kérdéskörével is, mivel a krónikus betegségekhez kapcsolódó senyvesztő
állapot (protein-energy wasting - fehérje-energia hiányos állapot) és a gyulladás közötti
kapcsolat krónikus vesebetegek esetében jól ismert. Az állapot felismerése a betegek
gondozása miatt nagyon fontos. Ismert, hogy a malnutríció-gyulladásos komplex
szindróma (MICS) esetén a morbiditás és a mortalitás többszörösére emelkedik. A
MICS kimutatására a beteg klinikai állapota alapján egy pontrendszert (Malnutrition
Inflammation Score, MIS) dolgoztak ki. Célkitűzésünk egy eddig MICS tekintetében
nem vizsgált populációban, vesetranszplantáció utáni betegeknél a MIS validálása a
gyulladásos citokinszintek alapján, illetve különböző modellek felhasználásával annak a
meghatározása, hogy a MICS kialakulásában milyen gyulladásos és/vagy tápláltsági
faktorok játszanak szerepet.
23
4
Betegek, módszerek és anyagok
Az egyes vizsgálatokba a betegek bevonása intézeti tudományos kutatásetikai
bizottságok előzetes jóváhagyását követően történt. (TUKEB 69/2000, 591/KO/2004,
175-1/2005, 49/2006) A vérvételek előtt a résztvevők tájékoztatást követően
beleegyezésüket adták; kiskorúak esetében a szülő (gondviselő) járult hozzá a vizsgálat
végzéséhez. Törekedtünk arra, hogy a vérvételek ne jelentsenek külön megterhelést,
ezért amikor lehetőségünk nyílt rá, a kutatási célú citokinszint-méréseket az egyéb
diagnosztikus célú vérvételekkel összehangoltuk.
A vérvételek során (amennyiben külön nem jelöltem) 5 ml natív vérmintát
vettünk le. A szérumot egyrészt a rutinlaboratóriumi vizsgálatok elvégzésére használtuk
fel, másrészt a citokinmérések elvégzéséig összegyűjtöttük, és a -80 °C-on tároltuk.
4.1
Mérőmódszereket összehasonlító vizsgálatokban résztvevők
Húsz egészséges önkéntestől (20 – 50 év, 15 nő, 5 férfi) vettünk le 10 – 10 ml
natív vérmintát, amiből szérumot szeparáltunk.
4.2
Klinikai vizsgálatokban résztvevő személyek
4.2.1 Perinatális vizsgálatok
4.2.1.1 Aszfixiás újszülöttek
Vizsgálatunkba 19, hipoxiás encefalopátiában szenvedő újszülöttet vontunk be,
akik 2005 január és 2006 november között az I.sz. Gyermekklinika Perinatális Intenzív
Osztályán kerültek felvételre. A gyermekek állapotát klinikai, neurológiai és EEG
kritériumok alapján értékeltük [Azzopardi és mtsai 2008], majd a gyermekeket a
nemzetközi TOBY (’Whole body hypotermia for the treatment of perinatal asphyxial
encephalopathy’) vizsgálatba (ISRCTN 89547571) vontuk és véletlenszerűen két
csoportba: szisztémás hipotermiával kezelt (n = 10), illetve normotermia mellett kezelt
(n = 9) csoportokba soroltuk. 1. táblázat
A mérsékelt szisztémás hipotermiával (rektális hőmérséklet 33 – 34oC) kezelt
csoport esetében a hűtés a hatodik posztnatális órán belül elkezdődött; a hipotermiát 72
órán keresztül hűtőmatrac segítségével tartottuk fenn. A normotermiás csoportban a
hőmérséklet 37,0 ± 0,2oC volt. Ezen túl az összes gyermek ugyanolyan standard
intenzív terápiás ellátásban részesült, ennek kapcsán rendszeresen, a TOBY
24
protokollnak megfelelő módon kaptak morfint is [Azzopardi és mtsai 2008]. Egyetlen
gyermeknél sem volt jelen szepszis, anyai korioamnionitisz.
Kardiovaszkuláris instabilitás esetén (az átlagos artériás vérnyomás 40 Hgmm
alatti) a gyermekek egyszer vagy többszöri adagban kaptak fiziológiás sóoldatot (10 –
20 ml/ttkg). Perzisztáló hipotónia esetén a gyermekek dobutamint (5 – 20 µg/ttkg*min1
) vagy dopamint (2 – 10 µg/ttkg*min-1) vagy noradrenalint (0,1 – 0,3 µg/ttkg*min-1)
kaptak. Terápiarezisztens esetekben hidrokortizol (1-2 mg/ttkg) adására is sor került.
Az aszfixiás újszülöttek klinikai jellemzőit az 1. táblázatban foglaltuk össze.
1. táblázat: Aszfixiás újszülöttek klinikai jellemzői
Hipotermia
Normotermia
n = 10
n=9
[37-41]
39
[35-40]
Gesztációs kor (hét)
39
Születési súly (g)
3350 [2300-4340]
3500 [2540-4040]
Hüvelyi szülés
9/10
6/9
Sürgősségi császármetszés
1/10
3/9
Mellkasi kompressziókkal újraélesztés
5/10
5/9
(n/N)
Spontán légzés visszatérésének az
[5 – 15]
10
15
[7 – 120]
időtartama (perc)
Apgar pontérték 1 min
2 [0 – 8]
2 [0 – 5]
Apgar pontérték 5 min
6 [3 – 8]
3 [0 – 7]
Apgar pontérték 10 min
6 [3 – 7]
5 [1 – 8]
Első mért pH
7,21 [7,06 – 7,34]
7,09 [6,80 – 7,29]
Első mért base excess (mmol/l)
-13,2 [-21,0 – -8,0]
-17,8 [-23,0 – -7,0]
Első mért laktát (mmol/l)
9,7 [ 6,0 – 15,0]
7,8 [6,1 – 15,0]
Az anyagcsereállapot meghatározásának
1,38 [0,5 – 3,33]
1,45 [1,0 – 4,5]
3,3 [2,5 – 5,3]
3,1 [2,5 – 5,5]
az időpontja (életóra)
Randomizálás időpontja (életóra)
Sarnat stádium (n)
1
2
3
0
Hőmérséklet a hatodik életórában ( C)
1
8
1
33,6 [33,4 – 33,7]
1
6
2
36,7 [35,7 – 36,9]*
4.2.1.2 Kissúlyú koraszülöttek
Negyven, a Semmelweis Egyetem I.sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika
Perinatális Intenzív Centrumában ellátott 1500 gramm születési súlyú koraszülöttől
25
vettünk 0,5 ml lítium-heparinnal alvadásgátolt vérmintát a születéskor, majd az 1, 3. és
7. életnapon; a citokinszinteket az ebből nyert plazmában határoztuk meg. A születési
súly mellett kritérium volt, hogy a résztvevők mindegyikétől minden vérminta
rendelkezésre álljon (ne következzen be az első héten haláleset), illetve, hogy a
koraszülöttek ne részesüljenek glükokortikoid-kezelésben.
4.2.1.3 Perinatális szepszisben szenvedő koraszülöttek
A Semmelweis Egyetem I.sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Perinatális
Intenzív Centrumában 2007 január 1 és 2008 december 31 közötti szepszis diagnózissal
kezelt 41 kora- és újszülöttől vett vérmintában a beküldő osztály kérésének megfelelően
prokalcitonin, CRP és vérkép-meghatározásokat végeztünk az antibiotikum-kezelés
megkezdése előtt, majd azt követően az első és a második napon. A megmaradt
vérmintákban mértük a citokinszinteket.
Az általunk alkalmazott szepszis-kritériumok [Dollner és mtsai 2001, Treszl és mtsai
2003]:
•
klinikai tünetek (1) sápadtság és icterus; (2) letargia, apnoe, bradycardia,
ingerlékenység és görcsrohamok; (3) tachypnoe és dyspnoe; (4) alacsony
vérnyomás, tachycardia és mikrocirkulációs zavar; (5) hányás és hasfali feszülés;
(6) láz és hőmérséklet-instabilitás.
•
laboratóriumi tünetek: CRP szint >20 mg/l (és/vagy prokalcitonin >10 µg/l) és a
fehérvérsejtszám >20 G/l.
Definíciónk szerint szepszis akkor volt jelen, ha pozitív hemokultúra vagy
jellegzetes laboratóriumi tünet mellett a fenti klinikai tünet-kategóriákból legalább 3,
illetve pozitív hemokultúra vagy ha pozitív hemokultúra / jellegzetes laboratóriumi
tünet nélkül a fenti klinikai tünet-kategóriákból legalább 4 volt jelen.
4.2.2 Citokinek májbetegségekben.
4.2.2.1 Vörösbort fogyasztó önkéntesek
Vizsgálatunkba egyetemi hallgatókat: 10 nőt (életkoruk 23 ± 3 év, testtömegük
60 ± 4,1 kg), illetve 11 férfit (életkoruk 23 ± 3 év, testtömegük 79 ± 5,3 kg) vontunk be.
A fizikális orvosi vizsgálat, a rutinlaboratóriumi paraméterek, valamint az anamnézis
alapján mindegyikük egészséges volt. Rendszeresen egyikük sem fogyasztott alkoholt
26
(átlagos
alkoholbevitel:
<20
gramm/hét),
nem
dohányoztak,
nem
szedtek
étrendkiegészítőt, illetve a nők nem használtak fogamzásgátló tablettákat sem.
A vizsgálat kezdetekor vért vettünk tőlük; ezt követően a férfiak naponta 3 dl, a
nők 2 dl vörösbort fogyasztottak (Egri Cuvée, König Pincészet). A vörösbor
alkoholtartalma 12%, resveratrol tartalma 12,03 mg/l volt. A következő vérvételre egy
hónap múlva került sor.
4.2.2.2 Krónikus májbetegségben szenvedők
Vizsgálatunkban 75 kompenzált májcirrhosisban szenvedő beteg vett részt,
akiket a Semmelweis Egyetem I.sz. Belgyógyászati Klinika hepatológiai ambulanciáján
gondoztak. A betegek közül 36-an alkoholos eredetű cirrhosisban (10 nő, 26 férfi;
átlagos életkor 54 ± 8 év), 25-en primer biliáris cirrhosisban (PBC) (22 nő, 3 férfi;
átlagos életkor 41 ± 9 év), 14-en pedig krónikus HCV talaján kialakult cirrhosisban (6
nő, 8 férfi; átlagos életkor 48 ± 7 év) szenvedtek. A betegek nem részesültek interferonkezelésben, és nem kaptak interleukin-készítményeket sem. Kontrollcsoportként 26 (12
nő, 14 férfi, átlagos életkor 58 ± 8 év) egyén szerepelt, akiknek az általános egészségi
állapotát a klinikán mérték fel, de akiknél a rutinlaboratóriumi vizsgálatok és a fizikális
vizsgálat nem igazolt betegséget.
4.2.2.3 Wilson-kóros betegek
Wilson-kórral
kapcsolatos
vizsgálatainkban
Semmelweis
Egyetem
I.sz.
Belgyógyászati Klinika hepatológiai ambulanciáján gondozott betegek, összesen 50-en
vettek részt. 81%-uknál igazolták M1069Q a Wilson kórra jellemző génmutáció
jelenlétét. A 19 nő életkora átlagosan 37 ± 11 év, a 31 férfié 33 ± 10 év volt. A
diagnózistól 12 ± 4 év telt el.
A kelátor terápiában (D-penicillamin kezelésben) részesülő betegek 46 %-nál a
terápia mellett is súlyos idegrendszeri tünetek álltak fent, 14 %-nál májenzim eltérések,
míg 12 %-nál idegi és májenzim eltérések együttesen is kimutathatók voltak, míg 28 %ukban az előbbi tünetek nem jelentkeztek. A kórra jellemző Kayser-Fleischer gyűrűpozitivitást leggyakrabban az idegi és májenzim eltéréseket együttesen prezentáló
betegek esetében (80 %) találtunk.
27
4.2.3 Citokinek egyéb belgyógyászati kórképekben
4.2.3.1 Prosztatakarcinóma és citokinprofil
A Semmelweis Egyetem Urológiai Klinikáról 18 áttétes prosztatarákos beteget
(életkor: 68 ± 5,6 év) vontunk be, akik a kemoterápiás Tamoxifen kezelés mellett egy
kereskedelmi forgalomban kapható, présléből, alacsony hőmérsékleten végbemenő
vákuumszárítási technológiával előállított céklaport (Engedélyszám: 1361/004/2003)
kaptak terápia szupplementumként 1
hónapig. A vérvételre a céklaporszedés
kezdetekor, illetve egy hónap után került
4.2.3.2 Vesetranszplantációt követő állapot
A Semmelweis Egyetem Transzplantációs Klinikán gondozott stabil állapotú
vesetranszplantált betegeket vontuk be a vizsgálatba; klinikai adataikat a.2. táblázat
összegzi.
A bevonni kívánt 1214 betegből 205 (17%) nem kívánt a vizsgálatban részt
venni, a betegek közül 16-ot (1%) pedig a kizárási kritériumok (utóbbi 4 hétben akut
rejekció, aktuális kórházi kezelés, 3 hónapon belül transzplantáció, akut fertőzés,
vérzés) miatt kizártunk. A vizsgált betegpopuláció ezért 993 betegből állt. A résztvevők
között kisebb arányban szerepeltek a férfiak, mint az eredeti populációban ( 57% vs.
67%; p<0.01).
A
veseelégtelenség
hátterében
álló
leggyakoribb
ok
a
krónikus
glomerulonephritis volt (23%). További okok: diabeteses nephropathia 5%; autosomalis
domináns polycystás vesebetegség 18%; krónikus pyelonephritis és tubularis
interstitialis betegség 13%; magas vérnyomás okozta nephropathia 6%. Egyéb vagy
ismeretlen eredetű vesebetegségben a betegek 35 százaléka szenvedett.
A vizsgálat időpontjában a betegek 81%-a szedett prednizolont, közel 50
százalékuk pedig ciklosporin A-t kapott. A betegek mintegy 40 százaléka kapott
takrolimuszt, 4%-a azatioprint, 8 százaléka szirolimuszt.
A vese beültetésekor az átlagos hideg iszkémiás időtartam 21 óra volt, késői
graftműködés a betegek 26%-nál, míg akut rejekció 34%-nál szerepelt az anamnézisben.
Élődonoros transzplantációt az esetek 4 százalékában végeztek. A donorok 64 százaléka
férfi, átlagos életkora 43 ± 14 év volt.
28
2. táblázat: Avesetranszplantált betegek kórtörténeti adatai (rövidítés: IQR= interkvartilis )
Összes beteg
Férfiak
Nők
p
(n = 993)
(n = 569)
(n = 424)
Életkor (év) (átlag ± szórás)
51 ± 13
50 ± 13
52 ± 12
<0,05
Utolsó transzplantáció óta eltelt idő
72 (75)
72 (72)
72 (81)
NS
20 (29)
20 (31)
20 (27)
NS
51 ± 21
53 ± 20
48 ± 21
<0,001
Cukorbetegség jelenléte (%)
21
21
20
NS
Hemoglobinszint (g/l) (átlag ± szórás)
135 ± 17
140 ± 17
127 ± 14
<0,001
Koleszterinszint
5,50 ± 1,28
5,36 ± 1,16
5,69 ± 1,39
<0,001
0; 0-85
0; 0-85
0; 0-85
NS
1248 ± 349
1241 ± 356
1257 ± 340
NS
26
30
21
<0,01
34
34
35
NS
hossza; (hónap; medián, IQR)
Megelőző dialízis időtartama (hónap;
medián, IQR)
Becsült GFR (ml/perc/1,73 m2) (átlag
± szórás)
(mmol/l)
(átlag
± szórás)
Panel reaktív ellenanyag titer (%)
(medián; min, max,)
Hideg iszkémiás idő hossza (perc)
(átlag ± szórás)
Anamnézisben
graftfunkció
megindulásának a késlekedése (%)
Akut rejekció az anamnézisben (%)
A betegeknél 2007 február és augusztus között az alábbi adatlap (3. táblázat)
segítségével meghatároztuk a malnutríciós-gyulladásos pontértéket (MIS).
29
3. táblázat: Malnutríció – inflammáció pontérték megállapításához használt adatlap
Malnutríciós-gyulladásos pontérték (MIS)
0
1
2
1 – Súlyváltozás (az elmúlt 3 – 6 hónap során bekövetkező súlyváltozás):
Súly nem változott, vagy a
Kisebb mértékű fogyás
1 kg-ot meghaladó
fogyás <0,5kg
(>0,5kg, de <1kg)
fogyás, de <5%
2 – Étrend, táplálékbevitel
Jó étvágy, a táplálékbevitel
nem változott
Valamelyest szuboptimalis a szilárd étel
fogyasztása
Szilárd étel fogyasztás
közepes mértékben
csökkent – teljes
mértékben
folyadékfogyasztás
3
Fogyás >5%
Hipokalóriás folyadék –
éhezés
3 – Gasztrointesztinális tünetek:
Nincs tünet, jó az étvágy
Enyhe tünetek, nincs Esetenként hányás vagy Gyakori hasmenés vagy
étvágy, esetenként
közepes fokú GI tünetek
hányás vagy súlyos
émelygés
étvágytalanság
4 – Funkcionális kapacitás (táplálkozással kapcsolatos funkciócsökkenés):
Funkcionális kapacitás
Felkeléssel esetenként A beteg függetlenségét
Ágyhoz / tolószékhez
normális – javult, jól érzi
problémák vannak,
igénylő tevékenységek
kötöttség, nincs, vagy
magát a beteg
gyakran érzi magát
(pl. fürdés) végzésével
kismértékű a fizikai
fáradtnak
problémák vannak
aktivitás
Az ESRD-t leszámítva
Enyhe társbetegség
Közepes társbetegség (1
Súlyos többszörös
egyébként egészséges
(kivéve az MCC*)
MCC*)
társbetegség (legalább 2
MCC*)
6 – Zsírraktárak csökkentek, vagy a szubkután zsír mennyisége kisebb (szem alatt, triceps, biceps területén,
mellkason):
Normális (nincs változás)
enyhe
közepes
súlyos
7- Izomvesztés jelei (kulcscsont, lapocka, borda területén, quadriceps izomzat, térd területén)
normális (nincs változás)
enyhe
közepes
súlyos
8 – Testtömegindex: BMI = testtömeg (kg) / magasság² (m)
18-19,99
16-17,99
BMI<16
≥20
9 –Se albumin (g/l)
35-39
30-34
<30
≥40
10 – Se transzferrin (g/l)
≥0,200
0,170-0,199
0,140-0,169
<0,140
Teljes pontérték = a fenti tíz tétel összege (0-30):
*MCC (fontosabb komoborbid állapotok) így III. vagy IV. stádiumú szívelégtelenség, AIDS, súlyos
koszorúér-betegség, közepes – súlyos obstruktív tüdőbetegség, idegrendszeri szövődmények, áttétes
daganat és/vagy kemoterápia.
30
4.3
Módszerek
4.3.1 Citokinszint-mérési eljárások
4.3.1.1 Citokinszintek mérése Bioplex rendszerrel
A vizsgálatokat Bio Rad Bio-Plex System teszttel Luminex® 200™ (Austin,
USA) készülék segítségével végeztük.
A mérés elve:
A színkódolású mikrorészecskéket előzetesen analit-specifikus antitestekkel
vonják be. A mikrorészecskéket, a standardokat és a mintákat a mintahelyekre
adagolják, és az immobilizált antitestek megkötik a kimutatandó analitokat. A nem
kötődött analitok mosása után a vizsgálandó analitra specifikus biotinilált antitestkeveréket adagolnak mindegyik mintahelyre. A nem kötődött biotinilált antitestek
eltávolítását célzó mosás után streptavidin-fikoeritrin konjugátumot (Streptavidin-PE)
adagolnak mindegyik mintahelyre, amely hozzákötődik a biotinilált detekciós
antitestekhez. Egy utolsó mosás eltávolítja a nem kötődött Streptavidin-PE-t, és a
mikrorészecskéket ezután újra szuszpendálják pufferben, majd a méréseket Luminex
analizátoron végzik. A mérés során a készülék kétféle lézert használ: az egyik lézer
mikrorészecske-specifikus, amely meghatározza, hogy melyik analitot vizsgáljuk, a
másik lézer a fikoeritrin által adott szignál erősségét jelzi, amely egyenesen arányos a
megkötött analit mennyiségével.
A mérés menete:
A mikrorészecske-koncentrátumokat a mellékelt keverőüvegben hígítottuk. A 4.
táblázatban látható mikrorészecske- koncentrátum mennyisége minden egyes analitra
értendő (pl. teljes tálca IL-1β és IL-6 mérése esetén adjunk 50µl IL-1β mikrorészecskekoncentrátumot és 50µl IL-6 mikrorészecske- koncentrátumot 5 ml mikrolemez
hígítóhoz.)
31
4. táblázat: Mérési helyek kiosztása a 96-os plate-en
Felhasznált mérési helyek
Mikrorészecske
koncentrátum
50 µl
37,5 µl
25 µl
12,5 µl
96
72
48
24
Mikrorészecske hígító
5 ml
3,75 ml
2,5 ml
1,25 ml
A vizsgálatokat RD6-40 Kalibrátor diluenssel négyszeresre hígított szérum- és
plazmamintákból végeztük.
Ezt követően az alábbi lépések történtek:
1.
A leírás szerint a reagenseket, mintákat és standardokat előkészítettük. Előre
megnedvesítettük a lemezt 100 µl mosópuffer hozzáadásával. Eltávolítottuk a
folyadékot
a
mérőhely
alján
lévő
szűrőn
át,
a
mikrolemezhez
tervezett
vákuumelosztóval.
2.
50 µl hígított mikrorészecske keveréket adtunk mindegyik mérőhelyre.
3.
50 µl standardot vagy hígított mintát adtunk az adott mérőhelyre. 3 órán
keresztül mikrolemezrázón inkubáltuk
4.
A lemezt úgy mostuk, hogy a folyadékot mindegyik mérőhelyről eltávolítottuk,
majd minden mintahelyet megtöltöttünk mosópufferrel (100 µl), és ismételten
eltávolítottuk a folyadékot. A mosást háromszor ismételtük.
5.
50 µl hígított Biotin Antitest koktélt adtunk mindegyik mérőhelyre, majd a
lemezt rázókészüléken inkubáltuk 1 órán át.
6.
A mosást a 4. pontnak megfelelően megismételtük.
7.
50 µl hígított Streptavidin-PE-t adtunk mindegyik mintahelyre
8.
30 percen át rázón inkubáltuk.
9.
A mosást a 4. pontnak megfelelően megismételtük.
10.
100 µl mosópuffert adtunk mindegyik mintahelyre, majd 2 percig inkubáltuk.
11.
Luminex analizátor felhasználásával az eredményt 90 percen belül olvastuk le.
Az eredmények kiszámítása:
A Standard Érték kártyákon lévő koncentrációk felhasználásával kiszámítottuk a
háromszoros hígítási sor koncentrációit az egyes hígításokra. Mindegyik standard és
32
minta duplikált eredményeinek átlagát vettük és kivontuk az átlag vak RFU (relative
fluorescens unit) középértékét.
Standard görbét készítettünk mindegyik analitra számítógépes 5-PL görbe
illesztéssel, amelyet számítógépes szoftveres adatredukció segítségével állítottunk elő.
Alternatív megoldásként készítettünk standard görbét úgy, hogy az y tengelyen
mindegyik standardra bejelöltük a median RFU értéket az x tengelyen lévő
koncentrációs értékekkel szemben, és a pontoknak legjobban megfelelő görbét
ábrázoltuk. Az adatok lineárissá tehetők még a citokin-koncentráció logaritmikus
értékeinek és az RFU logaritmikus adatainak ábrázolásával. Az ehhez legjobban illő
egyenes ezután regressziós elemzéssel meghatározható.
Az
egyes
minták
citokin-koncentrációjának
meghatározásához
először
megkerestük az y tengelyen az RFU értéket, melyet a standard görbére vetítettünk. A
metszéspont segítségével az x tengelyen leolvastuk a megfelelő citokinkoncentrációt.
Mivel a mintákat hígítottuk, a standardgörbéről leolvasható koncentrációt meg
kellett szorozni a hígítási faktorral. Az assay-t az R&D által előállított, magas
tisztaságú rekombináns humán citokinekkel szemben kalibráltuk.
4.3.1.2 Citokinszintek mérése Biochip rendszerrel
A mérés elve:
Az Evidence Investigator™ Biochip Array (Randox Ltd, Crumlin, United
Kingdom) technológia egy mintából egyszerre több analit kvantitatív meghatározására
használható. A Randox Biochip technológia egy szilárdtest eszköz alkalmazását jelenti,
melyben az egyes tesztrégiók különböző citokinekre és növekedési faktorokra
specifikus immobilizált antitesteket tartalmaznak. A citokin meghatározására sandwich
kemilumineszcens immunoassayt (enzimmel jelölt antitest próba) használnak. A minta
magas citokinszintje nagy torma-peroxidázzal jelölt antitest-kötődést, így nagy
kibocsátott kemilumineszcenciát eredményez.
A biochip egyes tesztrégiói által kibocsátott fényt digitális képfeldolgozási
technika érzékeli, majd egy tárolt kalibrációs görbe értékeivel hasonlítja össze. A minta
analit-koncentrációját a kalibrációs görbe alapján határozza meg.
Számos, az Evidence Investigator™ segítségével meghatározható különböző
immunoassay alapú, egyszerre több analit vizsgálatát lehetővé tévő próbát fejlesztettek
ki.
33
Az evidence investigator™ Citokin Array egyszerre határozza meg az IL-1α, IL1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, IFNγ, EGF, MCP-1 és TNFα szintet.
A mérés menete:
1. Cellánként 200 µl diluenst használtunk.
2. Cellánként 100 µl kalibrátort / mintát juttattunk a tálcára.
3. A tálcát a termoséker lapjára rögzítettük, majd 1 órán át 37°C-on 370 rpm
sebességgel inkubáltuk.
4. Az inkubációt követően a hordozókat tartalmazó tálcát eltávolítottuk el a
termosékerről. A reagenseket egy hirtelen mozdulattal kiürítettük a tálcáról.
5. Közvetlenül ezután két ciklusban lemostuk a tálcát. A hígított mosópuffert
tartalmazó mosópalack segítségével minden cellához 350 µl mosópuffert adtunk,
óvatosan megmozgatva, hogy az esetleg a biochipek alá került reagenst is
eltávolítsuk, majd egy hirtelen mozdulattal kiürítettük. Ezután még további 4
mosási ciklust vittünk véghez. Minden ciklus alatt a biochipeket 2 percen át
hagytuk állni a mosópufferben.
6. Az utolsó mosás után a hordozót óvatosan szűrőpapírra helyeztük a maradék
puffer eltávolítása érdekében.
7. Azonnal 300 µl konjugátumot pipettáztunk minden cellába.
8. Óvatosan megmozgattuk a tálcát.
9. A tálcát a termoséker lapjára rögzítettük, majd 1 órán át 37°C-on 370 rpm
sebességgel inkubáltuk.
10. Az inkubációt követően a hordozókat tartalmazó tálcát eltávolítottuk a
termosékerről. A reagenseket egy hirtelen mozdulattal kiürítettük a tálcáról.
11. Közvetlenül ezután a tálcát két ciklusban mostuk. A hígított mosópuffert
tartalmazó mosópalack segítségével minden cellához 350 µl mosópuffert adtunk.
Ezt további 4 mosási ciklus követte. Minden ciklus alatt a biochipeket 2 percen át
állni hagytuk a mosópufferben.
12. Az utolsó mosás után megtöltöttük a cellákat mosópufferrel, és közvetlenül a
képfeldolgozásig, de maximum 30 percig abban hagytuk a hordozókat.
13. A hordozókat egyenként dolgoztuk fel. A feldolgozásra váró hordozókat fénytől
óvtuk.
34
14. Közvetlenül a jelölő hozzáadása előtt a mosópuffert egy határozott mozdulattal
eltávolítottuk, majd a hordozót szűrőpapírra helyeztük a maradék mosópuffer
eltávolítása érdekében.
15. Ezután 250 µl aktív jelölő reagenst adtunk minden cellához és letakartuk a
fényvédelem céljából.
16. 2 perccel azután, hogy az utolsó cellához hozzáadtuk a jelölő reagenst, a tálcát az
Evidence Investigator készülékbe helyeztük.
17. A képek feldolgozása ezután automatikusan elindul.
Az eredmények kiszámítása:
A beépített erre a célra fejlesztett szoftver segítségével az eredmények azonnal
feldolgozása és kiértékelésre kerültek.
4.3.1.3 Egyedi citokinszint-mérések
4.3.1.3.1 IL-6-szint mérése Roche Modular E170 analizátorral
A mérés elve:
Az
egyedi
IL-6
szinteket
Roche
Modular
E
170
analizátorral,
elektrokemilumineszcens immunoassay-vel határoztuk meg. A teszt kifejlesztésénél a
szendvics-elvet vették alapul. A mintát először monoklonális antitest , majd jelölt
monoklonális antitest hozzáadásával inkubálja a készülék. A pozitív reakciót a
sztredtavidin bekötődése jelzi a chemiluminescens intenzitás megjelenésével.
A mérés menete:
1. inkubáció: 30 µl mintát inkubáltunk biotinizált monoklonális IL-6-specifikus
antitesttel.
2. inkubáció: A ruténium komplex-szel a jelölt monoklonális IL-6-specifikus antitest
és a sztreptavidinnel fedett mikrorészecskék hozzáadása után az antitestek a
mintában található antigénnel immunkomplexet hoznak létre.
A berendezés a reakcióelegyet a mérőküvettába szívja, ahol a mikrorészecskéket
(magnetizálható mikropartikulumokat) az elektróda a felszínén mágneses úton befogja.
A kötetlen anyagok ezután a mosófolyadék ProCell-lel együtt távoznak a rendszerből.
Az elektródára kapcsolt feszültség kemilumineszcens fénykibocsátást indukál, amit egy
fotomultiplier mér.
35
Az eredmények kiszámítása
Az eredményeket a készülék a kalibrációs görbe alapján határozza meg, amelyet
készülék-specifikusan, 2-pontos kalibrációval és a reagens-vonalkódból leolvasott
kalibráiós-görbe felhasználásával generál.
4.3.1.3.2 IL-6-szint mérése R&D ELISA módszerrel
A mérés elve:
A módszer kvantitatív enzim-immunoassay technikán alapul. IL-6-ra specifikus
monoklonális ellenanyagot visznek fel egy mikroplate-re. A standardok és a minták IL6 mennyisége az immobilizált ellenanyaghoz tapad. A kitapadt IL-6 kimutatására
mosást követően enzimhez( torma-peroxidázhoz) kapcsolt poliklonális ellenanyagot
visznek be a rendszerbe. Majd újabb mosás történik. Ezután a rendszerben maradt
torma-peroxidáz, (mennyisége a mintában levő IL-6 koncentrációtól függ) bontja a
kromogént tartalmazó hidrogén peroxid szubsztrátot, aminek a kapcsán a reakcióelegy
színintenzitása változik. Ez arányos a minta IL-6 tartalmával. A mérés során a
színintenzitás erősségét határozzuk meg.
A mérés menete:
A standardokat és reagenseket az előírásoknak megfelelően a méréshez
előkészítettük.
1. A mikroplate egyes mélyedéseibe 100 µl RD1W hígítót (assay diluent reagenst)
mértünk be.
2. Az egyes mélyedésekbe 100-100 µl standardot, mintát, vagy kontrollt mértünk be,
majd lezártuk a mellékelt fóliával.
3. Két órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk.
4. Ezt követően az egyes mélyedésekben lévő reakcióelegyet kiszívtuk, majd
háromszor mostuk. A mosást 400 µl mosópufferrel (Wash Buffer) végeztük; minden
egyes alkalommal a folyadékot teljes mértékben eltávolítottuk.
5. 200 µl IL-6 konjugátumot mértünk be az egyes mélyedésekbe, majd egy új fóliával
letakartuk a mikroplate-et. Két órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltunk.
6. Ezt követően négyszer újra mostuk az egyes mélyedéseket.
36
7. Az egyes mélyedésekbe 200 µl szubsztrátoldatot mértünk be, majd 20 percen
keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk, fénytől védve.
8. A reakciót az egyes mélyedésekbe mért 50 µl Stop Solution oldattal állítottuk le. Az
oldat színe kékről sárgára változott.
9. 450 nm-s hullámhosszon az abszorbancia értéket az egyes mélyedések esetében 30
percen belül lemértük mikroplate readerrel. Referencia-hullámhosszként 540 nm-t
használtunk.
Az eredmények kiszámítása:
Az abszorbanciaértékeket kétszer olvastuk le, a kapott értékeket átlagoltuk. A
standard értékekre a mikroplate-reader számítógépes programjának segítségével négy
paraméteres logisztikus görbét illesztettünk, az így képzett standardgörbe alapján tudtuk
meghatározni az egyes mintákban az IL-6 szintet.
4.3.1.3.3 TNFα-szint mérése R&D Elisa módszerrel
TNFα-szint mérési elve, menete és az eredmények kiszámítása egyezik a
4.3.1.3.2. pont alapján az IL-6 kapcsán bemutatottakkal, azzal a különbséggel, hogy
ennél a mérésnél nem IL-6, hanem TNFα monoklonális és poliklonális antitesteket
tartalmazott a rendszer.
4.3.2 Egyéb vizsgálatok
A rutinlaboratóriumi mérések és a citokinszint-meghatározások mellett több
vizsgálatunk kapcsán a fémionok és a redox-paraméterek meghatározására is sor került.
4.3.2.1 Fémion-meghatározások
A fémion-meghatározásokhoz
citrátos vért
vettünk; a
plazmát és a
vörösvértesteket a szokásos módszerekkel választottuk el. A mintákat kétszer 10 percen
keresztül 2500 rpm-en centrifugáltuk 4 °C-on. A vörösvértest szuszpenzió méréséhez a
minta hemoglobintartalmát egységesen 1 g%-ra állítottuk be. A plazmát és a
vörösvértest szuszpenziót is 4 °C-on tároltuk a mérésekig (amelyekre a vérvételt
követően 12 órán belül sor került).
A fémion-koncentrációkat ICP-OES készülékkel mértük, ami egy Spectro
Genesis készülékhez induktív módon kapcsolt plasma emissziós spektrométer (Kleve,
37
Germany). A vérminták (1 ml) salétromsav (5 ml) és hidrogénperoxid (2 ml)
keverékével történő roncsolása, majd 10 ml desztillált vízzel való hígítása után 15
fémion (Al, Ba, Ca, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, Ni, P, Pb, Sr, Zn) szintjét határoztuk meg.
A mérések során a vak kivonás, a háttérre való korrekciója mellett háromszor három
szekundum integrációs időt használtunk. A kalibrációs görbékhez különböző
koncentrációjú (0, 1, 5, 10, 20, 50 µg/ml) standard oldatokat használtunk. Mivel az ICP
mérések során a mátrixhatás jelen van, ugyanabban a mátrixban (5% HNO3 oldatok)
hígítottuk a standardokat, mint a mintákat [Szentmihályi és mtsai 2004].
A szelén a vörsvérsejtekben normál esetben olyan alacsony koncentrációban
volt, hogy nem tudtuk kiértékelni. Így előkezelés után a szeléniumtartalmat voltametriás
módszerrel a polarográfiás hatás alapján végeztük. [May és munkatársai 2005]
4.3.2.2 Antioxidáns aktivitás meghatározási módszerek
Redukálóképesség meghatározása
Plazma esetében 200 µl mintát használtunk és bidesztillált vízzel 1 ml-re
egészítettük ki a térfogatot, majd 2,5 ml 6,6-os pH-jú foszfátpufferrel (0,2 M) és 2,5 ml
1 %-os K3Fe(CN)6-oldattal elegyítettük, ezután 30 percig 30 oC-on inkubáltuk. 2,5 ml
10 %-os triklórecetsav-oldat hozzáadása után a reakcióelegyet 10 percig centrifugáltuk
2500 rpm-mel. A felülúszó 2,5 ml-ét 2,5 ml bidesztillált vízzel összekeverve, majd 0,5
ml 0,1 %-os FeCl3-oldatot hozzáadva, a kialakult szín intenzitása 700 nm-en mérhető,
és arányos a minta redukálóképességével. Referenciavegyületként aszkorbinsavat
használtunk. A minta redukálóképességét aszkorbinsav ekvivalensben (ASE) adtuk
meg. 1 aszkorbinsav ekvivalens az egységnyi térfogatú minta (1 ml) redukálóképessége,
ha hatása egyenértékű 1 µmol aszkorbinsavval [Oyaizu és mtsai 1986].
H-donor- aktivitás meghatározása
A
plazmaminták
H-donor
aktivitásának
meghatározása
1,1-difenil-2-
pikrilhidrazil stabil szabad gyök segítségével történt spektrofotometriásan.
A vizsgálathoz 50 µl plazmát 950 µl bidesztillált vízzel kiegészítettünk 1 ml-re,
majd 1 ml metanolt adtunk hozzá. Ehhez 500 µl metanolos DPPH-oldatot (9 mg DPPH
100 ml metanolban oldva) adtunk, és alapos összekeverés után a reakcióelegyet 30
percig 37 oC-on inkubáltuk. 10 perces centrifugálást (3000 rpm) követően olvastuk le az
abszorbanciát 517 nm-en metanol vakkal szemben. Az eredményt gátlás %-ban adtuk
meg:
38
gátlás % = [Abs(kontroll) - Abs(minta)] / Abs(kontroll)x100] [Hatano és mtsai 1988].
Össz –scavenger kapacitás meghatározása
Csekély mennyiségű humán plazmából (0,15 ml), ill. vörösvértestből (0,05 ml)
történt a vizsgálat. A kémiai reakció lényegében a H2O2/.OH - mikroperoxidáz - luminol
rendszer (pH 10,5) gátlása. A H2O2/.OH - mikroperoxidáz - luminol rendszer lúgos pHn fényt bocsát ki, mert a vaskomplex hatására a H2O2-ból .OH. gyök keletkezik Fentonreakcióban, és a gyök a luminolt gerjeszti. A luminol aminoftalát stabil anionná alakul
át és hν kvantum (420 nm) távozik. Ha a rendszerhez plazmát vagy vörösvértestszuszpenziót adunk, akkor ez a kémiai (kemilumineszcencia) reakció gátlódni fog. Az
úgynevezett totál scavenger kapacitás értéket (TSC) RLU %-ban (relative light unit)
adjuk meg. A méréshez Berthold Lumat 9501 készüléket használtunk [Blázovics és
mtsai 1999].
4.3.2.3 Transzmetilálás vizsgálata
A transz-metilezési folyamatok molekuláris résztvevőinek összessége nem
ismert, de a megköthető HCHO mennyisége addukt-képzést követően analitikai
módszerekkel mérhető, alkalmas a mobilizálható -CH3-pool mennyiségi jellemzésére.
A HCHO-t kromatográfiás elválasztás-technikával dimedon addukt formában
(formaldemeton), Gersbeck és mtsai [1989] módszerének adaptálásával határoztuk meg.
A mintákat 0,05%-os dimedon oldattal kezeltük (0.5 cm3 minta/ 0.5 cm3 dimedon). Az
így kapott szuszpenziót 10 percig 4oC-on centrifugáltuk (1500 g). A vizsgálatokhoz a
tiszta felülúszót használtuk. A kromatográfiás elválasztást Kieselgel 60 F254
vékonyréteg-lapon (Merck Co, Darmstadt, Germany) végeztük, kloroform:diklór-metán
65:35 (V/V) elegyével. A minőségi és mennyiségi azonosítás standard vegyület
alkalmazásával történt λ=265 nm hullámhosszon, Shimadzu CS-930 TLC/HPTLC
scanner (Shimadzu Co, Kyoto, Japan), segítségével [Blázovics és mtsai 2008].
4.3.2.4 Zn-protoporfirin és protoporfirin meghatározás
A meghatározáshoz EDTA-s vért használtunk. 100 µl vérhez 400 µl desztillált
vizet adva 30 percig fénytől elzárva végeztük a haemolizálást, majd a haemolizátum
100 µl–hez 6 ml 96%-os etanolt adtunk és 3000 rpm-en 5 percig centrifugáltuk. A
felülúszóból végeztük a meghatározást. 405 nm hullámhosszúságú fénnyel besugározva
39
mértük a minta fluorescens emisszióját 570-660 nm között Hitachi F-4010
spektrofluoriméterrel [Chisolm és mtsai 1976].
4.4
A vizsgálatokhoz felhasznált vegyszerek és kitek
A rutin kémiai és immunkémiai vizsgálatokat Roche kémiai és immunkámiai
tesztekkel végeztük (Roche Hitachi Modulár automatán) Kivételt képez a CRP, melyet
Olympus immunturbidimetriás teszttel és PSA free PSA, melyeket Abbott MEIA
teszttel métünk. . A rutin hematológiai vizsgálatok Simens Advia 120 hematológiai
automatával készültek. A szuperoxid-dizmutáz (SOD) meghatározása Ransod SDI125
kit leírásában ajánlott módszer szerint történt, a Glutation- peroxidáz (GSH/Pox)
meghatározása pedig a Ransel RS505 kit leírása szerint.
Az ICP OES kalibrációhoz Merk ICP standardokat használtunk.
A luminolt, microperoxidast, hydrogen- peroxidot, and 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrasyl
gyököt a SIGMA (St.Louis) cégtől szereztük be. A többi kémiai reagenst a Reanal Kftnél vásároltuk.
4.5
Statisztikai elemzés
A citokinszintek igen nagyfokú egyéni variabilitást mutatnak, ezért nem
követnek normál eloszlást. Emiatt az adatokat medián, tartomány, illetve medián,
interkvartilis (IQR) tartomány formájában adom meg. A különböző vizsgálati csoportok
összehasonlítása nem-parametrikus próbákkal (Wilcoxon, Mann-Whitney, Friedmannteszt) történt. Bizonyos vizsgálatok kapcsán speciális statisztikai próbákra is sor került,
ezeket az 5. pont alatt ismertetem.
A fémek és antioxidánsok vizsgálatoknál átlag és szórás alapján történt a
kiértékelés. A statisztikai analízishez az egyutas variancia (ANOVA) analízist
használtuk. [Dinya 2007]
40
5
Eredmények
5.1
Összehasonlító vizsgálatok
A különböző mérési rendszerek között lényeges különbségek vannak (antitestek
eltérőek, vizsgálat menete változó, eltérő a módszerek érzékenysége stb.) Ez
megnehezíti a kapott eredmények összehasonlítását. Az irodalomban a különböző
multiplex rendszerek alkalmazásával nyert értékek összehasonlítására vonatkozóan
eddig nem jelent meg adat.
Az IL-6-szint esetében alkalmazott Roche, Biochip és Bioplex módszerekkel
mért értékeket az 5. táblázat és 4. ábra mutatja. Egy résztvevő esetében mértünk
mindhárom rendszerben méréshatár feletti (over the level of detection, OLD) értéket.
Az egyes rendszerekben mért IL-6- szintek szorosan összefüggtek egymással, de a
Bioplex rendszerrel mért IL-6-szintek közel szignifikáns mértékben magasabbak voltak,
mint az Roche (p = 0,07), illetve Biochip (p = 0,06) rendszerrel mért értékek.
5. táblázat: Egészséges önkénteseknél a különböző rendszerekkel mért szérum IL-6-szintek
Résztvevő
IL-6 Roche
sorszáma
pg/ml
1
1,5
2
1,5
3
1,5
4
1,5
5
1,5
6
3,6
7
3,78
8
4,78
9
5,65
10
7,94
11
10,5
12
13,5
13
17,1
14
38,1
15
97,4
16
107
17
243
18
472
19
525
20
OLD
módszer
Roche vs. Biochip
Biochip vs. Bioplex
Bioplex vs. Roche
IL-6 Biochip
IL-6 Bioplex
pg/ml
pg/ml,
1,09
4,44
1,01
3,56
1,79
9,42
1,09
6,13
1,29
14,3
2,98
4,37
1,62
5,99
2,68
6,2
4,41
11,7
4,2
12,3
24,53
51,1
1,13
3,09
4,5
9,9
32,9
6,49
61,6
198
114
171
462
1199
806
1308
663
1574
OLD
OLD
r érték
0,98
0,97
0,97
41
IL-6
pg/ml
IL-6 szint Roche, Biochip és Bioplex módszerrel
10000
1000
IL-6
(Roche)
100
IL-6
Biochip
10
IL-6
Bioplex
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
betegek
4. ábra: Egészséges önkénteseknél a különböző rendszerekkel mért szérum IL-6-szintek a
különböző mérési tartományokban
A Bioplex és a Biochip rendszerekkel meghatározott citokinek szintjét külön is
összehasonlítottuk (lásd. 6. táblázat). Az egyes mérési rendszerekkel meghatározott
analitok szintjében az összefüggés erőssége nagymértékben analit-függő volt (0,28 és
0,98 között változott). A Bioplex rendszerben több alkalommal mértünk méréshatár
(BLD) alatti értéket, mint a Biochip rendszer esetében. A mérhető értékek esetében a
Bioplex rendszernél szignifikánsan vagy közel szignifikánsan nagyobb IL-6 (p = 0,02),
IL-4 (p = 0,06) és IFNγ (p = 0,09) értékeket mértünk. [Bekő, 2008]
42
6. táblázat: Biochip és Bioplex rendszerekkel mért citokinszintek, és ezek összefüggése BLD = kimutathatósági határ alatt
IL-6
sorszám
Biochip
IL-2
Bioplex
Biochip
1
1,62
5,99 BLD
2
1,09
4,44
3
1,01
3,56 BLD
4
1,79
9,42
5,30
5
1,09
6,13
5,30
6
1,29
Bioplex
Biochip
IL-10
Bioplex
Biochip
BLD
7,88
29,10 BLD
6,55 BLD
7,80
22,30
BLD
6,77
24,50 BLD
23,84
8,52
36,70
1,50
78,23
302
10,37
32,92
14,30 BLD
7 >900
IL-8
TNF-α
Bioplex
Biochip
IL-4
Bioplex
Biochip
IFNγ
Bioplex
Biochip
Bioplex
2,15
3,02 BLD
4,82 BLD
2,44 BLD
46,43
2,13 BLD
4,69 BLD
2,44 BLD
1,83
2,54 BLD
4,43 BLD
2,44 BLD
1,16
6,09
2,95
38,30
5,21
16,00
2,44
68,75
1,53
3,15
3,65
4,64
6,65
2,40
2,95
16,72
5,58
3,02
13,06
6,91
1,16
82,10 BLD
11,04 BLD
51,94
15995
6,84
257
970
1608
362
1919
161
715
3,32
101,47
7,98
1194
8
806
1307
8,94
78,37
405
391
70,00
307
98,49
198
7,83
16,00
12,76
227
9
462
1199
7,26
218
461
581
28,00
491
54,71
204
2,78
29,48
2,95
372
10
61,64
3,95
61,64
4,51
3,78
14,27
3,18 BLD
2,28
41,43
11
663
1573
3,00
6,90
663
929
3,79
11,11
14,50
51,48
6,38
5,94
13,01
134
12
4,20
12,29
5,10 BLD
57,66
180
2,29
13,39
3,37
5,83
4,27
0,90
2,17
12,48
13
114
171
14 >900
197 BLD
>32000
432 BLD
6,62
181
1394
904
5,88
14,40
2,28
4,64
4,69
122,52
2,28
5,32
265,20
2671
9743
28,34
135
24,21
1301
5,39
180,57
31,89
15,80
249
8400
7,62
9,72
6,02
10,63
4,69
4,94
2,28
15
24,53
16
4,41
11,68
5,32 BLD
468
961
1,72
2,70
17
2,68
6,20
5,10 BLD
213
192
8,04
13,20
18
32,95
6,49
10,80 BLD
17,90
22,28
6,43
27,38
19
1,13
3,09 BLD
7,84
8,85
1,17
1,89
2,65 BLD
2,91 BLD
BLD
BLD
20
4,50
9,94
36,00
28,07
1,29
1,63
6,53 BLD
2,91 BLD
BLD
BLD
0,48
0,28
r érték
0,97
51,09 BLD
2144
BLD
6,18
0,35
0,48
0,68
0,98
43
11,69 BLD
4,19
12,18
10,79 BLD
5,25 BLD
36,01
BLD
BLD
4,55 BLD
2,73 BLD
7,83 BLD
4,78
14,62
0,83
Az esetenként gyenge erősségű összefüggéseken túl az egyes rendszerekkel mért
citokinszintek között szisztémás eltérést is kimutattunk. Ez arra hívja fel a figyelmet, hogy az
egyes rendszerek alkalmazásakor a vizsgálatot végző laboratóriumnak külön-külön meg kell
határozni az egészséges egyénekre vonatkozó referenciaértéket, illetve, hogy a referenciaérték
feltüntetése mellett érdemes jelezni, hogy milyen módszerrel történt a meghatározás.
5.2
Klinikai vizsgálatok
5.2.1 Citokinszintek perinatális jelentősége
5.2.1.1 Aszfixia, teljes testhűtés és citokinkinetika
Kísérleti adatok alapján az újszülöttkori posztaszfixás agykárosodásban a gyulladásnak,
illetve az aktivált immunsejtek okozta idegsejt-károsodásnak központi szerepe van. Az
immunaktivációt a gyulladásos citokinek, az IL-1, IL-2, IL-6, TNFα és IFNγ szintek emelkedése
is jelzi, melyek a gyulladás kiváltásában és fenntartásában egyaránt közrejátszanak. A
gyulladásos citokinek szintje az irodalmi adatok szerint perinatális aszfixiát követően
ugrásszerűen nő. Az elhúzódó terápiás hipotermia igazoltan javítja a kimenetelt, ezért egyre
elterjedtebben használják. A hipotermia idegvédő hatásának egyik eleme a szisztémás
gyulladásra kifejtett gátló hatás lehet; ezt a hipotézist a szisztémás citokinszintek mérése alapján
kívántuk igazolni.
A citokinszintek statisztikai elemzésekor két külön nem-parametrikus megközelítést
alkalmaztunk. Elsőként az egyedi citokinszinteket úgynevezett split-plot modellben elemeztük,
ami két rögzített faktort tartalmazott: a kezelést (hipo- és normotermia), illetve a posztnatális kort
(6, 12, 24, és 72 óra). A betegek ebben a modellben random változóként szerepeltek.
A citokinszintek nem követtek normál eloszlást. Ezért az egyes értékeket rankokkal láttuk
el, a további számítások során ezeket a rankokat használtuk. A fő hatások és a közöttük lévő
kölcsönhatások szignifikancia szintjét a megfelelő F-próbákkal határoztuk meg; a 0,05 alatti p
értékeket tekintettük szignifikánsnak. Ezen túl a hűtés kezdete és a 6. órában mért logaritmizált
szérum citokinszintek közötti kapcsolat erősségét külön egyváltozós elemzéssel határoztuk meg.
Másik megközelítésként kiszámoltuk az egyes citokinértékek esetében a relatív hatás
értékeket (REV). A relatív hatás azt jelzi, hogy egy adott csoportban egy adott időpontban mért
citokinérték mekkora valószínűséggel lesz az összes csoport összes időpontjában citokinszintek
középértéke felett [Brunner, 2002]. Az alacsony REV értékek kisebb, míg a nagy REV értékek
nagyobb citokinszintre utalnak. A módszernek köszönhetően az egyidejűleg mért különböző
44
(gyakran extrém) citokinszintek tendenciájukban összehasonlíthatóvá válnak. A relatív hatásokat
az SAS program F1_LD_F1.sas makró alkalmazásával számoltuk.
A számított REV értékeket a mért citokinek biológiai hatásai szerint csoportosítottuk. A
proinflammatorikus IL-1-α, IL-1-β, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ és TNF-α citokinek REV értékeit,
illetve az antiinflammatorikus IL-4 és IL-10 REV értékeit egyszerre elemeztük – azaz a pro- és
antiinflammatorikus citokinek átlagos REV értékeit mind a két kezelési csoportban minden egyes
időpontban meghatároztuk. A Th2 – Th1 arány jellemzésére az IL4/IFN γ arány REV értékeit
külön elemeztük. ’Repeated measures ANOVA’ tesztet alkalmaztunk a posztnatális kor és a
kezelés pro- és antiinflammatorikus citokin REV értékekre, valamint az IL-4/IFN γ arány REV
értékre gyakorolt hatásának a meghatározására. A p < 0,05 értéket statisztikailag szignifikánsnak
tartottuk. Mivel explorátoros vizsgálatot végeztünk, nem korrigáltuk a p értéket az
öszehasonlítások számára (így az első fajú hiba nominális értéke meghaladta a 0,05-t). Az
elemzésből az MCP-1, EGF és VEGF szinteket kihagytuk, mivel immunmoduláns hatásuk nem
definiált.
A hipotermiás, illetve a normotermiás körülmények mellett mért citokinszinteket a 7.
táblázat összegzi. A méréstartományon kívül eső okok miatt a minták 94%-ában lehetett
meghatározni a citokinszinteket; a hiányzó adatok megoszlása a két csoportban egyenletes volt.
Az egyes csoportokon belül a citokinszintek nagymértékű variabilitást mutattak, bár a
hipotermiás csoportban 6 órás időpontban valamelyest alacsonyabbnak tűntek. A posztnatális kor
szignifikáns hatást gyakorolt az IL-6, IL-8 és IL-10 szintre (5. ábra). A szérum IL-8- és IL-10szint nagymértékben csökkent a 6. és a 72. posztnatális óra között (6. ábra). A szérum IL-10szintek a 6. órában mért [medián (interkvartilis tartomány)] 4,25 (1,61-45,4) pg/ml értékről a 72.
órára 1,6 (0 – 2,3) pg/ml szintre zuhantak a hipotermiás csoportban (p = 0,001), míg a
normotermiás csoportban 179.3 (1,72 – 900) pg/ml értékről 1,22 (0,98 – 2,5) pg/ml-re
csökkentek.
A posztnatális kor és a kezelés között az IL-6-szint esetében interakciót figyeltünk meg. A
hipotermiás csoportban a szérum IL-6-szint a 6. órában alacsony volt és az első 72 órában nem is
változott, míg a normotermiás gyermekeknél ugyanezen idő alatt a tizedére csökkent (6. ábra). (A
szérum IL-6-szint a 6. posztnatális órában a hipotermiás csoportban 31,62 (16,30-43,03) pg/ml, a
normotermiás csoportban 381,47 pg/ml (36,86-465,58) pg/ml (Mann Whitney teszt, p = 0,017). A
hűtött csoportban a 6. órában mért szérum IL-6 szintek szignifikánsan összefüggtek a megelőző
hűtés időtartamával: r2=0,47, p = 0,026.
A TNF-α esetében a posztnatális kor és a kezelés között figyeltünk meg kölcsönhatást.
Ennek a citokinnek a szintje a hipotermiás csoportban alacsonyabb volt a 6. órában.
45
A proinflammatorikus citokinszintek közös jellemzésére bevezetett REV értékek esetében
a 6. és a 72. posztnatális óra között a posztnatális kor közel szignifikáns hatását észleltük (p =
0,049), a posztnatális kor és a hipotermia között pedig kölcsönhatást találtunk (p = 0,049), (7.
ábra).
A hipotermiás kezelés esetében szignifikáns hatást találtunk az antiinflammatorikus REV
értékek esetében (p = 0,023), ez elsősorban a hipotermiás csoportban mért alacsonyabb REV
értékeknek volt köszönhető (8. ábra). Ezen túl mind a két csoportban a 6. és a 72. óra között az
IL-4/IFN-γ arány REV értékei szignifikánsan emelkedtek (p < 0.001) (9. ábra).
46
7. táblázat: Citokinszintek hipotermiás és normotermiás körülmények között kezelt aszfixiás újszülötteknél a 6 – 72. posztnatális órában. BLD =
kimutathatósági határ alatti érték
Hipotermia
Szérum
citokin
Normotermia
72 óra
6 óra
12 óra
Idő
hatás
72 óra
Kölcsön-hatás a
két faktor között
6 óra
12 óra
24 óra
IL-1-α
(pg/ml)
0,72 [ 0 -1,9]
BLD [ 0 –
4,32]
0,34 [ 0 -1,26]
BLD [0 -5,75] 0,68 [0 -1,19] BLD [ 0 -1,12] BLD [0 -0,72]
0,72 [0 -1,94]
0,75
0,25
0,96
IL-1-β
(pg/ml)
BLD [0 -8,4] 0,97 [ 0 – 7,96]
0,955[ 0 – 7,7]
BLD [0 – 22]
1,29 [0 -2,05]
1,14 [ 0 -1,8]
1,1 [0 -2,38]
0,83 [0 – 1,9]
0,33
0,46
0,61
IL-2
(pg/ml)
BLD [0 -6,9]
6,0 [ 0 – 10,5]
2,64 [ 0 -8,74]
6,0 [0 -10,3]
BLD [0 – 9 ]
BLD [ 0 – 4,9]
BLD [0 – 11]
BLD [0 -5,27]
0,38
0,81
0,34
IL-4
(pg/ml)
3,1 [ 0 – 9,6]
4,6 [ 2,4 – 6,9]
4,3 [ 0 – 6,9]
4,1 [0 – 8,5]
6,1 [2,8 -16]
4,6 [ 2,6 -7,2 ]
5,5 [3,1 -11,3] 4,2 [3,8 – 5,4]
0,16
0,15
0,09
IL-6
(pg/ml)
32 [3,4 –
111]
79 [ 16 – 342]
97 [ 42 -800]
59 [6,4 -800]
381 [26-735]
170 [ 17-800]
117 [26 -735]
30 [15 -217]
0,23
0,01
0,01
IL-8
(pg/ml)
447
[39 - >2900]
190
[37- >2900]
123
[ 25-1457]
73
[20 ->2900]
374
287
[41-721]
[81-2361]
249
[28-518]
[31-2487]
0,93
0,01
0,74
IL-10
(pg/ml)
4,3 [1,6-5,4]
2,7 [0,98 –163]
1,6 [1,12 -20]
1,6 [ 0 – 2,3]
179[1,7-900]
8,47 [0 -138]
3,0[1,3 -36]
1,2 [0,98-2,5]
0,25
<0,0001
0,19
Interf.-γ
pg/ml)
7,2 [ 0 – 25]
10,1[ 0 – 111]
8,8 [3,8 –136]
8,2 [ 2,2 – 68]
6,4 [0 -11,7]
7,6 [0 -41,7]
6,2 [0 -53]
2,2 [ 0 – 6,8]
0,28
0,29
0,46
TNF-α
(pg/ml)
6,4 [3,5- 94]
11,6 [4,9–137]
8,6 [ 4,5 – 29]
8,8 [5,4 – 75]
9,1 [6,6 -30]
10,1 [5,2 -4,5]
9,7 [3,7 -22]
10[6,9 – 12,5]
0,94
0,89
0,02
47
24 óra
Kezelés
hatás
73
P value
5. ábra: IL-6 szintek hipotermiában és normotermiában (medián, interkvartilis tartomány)
6. ábra: IL-10 szintek hipotermiában és normotermiában (medián, interkvartilis tartomány)
48
REV
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Posztnatális kor (óra)
Hypothermia
Normothermia
7. ábra: ’measures ANOVA’ teszt: a posztnatális kor és a hipotermia proinflammatorikus citokin REV
értékekre gyakorolt hatása. Posztnatális kor hatása: p = 0,049; posztnatális kor és a hipotermia közötti
kölcsönhatás: p = 0,049. REV = relatív effekt, részleteket lsd. a szövegben
0,8
REV
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Posztnatális kor (óra)
Hypothermia
Normothermia
8. ábra: ‘Repeated measures ANOVA’ teszt a posztnatális kor és a hipotermia antiinflammatorikus
citokinek REV értékére gyakorolt hatásának a kimutatására (hipotermia: p < 0,001); részleteket lásd a
szövegben
49
0,8
REV
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Posztnatális kor (óra)
Hypothermia
Normothermia
9. ábra: ‘Repeated measures ANOVA’ teszt a posztnatális kor és a hipotermia IL-4/IFN γ arány REV
értékeire gyakorolt hatásának a kimutatására. (kor: p < 0,001) Részleteket lásd a szövegben
5.2.1.2 Endogén
kortizol
hatása
a
szisztémás
citokinszintekre
koraszülött
és
újszülöttkorban
A koraszülöttek egy részében az adekvát terápia ellenére is súlyos gyulladásos
szövődmények, elsősorban légzőszervi és idegrendszeri károsodások lépnek fel. E szövődmények
hátterében egy közös patomechanizmus, a „magzati gyulladásos válaszreakció szindróma” (Fetal
Inflammatory Response Syndrome) körvonalazódott. Ennek lényege a magzati korban az
immunrendszer generalizált aktivációja. A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma során a
magzat szervezetében a proinflammatorikus citokinek, elsősorban az interleukin-6 szintjének
emelkedése következik be. A gyulladásos citokinek szintjét a perinatális fertőzés alapvetően
meghatározza. Emellett azonban teoretikusan számos egyéb tényező, így az alkalmazott terápia
és az endokrin státusz is modulálhatja a gyulladás intenzitását. Munkánk során az endogén
kortizol potenciális jelentőségére vonatkozóan gyűjtöttünk adatokat.
A koraszülötteknél mért, igen nagyfokú variabilitást mutató kortizol- és citokinszinteket a
8. táblázat összegzi. Bár tendenciájában több citokin esetében is észleltünk eltéréseket a
megszületést követően, szignifikáns változást csak az emelkedő IL-10 szintek esetében mutattunk
ki. Szintén kefejezett emelkedést igazoltunk a kortizolszintek esetében a születés után a 3. és a 7.
napon (p = 0,006, illetve p = 0,02).
50
Az endogén kortizolszint egészséges referenciatartománya kora- és újszülöttkorban
nagyon tág határok között változik: gyakorlatilag eddig még nem határoztak meg egy olyan cutoff értéket, ami alapján el lehetne dönteni azt, hogy egy kora- vagy újszülöttnél indokolt-e a
kortizoladás. Ezért elemzésünk során azt a megközelítést választottuk, hogy a vizsgálatban
résztvevő gyermekeket (aszfixiás újszülötteket, illetve koraszülötteket) a kortizolszintek
középértéke alapján sztratifikáltuk ’középérték alatti’, illetve ’középérték és afeletti’ (’alacsony’
és a ’magas’ kortizolszintű) csoportokra. Az ezekben a csoportokban mért citokinszinteket a 9. és
10. táblázatok összegzik.
51
8. táblázat: Kissúlyú koraszülöttek citokin- és kortizolszintje az első hét életnapon. (Adatok medián, kvartilis formában megadva; IL= interleukin, IFN=
interferon, TNF=tumor nekrózis faktor)
0. nap
1. nap
3. nap
7. nap
Kortizol (pg/ml)
59,15 [13,51 – 144]
186,1 [66,98 – 186,1]
253,94 [186,1 – 694]
286 [186,1 – 533]
IFNγ (pg/ml)
22,18 [1,11 – 109,0]
22,18 [12,28 – 82,28]
1,11 [1,11 – 72,16]
1,11 [1,11 – 113]
IL-10 (pg/ml)
10,1 [3,58 – 19,0]
14,9 [8,7 – 27,6]
15,5 [8,89 – 29,6
14,5 [7,85 – 29,6]
IL-12 (pg/ml)
18,57 [5,47 – 40,4]
27,9 [16,6 – 45,5]
29,6 [16,6 – 53,2]
27,68 [16,2 – 49,6]
IL-13 (pg/ml)
1,56 [1,09 – 9,12]
1,13 [1,09 – 6,29]
1,99 [0,3 – 6,29]
2,42 [0,89 – 6,32]
IL-17 (pg/ml)
104 [42,7 – 156]
96,6 [26,5 – 137]
61,7 [4,72 – 126]
81,5 [34,6 – 125]
IL-1β (pg/ml)
5,55 [0,05 – 19,01]
10,28 [4,05 – 25,4]
8,58 [0,655 – 23,66]
10,98 [2,46 – 29,6]
IL-2 (pg/ml)
1,35 [0,16 – 15,35]
8,54 [0,16 – 20,70]
2,51 [0,16 – 15,32]
2,46 [0,16 – 15,32]
IL-4 (pg/ml)
8,98 [4,67 – 15,78]
4,67 [4,67 – 17,5]
4,67 [4,67 – 14,05]
4,67 [4,67 – 11,44]
IL-5 (pg/ml)
3,14 [1,15 – 5,75]
2,08 [1,42 – 5,75]
5,75 [2,58 – 10,78]
9,14 [5,26 – 14,06]
IL-6 (pg/ml)
14,58 [9,13 – 137]
33,89[12,5 – 89,5]
51,4 [24,26 – 96,16]
85,8 [40,2 – 150,0]
IL-7 (pg/ml)
0,65 [ 0,65 – 9,45]
0,65 [0,65 – 2,728]
0,65 [0,65 – 0,65]
0,65 [0,65 – 0,65]
IL-8 (pg/ml)
417,8 [96,9 – 1351]
1284 [325 – 3444]
1102 (490 – 2296)
1155 [455 – 5506]
TNFα (pg/ml)
8,53 [ 3,59 – 31,93]
14,51 [6,51 – 32,25]
11,13 [3,59 – 23,84]
8,53 [3,59 – 31,93]
52
9. táblázat: táblázat Magas endogén kortizolszintű kissúlyú koraszülöttek citokin- és kortizolszintje az első hét életnapon (Adatok medián, kvartilis
formában megadva; IL= interleukin, IFN= interferon, TNF=tumor nekrózis faktor)
0. nap
1. nap
3. nap
7. nap
Kortizol (pg/ml)
90,8 [ 6,49 – 134]
186,1 [53,0 – 474]
639 [268 – 942]
548
IFNγ (pg/ml)
63,4 [1,11 – 113,09]
22,2 [12,28 – 97,7]
12,28 [1,11 – 113]
22,18 [1,11 – 113]
IL–10 (pg/ml)
8,60 [2,22 – 13,76]
13,22 [5,60 – 35,4]
27,8
[9,10 – 35,1]
18,10 [9,52 – 34,2]
IL–12 (pg/ml)
16,1 [0,56 – 26,6]
16,68 [13,05 – 44,3]
23,64 [16,33 – 51,3]
IL–13 (pg/ml)
1,99 [0,30 – 19,1]
1,99 [1,09 – 5,45]
3,85
IL–17 (pg/ml)
110,3 [44,4 – 159]
80,0 [14,4 – 142]
61,67 [10,8 – 149]
82,9 [36,2 – 148]
IL–1β (pg/ml)
3,87 [0,05 – 11,76]
9,74 [0,05 – 28,2]
7,62 [0,05 – 28,4]
10,28 [4,01 – 28,4]
IL–2 (pg/ml)
0,16 [0,16 – 7,22]
0,16 [0,16 – 33,6]
0,16 [0,16 – 12,43]
2,46 [0,16 – 15,3]
IL–4 (pg/ml)
8,98 [4,67 – 15,19]
7,35 [4,67 – 15,19]
4,67 [4,67 – 15,19]
4,67 [4,67 – 12,9]
IL–5 (pg/ml)
3,09 [1,15 – 5,75]
2,08 [1,51 – 6,02]
5,75
[1,51 – 10,04]
5,75 [1,75 – 10,04]
IL–6 (pg/ml)
14,55 [8,38 – 96,5]
25,02 [11,04 – 81,5]
53,9
[21,15 – 128]
82,4 [43,4 – 160]
IL–7 (pg/ml)
0,65 [0,65 – 1,84]
0,65 [0,65 – 1,25]
0,65
[0,65 – 0,65]
0,65 [0,65 – 0,65]
IL–8 (pg/ml)
243 [73,2 – 1905]
1735 [267 – 7342]
1120 [517 – 4463]
2397 [1321 – 6716]
TNFα (pg/ml)
3,59 [2,75 – 31,93]
8,53 [6,27 – 36,41]
15,29 [3,59 – 27,9]
8,53 [3,59 – 31,9]
53
[0,30 – 7,43]
[415 – 661
28,6 [15,7 – 63]
2,85 [ 0,69 – 13,8]
10. táblázat: Alacsony endogén kortizolszintű kissúlyú koraszülöttek citokin- és kortizolszintje az első hét életnapon (Adatok medián, kvartilis formában
megadva; IL= interleukin, IFN= interferon, TNF=tumor nekrózis faktor)
0. nap
1. nap
3. nap
7. nap
Kortizol (pg/ml)
40,5 [23,7 – 148]
10,5 [ 8,92 – 10,5]
10,5 [10,5 – 11,5]
12,7 [10,5 – 18,3]
IFNγ (pg/ml)
123 [1,11 – 54,6]
22,2 [12,3 – 54,6]
1,11 [ 1,11 – 22,2]
1,11 [1,11 – 54,6]
IL–10 (pg/ml)
14,3 [7,24 – 24,4]
17,8 [13,.0 – 24,4]
13,2 [ 8,89 – 27,8]
11,3 [5,83 – 27,8]
IL–12 (pg/ml)
29,6 [10,9 – 50,3]
40,7 [25,8 – 45,5]
29,6 [18,5 – 52,7]
26,8 [18,5 – 35,9]
IL–13 (pg/ml)
1,13 [1,09 – 3,85]
1,13 [ 1,09 – 6,29]
1,13 [ 1,09 – 3,85]
1,99 [1,09 – 6,29]
IL–17 (pg/ml)
96,6 [42,7 – 131]
96,6 [29,7 – 132]
61,7 [ 4,72 – 115]
80,0 [ 36,2 – 115]
IL–1β (pg/ml)
8,07 [4,05 – 28,4]
10,8 [ 5,58 – 24,5]
10,9 [ 4,55 – 16,2]
12,6 [2,33 – 37,4]
IL–2 (pg/ml)
8,07 [0,16 – 21,7]
11,5 [ 0,16 – 19,4]
4,06 [ 0,16 – 15,3]
1,91 [0,16 – 17,1]
IL–4 (pg/ml)
8,98 [4,67 – 17,5]
4,67 [ 4,67 – 17,5]
4,67 [ 4,67 – 12,9]
4,67 [4,67 – 9,23]
IL–5 (pg/ml)
3,18 [1,15 – 5,75]
2,08 [ 1,42 – 4,78]
5,75 [ 2,58 – 13,0]
10,5 [6,85 – 16,1]
IL–6 (pg/ml)
14,6 [9,54 – 139]
40,8 [15,6 – 90,1]
48,3 [25,0 – 77,0]
96,2 [34,2 – 140]
IL–7 (pg/ml)
0,65 [0,65 – 9,45]
0,65 [ 0,65 – 5,39]
0,65 [ 0,65 – 0,65]
0,65 [0,65 – 0,65]
IL–8 (pg/ml)
519 [144 – 1222]
1238 [331 – 2637]
1084 [415 – 1732]
597 [ 298 – 1058]
TNFα (pg/ml)
13,7 [6,51 – 31,9]
15,3 [ 6,51 – 23,8]
8,53 [ 6,51 – 15,3]
8,53 [6,51 – 31,9]
54
Az ’alacsony’ és a ’magas’ kortizolszintű csoportok kialakítása a 0, 1, 3. és 7. napon mért
kortizolszintek medián értékei alapján történt. Az adott napon mért értékek mediánja feletti
értékek esetén a gyermek ’1’, egyébként ’0’ értéket kapott. A négy mérési napon így kialakított
értékeket összegeztük; ennek alapján alacsony kortizolszintű csoportba soroltuk a 0, 1; míg a
magas kortizolszintű csoportba soroltuk a 3 és a 4 összpontszámú gyermekeket. Amennyiben az
összpontszám 2 volt, a hetedik napi kortizolszint határozta meg, hogy melyik csoportba kerül a
gyermek. Az ’alacsony’ és a ’magas’ kortizolszintű gyermekeknél mért citokinszinteket a 9. és
10. táblázat mutatja. Non-parametrikus teszttel vizsgálva az egyes citokinek esetében nem
észleltünk szignifikáns különbséget egyik napon sem.
Annak érdekében, hogy a biológiai hatás alapján csoportosított citokinekre kifejtett
kortizolhatást tesztelhessük, az 5.2.1.1.1. pontban bemutatott eljárást alkalmaztuk, azaz a
citokineket biológiai hatás szerint csoportosítottuk és úgy határoztuk meg a REV értékek,
valamint a kortizolszintek közötti interakciót.
Mivel a koraszülöttek rendkívül heterogén csoportot alkotnak, a kortizol citokin REV
értékekre gyakorolt hatását az érettebb (31 – 33. gesztációs hétre született), illetve az éretlenebb
(legfeljebb 30. gesztációs hétre született) gyermekek esetében külön-külön értékeltük (10. ábra).
Kimutattuk, hogy endogén kortizolszintek mellett a proinflammatorikus citokinek esetében
magasabbak a REV-értékek (p < 0,0001). A hatás az alacsonyabb gesztációs korú gyermekeknél
még kifejezettebb volt.
Az endogén kortizolszintet számos tényező, pl. stressz, mellékvese érettsége stb. mellett a
terápia is befolyásolhatja. Ebből a szempontból az egyik legfontosabb faktor az anyának a szülés
megkezdése előtt a magzat tüdőérésének a gyorsítása érdekében szülés előtt adott szteroid lehet.
Az általunk vizsgált populációban azonban a kortizolértékekre csak a posztnatális kor gyakorolt
hatást, a prenatális szteroidadás nem (11. ábra).
Az endogén kortizol és az antiinflammatorikus citokinszintek esetében nem találtunk
kapcsolatot.
55
0,45
REV
0,40 ∃
0,35
0,30
& < 30 hét, magas kortizol
∃ < 30 hét, alacsony kortizol
∋ > 30 hét, magas kortizol
% > 30 hét, alacsony kortizol
∃
&
%
∋
∃
∋
%
&
%
∃
&
∋
%
0,25
∋
&
0,20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Posztnatális kor (óra)
10. ábra: Koraszülöttek proinflammatorikus citokinszintjeinek endogén kortizoltól, érettségtől és
posztnatális kortól való függése, REV értékekre gyakorolt hatások: éretlenség p = 0,003, posznatális kor p
= 0,035, kortizolszint, p = <0,0001
0,65
REV
0,6
0,55
0,5
0,45
0,4
0,35 0,3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Posztnatális kor (óra)
Nincs prenatalis szteroid Prenatalis szteroid
11. ábra: Koraszülötteknél a kortizolszintekre (REV értékekre) a prenatális szteroidadás nem gyakorol
hatást (p = 0,97), csak a posztnatális kor (p < 0,0001)
56
A citokinek és az endogén kortizolszintek közötti kapcsolatot az 5.2.1.1. részben tárgyalt
aszfixiás újszülöttek esetében is vizsgáltuk. Kiderült, hogy az aszfixiás újszülöttek esetében a
kortizolszintek – szemben a koraszülöttekkel – az életkor előrehaladtával folyamatosan
csökkennek (p = 0,001) (12. ábra), azonban a hipotermiás kezelés nem befolyásolja a
kortizolszinteket.
1400
Kortizol (nmol/l)
1200
1000
800
600
400
200
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Posztnatális kor (óra)
Hypothermia
Normothermia
12. ábra: Kortizolszintek a hipotermiás és normotermiás csoportokban a posztnatális kor függvényében
Ezt követően ezt a populációt is ’alacsony’ és ’magas’ kortizolszintű csoportokra
osztottuk, a koraszülöttek esetében bemutatott módszerrel. Az 5.2.1.1 részben ismertetett módon
elemeztük, hogy a magas vagy alacsony kortizolszint hogyan hat az egyes citokinek REV
értékére, illetve a hatások alapján összesített pro- és antiinflammatorikus REV értékekre.
Elemzésünk azt mutatta, hogy a hipotermiás és a normotermiás kezelés, valamint a
posztnatális kor mellett az endogén kortizolszint is számos citokinszintre hatást gyakorol (lásd
11. táblázat). A pro- és antiinflammatorikus citokinek REV értékeinek összesítése alapján
együttesen is vizsgáltuk összességükben ezekre milyen hatást gyakorol a kortizolszint.
Kimutattuk, hogy a hipotermiás csoportban alacsony kortizolszinttel rendelkező koraszülöttekben
lényegesen magasabb a proinflammatorikus citokinek szintje, míg az antiinflammatorikusaké
alacsonyabb, mint magasabb kortizolszintekkel rendelkezőké. Normotermiás csoportban
lényegében nem észleltünk különbséget az alacsonyabb és a magasabb kortizolszintű gyermekek
között. Eredményeinket a 13. ábra összegzi.
57
11. táblázat: A kortizol, a hipotermiás kezelés és a posztnatális kor, illetve ezek interakciójának az egyes citokinekre gyakorolt hatása és
szignifikanciaszintje. (IL = interleukin, IFN = interferon, TNF= tumor nekrózis faktor)
Kortizol
hipotermia
posztnatális kor
Kortizol X idő
Kortizol
X Hipotermia
hipotermia
posztnatális kor
IFN-γ
0,56
0,34
0,21
0,03
0,91
0,49
IL-10
0,08
0,25
<0,0001
0,01
0,61
0,08
IL-1α
0,23
0,90
0,26
0,61
0,06
0,97
IL-1β
0,88
0,26
0,49
0,09
0,38
0,44
IL-2
<0,0001
0,32
0,68
0,41
0,85
0,27
IL-4
0,11
0,16
0,08
0,21
0,62
0,05
IL-6
0,70
0,24
0,004
0,16
0,78
0,003
IL-8
0,13
0,76
0,01
0,46
0,08
0,75
TNF—α
0,14
0,98
0,95
0,35
0,93
0,01
VEGF
0,08
0,16
<0,0001
0,27
0,86
0,02
IL-4 / IFN—γ
0,62
0,01
0,22
0,01
0,75
0,38
IL-10 / IL-6
<0,0001
0,25
<0,0001
0,01
0,24
0,69
IL-10 / IL-2
<0,0001
0,07
<0,0001
0,30
0,58
0,25
58
X
0,75
REV
0,75
Proinflammatikus citokinek REV értékei hypothermiában
Alacsony kortizol
Magas kortizol
∗
#
0,70
REV
Antiinflammatikus citokinek REV értékei hypothermiában
Alacsony kortizol
Magas kortizol
∗
#
0,70
0,65
0,65
0,60
0,60
#
0,55
#
0,50
0,45
#∗
0,50
∗
0,45
∗
∗
0,40
∗
0,55
#
#
0,40
#
∗
#
∗
0,30
0,30
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
10
20
30
Posztnatális kor (óra)
0,75
#
∗
0,35
0,35
REV
0,70
∗
0,65
0,75
Proinflammatikus citokinek REV értékei normothermiában
Alacsony kortizol
Magas kortizol
#
∗
#∗
#
0,45
60
70
80
Antiinflammatikus citokinek REV értékei normothermiában
Magas kortizol
Alacsony kortizol
#
∗
0,65
∗
0,60
0,50
50
REV
0,70
0,60
0,55
40
Posztnatális kor (óra)
#
∗
#
∗
0,55
#∗
#
0,50
#∗
0,40
#
∗
0,45
0,40
0,35
0,35
0,30
0,30
0
10
20
30
40
50
60
70
0
80
10
20
30
40
50
60
70
80
Posztnatális kor (óra)
Posztnatális kor (óra)
13. ábra: A kortizol, a hipotermiás kezelés és a posztnatális kor, illetve ezek interakciójának az
egyes citokinekre gyakorolt hatása és szignifikanciaszintje. (IL = interleukin, IFN = interferon,
TNF= tumor nekrózis faktor)
5.2.1.3 Perinatális szepszis és citokinprofil
Kora- és újszülöttkorban a szisztémás bakteriális fertőzés sokszor igen rapid lefolyású,
ezért a gyors diagnózis alapvetően fontos a hatékony terápia mielőbbi bevezetése és a súlyos
szövődmények megelőzése érdekében. A diagnózis felállítását a bakteriális gyorstesztek és a
hemokultúra mellett az akut fázis fehérjék szintjének, elsősorban a magasabb CRP, IL-6 és
prokalcitonin szint kimutatása segíti; ezek monitorozása támpontot ad abban is, hogy a terápia
mennyire hatásos. Munkánk során elemeztük, a biochip módszer segítségével meghatározott
citokinszintek adnak-e járulékos információt szeptikus újszülötteknél a prokalcitonin- és CRPszintek mellett.
A vizsgált populációban mért értékeket 12. táblázat összegzi.
A perinatális szepszis diagnózisa során cut-off értékként alkalmazott 20 mg/l CRP értéket,
illetve 10 µg/l prokalcitonin szintet meghaladó értéket 6, illetve 26 gyermeknél mértünk. Csupán
6, illetve 15 gyermek esetében haladta meg az IL-6, illetve IL-8-szint irodalom szerint a
szepszisre jellemző 80 pg/ml-s, illetve 90 pg/ml-s cut-off értéket [Kruegera, 2001]. Minden, a
prokalcitonin és/vagy a CRP szint alapján szeptikus betegnél magasabb volt az IL-6-szint. Az
59
emelkedett IL-8-at mutató 15 gyermek közül 6-nál az egészséges referenciatartományon belül
volt a prokalcitonin és CRP szintje; azaz az első napon 90 pg/ml feletti IL-8 és/vagy 2,5 µg/l
feletti prokalcitonin és/vagy 3 mg/l feletti CRP-szint a perinatális szepszis tüneteit mutató
újszülöttek 95%-nál jelen volt. Az IL-10 esetében perinatális szepszis kimutatására javasolt 40
pg/ml cut-off értéket [Bender, 2008] meghaladó szintet egyetlen gyermeknél sem mutattunk ki. A
betegek mindegyikénél a születést követően azonnal antibiotikus kezelést indítottak. Emellett a
prokalcitonin-értékek az 1. életnap és a 2. életnap között közel szignifikánsan (p = 0,07), míg a 2.
és 3. nap között szignifikánsan (p = 0,026); a CRP-szint a 2. és 3. nap között szignifikánsan (p =
0,003) csökkentek. A vizsgált citokinek esetében szignifikáns változást az egyes napok között
nem észleltünk.
12. táblázat: Veleszületett szepszisben az első három életnapon mért prokalcitonin-, CRP- és
citokinszintek, valamint fehérvérsejt-számok (medián, kvartilisek)
Szérum citokinek
Antibiotikum
adása Antibiotikus
kezelés Antibiotikus
kezelés
előtt
alatti 1. nap
alatti 2. nap
(1. életnap)
(2. életnap)
(3. életnap)
IL-6 (pg/ml)
11,2 (5,54 – 29,27)
8,2 (3,47 – 14,025)
4,3 (2,4 – 6,9)
IL-8 (pg/ml)
66,16 (38,72 – 162,9)
50,34 (17,08 – 101,27)
52,26 (32,19 – 123,5)
IL-10 (pg/ml)
3,555 (2,3 – 5,5)
2,945 (1,968 – 3,922)
2,165 (1,715 – 3,15)
Prokalcitonin-szint
15,56 (8,24 – 28,34)
1,535 (0,688 – 7,858)
0,35 (0,215 – 0,665)
CRP-szint (mg/l)
2,5 (0,675 – 9,4)
1,7 (0,6 – 9,7)
0,7 (0,1 – 4,625)
Fehérvérsejtszám (G/l)
15,7 (10,725 – 22,95)
10,75 (9 – 14,35)
12 (9,7 – 15,7)
(µg/l)
Az egyes életnapokon elemeztük a vizsgált citokinek, CRP- és prokalcitoninszintek,
valamint fehérvérsejt-számok közötti kapcsolatot (13. táblázat). Néhány időpontban egy-egy
analitot leszámítva nem mutattunk ki szignifikáns kapcsolatot a vizsgált paraméterek között. A
szignifikáns kapcsolatokat a táblázatban jelöltem.
60
13. táblázat: A mért gyulladásos citokinek (pg/ml), CRP (mg/l) és PCT (µg/l), valamint a FVS
(G/l) közötti kapcsolat erőssége (r értékek) szeptikus kora- és újszülötteknél az antibiotikus
kezelés megkezdése előtt (1. nap), majd után (2. és 3. nap). területek szignifikáns (p < 0,05)
erősségű kapcsolatot jelentenek, n = 41 szeptikus újszülött adatai alapján. (IL = interleukin, PCT
= prokalcitonin, CRP = C reaktív protein, FVS=fehérvérsejtszám)
1.nap
IL-8
IL-6
0,022
IL-8
IL-10
PCT
CRP
FVS
0,348
0,056
0,000
0,194
0,131
0,042
0,129
0,002
0,024
0,096
0,070
0,643
0,432
IL-10
PCT
0,271
CRP
2.nap
IL-8
IL-6
0,270
IL-8
IL-10
PCT
CRP
FVS
0,597
0,882
0,707
0,071
0,185
0,219
0,112
0,173
0,695
0,395
0,230
0,239
0,191
IL-10
PCT
0,103
CRP
3.nap
IL-8
IL-6
IL-8
0,042
IL-10
PCT
CRP
FVS
0,384
0,010
0,028
0,206
0,499
0,004
0,071
0,162
0,046
0,056
0,536
0,322
0,233
IL-10
PCT
0,101
CRP
61
5.2.2 Citokinek májbetegségekben. A fémion-koncentrációk összefüggése a szisztémás
citokinszintekkel
5.2.2.1 A vörösborfogyasztás hatása a citokinszintekre
Számos adat utal arra, hogy a nők érzékenyebbek az alkohol májtoxikus hatásaira. Nőknél
már napi 20 gramm, míg férfiaknál csak napi 30 gramm alkohol krónikus fogyasztása mellett
alakul ki májkárosodás. A nemtől függő különbségre számos magyarázat született, így például az,
hogy nőknél az alkohol farmakokinetikája, eliminációs sebessége, szöveti eloszlása eltérő, más a
metabolizmusért felelős enzimek aktivitása, fokozottabb a májsejtek érzékenysége az alkohol
által kiváltott gyulladásos ingerekre. Számos kísérleti adat és klinikai megfigyelés utal arra is,
hogy a májkárosodás kialakulásában a szabad gyökök által kiváltott toxikus hatásokkal, így a
szabad gyök indukálta gyulladással szembeni nemtől függő érzékenység is szerepet játszik.
Munkánk során a mérsékelt vörösborfogyasztás szisztémás gyulladásra, a nyomelemek szintjére
és a redox-homeosztázisra gyakorolt hatásait vizsgáltuk egészséges férfiakban és nőkben.
A vizsgálat kezdetekor (baseline value, BV) és végén (end value, EV) a májfunkciós
vizsgálatok eredményei egyaránt az egészséges referenciatartományban mozogtak (14. táblázat).
A vizsgálat kezdetekor a citokinszintek a férfiak és nők között nem különböztek. Nőknél
az egy hónapig tartó vörösborfogyasztást követően az IL1α és az IL2 citokinek, valamint a VEGF
szintje nőtt, míg az IL6 szintje csökkent. Férfiaknál szignifikáns változást a vizsgálat során nem
észleltünk egyik citokin esetében sem.(15. táblázat)
A vizsgálat kezdetén és végén mért fémion-szinteket az 17. táblázat összegzi. Érdekes
módon bizonyos fémionok (Zn, Pb) szintje és a Zn/Cu arány nőknél a vizsgálat kezdetekor
magasabb volt, mint férfiaknál. A nemtől való függés a vizsgálat során bekövetkező
változásokban is megjelent. Nőknél az EV mért vörösvértest Ca, Mg, Pb, Sr és Zn szintek,
valamint a Zn/Cu arány a vizsgálat végén mérve kisebb volt, mint a vizsgálat kezdetekor. Ezzel
szemben férfiaknál az Al, Ca, Li, Pb és Sr szintek csökkentekA fémionváltozással egyidejűleg az
antioxidáns védelemben is észleltünk eltéréseket. Nemtől függően különbözött a kiinduláskor
mért TSC és HDON paraméter is. Nőknél a HDON paraméter és a plazma redukálóképessége
fokozódott, míg a plazma és vörösvértestek szabadgyök-generáló képességét tükröző TSC
csökkent (p<0,001) vörösborfogyasztást követően. Férfiaknál a HDON és a redukálóképesség
egyaránt nőtt, míg csak a plazma TSC csökkent (14 ábra). A citokinszintek, a redox-rendszer és a
fémionok között számos összefüggést mutattunk ki (17. táblázat).
62
14. táblázat: Májfunkciós vizsgálatok eredménye a vizsgálat kezdetekor, majd egy hónapig tartó
mérsékelt vörösborfogyasztást követően
Nők
Paraméterek
Össz-bilirubin (µmol/l)
Szérum
aszpartát-
aminotranszferáz (U/L)
Szérum
alanin-
aminotranszferáz (U/L)
Szérum
γ-glutamiltranszferáz (U/L)
Férfiak
Vizsgálat kezdete
Vizsgálat vége
Vizsgálat kezdete
Vizsgálat vége
9,84 ± 3,22
10,1 ± 2,95
10,2 ± 2,17
10,0 ± 2,72
20,6 ± 1,80
21,2 ± 1,89
23,9 ± 5,13
23,0 ± 4,83
12,9 ± 2,51
12,5 ± 1,92
22,1 ± 9,27†
21,9 ± 8,79
14,9 ± 2,95
15,4 ± 2,80
23,7 ± 8,94†
23,2 ± 8,38
15. táblázat: Citokinszintek a vizsgálat kezdetekor, majd egy hónapig tartó mérsékelt
vörösborfogyasztást követően (IL = interleukin, IFN = interferon, TNF = tumor nekrózis faktor)
Szérum
Nők
Férfiak
citokin
(pg/ml)
Vizsgálat kezdete
Vizsgálat vége
Vizsgálat
Vizsgálat vége
kezdete
IFN-γ
1,5 [0,0 – 3,9]
2,0 [0,0 – 6,0]
2,2 [0,0 – 4,7]
2,0 [0,0 – 4,4]
IL-10
0,8 [0,0 – 1,7]
0,7 [0,0 – 1,2]
1,4 [0,0 – 2,3]
1,1 [0,0 – 3,0]
IL- 1α
0,4 [0,0 – 0,8]
0,9 [0,5 – 1,3]**
0,9[0,0 – 1,8]
0,8 [0,0 – 1,7]
IL- 1β
1,7 [0,0 – 4,3]
1,0 [0,0 – 2,3]
1,7 [0,0 – 4,5]
0,7 [0,0 – 2,0]
IL- 2
4,8 [0,0 – 9,8]
7,8 [5,6- 12,2]*
4,4 [0,0 – 6,9]
5,4 [0,0 – 7,8]
IL- 4
4,3 [2,1 – 7,0]
3,8 [2,1 – 6,8]
4,4 [2,4 – 8,5]
3,3 [0,0 – 6,6]
IL- 6
1,7 [0,6 – 4,8]
1,2 [ 0,0 – 3,7]*
1,0 [0,0 – 1,7]
1,1 [0,0 – 4,6]
IL- 8
21,1 [7,5 – 30,6]
20,0 [7,1 – 31,8]
22,1 [9,4 – 35,0]
13,7 [5,5 – 24,0]
TNF-α
10,3 [4,9 – 20,8]
9,9 [7,5 – 14,2]
8,1 [4,9 – 10,2]
12,1 [5,5 – 30,0]
VEGF
110 [ 24 – 245]
185 [ 46 – 320]*
272 [ 82 – 681]
244 [ 75 – 582]
** p<0,01 * p<0,05
63
16. táblázat: Egy hónapig tartó mérsékelt (nőknél 0,2 l/nap, férfiaknál 0,3 l/nap mennyiségű)
vörösborfogyasztás hatása a vörösvértestekben mért fémionszintekekre * szignifikáns különbség a
vizsgálat végén (EV) és a vizsgálat kezdetekor (BV) mért érték között, p<0,05. Az adatokat átlag, szórás
formában tüntettem fel
Nők
Férfiak
Vizsgálat kezdete
Vizsgálat vége
Vizsgálat kezdete
Vizsgálat vége
Al(µg/ml)
0,641 ± 0,305
0,526 ± 0,145
0,693 ± 0,207
0,415 ± 0,093*
Ba(µg/ml)
0,601 ± 0,140
0,617 ± 0,115
0,647 ± 0,086
0,579 ± 0,102
Ca(µg/ml)
4,170 ± 1,160
1,71 ± 0,377*
3,540 ± 0,890
1,580 ± 0,510*
Cu(µg/ml)
0,086 ± 0,037
0,082 ± 0,039
0,084 ± 0,037
0,075 ± 0,033
Fe(µg/ml)
26,610 ± 5,48
25,670 ± 4,700
27,890 ± 3,340
26,360 ± 4,310
Li(µg/ml)
0,177 ± 0,046
0,163 ± 0,041
0,178 ± 0,030
0,141 ± 0,023*
Mg(µg/ml)
1,798 ± 0,204
1,352 ± 0,170*
1,825 ± 0,278
1,588 ± 0,261
Mn(µg/ml)
0,015 ± 0,007
0,041 ± 0,081
0,015 ± 0,006
0,012 ± 0,003
P(µg/ml)
19,050 ± 4,950
19,040 ± 4,540
19,350 ± 4,470
18,900 ± 3,840
Pb(µg/ml)
0,297 ± 0,113
0,103 ± 0,015*
0,124 ± 0,044†
0,094 ± 0,012*
S(µg/ml)
54,850 ± 9,930
54,230 ± 8,600
56,780 ± 8,280
58,310 ± 6,670
Se(µg/ml)
0,013 ± 0,004
0,0120 ± 0,0017
0,018 ± 0,014
0,021 ± 0,012
Sr(µg/ml)
0,042 ± 0,014
0,031 ± 0,004*
0,040 ± 0,005
0,029 ± 0,004*
†
0,358 ± 0,066
4,773 ± 0,099
Zn(µg/ml)
0,582 ± 0,094
0,404 ± 0,050*
0,377 ± 0,127
Zn/Cu arány
6,767 ± 0,068
4,926 ± 0,099*
4,489 ± 0,124
64
14. ábra: Egy hónapig tartó mérsékelt vörösborfogyasztás hatása az antioxidáns paraméterekre nőknél és
férfiaknál
65
17. táblázat: Kapcsolat a fémionok, antioxidáns paraméterek és citokinszintek között (r és p
értékek) (red = redukáló képesség (%), HDON = hidrogén donor aktivitás (mmol/ml), vvtTSC =
vörösvértest totál scavenger kapacitás (RLU%), pl.TSC = plazma totál scavenger kapacitás
(RLU%); IL = interleukin (pg/ml), IFN = interferon (pg/ml)) A szoros korrelációt szürke színnel
jelöltem
Vizsgálat előtt
Vizsgálat után
Citokin – Fémion
IL-1α
Ba
IL-1 α
Fe
IL-1α
K
IL-1α
Mg
IL-1α
P
IL-1α
S
IL-2
Pb
IL-6
Mg
IL-6
S
IFNγ
Cu
IFNγ
LI
r
0,636
0,559
0,545
0,711
0,545
0,587
0,456
0,516
0,446
0,594
0,587
P
0,015
0,038
0,044
0,004
0,044
0,027
0,038
0,017
0,042
0,032
0,035
Citokin – Fémion
IL-4
Al
IL-4
Cu
IL-4
Fe
IL-8
Ba
IL-8
P
IL-10
Mg
r
0,475
0,475
0,472
0,549
0,469
0,561
P
0,046
0,046
0,048
0,012
0,037
0,046
Citokin – Redox
IL-1α
red.
IL-4
red.
IL-6
red.
IL-8
SH
r
0,748
0,473
0,459
0,552
P
0,002
0,030
0,036
0,009
Citokin – Redox
IL-6
HDON
IL-6
SH
IL-1α
HDON
IL-1β
pl.TSC
r
0,511
0,601
0,522
0,666
P
0,043
0,014
0,046
0,036
Fémion – Redox
Sr
red.
r
0,444
P
0,044
Fémion – Redox
Al
HDON
Ba
HDON
Fe
HDON
K
HDON
P
HDON
Sr
HDON
Ba
red.
Mg
red.
P
red.
S
red.
Sr
red.
Cu
vvtTSC
P
vvtTSC
r
0,452
0,574
0,471
0,486
0,571
0,567
0,596
0,545
0,584
0,475
0,538
0,486
0,457
P
0,040
0,006
0,031
0,026
0,007
0,007
0,004
0,011
0,005
0,029
0,012
0,030
0,043
66
5.2.2.2 Citokinprofil és májcirrhosis
A májfibrózis és májcirrhosis ugyanannak a kórfolyamatnak a különböző állomásai. A
májfibrózis esetén a máj kötőszövetesen átépül; ebben a folyamatban a gyulladás, a májsejtek
károsodása, pusztulása egyidőben van jelen. A gyulladás kialakulásában és fenntartásában a
gyulladásos citokinek fokozott termelődése központi szerepet játszik.
Vizsgálatsorozatunk
kapcsán azt vizsgáltuk, hogy a májcirrhosis hátterében álló ok hogyan befolyásolja a beteg
citokinprofilját.
Különböző etiopatogenezisű májcirrhosisban szenvedő betegek esetében vizsgált
citokinek szintjét az 18. táblázat összegzi. Cirrhosis minden típusában a májban termelődő akut
fázis fehérjeként nyilvántartott IL-6 szintje markánsan emelkedik. Ezen túl azonban a primer
biliáris cirrhosisban, illetve a HCV-fertőzés talaján, illetve a krónikus alkoholfogyasztás miatt
kialakuló cirrhosis esetén észlelt citokinprofilok egymástól is lényegesen különböztek. HCVfertőzés esetén az IL-2-szintek, míg primer biliáris cirrhosisban proinflammatorikus IL-8, illetve
a TNFα szintje haladta meg az egészséges referenciacsoportban észlelt koncentrációt; az
antiinflammatorikus IL-10 citokin szintje viszont primer biliáris cirrhosisban volt alacsonyabb.
18. táblázat: Citokinszintek különböző eredetű cirrhosisban szenvedő betegeknél (IL = interleukin, IFN =
interferon, TNF = tumor nekrózis faktor)
Egészséges
Alkoholos
Primer biliáris
Citokinek
referenciacsoport
cirrhosis
cirrhosis
HCV-fertőzés
(pg/ml)
n = 26
n = 36
n = 35
n = 14
IFNγ
1,78 [0,0 – 3,94]
2,18 [1,62 – 4,74]
2,05 [0,0 – 7,14]
1,60 [0,0 – 3,48]
IL-10
1,08 [0,0 – 2,07]
1,20 [0,12 – 2,71]
0,47 [0,0 – 3,32]*
1,08 [0,42 – 2,86]
IL-1α
0,64 [0,0 – 1,34]
0,62 [0,0 – 1,41]
0,25 [0,0 – 2,03]
0,57 [0,0 – 1,82]
IL-1β
1,57 [0,0 – 4,32]
1,17 [0,0 – 3,31]
0,72 [0,0 – 3,21]
1,57 [0,0 – 2,97]
IL-2
4,18 [0,0 – 6,83]
5,50 [3,95 – 13,2]
4,88 [0,0 – 9,12]
8,18 [3,24 – 13,8]*
IL-4
4,56 [2,15 – 6,97]
4,93 [2,24 – 10,3]
2,39 [0,0 – 9,04]
5,90 [2,26 – 11,4]
IL-6
1,51 [0,74 – 4,89]
10,8 [1,02 – 24,7]*
5,72 [0,0 – 17,6]*
4,80 [0,0 – 9,46]
IL-8
25,2 [6,84 – 48,1]
49,2 [7,72 – 138]
159 [14,9 – 305]*
17,7 [3,88 – 7,2]
TNFα
7,45 [2,54 – 14,4]
8,58 [2,15 –17,51]
11,4 [0,0 – 31,3]*
4,81 [1,94 – 8,62]
* p< 0,05 az egészséges referenciacsoporthoz képest
67
5.2.2.3 Wilson-kór és citokinek
A Wilson-kór a májban zajló rézmetabolizmus autoszomális recesszív módon öröklődő
rendellenessége, aminek az eredményeként a hepatocitákban és egyes extrahepatikus szervekben,
így az agyban és a szaruhártyában réz rakódik le. Ennek eredményeként Wilson-kórra a
neurodegeneratív betegség és a májbetegség együttes jelenléte a jellemző. A betegségben
kialakuló cirrhosis mellett jellegzetes idegrendszeri tünetek (beszédzavar, ataxia és Parkinson-kór
szerű extrapiramidális tünetek), a szaruhártyában típusos elváltozás (Kaiser-Fleischner-gyűrű)
figyelhetők meg. A tünetek azonban nem mindenkinél vannak egyforma mértékben jelen, van,
amikor a májelváltozások és van, amikor az idegrendszeri eltérések dominálnak. A tünetek
heterogenitásának az oka nem ismert. A szövődmények hátterében szabad gyökös károsodás,
illetve szisztémás gyulladás lehetősége merül fel.
Eredményeink azt mutatták, hogy D-penicillaminnal kezelt Wilson-kóros betegeknél a Cu
kivételével számos egyéb elem szintje is megváltozik (19. táblázat). A vörösvértestekben a
fémionok közül többnek (Al, Ba, Ca, Fe, Li, Mg és P) a szintje Wilson-kórban neurológiai
tünetektől függetlenül emelkedett. Ezen túl a klinikai tünetekkel járó Wilson-kóros betegeknél
szignifikánsan nőtt a Pb, Cr, Li és Ni szintje az egészséges kontrollokhoz és a klinikai tünetektől
nem szenvedő Wilson-kóros betegekhez viszonyítva.
Wilson-kóros betegeknél számos fémion szintje – a Cu-szintek kivételével– magasabb
volt az egészséges referenciaértéknél. Neurológiai tünetekkel járó Wilson-kór esetén a Cr-, a Li-,
a Ni- és a Pb-szintek magasabbak voltak a neurológiai tünetekkel nem járó Wilson-kórban
szenvedő betegekhez képest.
A rutinlaboratóriumi paraméterek alapján nem volt különbség az idegrendszeri tünetekkel
járó és nem járó Wilson-kóros csoport között. Az antioxidáns paraméterek (15. ábra), illetve
citokinszintek esetében sem észleltünk szignifikáns különbséget. (20. és 21. táblázatok), bár az
IL-6 és az IL-8 szintek az egészséges referenciaértéket meghaladták (p<0,05, ill. p<0,001).
68
19. táblázat: Vörösvértestek fémionszintje (átlag ± szórás) egészséges kontrollokban és Wilson-kóros
betegekben
Fémion
Egészséges
Neurológiai tünetekkel
(µg/ml)
referenciaérték
nem járó Wilson-kór
járó Wilson-kór
(n = 31)
(n = 16)
(n = 18)
Al
0,270 ± 0,088
0,680 ± 0,231*
0,626 ± 0,180*
Ba
0,007 ± 0,002
0,695 ± 0,108*
0,779 ± 0,150*
Ca
1,451 ± 0,369
3,460 ± 1,168*
3,540 ± 1,023*
Cr
0,139 ± 0,048
0,046 ± 0,029
0,231 ± 0,047**
Cu
0,030 ± 0,012
0,061 ± 0,027
0,076 ± 0,036
Fe
15,03 ± 3,38
29,55 ± 5,40*
31,52 ± 6,07*
Li
0,110 ± 0,032
0,157 ± 0,015*
0,198 ± 0,059*,**
Mg
0,928 ± 0,176
1,896 ± 0,385*
1,764 ± 0,293*
Ni
0,280 ± 0,038
0,089 ± 0,057
0,357 ± 0,245**
P
6,012 ± 2,614
18,762 ± 5,869*
21,145 ± 5,773*
Pb
0,053 ± 0,024
0,082 ± 0,055
0,175 ± 0,083**
Zn
0,471 ± 0,170
0,750 ± 0,423
0,575 ± 0,193
* szignifikancia az egészséges csoporthoz képest (p<0,05)
** szignifikancia a két Wilson-kóros csoport között (p<0,05)
69
20. táblázat: Főbb citokinszintek az egyes Wilson-kór altípusokban (tünetmentes: még nincsenek
szövődmények; IL = interleukin, IFN = interferon, TNF = tumor nekrózis faktor)
Wilson-kór
Szérum
Egészséges
Idegi+máj
Citokin
referenciaérték
Idegi érintettség
Máj érintettség
érintettség
Tünetmentes
(pg/ml)
n = 26
n = 22
n=6
n=7
n = 12
5,12 [3,01 – 7,55]
IFNγ
1,78 [0,0 – 3,94]
5,07 [2,85 – 7,60]
6,38 [4,97 – 7,82]
7,25 [3,0 – 12,0]
IL-10
1,08 [0,0 – 2,07]
0,84 [0,0 – 2,47]
0,42 [0,0 – 0,87]
1,45 [1,36 – 1,54] 1,92 [0,96 – 5,63]
IL-1α
0,64 [0,0 – 1,34]
0,51 [0,0 – 1,02]
0,0 [0,0 – 0,0]
1,37 [0,81 – 1,92] 0,84 [0,51 – 1,09]
IL-1β
1,57 [0,0 – 4,32]
1,98 [1,02 – 4,07]
0,46 [0,0 – 0,88]
3,12 [1,08 – 4,89] 3,48 [1,08 – 11,9]
IL-2
4,18 [0,0 – 6,83]
6,59 [4,70 – 8,52]
4,79 [3,68 – 5,90] 8,83 [7,36 – 11,1] 8,09 [7,36 – 9,40]
IL-4
4,56 [2,15 – 6,97]
3,41 [3,07 – 3,61]
2,76 [2,72 – 2,84] 15,5 [5,03 – 34,9] 4,92 [3,64 – 7,40]
IL-6
1,51 [0,74 – 4,89]
IL-8
25,2 [6,84 – 48,1] 89,1 [11,0 – 231] * 62,0 [10,0 – 206] * 81,0 [18,0 – 239] * 41,1 [17,2 – 84,1] *
TNF-α
7,45 [2,54 – 14,4] 12,6 [6,20 – 26,70] 6,27 [4,85 – 8,22] 11,5 [5,96 – 30,7] 9,83 [5,07 – 26,7]
4,81 [0,76 – 14,98]
*
7,87 [0,66 – 29,2] * 4,73 [1,89 – 7,72] * 6,77 [0,83 – 35,4] *
70
21. táblázat: Klinikai kémiai laboratóriumi paraméterek és antioxidáns védekezés idegrendszeri
tünetekkel járó és nem járó Wilson-kórban (ASAT = aszpartát aminotranszferáz; ALAT = alanin
aminotranszferáz, γ-GT = gamma-glutamiltranszferáz, CRP = C reaktív protein)
Neurológiai tünetekkel
Paraméterek
nem járó Wilson-kór
járó Wilson-kór
(n = 16)
(n = 18)
Fehérvérsejt (G/l)
8,4 ± 2,1
7,8 ± 0,3
Vörösvértest (T/l)
4,4 ± 0,3
4,3 ± 0,18
ASAT (U/l)
23,2 ± 4,3
24,1 ± 5,1
ALAT (U/l)
30,0 ± 12,7
22,2 ± 8,2
γ-GT (U/l)
32,7 ± 12,8
25,6 ± 11,0
ALP (U/l)
207 ± 83,1
182 ± 60,1
Össz-bilirubin (µmol/l)
10,1 ± 2,7
17,6 ± 10,2
Karbamid (mmol/l)
5,9 ± 0,9
5,9 ± 1,4
Kreatinin (µmol/l)
70,2 ± 13,2
82,2 ± 20,3
Cöruloplazmin (mg/l)
0,12 ± 0,05
0,11 ± 0,06
0,7 ± 0,5
1,4 ± 1,2
H-donor képesség (%)
56,66 ± 7,53
57,6 ± 9,67
Redukálóképesség (µmol/ml)
1,02 ± 0,23
0,92 ± 0,20
CRP (mg/l)
71
16
14
12
10
8
6
4
2
0
U/L
SOD aktivitás
600
SOD aktivitás
GSH/Pox aktivitás
U/L
GSHPX aktivitás
500
400
300
200
100
IDEG IDEG+MÁJ MÁJ
25000
0
MENTES
IDEG IDEG+MÁJ MÁJ
MENTES
RLU
Kemilumineszcens intenzitás
20000
15000
10000
5000
0
IDEG IDEG+MÁJ MÁJ
MENTES
15. ábra: Vörösvérsejtekben levő antioxidáns enzimek aktivitása és kemilumineszcens
intenzitása a Wilson-kór egyes altípusaiban. (ideg : csak idegrendszeri tünetek [n = 22]; ideg +
máj: idegrendszeri és májérintettség [n = 6]; máj: májérintettség [n = 7]; mentes: még nincsenek
szövődmények [n = 16])
5.2.3 Citokinek egyéb belgyógyászati kórképekben
5.2.3.1 Citokinprofilt befolyásoló cékla kezelés prosztatakarcinómában
Az utóbbi évek vizsgálatai alapján egyértelművé vált, hogy a tumoros betegek redoxhomeosztázisa szignifikáns mértékben különbözik az egészséges egyénekétől. A rák kialakulása
és szóródása során a szabadgyökös reakciók és az antioxidáns védekezés közötti egyensúly
nagymértékben a szabadgyökös folyamatok irányába tér ki. Ez a felismerés vezetett azokhoz a
próbálkozásokhoz, melyek célja, hogy az antioxidáns védekezőképesség javítása révén segítsék a
rákelleni védekezést. Munkánk során azt elemeztük, hogy az antioxidáns kezelés milyen hatást
gyakorol a citokinszintek és növekedési faktorok szérumszintjére ebben a betegségben.
Prosztatakarcinómás betegeknél az egy hónapig tartó céklakivonat-fogyasztás hatását a
citokinszintekre és a redox paraméterekre az 22. és 23. összegzi. A citokinszintek többsége
(IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8) valamelyest (de nem szignifikáns mértékben) csökkent,
72
vagy nem változott (TNF-α). A VEGF gyakorlatilag nem változott, az EGF közel duplájára nőtt
(p=0,003). Hasonlóképpen kismértékben nőtt a PSA és fPSA-szint is (22. táblázat).
A betegek vörösvértestjeiben a Zn-protoporfirin szintje szignifikáns mértékben csökkent,
és a szabad protoporfirin-koncentráció is tendenciájában csökkenést mutatott. Az eredmények azt
jelezték, hogy jelentős mértékben csökkent a betegek közötti eltérés, amit a kisebb mértékű
szórás prezentált. A plazmában és az vörösvértestekben mérhető indukálható szabadgyökkoncentráció a céklakezelést követően valamelyest kisebb volt (23. táblázat).
A szabad protoporfirin/Zn-protoporfirin arány és az vörösvértest TSC értéke (RLU%)
között szoros kapcsolatot találtunk (r = 0,79, p < 0,05). Ha a szabad protoporfirin és a HCHO
között vizsgáltuk a lineáris regressziót, akkor szintén szignifikáns korrelációt (r = 0,91)
igazoltunk.
A céklakezelés előtt a vörösvértestek kötött HCHO koncentrációja 1,02 ± 0,27 x 10-3, és a
kezelést követően 3,72 ± 1,08 x 10-3 µmol/mg vörösvértest volt. Tehát egyértelműen nőtt a
HCHO pool a betegek szervezetében, ami a vérszegénység mérséklését eredményezte.
A betegek plazma Ca-, Cu- és Mg-koncentrációja a kezelés ideje alatt nem változott
jelentősen és minden esetben az egészséges referenciatartományon belül volt. A vaskoncentráció
azonban szignifikánsan csökkent a céklafogyasztás hatására és a normál értéktartomány felé
mozgott. A Se-szint a kezelés hatására növekedett. Az Zn-koncentráció jelentősen csökkent, az
átlagérték az egészséges referenciatartományba esett. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a
fémion-homeosztázis kezd helyreállni, a fémionok a sejtekben, kompartmentekben maradnak a
cékla fogyasztása kapcsán (24. táblázat).
73
22. táblázat: Céklakivonat adás hatása kemoterápiában részesülő metasztatikus prosztatarákos
betegek citokinszintjeire, illetve a növekedési hormonszintekre (VEGF, vaszkuláris endoteliális
növekedési faktor; EGF = epidermális növekedési faktor, PSA = prosztataspecifikus antigén,
fPSA = szabad prosztataspecifikus antigén, IL = interleukin, IFN = interferon, TNF = tumor
nekrózis faktor)
Szérum citokin
Céklakezelés
előtt
után
IFNγ (pg/ml)
4,28 [0,04 – 9,52]
2,21 [0,30 – 4,18]
IL-10 (pg/ml)
1,54 [0,91 – 4,5]
0,88 [0,19 – 1,91]
IL-1α (pg/ml)
0,54 [0,12 – 2,33]
0,35 [0,19 – 0,52]
IL-1β (pg/ml)
1,18 [0,60 – 4,33]
0,42 [0,10 – 0,92]
IL-2 (pg/ml)
7,80 [4,40 – 15,5]
5,5 [2,20 – 13,3]
IL-4 (pg/ml)
4,70 [2,70 – 8,15]
4,0 [2,00 – 6,20]
IL-6 (pg/ml)
14,2 [4,20 – 36,3]
5,6 [2,30 – 12,1]
IL-8 (pg/ml)
31,2 [17,1 – 223]
25,3 [12,2 – 54,9]
TNF-α (pg/ml)
3,41 [1,60 – 7,50]
3,50 [2,52 – 4,48]
VEGF (pg/ml)
272 [146 – 388]
282 [120 – 442]
EGF (pg/ml)
59,0 [19,0 – 100]
110 [ 52 – 170] *
PSA ng/ml
93,0 [21,0 – 210]
133 [ 17 – 320]
fPSA ng/ml
20,2 [10,2 – 68,3]
30,6 [6,5 – 86,7]
* p < 0,05
74
23. táblázat: Cékla-kezelés hatása kemoterápiában részesülő metasztatikus prosztatarákos betegek redoxparamétereire és Zn-protoporfirin-szintjére (TSC = totál scavanger kapacitás, RLU = relative light unit)
Céklakezelés
Paraméterek
előtt
után
Zn- protoporfirin (nmol/l vvs)
1470 [702 – 223]
857 [559 – 1165]*
Szabad protoporfirin (nmol/lvvs)
334 [85 – 754]
301 [25,0 – 577]
Plazma TSC
3,25 [1,68 – 8,18]
1,69 [0,30 – 3,08]
71,8 [11,7 – 132]
54,71 [10,9 –
(RLU%)
Vörösvértest TSC (RLU %)
98,5]
*p<0,05
24. táblázat: Céklakezelés hatása kemoterápiában részesülő metasztatikus prosztatarákos betegek
plazmájában a fémion-koncentrációkra
Fémionok
Céklakezelés
(µg/ml)
előtt
után
Ca
77,82 ± 11,03
77,02 ± 16,44
Cu
1,25 ± 0,28
1,17 ± 0,37
Fe
12,52 ± 9,63
5,49 ± 3,83*
Mg
21,47 ± 3,51
20,95 ± 4,93
Se
0,011 ± 0,006
0,050 ± 0,016*
Zn
1,46 ± 0,60
1,03 ± 0,44*
*p<0,05
5.2.3.2 Vesetranszplantáció, malnutríció és gyulladás
A krónikus betegségekhez kapcsolódó senyvesztő állapot és az ezt kísérő fokozott
gyulladás a malnutríció-gyulladásos komplex szindróma (MICS), ami a betegek fokozott
morbiditásával és mortalitásával jár. A MICS felismerését vesetranszplantált betegeknél nehezíti,
hogy ennek a vizsgálatára nem áll rendelkezésre validált teszt. Munkánk során több klinikai
paraméter, illetve a gyulladásos citokinszintek alapján egy krónikus veseelégtelenségben
bevezetett és alkalmazott pontozóskála (malnutríciós-gyulladásos pontérték; Malnutrition
75
Inflammation Score, MIS) alkalmazhatóságát vizsgáltuk vesetranszplantált betegeknél a MICS
kockázatának felmérésére.
A vizsgálat során mért MIS (Malnutrition Inflammation Score)
A pontértékek megoszlását az 16. ábra mutatja. A MIS medián értéke 3 volt; ez
szignifikánsan nagyobb volt nőknél (MIS: median, interkvartilis tartomány (IQR): 3 (3); 4,1 vs. 3
(3); p<0,001) mint férfiaknál.
betegek száma
200
150
100
50
0
0
5
10
15
Malnutriciós gyulladásos pontérték
16. ábra: Malnutríciós-inflammációs pontérték (MIS) megoszlása vesetranszplantált betegeknél
Az IL-6 medián (IQR) szintje 2,09 (2,37) ng/l, a TNF-α-é 2,06 (1,34) ng/l. Mind a két
paraméter fordítottan arányos (IL-6: rho=-0,156; TNF-α: rho=-0,220, p<0,001,). Az IL-6
szignifikáns kapcsolatot mutatott az életkorral (rho=0,247; p<0,001). A CRP median (IQR)
értéke 3,1 (5,4) mg/l volt. A CRP egyenesen arányos volt az életkorral (r = 0,146; p<0,001),
illetve fordítottan korrelált (r = -0.089; p<0.01).
Malnutrícióra utaló markerek: Az átlagos BMI értéke 27±5 kg/m2 volt. A férfiak
haskörfogata és pre-albumin szintje nagyobb volt a nőkhöz képest (103±13 cm vs. 93±14 cm;
p<0,001 és 36,5±7,6 mg/dl vs. 32,1±6,8 mg/dl; p<0,001).A malnutrícióra és gyulladásra utaló
főbb paramétereket a 25. táblázat összegzi.
76
25. táblázat: Malnutríciós és gyulladásos paraméterek a vesetranszplantált betegeknél (SD = szórás, IQR
= interkvartilis tartomány, NS = nem szignifikáns)
Összes beteg
Férfiak
Nők
(n=993)
(n=569; 57%)
(n=424; 43%)
p
MIS (median (IQR); átlag)
3 (3); 3,6
3 (3); 3,2
3 (3); 4,1
<0,001
Testtömeg (kg) (átlag ± SD)
75 ± 16
81 ± 15
68 ± 13
<0,001
Haskörfogat (cm) (átlag ± SD)
99 ± 14
103 ± 13
93 ± 14
<0,001
BMI (kg/m2) (átlag ± SD)
27 ± 4,9
27,2 ± 4,6
26,7 ± 5,2
NS
CRP (mg/l) (median (IQR))
3,1 (5,4)
3,1 (4,8)
3,4
NS
Albumin (g/l) (átlag ± SD)
41 ± 4
42 ± 4
40 ± 4
<0,001
Pre-albumin (g/l) (átlag ± SD)
0,346 ± 0,076
0,365 ± 0,076
0,321 ± 0,068
<0,001
(median 2,09 (2,37)
2,04 (2,02)
2,15 (3,20)
NS
Leptin (µg/l) (median (IQR))
15,1 (25,3)
10,7 (15,44)
28,04 (40,1)
<0,001
TNF-α
α (ng/l) (median (IQR))
2,06 (1,34)
2,10 (1,31)
1,95 (1,34)
NS
Interleukin-6
(ng/l)
(5,8)
(IQR))
A MIS és a különböző gyulladásos és malnutríciós paraméterek közötti kapcsolatok
erősségét a 26. táblázat összegzi. A haskörfogat összefüggött az életkorral (r = 0,299; p < 0,001),
míg az eGFR értékkel nem. A pre-albumin-szint az életkorral (r = -0,068; p<0,05) és az eGFR
értékkel fordítottan arányos volt (r = -0,263; p<0,001).
77
26. táblázat: A MIS score és a legfontosabb laboratóriumi, antropometriás és demográfiás adatok közötti
nem korrigált és korrigált összefüggések erőssége (CRP = C-reaktív protein, GFR = glomeruláris
filtrációs ráta, IL = interleukin, TNF = tumor nekrózis faktor)
Korrelációs koefficiens ®
MIS
Korra, nemre korrigált
r érték
Életkor
0,213*
-
Testtömeg
-0,254*
-0,297*
Haskörfogat
-0,144*
-0,214*
Becsült GFR
-0,281*
-0,217*
Dialízisen eltöltött idő
0,040
0,025
IL-6
0,231*
0,165*
TNF-α
0,102*
0,109*
Leptin
-0,057
-0,140*
CRP
0,094*
0,194*
Összkoleszterin
-0,021
-0,053
Prealbumin
-0,165*
-0,116*
Ferritin
0,125*
0,181*
Hemoglobin
-0,315*
-0,300*
*: p<0,01
Nőknél nagyobb volt a szérum leptin szint, mint a férfiaknál (median (IQR): 28 (40) µg/l
vs. 11 (15) µg/l; p<0,001), egyenesen arányos volt az életkorral (rho=0,092; p<0,01), míg
fordítottan arányos volt az eGFR értékkel (rho=-0,159; p<0,001).
78
Gyulladásos markerek:
A szérum IL-6-szint a MIS kvartilisek alapján képzett négy alcsoportban a MIS emelkedésével
arányosan egyre magasabb volt (p<0,001) (17. ábra).
Malnutriciós gyulladásos pontérték
17. ábra: Interleukin IL-6-szint a MIS kvartilisek alapján képzett négy alcsoportban
Hasonló trendet észleltünk a TNF-α esetében is (median (IQR) érték: első MIS
kvartilisben: 1,99 (1,17) ng/l; második MIS kvartilisben: 2,07 (1,40) ng/l; harmadik MIS
kvartilisben: 2,02 (1,30) ng/l; negyedik MIS kvartilisben: 2,27 (1,64) ng/l; p<0,05). A MIS
szignifikánsan összefüggött a gyulladásos citokinek szintjével (IL-6; TNF-α; CRP), a kapcsolat
szignifikáns maradt az életkorra és nemre történő korrekciót követően is. A MIS fordítottan
arányos volt az eGFR értékével (r = -0,281) és a hemoglobin szinttel (r = -0,315), illetve
egyenesen arányos volt a szérum ferritinnel (rho=0,125).
79
Malnutríciós markerek
Az alcsoportokban a haskörfogat mediánértéke a nagyobb MIS kvartilisekben
szignifikánsan csökkent (p<0,001) (18. ábra)
Malnutriciós gyulladásos pontérték
18. ábra: Haskörfogat a MIS kvartilisekben
A szérum prealbumin szint a MIS kvartilisek alapján képzett alcsoportokban
folyamatosan csökkent (átlag ± SD): első kvartilis : 35,9 ± 7,3; második kvartilis: 34,4 ± 7,2;
harmadik kvartilis: 33,7 ± 7,6 és negyedik kvartilis: 33,1 ± 8,3; p<0,001. A MIS pontérték
szignifikánsan összefüggött a tápláltsági állapotot tükröző paraméterekkel (leptin; testtömeg,
haskörfogat és prealbumin szint). A korra és nemre való korrekciót követően is szignifikánsak
maradtak ezek az összefüggések.
MIS strukturális egyenletmodellek
Annak ellenőrzésére, hogy a MIS valóban mind a gyulladást, mind a tápláltsági állapotot
méri, a “strukturális egyeneletek modellezése” (SEM) módszert alkalmaztuk 1 vagy 2 látens
változó feltételezésével. A ”látens változók” a “gyulladás” és a “malnutríció” feltételezett
komponenseknek felelnek meg a MIS összpontszámon belül. A két látens változós modell
80
pontosabban illeszkedett a vizsgálat adataihoz, mint a csak egy kompozit változót feltételező
modell.
A 19. ábra a MIS strukturális egyenletmodell által feltételezett összefüggéseket, azok erősségét és
irányát mutatja.
0,37
-0,38
leptin
0,12
e7
malnutrició
0,33
MIS
-0,49
0,66
1,02
0,27
-0,20
Haskörfogat
Prealbumin
0,82
0,16
e3
e4
inflammació
0,6
-0,32
6,072 (df)
0,65
CRP
0,809
0,28
RMSEA 0,000
IL- 6
0,45
0,43
e2
e5
GFI 0,997
AGFI 0,991
TNF- α
CFI 1,000
0,08
e6
19. ábra: Strukturális egyenletmodell két latens változóval és az egyes változók közötti kapcsolat
erősségével. Részleteket lásd a szövegben
A két latens változót feltételező modellben a malnutríciós latens változó és a MIS közötti
kovariancia érték szignifikánsan eltért nullától (-2,92, p<0,001), a korreláció értéke -0,38 volt. A
latens gyulladásos változó és a MIS közötti kovariancia érték 1,49, a korreláció értéke pedig 0,32
volt (p<0,001).
81
6
Megbeszélés
Az immunrendszer sejtjei között a kommunikáció citokineken, ezeken a kisméretű, 8 000-
40 000 Da nagyságú fehérjemolekulákon keresztül valósul meg. A citokinek fokozzák vagy
gátolják az immunkompetens sejtek aktiválását, proliferációját és differenciálódását, ezáltal
szabályozzák az immunfolyamatokat, az immunválasz intenzitását, tartamát, az ellenanyagok
szintézisét és további citokinek termelését.
A citokinszintek mérésére általánosan elterjedtek az immunanalitikai módszerek. Ezek
egészen a legutóbbi időkig egy-egy specifikus analit mérését tették lehetővé, így sokáig nem volt
lehetőség arra, hogy a citokineket mint egy komplex rendszer részét egyszerre vizsgáljuk. A pár
éve bevezetett multiplex citokinszintmérő rendszerek ezért jelentettek áttörést. Magyarországon
elsőként volt alkalmunk az összehasonltó vizsgálatokat elvégezni, és a rendszereket tesztelni
reprezentatívnak minősülő betegpopuláción. A Semmelweis Egyetem Klinikáival szoros
kooperációban mód nyílt a külünböző klinikai esetekben a betegség-imunprofil megnyugtató
feltérképezésére. Vizsgálataink során összehasonlítottuk a különböző multiplex rendszerekkel
kapott eredményeket, illetve néhány betegségben meghatároztuk a jellemző citokinprofilt.
Kezelési módok hatásosságának felmérésére, illetve azok mellékhatásáinak vizsgálatára is
sor került.
6.1
Összehasonlító vizsgálatok
A különböző mérési rendszerek között lényeges különbségek vannak (antitestek eltérőek,
vizsgálat menete változó, eltérő a módszerek érzékenysége stb.) Ez megnehezíti a kapott
eredmények összehasonlítását. Az irodalomban a különböző multiplex rendszerek alkalmazásával
nyert értékek összehasonlítására vonatkozóan nem találtunk adatokat. Célkitűzésünk annak a
vizsgálata volt, hogy két multiplex rendszer (Biochip® és Bioplex®), azaz a chip felületre kötött
antitestek vagy a mikrogyöngyök felületére kötött antitestek segítségével mért citokinszinteredmények mennyire szorosan függnek össze, illetve, hogy az ezekkel mért egyik analit (IL-6)
érték összevethető-e egyedi IL-6 mérő ELISA-kittel kapott eredményekkel.
Eredményeink egyértelműen jelzik, hogy a multiplex citokinszint-meghatározásra
alkalmas Biochip és Bioplex rendszerekkel az IL-6-szint gyakorlatilag az összes, az IL-2, IL-8,
IL-10, TNF-α, IL-4, IFNγ viszont csak az esetek egy részénél mérhető az egészséges
önkéntesekben. Az egyes mérési rendszerekkel kapott eredmények – bár bizonyos esetekben
szoros kapcsolat áll fenn közöttük – alapvetően rendszer-specifikusak. Ezért alapvetően fontos,
hogy egy adott laboratórium egy adott kísérlethez mindig ugyanazt a rendszert alkalmazza. Az
82
egy adott rendszerrel mért citokinértékek nem használhatóak fel olyan kísérletek során,
melyekben egyéb módon (is) mértek citokinszinteket.
Az esetenként gyenge erősségű összefüggéseken túl az egyes rendszerekkel mért
citokinszintek között szisztémás eltérést is kimutattunk. Ez arra hívja fel a figyelmet, hogy az
egyes rendszerek esetében a vizsgálatot végző laboratóriumnak külön-külön meg kell határoznia
az egészséges populációra vonatkozó referenciaértéket, illetve, hogy a referenciaérték feltüntetése
mellett érdemes jelezni, hogy milyen módszerrel történt a meghatározás.
6.2
Citokin-profil vizsgálata fiziológiás és patológiás körülmények között
6.2.1 Citokinszintek perinatális jelentősége
Kísérleti adatok alapján az újszülöttkori posztaszfixás agykárosodásban a gyulladásnak,
illetve az aktivált immunsejtek okozta idegsejt-károsodásnak központi szerepe van [Scher és
mtsai 2001]. Az immunaktivációt a gyulladásos citokinek, az IL-1, IL-2, IL-6, TNFα és IFNγ
[Damman és mtsai, 1997; Xanthou, 2002] szintek emelkedése is jelzi, melyek a gyulladás
kiváltásában és fenntartásában egyaránt közrejátszanak. A gyulladásos citokinek szintje
perinatális aszfixiát követően ugrásszerűen nő [Aly és mtsai 2006, Okazaki és mtsai 2006,
Xanthou és mtsai 2002].
Az elhúzódó terápiás hipotermia igazoltan javítja a kimenetelt, ezért egyre elterjedtebben
használják [Azzopardi és mtsai 2007, Jacobs és mtsai 2007]. A hipotermia idegvédő hatásának
egyik eleme a szisztémás gyulladásra kifejtett gátló hatás lehet. Célkitűzésünk az volt, hogy a
pro- és antiinflammatorikus citokinek posztnatális kinetikája alapján jellemezzük a hipotermia
gyulladásra gyakorolt hatásait aszfixiás eredetű újszülöttkori encefalopátiás gyermekekben,
illetve ellenőrizzük a kezelés hathatósságát.
Adataink alapján perinatális aszfixiát követően az első 72 életóra alatt a szérum
citokinszintek a posztnatális kortól, valamint a hipotermiás kezeléstől függően változnak. A 6.
életórában
az
IL-6-koncentrációk
szignifikánsan alacsonyabbak voltak a
hipotermiás
gyermekeknél a normotermiásokhoz képest, illetve egyéb citokinek esetében is kisebb értékek
iránti tendenciát észleltünk. Mindamellett mind a két csoportban a pro- és antiinflammatorikus
citokinszintek a születést követő 72 óra alatt csökkentek, illetve a Th1- és Th2 citokinek aránya a
Th2 dominancia irányába tolódott el.
A perinatális adaptáció során ismert, hogy szisztémás gyulladásos reakció van jelen,
azonban csak néhány vizsgálat során elemezték több időpontban egyszerre többféle citokin
szintjét [Protonotariou és mtsai 1999, Sarandakou és mtsai 1998]. Neonatalis encefalopátia
esetében a citokinszint-kinetikára vonatkozó humán adatok azonban teljesen hiányoznak.
83
Korábbi vizsgálatok alapján hipoxiás-iszkémiás inzultus esetén az IL-6, IL-8 és IL-10
szintek a plazmában [Aly és mtsai 2006, Okazaki és mtsai 2006, Xanthou és mtsai 2002] vagy az
agyszövetben [Saliba és mtsai 2001, Szaflarski és mtsai 1995, Grow és mtsai 2002]
összefügghetnek a neurológiai károsodás mértékével [Xanthou és mtsai 2002]. Xanthou és
munkatársai IL-6, IL-1β és TNF-α plazmaszinteket vizsgáltak 1, 3 és 5 napos posztaszfixiás és
szeptikus kora- és újszülötteknél. Kimutatták, hogy az IL-6 szintek mind a két csoportban az
egészséges kontrollokhoz képest nagymértékben nőttek, azonban a 3 napra hasonlóak lettek.
Megfigyelésünk, miszerint posztaszfixiás újszülötteknél a szérum IL-6 citokinszintek a 6. és 72
életórában csökkennek, megfelelnek ezeknek az adatoknak.
Teoretikusan a kedvező klinikai hatások alapján arra lehetne számítani, hogy az elhúzódó
mérsékelt hipotermia a hipoxiás-iszkémiás inzultust követően immunmoduláns hatást fejt ki és
gátolja a szisztémás gyulladást. In vitro és állatkísérletes adatok szerint a hipotermia, legalábbis
rövid távon, csökkenti a gyulladásos és fokozza az antiinflammatorikus folyamatokat [Beilin és
mtsai 1998, Fairchild és mtsai 2000, Gundersen és mtsai 2001, Matsui és mtsai 2006, Qing és
mtsai 2001, Scumpia és mtsai 2004].
Posztaszfixiás újszülöttekben a hipotermia gyulladásra gyakorolt hatásával kapcsolatosan
eddig egyetlen humán adat áll rendelkezésre [Akisu és mtsai 2003]: posztaszfixiásoknál a
likvorban a trombocita eredetű növekedési faktor (platelet derived growth factor, PDGF) szintje
hipotermiás körülmények között kisebb, mint normotermia mellett.
Mivel az IL-6 központi szerepet játszik a citokinkaszkád szabályozásában, kitüntetett
figyelemmel elemeztük az IL-6-szint hipotermiában bekövetkező változását. A hipotermiás
kezelést a megszületést követően körülbelül 3 órán belül kezdtük el, amikor a citokinválasz
várhatóan már megkezdődött. Az a megfigyelésünk, miszerint 6 óránál a szérum IL-6 szintek
hipotermiában szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint normotermia mellett, illetve, hogy a
hűtés időtartama egyértelműen befolyásolja az aszfixiát követő gyulladásos válasz mértékét, azt a
hipotézist támasztja alá, hogy a hipotermia neuroprotektív hatásában a hipotermia gyulladásgátló
hatása is szerepet játszik. Szabó és mtsai [2008] További vizsgálatokra lenne szükség ennek
megerősítésére, bár ezek kivitelezése – mivel napjainkban a terápiás célú mérsékelt hipotermia az
újszülöttkori posztaszfixiás agykárosodás ellátásának a rutin részét képezi – etikai korlátokba
ütközik.
Azt is kimutattuk, hogy a gyulladáscsökkentő hatású IL-10 citokin szérumszintje a
születést követő 6 – 72 óra között nagymértékben csökken. Ebben az esetben a hűtött és nem
hűtött gyermekek között nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget. A hipotermia
IL-10 szintekre gyakorolt hatására vonatkozó kísérletes adatok ellentmondásosak. Míg Matsui és
84
mtsai [2008] szerint újszülöttkori patkány mikroglia tenyészetben hipotermiás körülmények
között az IL-10 citokinszint-termelés alacsonyabb, egy másik vizsgálat szerint emberben
hipotermiás körülmények között végzett szívműtétet követően az IL-10 szintek emelkedtek
[Buttram és mtsai 2007]. Érdekes módon, bár arra lehetne számítani, hogy az IL-10 adás
neuroptrotektív agykárosodást követően, Kline és mtsai [2002] egy patkánymodellben
kimutatták, hogy IL-10 adás gátolja a hipotermia agykárosodásra kifejtett kedvező hatását.
Míg a kísérletes adatok többsége szerint hipotermia esetén a gyulladás intenzitása csökken
[Fairchild és mtsai 2000, Quing és mtsai, 2006; Russwurm és mtsai 2002], egyes in vitro
megfigyelések szerint az enyhe hipotermia gyulladásfokozó hatású, mivel emeli az IL-1-β, IL-6,
IL-12p70 és TNF-α szinteket [Matsui, 2006], illetve csökkenti az IL-10 szintet [Matsui és mtsai
2004]. Ezen túl enyhe hipotermia mellett szeptikus betegeknél is emelkedik a gyulladásos
citokinek szintje [Fairchild és mtsai 2004]. Mások egy reszuszcitációt követő szisztémás
gyulladást elemző patkánymodellben nem észlelték a hipotermia gyulladásgátló hatását
[Callaway és mtsai 2008].
Munkánk során a citokineket biológiai hatásuk alapján csoportosítottuk és a REV
értékekben bekövetkező változásokat elemeztük. Külön vizsgáltuk a Th2-Th1 arányt jellemző
IL-4 / IFN-γ arányt is. Adataink szerint a posztnatális kor és a hipotermia valamelyes hatást
fejtett ki a citokinekre, azaz egy olyan tendenciát észleltünk, ami alapján a posztnatális kor
előrehaladtával és hipotermia mellett alacsonyabbak a szintek, azonban a leginkább szembetűnő
változás az IL-4 / IFN-γ arányban a 6 és 72 óra közötti időszakban bekövetkező emelkedés volt.
Ez a jelenség a hűtött és a nem hűtött csoportban egyaránt kimutatható volt. Egészséges
kontrollcsoport hiányában nem lehet eldönteni, hogy ez a jelenség a szülést követő természetes
posztnatális adaptáció része, vagy pedig a perinatális aszfixiára adott gyulladásos válasz
normalizálódásának az eredménye-e.
A koraszülöttek egy részében az adekvát terápia ellenére is súlyos gyulladásos
szövődmények, elsősorban légzőszervi és idegrendszeri károsodások lépnek fel. E szövődmények
hátterében egy közös pathomechanizmus, a „magzati gyulladásos válaszreakció szindróma”
(Fetal Inflammatory Response Syndrome) körvonalazódott [Andrews és mtsai 2000, Dammann és
mtsai 2005, Erdei és mtsai 2003, Gomez és mtsai 1998, Keelan és mtsai 1999]. Ennek lényege a
magzati korban az immunrendszer generalizált aktivációja. A magzati gyulladásos válaszreakció
szindróma során a magzat szervezetében a proinflammatorikus citokinek, elsősorban az
interleukin-6 szintjének emelkedése következik be. A gyulladásos citokinek szintjét a perinatális
fertőzés alapvetően meghatározza. Emellett azonban teoretikusan számos egyéb tényező, így az
alkalmazott terápia és az endokrin státusz is modulálhatja a gyulladás intenzitását.
85
Koraszülötteknél a keringő kortizolszintet számos tényező befolyásolja: a hipotalamuszhipofízis tengely éretlensége, a szülés módja és az azzal járó stressz-reakció, perinatális
események (aszfixia, légzési elégtelenség), az alkalmazott kezelés (antenatális anyai szteroid
kezelés). Egyes esetekben átmenetileg nem termelődik elegendő endogén kortizol, ami miatt a
koraszülött nem képes a kardiovaszkuláris és a biokémiai homeosztázis fenntartására, relatív
mellékvese-elégtelenség következik be [Ng, 2008]. Az alacsony endogén kortizolszintek mellett
szisztémás hipotenzió jelentkezhet [Ng, 2004]. Kora- és újszülöttek esetében szoros kapcsolatot
találtak a morbiditás és a relatív mellékvese-elégtelenség között. [Langer, 2006] Ebben a
kardiovaszkuláris instabilitás mellett szerepe lehet a fokozott gyulladásnak, illetve a rendkívül
magas gyulladásos citokinszinteknek is. Az alacsony kortizolszintnek nemcsak koraszülötteknél,
hanem patológiás állapotú érett újszülötteknél bekövetkező gyulladásos válaszreakcióban is lehet
szerepe. Célkitűzésünk az volt, hogy elemezzük koraszülötteknél az egyik legfontosabb
gyulladást befolyásoló hormon, az endogén módon szintetizált kortizol és a gyulladásos citokinek
szintje közötti kapcsolatot. Ezen túl vizsgálni kívántuk aszfixiás újszülöttek esetében is a
gyulladásos válasz és az endogén kortizolszintek közötti kapcsolatot.
A stressz vagy betegség hatására felszabaduló kortizol elengedhetetlen a túléléshez
[Fernandez és mtsai 2009]. Relatív mellékvese-elégtelenségről akkor van szó, ha a betegnél nem
szabadul fel megfelelő mennyiségű kortizol a stressz / betegség hatására. Számos vizsgálat
igazolta, hogy ilyen esetben nő a morbiditás és mortalitás.
A mellékvesekéreg-elégtelenség különösen gyakori súlyos állapotú, szeptikus betegeknél.
Elsősorban akkor szokott felmerülni ez a lehetőség, ha a súlyos sokkban lévő beteg nem reagál a
hagyományos sokkellenes kezelésre [Langer és mtsai 2006]. Diagnosztikájában elsősorban a
teljes kortizolszint mérése segít. Intenzívosztályon kezelt felnőtteknél a mellékveseelégtelenségben szenvedő betegeknél az alapbetegség életveszélyes állapotoktól az enyhébb
szervi elégtelenségig terjedhet [Shenker és mtsai 2001]. Mivel nincsenek anamnesztikus adatok, a
kortizolszintet nem monitorozzák rutinszerűen, illetve számos társbetegség is jelen van, az
egyértelmű diagnózis gyakran késik.
A relatív mellékvese-elégtelenség klinikai megjelenési formája általában a katekolaminfüggő hiperdinámiás sokk, ami szteroidokra reagál [Nieboer és mtsai 2000]. A szteroidokra adott
paradox válasz hátterében sejtszinten a glükokortikoidokra adott válaszkészség csökkenése állhat.
A glükokortikoidok a sejtmembránban jelen lévő adrenerg receptorok intracelluláris
szignalizációját biztosítják, ez glükokortikoid-hiány esetén csökken [Bennett és mtsai 1999]. A
mellékvese-elégtelenség gyanúját felvetheti az eozinofília [Beishuizen és mtsai 1999], nem
86
megmagyarázható hipotermia, hiperpigmentáció, hiperkalémia és hiponatrémia, émelygés,
hányás és hasi fájdalom, valamint a folyadékra, katekolaminra nem reagáló hipotenzió.
Egyre több bizonyíték jelzi, hogy a relatív mellékvese-elégtelenség szerepet játszik
koraszülötteknél a hemodinamikai instabilitás és hipotenzió kialakulásában, azonban továbbra
sem ismert, hogy mennyire hatásos vagy biztonságos ennél a populációnál a glükokortikoidok
pótlása. Nagyon éretlen, 30. gesztációs hét előtt született koraszülötteknél gyakran mérnek súlyos
artériás hipotenzió esetén alacsonyabb kortizolszinteket [Heckmann és mtsai 2001].
Koraszülöttekkel kapcsolatosan végzett munkánk során azt elemeztük, hogy a relatív
mellékvese-elégtelenségnek van-e nem kardiovaszkuláris következménye. Vannak ugyanis arra
vonatkozó adatok, hogy az élet első hetei során fennálló csökkent mellékvese-működés esetén nő
a bronchopulmonáris diszplázia (BPD) kockázata [Heckmann és mtsai 2001]. Mivel ismert, hogy
a BPD pathomechanizmusában a gyulladás központi szerepet játszik [Bokodi és mtsai 2007],
ezért megalapozottnak tűnt az a felvetés, hogy az alacsony endogén kortizolszint mellett nagyobb
lehet a gyulladásos reakcióban szerepet játszó citokinek szintje.
A kérdés vizsgálatát megnehezíti az a tény, hogy koraszülöttekre vonatkozóan nem állnak
rendelkezésre egészséges referenciaértékek, illetve, hogy a citokinszintek nagymértékű egyéni
variabilitást mutatnak. Az előbbi problémát azzal oldottuk meg, hogy a ’relatív’ adrenális
inszufficiencia kifejezés helyett medián alatti – ’alacsony’ –, illetve medián feletti – ’magas’ –
kortizolszintű csoportokat definiáltunk és ezek a citokinszintjeit hasonlítottuk össze. A
citokinszintek összehasonlítására az 5.2.1.1. pontban ismertetett REV paramétert vezettük be.
Eredményeink egyértelműen jelzik, hogy az alacsony kortizolszintekkel rendelkező
koraszülötteknél a gyulladásos citokinek szintje emelkedik, illetve, hogy ez a jelenség az
éretlenebb kohortokban még kifejezettebb. Azaz a mellékvese-működés és a szisztémás gyulladás
mértéke koraszülötteknél szorosan összefügg, aminek esetleg szerepe lehet a koraszülötteket
fenyegető perinatális szövődmények kialakulásában és kockázatában. Eredményeink azt a
lehetőséget is felvetik, hogy a veszélyeztetett populációkban a csökkent mellékveseműködés
kompenzálásaként érdemes lehet a glükokortikoidok pótlásával próbálkozni – az ilyen
indikációval kapcsolatban végzett terápiára vonatkozóan azonban a biztonságossági és
hatásossági adatok még hiányoznak. Ezekkel kapcsolatosan további vizsgálatokra van szükség.
A rendelkezésre álló adatok lehetővé tették annak meghatározását, hogy a prenatálisan az
anyánál végzett szteroidkezelés befolyásolja-e posztnatálisan az újszülöttben mérhető
kortizolszintek kinetikáját. Bár teoretikusan a hipofízis-mellékvese tengely szuppressziójának a
lehetősége fennáll, adataink alapján ezzel nem kell számolni.
87
Másik elemzésünket aszfixiás újszülöttek esetében végeztük. Eredményeink ebben az
esetben is igazolták, hogy az endogén kortizolszint a szisztémás citokinszintekre döntő hatást
gyakorol. Az alacsony kortizolszintű csoportokban a proinflammatorikus citokinek (IFN-γ, IL-1,
IL-2, IL-6, TNFα) szintje nőtt, míg az antiinflammatorikusaké (IL-4, IL-10) csökkent a magasabb
kortizolszintű csoportokhoz képest. A kortizol jelentőségét IL-10, IL-10 / IL-6, IL-10 / IL-2,
IFN-γ és a kortizol, illetve a terápia – kortizol és posztnatális kor –kortizol közötti szignifikáns
interakciók is alátámasztják, amelyek azt jelzik, hogy az alacsonyabb kortizolszintek esetén
kifejezettebb a szisztémás gyulladás posztaszfixiás koraszülöttek esetében is. Fontos megjegyezni
azt is, hogy a hipotermiás koraszülöttek esetében a kortizolhiány és a gyulladásos citokinek
közötti összefüggés kifejezettebb. Ez megfelel azoknak az irodalmi adatoknak, melyek szerint
súlyos szepszisben, amikor nagy a mellékvese-elégtelenség kockázata, a terápiásan alkalmazott
hipotermia során fokozódhat a gyulladásos reakció [Fernandes és mtsai 2008; Marik és mtsai
2007].
Kora- és újszülöttkorban a szisztémás bakteriális fertőzés sokszor igen rapid lefolyású,
ezért a gyors diagnózis alapvetően fontos a hatékony terápia mielőbbi bevezetése és a súlyos
szövődmények megelőzése érdekében. A diagnózis felállítását a bakteriális gyorstesztek és a
hemokultúra mellett az akut fázis fehérjék szintjének, elsősorban a magasabb CRP, IL-6 és
prokalcitonin szint kimutatása segíti; ezek monitorozása támpontot ad abban is, hogy a terápia
mennyire hatásos. Célkitűzésünk az volt, hogy elemezzük, a biochip módszer segítségével
meghatározott citokinszintek adnak-e járulékos információt szeptikus újszülötteknél a
prokalcitonin- és CRP-szintek mellett.
A perinatális szepszis azonnali diagnózisa jelenleg is nagy kihívást jelent a klinikusok
számára [Arnon és mtsai 2008, Burke és mtsai 2009, Mishra és mtsai 2006]. Roppant nagy
szükség lenne olyan gyors és pontos vizsgálati eljárások kidolgozására, melyek alapján a
szepszisre gyanús gyermekeknél azonnal el lehetne kezdeni a kezelést.
A szepszis diagnózisa egyértelmű, ha a hemokultúra eredménye pozitív. A hemokultúra
viszont időt vesz igénybe, míg a kezelés megkezdésével nem lehet várni. Ezért a perinatális
szepszist a hemokultúra eredményének megérkezéséig döntően a klinikai tünetek [Dollner és
mtsai 2001] és a laboratóriumi vizsgálatok eredményén diagnosztizálják. Utóbbiak közül a
klinikai gyakorlatban a CRP- és a prokalcitoninszint mérése terjedt el, ezek negatív prediktív
értéke 20 mg/l, illetve 10 µg/l melletti cutoff érték esetén 90% feletti.
Munkánk során a klinikai tünetek és a terápiás válasz alapján azt elemeztük, hogy az IL-6,
IL-8 és IL-10 citokinszintek mérésével segíthető-e a korai szepszis diagnózisa újszülötteknél.
88
Az általunk vizsgált populációban az első napon, az antibiotikus kezelés megkezdése előtt
mért a CRP- és/vagy prokalcitonin-szint a szeptikus újszülöttek 63,4%-nál jelezte a betegséget.
Érdekes módon az ezek mellett vizsgált citokinek szintje csak a gyermekek töredékénél haladta
meg azt a cutoff értéket, ami felett az irodalmi adatok alapján szepszisről van szó [Bender és
mtsai 2008], ami jelzi, hogy a perinatális szepszis korai fáziásnak a laboratóriumi
diagnosztikájában alapvetően erre a két paraméterre érdemes hagyatkozni.
Fontos megjegyezni, hogy az általunk vizsgált szeptikus újsülöttek esetében az emelkedett
IL-8 szint járulékos információt jelenthet. Az IL-8 cut-off értékét meghaladó betegek közül
ugyanis hatnál (a vizsgált populáció 15%-nál) sem a CRP, sem a prokalcitonin-szint nem utalt
szepszisre. Az IL-8 szint rutinszerű mérésével és 90 pg/ml-s cut-off érték alkalmazásával az
általunk vizsgált, veleszületett szepszisben szenvedő újszülötteknek 78,4%-a azonosítható.
Eredményeink szerint viszont ebben a kísérleti felállásban az IL-6 és az IL-10 szinteknek nincs
prediktív értéke. (Érdemes azonban azt is megjegyezni, hogy a kismértékben emelkedett
fehérvérsejt-számnak sem volt ebből a szempontból kiemelt jelentősége.)
Vizsgáltuk, hogy az általunk mért citokinszintek hogyan változnak akutan az antibiotikus
kezelés bevezetésekor. (A vizsgálatba vont újszülöttek állapota az antibiotikus kezelés
bevezetésekor lényegesen javult, a terápia végére az újszülöttek meggyógyultak.) Az első három
életnapon dinamikusan csökkenő prokalcitonin-szintet és mérsékeltebb ütemben csökkenő CRPszintet mutattunk ki [Fehér és mtsai 2008]. A vizsgált citokinek ebből a szempontból nem voltak
informatívak, bár meg kell jegyezni, hogy mindegyik citokin szintje csökkenő tendenciát
mutatott. Adataink alapján azt nem lehet megmondani, hogy a mért adatok milyen mértékben
jelezték a terápiás választ és/vagy az esetleg fennálló gyulladás progresszióját, illetve azt, hogy a
születés során tranziensen emelkedő citokinszintek normalizálódnak [Buonocore és mtsai 1995,
Chisea és mtsai 2001, Rizos és mtsai 2007, Sarandakou és mtsai 1998]. A kérdést egészséges
újszülöttek bevonásával és szekvenciális vizsgálatával lehetne eldönteni, erre azonban etikai okok
miatt nincs sok lehetőség.
Az általunk vizsgált fehérjék akut fázis fehérjék, így elemeztük a közöttük fennálló
kapcsolat erősségét, ez azonban csak elvétve volt szignifikáns mértékű. Ez annak a jele, hogy a
mért analitok a gyulladásos választ más-más aspektusból képezik le, a gyulladásos folyamatot
eltérő kinetikával követik, azaz hipotetikusan eltérő élettani folyamatokat tükröznek. Bár ezek
vizsgálata az alapkutatás szempontjából minden bizonnyal nagy jelentőségű lehet, klinikai
hasznosságuk valószínűleg korlátozott.
89
6.2.2 Citokinek májbetegségekben. A fémion-koncentrációk összefüggése a szisztémás
citokinszintekkel
Számos adat utal arra, hogy a nők érzékenyebbek az alkohol májtoxikus hatásaira [Lieber
és mtsai 1994]. Nőknél már napi 20 gramm, míg férfiaknál csak napi 30 gramm alkohol krónikus
fogyasztása mellett alakul ki májkárosodás. A nemtől függő különbségre számos magyarázat
született, így például az, hogy nőknél az alkohol farmakokinetikája, eliminációs sebessége,
szöveti eloszlása eltérő [Baraona és mtsai 2001, Frezza és mtsai 1990], más a metabolizmusért
felelős enzimek aktivitása [Chrostek és mtsai 2003, Müller 2006], fokozottabb a májsejtek
érzékenysége a gyulladásos ingerekre [Dettling és mtsai 2008, Thurman és mtsai 2000]. Számos
kísérleti adat és klinikai megfigyelés utal arra is, hogy a májkárosodás kialakulásában a szabad
gyökök által kiváltott toxikus hatásokkal, így a szabad gyök indukálta gyulladással szembeni
nemtől függő érzékenység is szerepet játszik [Yamashina és mtsai 2005]. Az alkohol okozta
károsodást nagymértékben
Alkoholtartalma
ellenére
befolyásolja,
a
vörösbor
hogy milyen formában kerül
mérsékelt
mennyiségben
történő
elfogyasztásra.
fogyasztásával
kapcsolatosan számos kedvező biokémiai hatást mutattak ki, aminek a hátterében a vörösbor
antioxidáns hatása lehet. Célkitűzésünk az volt, hogy a mérsékelt vörösborfogyasztás szisztémás
gyulladásra, a fémionok szintjére és a redox-homeosztázisra gyakorolt hatásait vizsgáljuk
egészséges férfiakban és nőkben és elemezzük, hogy ezek a hatások mutatnak-e nemtől való
függést.
Vizsgálatunk igazolta, hogy az egy hónapig tartó, a lakosság nagy hányadára jellemző
mennyiségben történő mérsékelt vörösborfogyasztás egészséges fiatal egyénekben a szérum
citokinszintek, fémionok és antioxidáns-paraméterek esetében nemtől függő módon markáns
változásokat idéz elő [Bekő és mtsai 2008].
Egyrészt kimutattuk, hogy egészséges fiatal nőknél és férfiaknál egy hónapon keresztül
napi 24 g, illetve 36 g alkohol nem okoz májkárosodást. Ez a megfigyelés ellentmond számos
korábbi közleménynek, amely felhívta a figyelmet arra, hogy ez a mennyiségű alkohol már
egészségre veszélyes lehet. [Becker és mtsai 1996, Bellentani és mtsai 1997, Snow és mtsai 2009]
Az ellentétes eredményt talán megmagyarázhatja az, hogy a résztvevők vörösbort fogyasztottak,
ami az alkohol mellett számos egyéb, az alkoholos májkárosodás ellen védő bioaktív anyagot is
tartalmaz mint a flavonol származékok (katechinek), fenol-karbonsavak és –aldehidek
(pl.gallusz-, sziringin-vanillinsavak, sziringin-protokatechualdehidek) és a flavonol származékok,
kiemelten a B gyűrűn vicinális hidroxilcsoportokat tartalmazók (kvercetin, kvercitrin, miricetin)
továbbá a rezverarol [Rivero-Pérez és mtsai 2007, Kasdallah-Grissa és mtsai 2007, Upadhyay és
mtsai 2008]. A rezveratrolról a közelmúltban kimutatták, hogy alkoholos májkárosodás
90
egérmodelljében meg lehet szüntetni a zsírmájat, valószínűleg az intracelluláris jelátvitelre és
zsírmetabolizmusra gyakorolt hatása révén [Ajmo és mtsai 2008]. Mivel az általunk használt
vörösbor, az Egri Cuvée rezveratrol-tartalma nagy (12,03 mg/l), lehet, hogy ez az egyik olyan
tényező, ami megakadályozta a májkárosodás kialakulását.
Annak ellenére, hogy nem észleltünk a májműködésben eltéréseket, markáns változásokat
figyeltünk meg a szérum citokinszintek, fémionok és antioxidáns védekezőképesség esetében. A
változások jelentős része nemtől függő – nők esetében sokkal kifejezettebb – volt.
Egyik legfontosabb megfigyelésünk, hogy nőknél egy hónapig tartó vörösborfogyasztás
mellett egyes citokinek szintje szignifikánsan változik. A gyulladásos citokinek – így a TNFα,
IL-1, IL-8 és a májban termelődő többi akut fázis citokin, így az IL-6 – jelentősége alkoholos
májkárosodásban ismert. Alkoholos májbetegségben két faktor váltja ki a fokozott
citokintermelést: egyrészt nő a szervezet endotoxin-expozíciója, másrészt az alkohol lebontása
során szabad gyökök generálódnak és ezek határása aktiválódnak az NF-κB útvonalon keresztül a
gyulladásos citokineket termelő gének [Khoruts és mtsai 2001, Mandrekar és mtsai 2009, Nanji
és mtsai 1999]. Érdekes módon a szignifikáns citokinszint-változások nem egy irányba mutatnak.
A gyulladásos citokinek közül kettőnek (IL-1α és IL-2) a koncentrációja nőtt, az IL-6-szint
csökkent, míg a TNFα szintje lényegében nem változott. Eredményeink alapján nem lehet
megmondani azt, hogy ez összességében májkárosodás lehetőségére hívja-e fel a figyelmet –
mindenesetre az a tény, hogy az egy hónapos vizsgálatot követően a májfunkciós tesztek
eredménye nem változott, azt jelzik, hogy a citokinszintek ilyen mértékű és jellegű
megváltozásának valószínűleg nincs klinikai jelentősége. Ettől eltekintve azonban az, hogy
citokinszint-eltéréseket csak a nőknél figyeltünk meg, jelezheti, hogy az alkohol nemtől függő
májkárosító hatásában az eltérő gyulladásos válaszkészségnek szerepe lehet [Bekő és mtsai
2008].
A fémionok esetében talán a legfontosabb változásnak az ólomszintek csökkenését tartjuk,
ezt a hatást férfiaknál és nőknél egyaránt észleltük. Magas ólomexpozíció esetén ismert, hogy a
szabadgyök-képződés fokozódik, ezzel összefüggésben pedig nő a máj, az agy és a vesetoxicitás
kockázata. [Flora és mtsai 2007, Hermes és mtsai 1991, Hsu és mtsai 2002]. Ebből a
szempontból a vörösborfogyasztás kifejezetten kedvező hatású [Mudipalli és mtsai 2007]. A
potenciális kedvező hatást jelzi, hogy a vizsgálat során a résztvevőknél az antioxidáns védekezés
javult.
Eredményeink alapján természetesen nem lehet megmondani, hogy az ólomszint
csökkenése a vörösborban jelen lévő, eddig még nem azonosított anyagnak köszönhető-e.
Potenciálisan a sztilbénszármazék rezveratrol és egyéb polifenolos vegyületek jönnek szóba
91
[Lavid és mtsai 2001; Shalan és mtsai 2005] Az alumíniumszint esetében észlelt hasonló mértékű
csökkenés ezt a kelátor hatást valószínűsíti.
A fémionok szintjének a megváltozásában elméletileg a diéta is szerepet játszhat. Ez a
lehetőség különösen a kalcium esetében jön szóba. Bár a résztvevők étrendjét nem elemeztük
részleteiben, elképzelhető, hogy a kalciumszint csökkenése annak az eredménye, hogy a
rendszeres alkoholfogyasztás miatt csökkent a kalciumban gazdag italok (tej, gyümölcslé)
fogyasztása. (Egyik esetben sem jeleztek a résztvevők laktóz intoleranciát, ami szintén ezt a
felvetést támasztja alá.) Emellett általánosan ismert, hogy a krónikus alkoholfogyasztás mellett
csökken a kalciumbevitel [Fatma és mtsai 2004; Perry és mtsai 1998], illetve egy egyelőre
ismeretlen mechanizmus révén csökken az ionizált és összes kalciumszint [Diez és mtsai 1997;
Keiver 2005]. Vizsgálatunkban a Sr és a Ca parallel módon változott. Mivel a Sr és a Ca
fizikokémiai tulajdonságai hasonlóak, illetve a Sr döntően a Ca-mal együtt fordul elő, a Sr-szint
csökkenésében valószínűleg ugyanolyan mechanizmus játszik szerepet, mint a Ca-szint
csökkenésében.
Eredményeink alapján a fémionok nemtől függő módon változnak [Bekő és mtsai 2009].
Nőknél a vizsgálat kezdetekor magasabb a Mg és Zn szint, illetve a Zn/Cu arány a
vörösborfogyasztás során csökkent, ezzel szemben férfiaknál ezek nem változtak. Ismert, hogy a
Zn és Mg védenek az alkohol indukálta májkárosodással szemben [Cabré és mtsai 2001, Kang és
mtsai 2005, Poikolainen és mtsai 2008]. A Zn adása megakadályozza az etanol okozta P450 2E1
aktivitás-fokozódást, illetve fokozza az alkohol metabolizmusát végző alkohol-dehidrogenáz
aktivitást. Az intracellularis Zn Fas/FasL-mediált útvonalon keresztül gátolja az alkoholindukálta májsejt-apoptózist [Bolkent és mtsai 2006]. A Zn a glutation-függő és a szuperoxiddizmutáz antioxidáns kapacitást is fokozza. Eredményeink alapján nem tudjuk megmondani,
hogy mi állhat a nemi különbségek hátterében, azonban a Zn- és Mg-szintekben észlelt eltérés
szerepet játszhat a nők alkohol iránti fokozott érzékenységében.
Az a megfigyelésünk, hogy a vörösborfogyasztással összefüggésben javult a résztvevőknél
az antioxidáns védekezőképesség, a korábbi adatoknak megfelel [de Gaetano és mtsai 2003,
Stanley és mtsai 1999]. Ez részben a vörösvértestek csökkent fémion-koncentrációjával függhet
össze. A fémionok és az antioxidáns védelem közötti kapcsolat általánosan ismert, ezt mi is
kimutattuk [Bjelakovic és mtsai 2008, Zidenberg-Cherr és mtsai 2001]. Valószínűleg a nőknél
bekövetkező kifejezettebb antioxidáns-státusz javulás a kifejezettebb fémion-szint változásokkal
áll kapcsolatban. Az antioxidáns védelem javulásában ezen túl a vörösborban lévő polifenolok, a
rezveratrol a favonol származékok (katechinek), fenol-karbonsavak és –aldehidek (pl.gallusz-,
sziringin-vanillinsavak, sziringin-protokatechualdehidek) és a flavonol származékok, kiemelten a
92
B gyűrűn vicinális hidroxilcsoportokat tartalmazók (kvercetin, kvercitrin, miricetin) is szerepet
játszhat. (Utóbbinak azonban a nemek közti különbségben elhanyagolható lehet a szerepe,
ugyanis a férfiaknál a testtömeg-kilogrammra vonatkoztatva elfogyasztott napi antioxidáns dózis
csupán 10%-kal haladta meg a nőknél becsült értéket).
A májfibrózis és májcirrhosis ugyanannak a kórfolyamatnak a különböző állomásai. A
májfibrózis esetén a máj kötőszövetesen átépül. Ebben a folyamatban a gyulladás, a májsejtek
károsodása, pusztulása egyidőben van jelen. A gyulladás kialakulásában és fenntartásában a
gyulladásos citokinek fokozott termelődése központi szerepet játszik (6.2.2.2.A ábra) [Pinzani és
mtsai 2001, Tsukamoto és mtsai 1999].
20. ábra Májkárosító noxa és a citokinválasz közötti kapcsolat [Pár és mtsai 2006]
Célkitűzésünk annak az elemzése volt, hogy a fibrózis végállapotát jelentő májcirrhosis
esetén mérhető szisztémás citokin-profil változik-e a májcirrhosis etiológiájától függően. Ennek
érdekében krónikus alkoholfogyasztás, HCV-fertőzés miatt kialakult cirrhosisban, illetve primer
biliáris cirrhosisban szenvedő betegek citokinszintjeit határoztuk meg.
A citokinek központi szerepet játszanak az intrahepatikus immunsejtek és a hepatociták
kommunikációjában: egyaránt befolyásolják a sejthomeosztázis szabályozó intracelluláris
jelátvivő útvonalakat, illvetve az immunsejtek működését. A veleszületett immunitást alapvetően
befolyásoló TNF-α és IL-6 termeléséért a Kupffer-sejtek és a májba került monociták és
93
makrofágok a felelősek. Ezek a citokinek olyan szignálokat indíthatnak el, melyek
eredményeként a májsejtek apoptózisa következhet be, beindulhat a kötőszöveti fibrózis [Tacke
és mtsai 2009].
A citokintermelődés diszregulációja és a következményes szöveti gyulladás a májsejteket
támadó vírusfertőzések, így a HCV esetén egyértelműen jelen van [Tiegs és mtsai 2007]. Egyre
több adat utal azonban arra, hogy az antigéntől független májbetegségekben is központi szerepe
van az ellenőrizetlen immunválasznak. Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy vannak-e olyan
specifikus citokinek, amelyek a különböző etiológiájú, vírusos, autoimmun, illetve toxikus
eredetű májcirrhosisokban eltérő módon viselkednek.
Eredményeink azt mutatják, hogy bár klinikailag és szövettanilag a cirrrhosis egy
végállapot, a patológiás folyamat celluláris szinten korántsem zárult még le, mert mindegyik
cirrotikus csoportban az egészséges szintet többszörösen meghaladó IL-6 szinteket észleltünk. Ez
az eredmény megfelel az IL-6-nak a máj kötőszövetes átépülésében játszott központi szerepével
[Kershenobich Stalnikowitz és mtsai 2003].
A cirrotikus betegeken belül a legalacsonyabb citokinszinteket alkoholos eredetű
májcirrhosisban
szenvedő
betegeknél
mértük.
Bár
a
betegség
kialakulásában
a
proinflammatorikus citokinek ellenőrizetlen termelődésének az irodalmi adatok alapján fontos
szerepe van [Jeong és mtsai 2008], a gyulladás jelentősége a HCV-fertőzés, illetve a PBC talaján
kialakult májkárosodáshoz képest kisebb. HCV-fertőzés talaján kialakult cirrhosisban az IL-6szint mellett csak az IL-2-szint emelkedett szignifikánsan. Ez a megfigyelésünk összhangban van
azoknak a korábbi vizsgálatoknak az eredményeivel, melyek HCV-fertőzésben és az ennek
talaján kialakult cirrhosisban nagyobb IL-2 szérumszinteket igazoltak [Kasprzak és mtsai 2004,
Kasprzak és mtsai 2006].
Az IL-6 mellett a legmagasabb gyulladásos citokinszintek az autoimmun eredetű PBCben mérhetőek. Ebben a kórképben az IL-8- és a TNFα-szintek az egészséges referenciaérték
többszörösét is elérhetik, illetve az átlagos antiinflammatorikus IL-10-szint az egészségesekben
mért érték kevesebb, mint a fele. PBC-ben a magas TNFα-szint ismert [Jirillo és mtsai 2002],
míg az általunk észlelt kiemelkedő IL-8-szintekről eddig csak igen korlátozott számú irodalmi
adat áll rendelkezésre [Chuang és mtsai 2006]. Eddig túlnyomórészt csak szövettani vizsgálatok
eredménye jelezte, hogy a biliáris sejtekben az IL-8 expressziója összefügghet a betegség
súlyosságával és progressziójával. [Isse és mtsai 2007].
Eredményeink alapján azt a következtetést vontuk le, hogy az IL-8-szint emelkedése
PBC-ben fontos diagnosztikus jel és esetleg terápiás célpont is lehet. HCV-ben az IL-2 szint
94
emelkedése karakterisztikus, míg alkoholos eredetű májcirrhosisban a szisztémás gyulladásra
utaló jel – a magasabb IL-6 szintek kivételével – nem figyelhető meg.
A Wilson-kór a májban zajló rézmetabolizmus autoszomális recesszív módon öröklődő
rendellenessége, aminek az eredményeként a hepatocitákban és egyes extrahepatikus szervekben,
így az agyban és a szaruhártyában réz rakódik le. Ennek eredményeként Wilson-kórra a
neurodegeneratív betegség és a májbetegség együttes jelenléte a jellemző. A betegségben
kialakuló cirrhosis mellett jellegzetes idegrendszeri tünetek (beszédzavar, ataxia, Parkinson-kór- szerű extrapiramidális tünetek), a szaruhártyában típusos elváltozás (Kaiser-Fleischner-gyűrű)
figyelhetők meg. A tünetek azonban nem mindenkinél vannak egyforma mértékben jelen, van,
amikor a májelváltozások, és van, amikor az idegrendszeri eltérések dominálnak. A tünetek
heterogenitásának az oka nem ismert. Célkitűzésünk annak a vizsgálata volt, hogy különböző
domináns tünetek mellett a redoxrendszerek aktivitásában, a fémion-, illetve a citokinszintek
esetében van-e különbség, ezek mennyire jellemzőek az egyes Wilson-kór altípusokra olyan
betegeknél, akik kelátor-kezelésben részesülnek.
Számos réztartalmú enzim van jelen az agyszövetben, így a dopamin-β-hidroxiláz, vagy a
Cu/Zn szuperoxid-dizmutáz (SOD1). Ezek működése réztúlterhelés mellett megváltozhat.
[Kitzberger és mtsai 2005]. Mivel a rézen kívül egyéb fémionok szintje is emelkedhet Wilsonkórban, ez a különböző sejtek és szervek, így az idegrendszer károsodásához vezethet.
Vizsgálatunk célkitűzése az volt, hogy elemezzük, a rézen kívül egyéb fémionok szintje eltérő-e
neurológiai tünetekkel járó Wilson-kóros betegeknél. Mivel ismert, hogy a Fenton-reakció révén
a fémionok alapvetően befolyásolják a szabadgyök-képződést, illetve a gyulladásos reakciók
intenzitását, vizsgálatunk kapcsán meghatározzuk azt is, hogy neurológiai tünetekkel járó Wilson
kórban megváltoznak-e a szisztémás citokinszintek és csökken-e az antioxidáns védelem
neurológiai szövődményekben nem szenvedő betegekhez képest.
Kutatásaink eredményei az irodalommal összhangban [Wiggelinkhuizen és mtsai 2009]
egyértelműen igazolták, hogy krónikus kelátorterápia mellett a szöveti rézszint Wilson-kórban
normalizálódik, függetlenül attól, hogy jelen vannak-e az idegrendszeri szövődmények, vagy
sem. (A terápia során betegeink 50%-nál a karakterisztikusnak tartott Kaiser-Fleischner gyűrű is
eltűnt). A kelátorkezelés ellenére azonban Wilson kórban számos fémion lényegesen meghaladta
az egészséges referenciatartomány felső határát. [Bekő és mtsai 2009] Ennek számos
patofiziológiai következménye lehet. Általánosan ismert ugyanis, hogy a nehézfémek (arzén,
kadmium, ólom, higany, nikkel) közvetlen hatást gyakorolnak a mentális viselkedésre. Hatásukra
a mentális és központi idegrendszeri funkciók károsodnak. Befolyásolják a neurotranszmitterek
termelődését és felhasználását, illetve számos anyagcserefolyamatot [Maile és mtsai 1999]. Az
95
alumínium célszerve a csont, agy, vese és gyomor. Az alumíniummérgezés főbb tünete a
bélfalizomzat
görcse,
demencia,
gasztroenteritisz,
vesekárosodás,
májműködési
zavar,
izomfájdalom, pszichózis és légszomj és általános gyengeség [Maile és mtsai 1999].
Ólommérgezés esetén akut és krónikus központi idegrendszeri károsodás lép fel. Az ólom a
fehérjék SH-csoportjait támadja és inaktiválja. Különösen veszélyes a fejlődő agyra, amiben a
neruonhálózatok kialakulását gátolja [Walsh és mtsai 1984]. A tartós krómexpozíció vese- és
májkárosodást vált ki, károsítja a keringést és az idegrendszert is. A báriumtoxicitás klasszikus
jele a súlyos hypokalémia, szívritmuszavar, légzési elégtelenség, elhúzódó idegrendszeri
diszfunkció, bénulás, myoclonus, magas vérnyomás és súlyos tejsavas acidózis [Ira és mtsai
2002].
Vizsgálatunk során kiderült, hogy a neurológiai tüneteket mutató betegeknél
szignifikánsan magasabb volt a Li, Pb, Cr és Ni szintje a neurológiai tünetektől mentes
betegekhez képest. Ezen elemek idegrendszeri működésre gyakorolt hatása alapján megalapozott
azt feltételezni, ezeknek az emelkedett fémionszinteknek jelentősége lehet a Wilson-kórhoz
társuló neurológiai szövődmények kialakulásában. Fontos hangsúlyozni azt is, hogy ezek a
szintek kelátorkezelés mellett emelkedtek. Ez egyrészt felhívja a figyelmet arra, hogy a ma
Magyarországon Wilson-kórban rutinszerűen alkalmazott D-penicillamin mellett egyéb,
kelátorok alkalmazása is indokolt lehet. Másrészt jelzi, hogy a kezelés hatékonyságának a
monitorozására a rézszintek ellenőrzése mellett egyéb fémionszintek mérésére is szükség lehet.
A
fémionszint-emelkedés
eredményeként
fokozódhat
a
szabadgyökös
reakciók
intenzitása. Ezt számos aspektusból vizsgáltuk (antioxidánsvédelem, antioxidáns enzimek
aktivitása, citokinszintek), azonban a neurológiai szövődményekkel járó és nem járó Wilson-kór
között nem találtunk különbséget. A különbség hiányára két magyarázatot feltételezünk:
(a) Ismert, hogy az idegrendszerben felhalmozódó réz hatására bekövetkező fokozott
szabadgyök-terhelés neurodegeneratív folyamatokat indukál [Rossi és mtsai 2004, Strausak és
mtsai 2001]. A D-penicillamin-kezelés során a Cu-szintek alapján történik a betegek
gondozása, így elképzelhető, a normalizált Cu-szintek mellett valóban nincs jelen fokozott
szabadgyök-terhelés. A többi, Wilson-kórban emelkedett fémionok valószínűleg nem
szabadgyök-mediált módon, hanem egyéb mechanizmusok, például egyes kulcsfontosságú
enzimek gátlása révén gyakorolnak hatást a sejtműködésre.
(b) Mérőmódszereink a szisztémás szabadgyök-terhelés és az ezzel szembeni védekezés
vizsgálatát tették lehetővé. Adataink csak közvetve utalnak a lokálisan kialakuló redoxhomeosztázis változásokra [Bekő és mtsai 2009].
96
Ismert, hogy számos neurodegeneratív betegségben a citokinszint megváltozása szerepet játszik
[Rojo és mtsai 2008, Shaftel és mtsai 2008]. Perry és munkatársai megfigyelése szerint az agyban
a pro- és antiinflammatorikus citokinek egyensúlyzavara a mikroglia-sejtek aktivációját váltja ki
és ez vezet az idegszövet károsodásához [Perry és mtsai 2004]. Kezelés előtt álló Wilson-kóros
betegeknél egy korábbi vizsgálat [Goyal és mtsai 2008] kimutatta, hogy a gyulladásos citokinek,
így a TNF-α, IFN-γ és IL-6 szintje emelkedik, ami folyamatosan fennálló gyulladásos reakcióra
utal. A szerzők feltételezték, hogy ebben a magasabb rézszinteknek van szerepe.
Munkánk során emelkedett IL-6- és IL-8-szintet találtunk a Wilson-kóros betegeknél, ami
alátámasztja, hogy valamilyen ok miatt a kezelt Wilson-kóros betegeknél is szisztémás gyulladás
van jelen [Bekő és mtsai 2007]. Mivel a vizsgálatunkban részt vevő betegeknél a rézszintet
normalizálták, ezért nem valószínű, hogy a fokozott gyulladásért a rézanyagcsere zavara lenne a
felelős. A fokozott gyulladásos reakcióban a többi fémion szintjének az emelkedése is szerepet
játszhat, habár a citokinszintek és a fémion-szintek között közvetlen kapcsolatot nem mutattunk
ki. Érdes módon a neurológiai tünetekkel szövődött Wilson-kór mellett a szisztémás gyulladás
intenzitása nem volt magasabb. Ez jelzi, hogy a a gyulladásos citokinek szintjének a mérése nem
segít az egyes Wilson-kóros alcsoportok elkülönítésében, viszont nem zárja ki a lokálisan, az
idegrendszerben zajló gyulladás lehetőségét.
6.2.3 Citokinek egyéb belgyógyászati kórképekben
Az utóbbi évek vizsgálatai alapján egyértelművé vált, hogy a tumoros betegek redoxhomeosztázisa szignifikáns mértékben különbözik az egészséges egyénekétől [Ristow és mtsai
2006]. A rák kialakulása és szóródása során a szabadgyökös reakciók és az antioxidáns
védekezés közötti egyensúly nagymértékben a szabadgyökös folyamatok irányába tér ki
[Belostotskaya és mtsai 2005, Blázovics és mtsai 2008].
Ez a felismerés vezetett azokhoz a próbálkozásokhoz, melyek célja, hogy az antioxidáns
védekezőképesség javítása révén segítsék a rákelleni védekezést.
A cékla (Beta vulgaris L. ssp. esculenta var. rubra) kedvező táplálkozás-élettani hatásai
bioaktív komponenseinek, a betainnak, betaninoknak, betaxantinoknak, flavonoidoknak,
polifenoloknak, vitaminoknak, (tiamin, riboflavin, piridoxin, aszkorbinsav), biotinnak, fólsavnak
köszönhetők. Szénhidrátkomponensei a glükóz, fruktóz és a szacharóz, valamint jelentős a
pektintartalma is. A céklát a népgyógyászat különféle daganatos betegségek gyógyítására is
alkalmazza. Az antioxidáns hatás kialakításában részt vesznek a színanyagok és a fenolos
vegyületek is. Irodalmi adatok és saját korábbi kutatásaink alapján tehát feltételeztük, hogy a
cékla optimális mértékű fogyasztása hasznos kiegészítője lehet a kemoterápiás kezelésben
97
részesülő prosztatarákos betegek táplálkozásjavításának. Célkitűzésünk annak a vizsgálata volt,
hogy prosztatakarcinómás betegeknél liofilizált céklapor adásakor hogyan változik a redox
rendszerek aktivitása, illetve ez milyen hatást gyakorol a szisztémás citokinszintekre és
növekedési faktorokra.
Irodalmi adatok, korábbi és jelen kutatásaink eredményei azt mutatták, hogy a
szervezetben végbemenő rákos folyamatok a szervezet egészét érintik, annak homeosztázisát
befolyásolják [Nyirády és mtsai 2009]. Ha az egy hónapig tartó cékla-kezelt, kemoterápiában is
részesülő metasztatikus betegek adatait elemeztük, akkor azt tapasztaltuk, hogy általában a
proinflammatorikus citokinek szérumszintje tendenciájában csökkent a cékla hatására. Az EGF
értéke ellenben szignifikánsan nőtt a kiegészítő kezelés hatására, ami az androgén dependens
tumorsejtek proliferációjában jelentős szerepet játszik. Ez a tény felhívja a figyelmet a kezelés
potenciális veszélyeire [Gregory és mtsai 2004; Zhu és mtsai 2008; Bekő és mtsai 2009 ]. E
megállapítással kapcsolatban azonban farmakognóziai kutatások is szükségesek lehetnek, mert a
céklafajták között szignifikáns különbségek mutathatók ki a biológiailag aktív hatóanyagok
koncentrációiban. E területen jelenleg is intenzív kutatásokat folytatunk.
Ha az IL-2 szérumszintjeit betegekre lebontva értékeltük, akkor azt láttuk, hogy az IL-2 a
betegek közel felében (44%) emelkedett, ami kedvező hatást jelez [Bălăşoiu és mtsai 2005].
Figyelemre
méltó
volt,
hogy
az
IL-6-,
IL-8-
és
a
TNF-alfa-szintek,
melyeknek
proinflammatórikus aktivitása összefüggést mutat a betegség progressziójával, több betegnél
jelentősen csökkent [Michalaki és mtsai 2004]. Annak megítéléséhez, hogy a betegek közül
kiknek az esetében érvényesül a kedvező hatás, további vizsgálatok végzése és az összefüggések
elemzése szükséges.
A Semmelweis Egyetemen folyó régebbi kutatások vastagbél-daganatos betegekben
differenciál-diagnosztikai jelentőségűnek találta az vörösvértestek össz-scavenger kapacitásának
változását [Blázovics és mtsai 2008]. Az eredmények arra engedtek következtetni, hogy a
vizsgálatokhoz korábban kifejlesztett kemilumineszcenciás módszer az álnegatív és álpozitív
eseteknél egyértelműen megerősítette a feltételezett diagnózist. A plazma redoxi-státuszának
változása és a fémion-koncentrációk meghatározása további bizonyítékot adott a helyes diagnózis
felállításához, és a szükséges orvosi beavatkozások tervezéséhez [Blázovics és mtsai 2008]. Bár a
totál scavenger kapacitás változása az általunk vizsgált populációban nem volt szignifikáns, a
tendencia kedvező, amit a plazma Fe-, Se- és Zn-koncentráció és a Zn-protoporfirin szint
változásai is megerősítenek. A vörösvértestekben mérhető kötött formaldehid-koncentráció
meghatározásai pedig azt sejtették, hogy a szervezet egészét jellemző metil-pool csökkenése
szoros korrelációt mutat a tumoros folyamatok súlyosságával [Blázovics és mtsai 2008; Nyirády
98
és mtsai 2009]. Ezeknek a megfigyeléseknek a hátterében egy komplex rendszer jelenléte
igazolódott.
Az utóbbi két évtizedben igazolták a formaldehid meghatározó szerepét a biológiai
rendszerek működésében. A HCHO mindig kötött formában van jelen az élő rendszerekben. A
kötéserősség azonban változó. A transzmetilezési reakciók mindig formaldehidet generálnak. A
transzmetilezés térszerkezetet módosító szubsztitúciós reakció, fontos szerepet tölt be a fehérjék
közötti, ill. a sejten belüli kölcsönhatásokban. Ismert a DNS működést szabályozó metilhisztonok
jelentősége és a DNS bázisainak metileződése is [Baylin 1998, Baylin 2006, Park 1990, Szende
2001]. Az L-metionin S-metilcsoportjának a képződése HCHO-on keresztül történik. A HCHO
képződése az S-adenozil-L-metionin (SAM) S-, metilcsoportjából a legkülönbözőbb enzimatikus
transzmetilezési reakciókhoz kapcsolódik [Huszti 1986, Wei 2007]. A HCHO tehát
nélkülözhetetlen molekula a biokémiai reakcióutakon. Kimutatták, hogy bizonyos fehérjék lizin,
arginin, hisztidin, glutaminsav, aszparaginsav, láncvégi alanin, prolin, fenilalanin nitrogén
atomjain, a cisztein kénatomján és a metionin kén- és nitrogénatomján metileződhet. Azonban
szabad metilezett aminosavakat is izoláltak [Tyihák és mtsai 1998]. Bizonyították, hogy a
transzmetilezési folyamatokhoz Cu ionokra is szükség van. Egy Cu ion négy HCHO molekulát
képes szállítani. [Tyihák és mtsai 2009]
A protoporfirin IX heterociklusos molekula a protoporfirinogén-oxidáz aktivitásának
következtében alakul ki. A molekula a ferrokelatáz hatására tovább alakul hemmé. A hemoglobin
bioszintézise részben a citoszolban, részben a mitokondriumban zajlik. A hem és a globin végül a
citoszolban kapcsolódik össze. Igazolták, hogy a fehérjén az arginin (38), metionine (65) és a
lizin (72) mellett a metionin (80) is metilálódik, így a Fe komplexbe záródik és kialakul a
hemoglobin. A H2O2/.OH – mikroperoxidáz – luminol kísérleti rendszerünk a tumoros betegek
vörösvértestjeiben megjelenő szabad protoporfirin koncentrációjától függően képes fényt
generálni. A rákos betegek korai stádiumában jelentkező csökkent CH3-pool miatt nem képes
maradéktalanul kialakulni a hemoglobin, így a szabad protoporfirin a rendszerben lévő oxigén
szabad gyökökkel reagálva maga is gyökösödik, és hozzájárul a luminol aminoftálsav
átalakulásához, amit kemilumineszcencia kísér. A rákbetegség későbbi stádiumaiban, illetve
metasztázisban egyre inkább csökken a szervezet metilcsoport-raktára, így a hemoglobin mellett
nemcsak a vas-komplexnél jóval stabilabb Zn-protoporfirin, hanem a szabad protoporfirin szintje
is jelentősen megnő. Ekkor a nagy koncentrációban kimutatható protoporfirin már
antioxidánsként viselkedik, és gátolja a Fenton-reakciót, ezért kevesebb hidroxilgyök keletkezik
vas jelenlétében a vizsgálati rendszerben lévő hidrogén-peroxidból, így az oxigén szabad gyökök
99
scavengelése miatt a luminol nem bomlik el a vizsgálati idő alatt, és a műszer szignifikánsan kis
fényintenzitást detektál [Blázovics és mtsai 2009]
Amennyiben egy táplálék-kiegészítő készítmény metil-donor vegyülete(i) növelik a
szervezet metilcsoport-készletét, úgy a vörösvértestekben egyre nagyobb az esély a hemoglobin
koncentrációjának növekedésére és a szervezet oxigén-ellátottságának helyreállítására, vagyis a
rákos folyamat progressziójának mérséklésére, illetve a beteg életminőségének javítására. Tehát a
redox-homeosztázist jellemző totál scavenger kapacitás (az indukálható kemilumineszcencia
reciproka) és a transzmetilezési folyamatokból származó HCHO dimedon adduktként történő
meghatározása együttesen jó hatásokkal jelzik a tumoros folyamatok stádiumát, és felhívják a
figyelmet az esetleges ál-pozitív vagy ál-negatív PSA értékekre, valamint képes a kezelések
hatásának lemérésére, így nagyobb biztonsággal kezelhető a prosztatarákos beteg. A kezelésnek
jelentős gyulladásgátló hatásai lehetnek, viszont nőhet bizonyos proliferációt elősegítő
vegyületek szintje is. Ezért rendkívül fontosnak tartjuk a táplálék-kiegészítők orvosi kontroll alatt
történő, személyre szabott alkalmazását, mert a sokkomponensű készítmények esetében nehezen
ítélhető meg egy kiragadott vegyület, esetünkben a betain hatása, mivel számos más bioaktív
ágens koncentrációviszonyai szignifikánsan torzíthatják a várt kedvező hatást.
A krónikus betegségekhez kapcsolódó senyvesztő állapot (protein-energy wasting –
fehérje-energia hiányos állapot) és a gyulladás közötti kapcsolat tartós dialízisen lévő betegek
esetében jól ismert [Kaizu és mtsai 2003]. A gyulladás az urémiás kachexia egyértelmű
rizikófaktora; a
C-reaktív-protein-szint a zsírszövet mennyiségében később kialakuló
csökkenésnek független prediktora. A gyulladás és a malnutríció közötti szoros kapcsolat alapján
határozták meg az elmúlt évek során a malnutríció-gyulladásos komplex szindrómát (MICS). A
MICS kedvezőtlenül befolyásolja a veseelégtelenségben szenvedő betegek prognózisát. Több
megfigyelés szerint szoros kapcsolatban áll az ateroszklerózis fokával mind dialízis előtt álló
[Stenvinkel és mtsai 1999] mind dializált betegeknél [Stenvinkel és mtsai 2000, Wang és mtsai
2005]. MICS fennállása esetén beszámoltak az erythropoietin hatásának a csökkenéséről
[Kalantar-Zadeh és mtsai 2003, Locatelli és mtsai 2006], a betegek fokozott morbiditásáról és
mortalitásáról is [Lopez és mtsai 2007]. Célkitűzésünk vesetranszplantált betegek körében a
malnutríciós-gyulladásos pontérték (Malnutrition Inflammation Score, MIS) és a gyulladásos
citokinszintek közötti kapcsolat elemzése, vesetranszplantált betegeknél a MICS kockázatának
felmérése.
A korábbi vizsgálatok alapján a tartós dialízisen lévő betegek között igen gyakori a
protein-energiahiányos állapot és a gyulladás együttes előfordulása [Kalantar-Zadeh és mtsai
2001], ezért ezt az állapotot ’malnutríciós – gyulladásos komplex szindrómának’ ( ‘malnutrition100
inflammation complex syndrome’ (MICS)) nevezik. A MICS összefügg az oxidatív stressz [Pou
és mtsai 2007], az eritropoietin rezisztencia [Agarwal és mtsai 2008, Locatelli és mtsai 2006], a
morbiditás és mortalitás [Kalantar-Zadeh és mtsai 2004; Molnár és mtsai 2007] mértékével.
Vizsgálatunk célja annak az elemzése volt, hogy a MIS pontozóskála (Malnutrition Inflammation
Score) mennyire megbízható eszköz MICS felmérésére vesetranszplantált betegek körében.
Jelenleg nem tisztázott, hogy mi a legjobb módszer krónikus vesebeteg populációban a
MICS meghatározására [Rambod és mtsai 2008]. Az utóbbi években dializált betegek körében
egyre több vizsgálatban alkalmazták a Kalantar-Zadeh és mtsai által kifejlesztett MIS-t [2001]. A
közelmúltban egy tanulmányban a MIS skálát referencia eszközként használták a tápláltsági
állapot leírására hemodializált betegek körében [Yamada és mtsai 2008] Jelenleg a MICS
meghatározására a MIS pontszámot egyre általánosabban elfogadják krónikus vesebetegek
esetében.
Vizsgálatunkban a MIS értékek megoszlása a mások által közölthöz hasonló volt
[Kalantar-Zadeh és mtsai 2004], bár a MIS középértéke alacsonyabb volt, ami arra utal, hogy a
MICS transzplantált betegeknél kevésbé súlyos formában van jelen, mint dializáltaknál.
Felmérésünkben a MIS mellett több citokint (IL-6, TNF-α), leptint, illetve laboratóriumi
paramétereket: pre-albumin, CRP, albumin, transzferrin szinteket is meghatároztunk, illetve
mértük és kiszámoltuk az antropometriai változókat is. Irodalmi adatok szerint a leptin, IL-6,
TNF-α és többi mért paraméter megbízhatóan jelzi a fehérje-energiahiányos állapotot [Mak és
mtsai 2006; Kalantar-Zadeh és mtsai 2004]. Elemzéseinkben szignifikáns összefüggést találtunk
a MIS és a vizsgált citokinek, illetve tápláltsági állapotot jelző paraméterek között, hasonlóan a
dializált betegeknél közöltekhez [Kalantar-Zadeh és mtsai 2004].
Hipotézisünk az volt, hogy a MIS a gyulladást és az alultápláltságot együttesen jelzi, azaz,
hogy a MIS voltaképpen a MICS-t méri. Ezt hipotézist “strukturális egyeneletek modellezese”
(Structural Equation Model, SEM) módszerrel vizsgáltuk. A SEM egy olyan statisztikai eljárás,
ami ok-okozati kapcsolatok becslését teszi lehetővé statisztikai adatok és feltételezett kvalitatív
ok-okozati kapcsolatok alapján és így alkalmas arra, hogy egy adott feltételezést (azaz, hogy a
MIS elméletben felosztható egy malnutríciót és egy gyulladást mérő faktorra, latens változóra)
teszteljünk és elemezzük, hogy mennyire illeszkedik az így számított modell, milyen mértékben
felel meg a tanulmány során gyűjtött aktuális adatoknak. A modell lehetővé teszi a latens (azaz
közvetlenül nem mért, de becsült) változók hatásának elemzését, becslését is [Remport és mtsai
2009].
Az alkalmazott modell esetében a két latens változót tartalmazó SEM mutatta a legjobb
illeszkedést, ami megerősíti azt a feltételezésünket, hogy a MIS egy malnutríciós és egy
101
gyulladásos komponenst is mér. Míg a regressziós modellekben feltételezzük, hogy a magyarázó
változókat hibamentesen mértük, a SEM modellben a változók mérési hiba-faktora szerepel a
modellben. Az ábrán jelzett hiba értékek (e1 – e7) ezeknek a mérési hibafaktoroknak felelnek
meg (19. ábra). A mért változók és a nem mért latens változók közötti nyilak feletti számok
standardizált regressziós koefficienseknek tekinthetők. Ahogy a 19. ábra is mutatja,
feltételezésünk szerint egyes változók, így a pre-albumin szintje, a haskörfogat és a leptinszint
mind a két latens faktorral összefügg. A CRP, IL-6 és TNF-α szintek csak a gyulladásos latens
faktorral vannak kapcsolatban. A CRP esetében például a gyulladással való kapcsolat mértékét a
0,67 standardizált regressziós koefficiens jelzi. A kétirányú nyilak és az ennek megfelelő értékek
a korrelációs koefficienseket mutatják. Az alultápláltsági és gyulladásos látens faktorok
egymással, illetve a MIS értékkel is összefüggtek. A szövegdobozok feletti számok a többszörös
korrelációs értékeket jelzik, azaz azt, hogy a latens változók esetében az adott változó milyen
mértékben járul hozzá a varianciához.
Ismereteink szerint ez az első olyan vizsgálat, amely vesetranszplantált betegek esetében a
MICS meghatározására a MIS-t alkalmazta. Munkánk erőssége, hogy nagyszámú beteg
bevonásával sikerült egy olyan teoretikus modellt kidolgozni, amiben a klinikai paramétereket, a
gyulladásos faktorokat és a tápláltsági állapotot együttesen lehet értékelni és egymás közötti
kapcsolatukat meghatározni. [Molnár és mtsai 2009]
Eredményeink azt mutatják, hogy a MIS érték megbízhatóan jelzi a MICS jelenlétét
vesetranszplantált betegeknél. Ez lehetővé teszi, hogy a MICS fennállását könnyen és olcsón
lehessen vizsgálni ennél a betegcsoportnál, anélkül, hogy drága laboratóriumi vizsgálatokra volna
szükség . A MIS ezen túl a kutatást is segítheti, alkalmazásával a MICS előfordulási gyakorisága
nagy betegpopuláción gyorsan meghatározható.
102
Tézisek
1.
A multiplex citokinszint-mérő rendszerekkel mért analitok szintje esetenként
nagymértékben eltérő lehet, ezért a metodikai repertoár kiválasztása és konzekvens használata
rendkívül fontos. A vizsgálatot végző laboratórium mérőmódszerenként külön-külön kell
megállapítsa az egészséges referenciaértékeket.
2.
Aszfixiás újszülötteknél a gyulladásos citokinek szintje a posztnatális kor előrehaladtával
és hipotermia mellett alacsonyabb.
3.
Alacsony endogén kortizolszint esetén a gyulladásos citokinek szintje nő koraszülötteknél
és posztaszfixiás újszülötteknél.
4.
Az újszülöttkori szepszis diagnózisát segíti, ha az antibiotikus kezelés megkezdése előtt
levett vérmintában a prokalcitonin és CRP szintek mellett az IL-8 szint mérésére is sor kerül.
5.
Nőknél az alkohol májkárosító hatásai iránti fokozott érzékenységben a krónikus
alkoholfogyasztás
mellett
bekövetkező
citokinszint-változás
szerepet
játszhat.
A
vörösborfogyasztás hatást gyakorol egyes fémionok szintjére és az antioxidáns védelemre.
6.
Alkoholos eredetű, illetve HCV-fertőzés okozta májcirrhosisban, valamint primer biliáris
cirrhosisban (PBC) az IL-6-szintnő. PBC-re a magas IL-8 szint, HCV-fertőzés miatt kialakult
cirrhosisra a magas IL-2 szint a jellemző.
7.
Wilson-kórban kelátorral kezelt betegeknél a magasabb IL-6 és IL-8 szint alapján
szisztémás gyulladás van jelen. A neurológiai tünetek függetlenek a citokinszintektől. Wilsonkóros betegeknél számos fémion szintje nő, aminek szerepe lehet a szövődmények
kialakulásában.
8.
Áttétes prosztatakarcinómás betegekben antioxidánsban gazdag cékla fogyasztásakor a
gyulladásos citokinek szintje csökken. Egyben bizonyos növekedési faktorok szintje nőhet, ami
miatt ezeknél a betegeknél fokozott óvatosság indokolt.
9.
Vesetranszplantált betegeket vizsgálava azt találtuk, hogy az általános állapot, az IL-6 és
TNF-α szint és más gyulladásos markerek alapján a malnutríciós-gyulladásos pontérték (MIS)
megfelelően jelzi a malnutríciós-gyulladásos komplex szindróma fennállását veseelégtelen
betegeknél.
103
Összefoglalás
Ph.D. munkám során a laboratóriumban olyan rendszereket honosítottam meg, melyekkel
egyidejűleg több citokin szintjét lehet meghatározni. Összehasonlító méréseink alapján a
különböző rendszerekkel mért analitok szintje esetenként eltér. Ezért mérőmódszerenként különkülön kell megállapítani az egészséges referenciaértékeket, illetve, egy adott vizsgálatsorozat
során egy adott módszerrel kell mérni a citokinszinteket.
Meghatározásainkat olyan kórképekben végeztük el, amelyek kapcsán valószínűsíthető
volt a citokin kaszkád érintettsége. A vizsgálatok egy részében a gyulladásos reakciót alapvetően
meghatározó szabadgyök-homeosztázisra és az ezzel kapcsolatban álló fémion-szintekre jellemző
paramétereket is mértük.
Perinatális vizsgálataink kimutatták, hogy posztaszfixiás újszülötteknél a gyulladásos
citokinek szintje a posztnatális kor előrehaladtával, illetve terápiás hipotermia mellett csökken.
Ebben az időszakban a szisztémás citokinszinteket a mellékvesefunkció alapvetően befolyásolja:
alacsony endogén kortizolszint esetén a gyulladásos citokinek szintje nő. További
megállapításunk, hogy az újszülöttkori szepszis diagnózisában segítség lehet az a prokalcitonin és
CRP szintek mellett az IL-8 szint mérése is.
Hepatológiai vizsgálataink kapcsán kimutattuk, hogy nőknél a mérsékelt, de krónikus
alkoholfogyasztás mellett kifejezettebb citokinszint-változások következnek be. A krónikus
vörösborfogyasztás ezen túl nemtől függő hatást gyakorolhat egyes fémionok szintjére és az
antioxidáns védelemre is. Májcirrhosisban kimutattuk, hogy a betegség oka befolyásolja a
citokinprofilt; primer biliaris cirrhosisra magas IL-8 szint, HCV-fertőzésre magas IL-2 szint a
jellemző. Wilson-kóros betegeknél a magasabb IL-6 és IL-8 szint alapján szisztémás gyulladás
van jelen, de a neurológiai tünetek függetlenek a citokinszintektől. Egyúttal viszont számos
fémion szintje is nő, aminek szerepe lehet a szövődmények kialakulásában.
Prosztatakarcinómában antioxidáns étrendkiegészítő hatására a gyulladásos citokinek
szintje csökken. Emellett viszont a növekedési faktorok szintje nő, ezért ilyen betegségben
fokozott óvatosság indokolt. Vesetranszplantált betegeknél az általános állapot, az IL-6 és TNF-α
szintek alapján a malnutríciós-gyulladásos pontérték megfelelően jelzi a malnutríciós-gyulladásos
komplex szindróma fennállását.
Vizsgálataink alapján a multiplex citokinszintek meghatározásra alkalmas rendszerek,
redox-homeosztázis és fémion-profil meghatározás segíthetnek az egyes kórfolyamatokban
kitüntetett szerepet játszó faktorok azonosítására, esetleg diagnosztikus markerek és/vagy terápiás
célpontok kijelölésére.
104
Summary
During my Ph.D. work I introduced complex systems into the laboratory that enable us to
determinate simultaneously the level of several cytokines. Our measurements indicated that the
results obtained by different systems may differ; therefore reference ranges should be established
for each systems and one kind of system should be used in one experiment.
We performed our studies in disorders with probable involvement of cytokine cascade. In
some instances we also determined parameters of free-radical homeostasis and trace element
levels that are strongly associated with systemic inflammation.
In perinatal disorders we found that proinflammatory cytokines may decrease with
postnatal age and hypothermia in postasphyxiated neonates. Systemic cytokine levels determined
are also affected by adrenal function, as level of inflammatory cytokines may increase in the
presence of low cortisol levels. In another study we found that the diagnosis of perinatal sepsis
may be improved by IL-8 determination in addition to procalcitonin and CRP measurements.
Our hepatological studies demonstrated that the gender-dependent difference in alcohol
induced hepatopathy may be attributed, at least partly, to increased cytokine production after
chronic alcohol consumption. Red wine consumption may have an impact on the level of some
trace elements and antioxidant defense. In liver cirrhosis we demonstrated that cirrhosis of
different origins are characterized by specific cytokine-profiles; i.e. extremely high IL-8 and IL-2
levels are present in PBC and HCV-infection, respectively. In patients with Wilson’s disease a
systemic inflammation is present, supported by high IL-6 and IL-8 levels. Neurological signs and
symptoms are independent of cytokine levels. The levels of a number of trace elements are
increased that may contribute to complications.
In patients with prostate cancer proinflammatory cytokine levels decrease on
administration of a specific antioxidant supplement. The treatment, however, may also increase
some growth factors that warrants caution. According to clinical signs and symptoms and IL-6
and TNF-α levels the malnutrition-inflammatory score (MIS) reflects reliably the presence of
malnutrition-inflammatory complex syndrome (MICS) in patients after renal transplantation: this
finding is of clinical importance when subjects at risk for MICS are to be identified.
Our results indicate that the use of systems suitable for simultaneous detection of cytokine
levels, redox homeostasis and trace-element profile may help to identify specific factor in the
pathomechanism of immune-mediated disorders and, possibly, may contribute to recognize
diagnostic markers and/or therapeutic targets.
105
Irodalomjegyzék
1. Abbas AK, Lichtman AH. (2003) Cellular and molecular biology, 5th Edition, Saunders,
Philadelphia
2. Agarwal R, Davis JL, Smith L. (2008) Serum albumin is strongly associated with
erythropoietin sensitivity in hemodialysis patients. Clin J Am Soc Nephrol 3:98-104.
3. Ajmo JM, Liang X, Rogers CQ, Pennock B, You M. (2008) Resveratrol alleviates alcoholic
fatty liver in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295:833-842.
4. Akisu M, Huseyinov A, Yalaz M, Cetin H, Kultursay N. (2003) Selective head cooling with
hypotermia suppresses the generation of platelet-activating factor in cerebrospinal fluid of
newborn infants with perinatal asphyxia. Prostaglandins Leukotrienes Essent Fatty Acids
69:45-50
5. Aly H, Khashaba MT, El-Ayouty M, El-Sayed O, Hasanein BM. (2006) IL 1beta, IL 6 and
TNF alpha and outcomes of neonatal hypoxic ischemic encephalopathy. Brain Dev 28:178182
6. Andrews WW, Hauth JC, Goldenberg RL. (2000) Infection and preterm birth. Am J
Perinatol 17: 357-365.
7. Arnon S, Litmanovitz I. (2008) Diagnostic tests in neonatal sepsis. Curr Opin Infect
Dis.21:223-227.
8. Azzopardi D, Brocklehurst P, Edwards D, Halliday H, Levene M, Thoresen M, Whitelaw
A; TOBY Study Group. (2008) The TOBY Study. Whole body hypothermia for the
treatment of perinatal asphyxia encephalopathy: A randomized controlled trial. BMC
Pediatr 30:17.
9. Azzopardi D, Edwards AD (2007) Hypothermia. Semin Fetal Neonatal Med;12:303 310.
10. Bălăşoiu M, Turculeanu A, Avrămescu C, Comănescu V, Simionescu C, Mogoantă L.
(2005) Cytokines levels in prostate adenocarcinomas. Rom J Morphol Embryol. 46:179182.
11. Baraona E, Abittan CS, Dohmen K, Moretti M, Pozzato G, Chayes ZW, Schaefer C, Lieber
CS. (2001) Gender differences in pharmacokinetics of alcohol. Alcohol Clin Exp Res
25:502-507.
12. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP. (1998) Alterations in DNA
methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res 72:141-196.
106
13. Baylin SB, Ohm JE. (2006) Epigenetic gene silencing in cancer – a mechanism for early
oncogenic pathway addiction? Nat Rev Cancer 6:107-116.
14. Becker U, Deis A, Sørensen TI, Grønbaek M, Borch-Johnsen K, Müller CF, Schnohr P,
Jensen G. (1996) Prediction of risk of liver disease by alcohol intake, sex, and age: a
prospective population study. Hepatology 23:1025-1029
15. Beilin B, Yehuda S, Razumovsky J, Wolloch Y, Zeidel A, Bessler H. (1998) Effects of mild
perioperative hypothermia on cellular immune responses Anesthesiology 89: 1133-1140
16. Beishuizen A, Vermes I, Hylkema BS, Haanen C. (1999) Relative eosinophilia and
functional adrenal insufficiency in critically ill patients. The Lancet 353: 1675
17. Bekő G, Ostovits J, Visnyei Zs, Szalay F, Sátori A, Blázovics A, Szentmihályi K. (2009)
Significant difference in the concentration of Special metal elements in Wilson’s disease
with different symptoms during penicillamine treatment Trace elements in the food chain 3:
31-35.
18. Bekő G, Csák T, Hagymási K,Osztovits J, Visnyei Zs, Bányai É, Blázovics A. (2007) The
change in the levels of cytokines and growth factors in healthy young adults after regular
red wine consumption. Z Gastroenterol 45: pp 438.
19. Bekő G, Hagymasi K, Szentmihalyi K Biro E, Osztovits J, Szalay F, Bárkovits S, Blazovics
A. (2008) How can nutritional factors modify the cytokine pattern and redox parameters in
alcoholic drink consumption women? Clin Chem Lab Med, 46, S351
20. Bekő G, Hagymási K, Szentmihályi K Stefanovits Bányai É, Osztovits J, Fodor J, Fehér J,
Blázovics A. (2009) Sex-dependent alterations in erythrocyte trace element levels and
antioxidant status after one month of moderate daily red wine consumption. Eur J
Gastroenterol HepatolSep 25. [Epub ahead of print]
21. Bekő G, Krkos K, Rácz K Patócs A, Tulassay Zs. (2008) A szérum inzulinszerű növekedési
faktor-1 (IGF-1) referenciatartományának vizsgálata. Magyar Belorvosi Archivum 5: 400405
22. Bekő G, Osztovics J, Visnyei Z, Csák T, Blázovics A, Kovács M, Szalay F. (2008)
Different cytokine patterns in alcoholic cirrhosis, MCV-related cirrhosis and primary biliary
cirrhosis. Z. Gastroenterol. 46, 488.
23. Bekő G, Osztovits J, Visnyei Z, Csák T, Blázovics A, Sátori A, Szalay F. (2008) Biochip
citokin-
és
növekedési
faktor
protein
array
májcirrhosisban. Magyar Belorvosi Archivum 3:45.
107
vizsgálatok
különböző
etiológiájú
24. Bekő G, Osztovits J, Visnyei Z., Szalay F., Sátory A,. Blázovics A, Szentmihályi K. (2009)
Significance of measurement and difference of special metal elemens in Wilson’s disease
during penicillinamin treatment. Clin chem Lab Med; 47: s276
25. Bekő G, Visnyei Zs, Osztovits J, Csák T, Szalay F, Czabai G. Bárkovits S., Blázovics A.
(2007) Penicillamin-kezelt Wilson-kóros betegek redox-státusa. MSZKT konferencia, Pécs.
október 11-13
26. Bekő G. (2008) Biochip technika a labordiagnosztikában, citokinmérések. Orvosképzés 4:
309-312
27. Bekő G., Bíró E., Kovács M., Mátrai B. (2008) Újabb citokin mérési módszerek a
labordiagnosztikában A citokin és növekedési faktor panelek értéke Klin. Kísérl. Lab. Med.
34: 41.
28. Bekő G, Blázovics A, Szentmihályi K, Bíró E, Romics I, Nyirády P. Biochip cytokine
pattern in early prosate cancer. XVIII. International Semmelweis Symposium of Urology
2009 , UroOnkológia 2009; 4, pp. 23
29. Bellentani S, Saccoccio G, Costa G, Tiribelli C, Manenti F, Sodde M, Saveria Crocè L,
Sasso F, Pozzato G, Cristianini G, Brandi G. (1997) Drinking habits as cofactors of risk for
alcohol induced liver damage. Gut 41:845-850
30. Bender L, Thaarup J, Varming K, Krarup H, Ellermann-Eriksen S, Ebbesen F. (2008) Early
and late markers for the detection of early-onset neonatal sepsis. Danish Medical Bulletin
55: 219-23
31. Bennett N, Gabrielli A. (1999) Hypotension and adrenal insufficiency. J Clin Anesth 11:
425-430
32. Bjelakovic G, Nikolova D, Gluud LL, Simonetti RG, Gluud C. (2008) Antioxidant
supplements for prevention of mortality in healthy participants and patients with various
diseases. Cochrane Database Syst Rev.2:CD007176.
33. Black RA, Rauch CT, Kozlosky CJ, Peschon JJ, Slack JL, Wolfson MF, Castner BJ,
Stocking KL, Reddy P, Srinivasan S, Nelson N, Boiani N, Schooley KA, Gerhart M, Davis
R, Fitzner JN, Johnson RS, Paxton RJ, March CJ, Cerretti DP (1997). A metalloproteinase
disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells Nature 385 (6618): 729–
33.
34. Blázovics A, Fébel H, Székely E ., Bekő G, Szóke E, Szentmihályi K, Sárdi É. (2008)
Effect of high resveratrol content red wine versus ethanol on homeostasis in rats. Z.
Gastroenterol.46: 489
108
35. Blázovics A, Kovács A, Lugasi A, Hagymási K, Bíró L, Fehér J. (1999) Antioxidant
defence in erythrocytes and plasma of patients with active and quiescent Crohn’s disease
and ulcerative colitis: A chemiluminescent study, Clin. Chem, 45;6:895-896.
36. Blázovics A, Szilvás A, Székely G, Tordai E, Székely E, Czabai G, Pallai Z, Sárdi E.
(2008) Important bioactive molecules of erythrocytes in colorectal cancer patients after
colectomy. Open Med Chem J, 2:6-10.
37. Blázovics A, Szilvás Á, Székely Gy, Székely E, Bekő G, Barkovits S, Sárdi É. (2008)
Measuring of redox homeostasis, bounded HCHO and protoporphyrine concentrations of
erythrocytes help us to predict early metastasis. Clin Chem Lab Med 46: S51
38. Blázovics, Hagymási K, Blazics B, Balázs A, Bekő G. (2009) Jelentkezik-e szex-függő
eltérés az immunreakciókban kismértékű tartós vörösborfogyasztás alkalmával? XIV.
Congressus Pharmaceuticus Hungaricus 2009 , Gyógyszerészet 11, pp 17: S79
39. Bokodi Géza Miklós (2007) Genetikai polymorphismusok szerepe a bronchopulmonális
dysplasia és a perinatális tüdőkárosodás kialakulásában. Ph.D. disszertáció, Budapest,
Semmelweis Egyetem
40. Bolkent S, Arda-Pirincci P, Bolkent S, Yanardag R, Tunali S, Yildirim S. (2006) Influence
of zinc sulfate intake on acute ethanol-induced liver injury in rats. World J Gastroenterol
12:4345-4351.
41. Bracci R, Buonocore G. (2003) Chorioamnionitis: a risk factor for fetal and neonatal
morbidity. Biol Neonate, 83:85-96.
42. Brunner E, Domhof S, Langer F. (2002) Nonparametric analysis of longitudinal data in
factorial experiments. Wiley, New York
43. Buonocore G, De Filippo M, Gioia D, Picciolini E, Luzzi E, Bocci V, Bracci R. (1995)
Maternal and neonatal plasma cytokine levels in relation to mode of delivery. Biol Neonate.
68:104 – 110
44. Burke C. (2009) Perinatal sepsis. J Perinat Neonatal Nurs. 23:42-51.
45. Buttram SD, Wisniewski SR, Jackson EK, Adelson PD, Feldman K, Bayir H, Berger RP,
Clark RS, Kochanek PM. (2007) Multiplex assessment of cytokine and chemokine levels in
cerebrospinal fluid following severe pediatric traumatic brain injury: effects of moderate
hypotermia. J Neurotrauma 24:1707-1718.
46. Cabré M, Camps J, Ferré N, Paternáin JL, Joven J. (2001) The antioxidant and
hepatoprotective effects of zinc are related to hepatic cytochrome P450 depression and
109
metallothionein induction in rats with experimental cirrhosis. Int J Vitam Nutr Res.71:229236.
47. Callaway CW, Rittenberger JC, Logue ES, McMichael MJ. (2008) Hypotermia after
cardiac arrest does not alter serum inflammatory markers. Crit Care Med 36:2607-2612.
48. Cavaillon JM (2001) Pro- versus antiinflammatory cytokines: myth or reality. Cell Mol
Biol. 47:695-702.
49. Chiesa C, Signore F, Assumma M, Buffone E, Tramontozzi P, Osborn JF, Pacifico L.
(2001) Serial measurements of C-reactive protein and interleukin – 6 in the immediate
postnatal period: reference intervals and analysis of maternal and perinatal confounders.
Clin Chem. 47:1016 – 1022
50. Chisolm JJ, Jr. Brown DH. (1975) Micro-scale photofluorometric determination of “free
erythrocyte porphyrin” (Protoporphyrin IX). Clin Chem 21:1669-1682.
51. Chrostek L, Jelski W, Szmitkowski M, Puchalski Z. (2003) Gender-related differences in
hepatic activity of alcohol dehydrogenase isoenzymes and aldehyde dehydrogenase in
humans. J Clin Lab Anal 17:93-96.
52. Chuang YH, Lian ZX, Tsuneyama K, Chiang BL, Ansari AA, Coppel RL, Gershwin ME.
(2006) Increased killing activity and decreased cytokine production in NK cells in patients
with primary biliary cirrhosis. J Autoimmun. 26:232-240.
53. Conti P, Kempuraj D, Kandere K, Di Gioacchino M, Barbacane RC, Castellani ML, Felaco
M, Boucher W, Letourneau R, Theoharides TC. (2003) IL-10, an inflammatory/inhibitory
cytokine, but not always. Immunol Lett. 86:123-129.
54. Dabbagh K, Takeyama K, Lee HM, Ueki IF, Lausier JA, Nadel JA. (1999) IL-4 induces
mucin gene expression and goblet cell metaplasia in vitro and in vivo. J Immunol.162:62336237.
55. Dammann O, Leviton A, Gappa M, Dammann CE. (2005) Lung and brain damage in
preterm newborns, and their association with gestational age, prematurity subgroup,
infection/inflammation and long term outcome. BJOG, 112: S4-9
56. Dammann O, Leviton A. (1997) Maternal intrauterine infection, cytokines, and brain
damage in the preterm newborn. Pediatr Res 42:1–8
57. Dayer JM. (2002) Evidence for the biological modulation of IL-1 activity: the role of IL1Ra. Clin Exp Rheumatol. 20:S14-20
58. De Gaetano G, Di Castelnuovo A, Donati MB, Iacoviello L. (2003) The mediterranean
lecture: wine and thrombosis--from epidemiology to physiology and back. Pathophysiol
Haemost Thromb. 33:466-471.
110
59. Delespesse G, Demeure CE, Yang LP, Ohshima Y, Byun DG, Shu U. (1997) In vitro
maturation of naive human CD4+ T lymphocytes into Th1, Th2 effectors. Int Arch Allergy
Immunol. 113:157-159.
60. Desplat-Jego S, Bardin N, Larida B, Sanmarco M. (2007) Evaluation of the bioplex 2200
ANA screen for the detection of antinuclear antibodies and comparison with conventional
methods Ann. N.Y. Acad. Sci. 1109: 245–255.
61. Dettling A, Witte S, Skopp G, Graw M, Haffner HT. (2008) A regression model applied to
gender-specific ethanol elimination rates from blood and breath measurements in nonalcoholics. Int J Legal Med. Oct 7.
62. Diez A, Serrano S, Cucurull J, Mariñoso L, Bosch J, Puig J, Nogués X, Aubia J. (1997)
Acute effects of ethanol on mineral metabolism and trabecularbone in Sprague-Dawley rats.
Calcif. Tissue Int. 61: 168-171.
63. Dinarello CA. (1998) Interleukin-1, interleukin-1 receptors and interleukin-1 receptor
antagonist. Int Rev Immunol. 16:457-499.
64. Dinarello CA. (2000) Proinflammatory cytokines. Chest. 118:503-508.
65. Dinya E.(2007) Biometria az orvosi gyakorlatban 2. kiadás Medicina, Medicina Budapest
66. Døllner H, Vatten L, Linnebo I, Zanussi GF, Laerdal A, Austgulen R. (2001) Inflammatory
mediators in umbilical plasma from neonates who develop early-onset sepsis. Biol Neonate
80:41-47.
67. Dunn E, Sims JE, Nicklin MJ, O'Neill LA (2001). "Annotating genes with potential roles in
the immune system: six new members of the IL-1 family". Trends Immunol. 22 (10): 533–6.
68. Edelson MB, Bagwell CE, Rozycki HJ. (1999) Circulating pro- and counterinflammatory
cytokine levels and severity in necrotizing enterocolitis. Pediatrics 103:766-771.
69. Erdei G, Tóth P, Vásárhelyi B (2003) Új klinikai entitás a perinatológiában: a magzati
gyulladásos válaszreakció szindróma. Orvosi Hetilap, 144:1515-1519.
70. Fairchild KD, Singh IS, Patel S, Drysdale BE, Viscardi RM, Hester L, Lazusky HM,
Hasday JD. (2004) Hypotermia prolongs activation of NF-kappaB and augments generation
of inflammatory cytokines. Am J Physiol Cell Physiol 287:C422-431.
71. Fairchild KD, Viscardi RM, Hester L, Singh IS, Hasday JD. (2000) Effects of hypotermia
and hypertermia on cytokine production by cultured human mononuclear phagocytes from
adults and newborns. J Interferon Cytokine Res 20:1049-1055.
72. Fatma M. El-Demerdash. (2004) Antioxidant effect of vitamin E and selenium on lipid
peroxidation, enzyme activities and biochemical parameters in rats exposed to aluminium. J
Trace Elements Med Biol 18:113-121.
111
73. Fehér A, Olajos F, Nobilis A, Novák M, Bekő G (2009) Monitoring of procalcitonin and Creactive protein level of prematures and newborns in the early stage of their lives. Clin
Chem Lab Med 47: S223.
74.Fernandes D, Duma D, Assreuy J. (2008) Steroids and nitric oxide in sepsis. Front Biosci
13:1698-1710.
75. Fernandez EF, Watterberg KL. (2009) Relative adrenal insufficiency in the preterm and
term infant. J Perinatol.29:S44-49
76. Fitzgerald SP, Lamont JV, McConnell RI, Benchikh el O. (2005) Development of a highthroughput
automated
analyzer
using
biochip
array
technology,
Clinical
Chemistry.51:1165-1176.
77. Flora SJ, Flora G, Saxena G, Mishra M. (2007) Arsenic and lead induced free radical
generation and their reversibility following chelation. Cell Mol Biol.53:26-47
78. Frezza M, di Padova C, Pozzato G, Terpin M, Baraona E, Lieber CS. (1990) High blood
alcohol levels in women. The role of decreased gastric alcohol dehydrogenase activity and
first-pass metabolism. N Engl J Med. 322:95-99.
79. Gergely J, Erdei A. Immunbiológia. Medicina Könyvkiadó, Budapest 1998: 32-201
80. Gersbeck N, Schönbeck F, Tyihák E. (1989) Measurement of formaldehyde and its main
generators in Erysiphe graminis infected barley plants by planar chromatographic
techniques. J Planar Chromatogr 2:86-89.
81. Gomez R, Romero R, Ghezzi F, Yoon BH, Mazor M, Berry SM. (1998) The fetal
inflammatory response syndrome. Am J Obstet Gynecol, 179: 194-202.
82. Goyal MK, Sinha S, Patil SA, Jayalekshmy V, Taly AB. (2008) Do cytokines have any role
in Wilson's disease? Clin Exp Immunol. 154: 74–79.
83. Gregory CW, Fei X, Ponguta LA, He B, Bill HM, French FS, Wilson EM. (2004)
Epidermal growth factor increases coactivation of the androgen receptor in recurrent
prostate cancer. J Biol Chem. 279:7119-7130.
84. Grow J, Barks JD. (2002) Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term
infant: current concepts. Clin Perinatol 29:585-602
85. Gundersen Y, Vaagenes P, Pharo A, Valø ET, Opstad PK. (2001) Moderate hypothermia
blunts the inflammatory response and reduces organ injury after acute haemorrhage. Acta
Anaesthesiol Scand. 45:994-1001.
86. Haas H, Falcone FH, Holland MJ, Schramm G, Haisch K, Gibbs BF, Bufe A, Schlaak M.
(1999) Early interleukin-4: its role in the switch towards a Th2 response and IgE-mediated
allergy. Int Arch Allergy Immunol. 119:86-94.
112
87. Hatano T, Kagawa H, Yasuhara T, Okuda T. (1988) Two new flavonoids and other
constituents in licore root: their relative astringency and radical scavenging effects, Chem
Pharm Bull, 36;2090-2097.
88. Heckmann M, Wudy SA. (2001) [Adrenal function in very preterm infants in the early
postnatal period] Klin Padiatr.213:307-313
89. Hermes-Lima M, Pereira B, Bechara EJ. (1991) Are free radicals involved in lead
poisoning? Xenobiotica.21:1085-1090
90. Hsu PC, Guo YL. (2002) Antioxidant nutrients and lead toxicity. Toxicology.180:33-44.
91. Huszti S, Tyihák E. (1986) Formation of formaldehyde from S-adenosyl-L-(mehyl-3H)
methionine during enzymatic transmetilation of histamine. FEBS Letters 209:362.
92. Ira A, Taddeo JJ, Kelly K Valenziano C. (2002) Poisoning as a result of barium styphnate
explosion. Am J Ind Med. 41:285-288.
93. Isse K, Harada K, Nakanuma Y. (2007) IL-8 expression by biliary epithelial cells is
associated with neutrophilic infiltration and reactive bile ductules. Liver Int. 27:672-680.
94. Jacobs S, Hunt R, Tarnow-Mordi W, Inder T, Davis P. (2007) Cooling for newborns with
hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev 17:CD003311
95. Jeong WI, Gao B. (2008) Innate immunity and alcoholic liver fibrosis.J Gastroenterol
Hepatol. 23:S112-118.
96. Jirillo E, Caccavo D, Magrone T, Piccigallo E, Amati L, Lembo A, Kalis C,
Gumenscheimer M. (2002) The role of the liver in the response to LPS: experimental and
clinical findings. J Endotoxin Res. 8:319-327.
97. Kaizu Y, Ohkawa S, Odamaki M, Ikegaya N, Hibi I, Miyaji K, Kumagai H. (2003)
Association between inflammatory mediators and muscle mass in long-term hemodialysis
patients. Am J Kidney Dis 42:295-302.
98. Kalantar-Zadeh K, Kopple JD, Humphreys MH, Block G. (2004) Comparing outcome
predictability of markers of malnutrition-inflammation complex syndrome in haemodialysis
patients. Nephrol Dial Transplant 19:1507-19.
99. Kalantar-Zadeh K, McAllister CJ, Lehn RS, Liu E, Kopple JD. (2003) Effect of
malnutrition-inflammation complex syndrome on EPO hyporesponsiveness in maintenance
hemodialysis patients. Am J Kidney Dis 42:761-773.
100. Kang YJ, Zhou Z. (2005) Zinc prevention and treatment of alcoholic liver disease. Mol
Aspects Med. 26:391-404.
113
101. Kasdallah-Grissa A, Mornagui B, Aouani E, Hammami M, El May M, Gharbi N, Kamoun
A, El-Fazaâ S. (2007) Resveratrol, a red wine polyphenol, attenuates ethanol-induced
oxidative stress in rat liver. Life Sci 80:1033-1039.
102. Kasprzak A, Seidel J, Adamek A, Biczysko W, Wysocki J, Spachacz R, Juszczyk J, Zabel
M. (2006) Interleukin-2 (IL-2) expression in livers of patients with chronic hepatitis C virus
(HCV) infection. Folia Histochem Cytobiol.44:103-010.
103. Kasprzak A, Zabel M, Biczysko W, Wysocki J, Adamek A, Spachacz R, Surdyk-Zasada
J. (2004) Expression of cytokines (TNF-alpha, IL-1alpha, and IL-2) in chronic hepatitis C:
comparative hybridocytochemical and immunocytochemical study in children and adult
patients. J Histochem Cytochem. 52:29-38.
104. Kathy S. Wang, David A. Frank, and Jerome Ritz.(2000) Interleukin-2 enhances the
response of natural killer cells to interleukin-12 through up-regulation of the interleukin-12
receptor and STAT4. Blood. 95:3183-3190 .Keelan JA, Marvin KW, Sato TA, Coleman M,
McCowan LM, Mitchell MD. (1999) Cytokine abundance in placental tissues: evidence of
inflammatory activation in gestational membranes with term and preterm parturition. Am J
Obstet Gynecol, 181: 1530-1536.
105. Keiver K, Duggal S, Simpson ME. (2005) Ethanol administration results in a prolonged
decreses in blood ionized calcium levels in the rat. Alcohol 37: 173-178.
106. Kershenobich Stalnikowitz D, Weissbrod AB. (2003) Liver fibrosis and inflammation. A
review. Ann Hepatol. 2:159-163.
107. Khoruts A, Stahnke L, McClain CJ, Logan G, Allen JI. (1991) Circulating tumor necrosis
factor, interleukin-1 and interleukin-6 concentrations in chronic alcoholic patients.
Hepatology. 13:267-276
108. Kitzberger R, Madl C, Ferenci P. (2005) Wilson disease. Metab Brain Dis. 20:295-302.
109. Kline AE, Bolinger BD, Kochanek PM, Carlos TM, Yan HQ, Jenkins LW, Marion DW,
Dixon CE. (2002) Acute systemic administration of interleukin-10 suppresses the beneficial
effect of moderate hypotermia following traumatic brain injury in rats. Brain Res 937:2231.
110. Koningsberger JC, Van Asbeck BS, Van Hattum J, Wiegman LJ, Van Berge Henegouwen
GP, Marx JJ. (1993) The effect of porphyrins on cellular redox systems: a study on the dark
effect of porphyrins on phagocytes. Eur J Clin Invest. 23:716-723.
111. Krueger M, Nauck MS, Sang S, Hentschel R, Wieland H, Berner R. (2001) Cord blood
levels of interleukin-6 and interleukin-8 for the immediate diagnosis of early-onset infection
in premature infants. Biol Neonate 80:118-123
114
112. Köhidai L, Csaba G (1998). "Chemotaxis and chemotactic selection induced with cytokines (IL-8,
RANTES and TNF-alpha) in the unicellular Tetrahymena pyriformis". Cytokine 10 (7): 481–6.
113. Langer M, Modi BP, Agus M. (2006) Adrenal insufficiency in the critically ill neonate
and child. Curr Opin Pediatr.18:448-453.
114. Lavid N, Schwartz A, Yarden O, Tel-Or E. (2001) The involvement of polyphenols and
peroxidase activities in heavy-metal accumulation by epidermal glands of the waterlily
(Nymphaeaceae). Planta 212:323-331.
115. Lieber CS. (1994) Susceptibility to alcohol-related liver injury. Alcohol Alcohol Suppl. 2:
315-326.
116. Locatelli F, Andrulli S, Memoli B, Maffei C, Del Vecchio L, Aterini S, De Simone W,
Mandalari A, Brunori G, Amato M, Cianciaruso B, Zoccali C. (2006)
Nutritional-
inflammation status and resistance to erythropoietin therapy in haemodialysis patients.
Nephrol Dial Transplant 21:991-998
117. Lopes AA, Elder SJ, Ginsberg N, Andreucci VE, Cruz JM, Fukuhara S, Mapes DL, Saito
A, Pisoni RL, Saran R, Port FK. (2007) Lack of appetite in haemodialysis patients
associations with patient characteristics, indicators of nutritional status and outcomes in the
international DOPPS. Nephrol Dial Transplant 22:3538-3546
118. Lorenz E, Hallman M, Marttila R, Haataja R, Schwartz DA. (2002) Association between
the Asp299Gly polymorphisms in the Toll-like receptor 4 and premature births in the
Finnish population. Pediatr Res. 52: 373-376.
119. Luheshi GN. (1998) Cytokines and fever. Mechanisms and sites of action. Ann N Y Acad
Sci. 856: 83-89.
120. Maile P. (1999) Oral chelation and nutritional replacement therapy for chemical and
heavy metal toxicity and cardiovascular disease. Townsend Letter.
121. Mandrekar P, Szabo G. (2009) Signalling pathways in alcohol-induced liver
inflammation. J Hepatol. 50:1258-1266.
122. Marik PE. (2007) Mechanisms and clinical consequences of critical illness associated
adrenal insufficiency.Curr Opin Crit Care 13:363-369.
123. Matsui T, Ishikawa T, Takeuchi H, Okabayashi K, Maekawa T. (2004) Mild hypotermia
inhibits IL-10 production in peripheral blood mononuclear cells. Acta Anaesthesiol Scand
48:205-210.
124. Matsui T, Ishikawa T, Takeuchi H, Okabayashi K, Maekawa T. (2006) Mild hypotermia
promotes proinflammatory cytokine production in monocytes. J Neurosurg Anesthesiol
18:32-36.
115
125. Matsui T, Kakeda T. (2008) IL-10 production is reduced by hypotermia but augmented by
hypertermia in rat microglia. J Neurotrauma 25:709-715.
126. May Z, Taba G., Blázovics A., Székely E., Bíró E., Fébel H., Szentmihályi K. (2005)
Stripping technika alkalmazása különböző mintákban lévő szelén meghatározásánál
voltammetriás módszerrel. XI. Nemzetközi Vegyészkonferencia Proceeding: 354-356,
ISBN 973-7840-07-0
127. Michalaki V, Syrigos K, Charles P, Waxman J. (2004) Serum levels of IL-6 and TNFalpha correlate with clinicopathological features and patient survival in patients with
prostate cancer. Br J Cancer. 90:2312-2316.
128. Mishra UK, Jacobs SE, Doyle LW, Garland SM. (2006) Newer approaches to the
diagnosis of early onset neonatal sepsis. Arch Dis Child 91:F208-F212
129. Mocellin S, Panelli MC, Wang E, Nagorsen D, Marincola FM. (2003) The dual role of
IL-10. Trends Immunol. 24:36-43.
130. Molnár MZ, Czira M, Ambrus C, Szeifert L, Szentkirályi A, Bekő G, Rosivall L,
Remport Á, Novák M, Mucsi I. (2007) Anemia is associated with mortality in kidneytransplanted patients-a prospective cohort study. Am J Transplant. 818-24
131. Molnar MZ, Remport A, Czira ME, Sarvary E, Beko G, Rudas A, Ujszaszi A, Novak M,
Mucsi I. (2009) The role of the malnutrition-inflammation complex syndrome in posttransplant anemia: results of the malnutrition-inflammation complex syndrome in
transplantation-Hungary (minit-hu) study 14th ESOT Congress, Paris.
132. Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, O'Garra A (2001). Interleukin-10 and the
interleukin-10 receptor. Annu. Rev. Immunol. 19: 683–765.
133. Mudipalli A. (2007) Lead hepatotoxicity and potential health effects. Indian J Med Res.
126:518-527.
134. Müller C. (2006) Liver, alcohol and gender. Wien Med Wochenschr. 156:523-526.
135. Nanji AA, Jokelainen K, Rahemtulla A, Miao L, Fogt F, Matsumoto H, Tahan SR, Su GL.
(1999) Activation of nuclear factor kappa B and cytokine imbalance in experimental
alcoholic liver disease in the rat. Hepatology. 30:934-943.
136. Nelms K, Huang H, Ryan J, Keegan A, Paul WE. (1998) Interleukin-4 receptor signalling
mechanisms and their biological significance.Adv Exp Med Biol. 452:37-43.
137. Nelms K, Keegan AD, Zamorano J, Ryan JJ, Paul WE. (1999) The IL-4 receptor:
signaling mechanisms and biologic functions. Annu Rev Immunol.17:701-738.
116
138. Ng PC, Lee CH, Lam CW, Ma KC, Chan IH, Wong E, Fok TF. (2004) Transient
adrenocortical insufficiency of prematurity and systemic hypotension in very low
birthweight infants. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 89:F119-126.
139. Ng PC. (2008) Is there a "normal" range of serum cortisol concentration for preterm
infants? Pediatrics. 122:873-875
140. Nieboer P, van der Werf TS, Beentjes JA, Tulleken JE, Zijlstra JG, Ligtenberg JJ. (2000)
Catecholamine dependency in a polytrauma patient: relative adrenal insufficiency?
Intensive Care Med 26: 125-127
141. Nishio A, Keeffe EB, Gershwin ME. (2002) Immunopathogenesis of primary biliary
cirrhosis. Semin Liver Dis. 22:291-302.
142. Nyirády P, Blázovics A, Romics I May Zoltán, Székely E, Bekő G, Szentmihályi K.
(2009) Microelement concentration differences between patients with and without prostate
adenocarcinoma. Trace Elements in the Food Chain Vol. 3. Deficiency or excess of trace
elements in the environment as a risk of health, Eds. Szilágyi M. and Szentmihályi K.
Hungarian Academy of Sciences, pp. 26-30. Budapest,.
143. Okazaki K, Nishida A, Kato M, Kozawa K, Uga N, Kimura H (2006) Elevation of
cytokine concentrations in asphyxiated neonates. Biol Neonate 89:183-189.
144. Old LJ (1995). Tumor necrosis factor (TNF). Science 230 (4726): 630–2.
145. Opal SM, DePalo VA. (2000) Anti-inflammatory cytokines. Chest. 117:1162-1172.
146. Oyaizu M (1986) Studies on products of browning reaction prepared from glucosamine,
Jpn. J. Nutr, 44:307-315.
147. Pár G, Berki T, Pálinkás L, Balogh P, Szereday L, Halász M, Szekeres-Barthó J, Miseta
A, Hegedus G, Mózsik G, Hunyady B, Pár A. (2006) [Immunology of HCV infection: the
causes of impaired cellular immune response and the effect of antiviral treatment] Orv
Hetil. 147:591-600.
148. Park IK, Paik WK. (1990) The occurrence and analysis of methylated amino acids in
protein methylation. 1-16 Eds., Paik WK, and Kim S. CRC Press Inc., Boca Raton, Florida,
149. Perry HM 3rd, Horowitz M, Fleming S, Kaiser FE, Patrick P, Morley JE, Cushman W,
Bingham S, Perry HM (1998) Effect of recent alcohol intake on parathyroid hormone and
mineral metabolism in men, Alcohol Clin Exp Res 22:1369–1375.
150. Perry VH. (2004) The influence of systemic inflammation on inflammation in the brain:
implications for chronic neurodegenerative disease. Brain Behav Immun. 18:407–413.
151. Pinzani M, Marra F. (2001) Cytokine receptors and signaling in hepatic stellate cells.
Semin Liver Dis. 21:397-416.
117
152. Poikolainen K, Alho H. (2008) Magnesium treatment in alcoholics: a randomized clinical
trial. Subst Abuse Treat Prev Policy 25:3-5.
153. Pou KM, Massaro JM, Hoffmann U, Vasan RS, Maurovich-Horvat P, Larson MG,
Keaney JF Jr, Meigs JB, Lipinska I, Kathiresan S, Murabito JM, O'Donnell CJ, Benjamin
EJ, Fox CS (2007) Visceral and subcutaneous adipose tissue volumes are cross-sectionally
related to markers of inflammation and oxidative stress: the Framingham Heart Study.
Circulation 116:1234-1241.
154. Protonotariou E, Malamitsi-Puchner A, Giannaki G, Rizos D, Phocas I, Sarandakou A.
(1999) Patterns of inflammatory cytokine serum concentrations during the perinatal period.
Early Hum Dev 56:31-38.
155. Qing M, Vazquez-Jimenez JF, Klosterhalfen B, Sigler M, Schumacher K,Duchateau J,
Messmer BJ, von Bernuth G, Seghaye MC. (2001) Influence of temperature during
cardiopulmonary bypass on leukocyte activation, cytokine balance, and post-operative
organ damage. Shock.15:372-377
156. Qing M, Wöltje M, Schumacher K, Sokalska M, Vazquez-Jimenez JF, Minkenberg R,
Seghaye MC. (2006) The use of moderate hypotermia during cardiac surgery is associated
with repression of tumour necrosis factor-alpha via inhibition of activating protein-1: an
experimental study. Crit Care 10:R57.
157. Rambod M, Kovesdy CP, Kalantar-Zadeh K (2008) Malnutrition-Inflammation Score for
risk stratification of patients with CKD: is it the promised gold standard? Nat Clin Pract
Nephrol 4:354-355.
158. Remport A, Czira M E, Rudas A., Ujszaszi A, Sarvary E, Beko G, Mucsi I, Novak M,
Molnar MZ. (2009) Association between the malnutrition and inflammation complex
syndrome score and mortality in kidney transplanted 14th ESOT Congress, Paris
159. Rivero-Pérez MD, Muñiz P, Gonzalez-Sanjosé ML.( 2007) Antioxidant profile of red
wines evaluated by total antioxidant capacity, scavenger activity, and biomarkers of
oxidative stress methodologies. J Agric Food Chem. 55:5476-83.
160. Rizos D, Protonotariou E, Malamitsi-Puchner A, Sarandakou A, Trakakis E, Salamalekis
E. (2007) Cytokine concentrations during the first days of life. Eur J Obstet Gynecol
Reprod Biol. 131:32-35.
161. Rojo LE, Fernández JA, Maccioni AA, Jimenez JM, Maccioni RB. (2008)
Neuroinflammation: implications for the pathogenesis and molecular diagnosis of
Alzheimer's disease. Arch Med Res. 39:1-16.
118
162. Róka A, Vásárhelyi B, Bodrogi E, Machay T, Szabó M. (2008) Elevated morphine
concentrations in neonates treated with morphine and prolonged hypothermia for hypoxic
ischaemic encephalopathy. Pediatrics 121:e844-849
163. Romagnoli C, Frezza S, Cingolani A, De Luca A, Puopolo M, De Carolis MP, Vento G,
Antinori A, Tortorolo G.( 2001) Plasma levels of interleukin-6 and interleukin-10 in
preterm neonates evaluated for sepsis. Eur J Pediatr 160:345-350.
164. Rossi L, Lombardo MF, Ciriolo MR, Rotilio G. (2004) Mitochondrial dysfunction in
neurodegenerative diseases associated with copper imbalance. Neurochem Res. 29:493-504.
165. Russwurm S, Stonāns I, Schwerter K, Stonāne E, Meissner W, Reinhart K. (2002) Direct
influence of mild hypotermia on cytokine expression and release in cultures of human
peripheral blood mononuclear cells. J Interferon Cytokine Res 22:215 221.
166. Saliba E, Henrot A. (2001) Inflammatory mediators and neonatal brain damage. Biol
Neonate 79:224-227.
167. Sarandakou A, Giannaki G, Malamitsi-Puchner A, Rizos D, Hourdaki E, Protonotariou E,
Phocas I. (1998) Inflammatory cytokines in newborn infants. Mediators Inflamm. 7:309 –
312
168. Scher M Perinatal asphyxia: timing and mechanisms of injury in neonatal encephalopathy.
(2001) Curr Neurol Neurosci Rep 1:175-84.
169. Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA. (2004) Interferon-gamma: an overview of
signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol. 75:163-189.
170. Scumpia PO, Sarcia PJ, Kelly KM, DeMarco VG, Skimming JW. (2004) Hypothermia
induces anti-inflammatory cytokines and inhibits nitric oxide and myeloperoxidasemediated damage in the hearts of endotoxemic rats. Chest. 125:1483-1491.
171. Shaftel SS, Griffin WS, O'Banion MK. (2008) The role of interleukin-1 in
neuroinflammation
and
Alzheimer
disease:
an
evolving
perspective.J
Neuroinflammation.;5:7.
172. Shalan MG, Mostafa MS, Hassouna MM, El-Nabi SE, El-Refaie A. (2005) Amelioration
of lead toxicity on rat liver with Vitamin C and silymarin supplements.Toxicology 206:115.
173. Shenker Y, Skatrud JB. (2001) Adrenal insufficiency in critically ill patients Am J Respir
Crit Care Med 163:1520-23
174. Snow WM, Murray R, Ekuma O, Tyas SL, Barnes GE. (2009) Alcohol use and
cardiovascular health outcomes: a comparison across age and gender in the Winnipeg
Health and Drinking Survey Cohort. Age Ageing 38:206-12.
119
175. Stanley LL, Mazier MJ. (1999) Potential explanations for the French paradox. Nutr Res
19:3–15.
176. Stenvinkel P, Heimbürger O, Lindholm B, Kaysen GA, Bergström J. (2000) Are there two
types of malnutrition in chronic renal failure? Evidence for relationships between
malnutrition, inflammation and atherosclerosis (MIA syndrome). Nephrol Dial Transplant
15:953-960.
177. Stenvinkel P, Heimbürger O, Paultre F, Diczfalusy U, Wang T, Berglund L, Jogestrand T.
(1999) Strong association between malnutrition, inflammation, and atherosclerosis in
chronic renal failure. Kidney Int 55:1899-1911.
178. Strausak D, Mercer JF, Dieter HH, Stremmel W, Multhaup G. (2001) Copper in disorders
with neurological symptoms: Alzheimer's, Menkes, and Wilson diseases. Brain Res Bull.
55:175-185.
179. Szabó M, Treszl A, Roka A, Vásárhelyi B, Mészáros G, Tulassay T.(2008) Cytokine
balance is shifted to a pro-inflammatory status in postasphyxic neonates treated with
systemic hypothermia when cortisol levels are lower than the median. Acta Pediatrica: pp.
28-29.
180. Szaflarski J, Burtrum D, Silverstein FS. (1995) Cerebral hypoxia-ischemia stimulates
cytokine gene expression in perinatal rats. Stroke 26:1093-1100.
181. Szende B, Tyihák E, Trézl L. (2001) Role of arginine and its methylated derivatives in
cancer biology and treatment. Cancer Cell Int 1:1-3.
182. Szentmihályi K, Fehér E, Vinkler P, Kéry A, Blázovics A.(2004) Metabolic alterations of
toxic and nonessential elements by the treatment of Sempervivum tectorum extract in a
hyperlipidemic rat model. Toxicologic Pathology 32:50-57.
183. Tacke F, Luedde T, Trautwein C. (2009) Inflammatory pathways in liver homeostasis and
liver injury. Clin Rev Allergy Immunol. 36:4-12.
184. Thurman RG. (2000) Sex-related liver injury due to alcohol involves activation of Kupffer
cells by endotoxin. Can J Gastroenterol. 14:129D-135D.
185. Tiegs G (2007) Cellular and cytokine-mediated mechanisms of inflammation and its
modulation in immune-mediated liver injury. Z Gastroenterol. 45:63-70.
186. Tocci MJ. (1997) Structure and function of interleukin-1 beta converting enzyme. Vitam
Horm. 53:27-63.
187. Thornton AM, Shevach EM (1998). "CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress
polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production". J. Exp. Med.
188: 287–96
120
188. Treszl A, Héninger E, Kálmán A, Schuler A, Tulassay T, Vásárhelyi B. (2003) Lower
prevalence of IL-4 receptor alpha-chain gene G variant in very-low-birth-weight infants
with necrotizing enterocolitis. J Pediatr Surg. 38:1374-8.
189. Treszl A, Kocsis I, Szathmári M, Schuler A, Héninger E, Tulassay T, Vásárhelyi B.
(2003) Genetic variants of TNF-alpha, IL-1beta, IL-4 receptor alpha-chain, IL-6 and IL-10
genes are not risk factors for sepsis in low-birth-weight infants. Biol Neonate. 83:241-5.
190. Treszl A, Tóth-Heyn P, Kocsis I, Nobilis A, Schuler A, Tulassay T, Vásárhelyi B. (2002)
Interleukin genetic variants and the risk of renal failure in infants with infection. Pediatr
Nephrol. 17:713-7
191. Treszl A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2006) Genetic basis for necrotizing enterocolitis-risk factors and their relations to genetic polymorphisms. Front Biosci. 11:570-580
192. Treszl A, Vásárhelyi B, Tulassay Zs, Szathmári M (2000) A tumor nekrózis faktor-alfa
élettana és szerepe egyes betegségek patogenezisében Magyar Belorvosi Archívum 53: 397403.
193. Treszl A. (2005) Citokin gén-polimorfizmusok jelentősége a kissúlyú koraszülötteket
érintő perinatális szövődmények kialakulásában, Ph.D. disszertáció, Budapest, Semmelweis
Egyetem
194. Tsukamoto H. Cytokine regulation of hepatic stellate cells in liver fibrosis. (1999)
Alcohol Clin Exp Res. 23:911-6.
195. Tyihák E, Trézl L, Szende B. (1998) Formaldehyde cycle and the phases of stress
syndrome. In: Stress of Life: From molecules to Man. Ann NY Acad Sci 851: 259.
196. Tyihák E, Takátsy A, Móricz Á. M, Ott P. G, Ohmacht R. (2009) Trace elements as
formaldehyde carriers. Trace Elements in the Food Chain Vol. 3. Deficiency or excess of
trace elements in the environment as a risk of health, Eds. Szilágyi M. and Szentmihályi K.
Hungarian Academy of Sciences, pp. 392-396. Budapest,
197. Upadhyay G, Singh AK, Kumar A, Prakash O, Singh MP. (2008) Resveratrol modulates
pyrogallol-induced changes in hepatic toxicity markers, xenobiotic metabolizing enzymes
and oxidative stress. Eur J Pharmacol 596:146-52.
198. Utgaard JO, Jahnsen FL, Bakka A, Brandtzaeg P, Haraldsen G. (1998) Rapid secretion of
prestored interleukin 8 from Weibel-Palade bodies of microvascular endothelial cells. J.
Exp. Med. 188: 1751–1756.
199. Wajant H, Pfizenmaier K, Scheurich P (2003). Tumor necrosis factor signaling. Cell
Death Differ. 10 (1): 45–65.
121
200. Walsh TJ, Tilson HA (1984) Neurobehavioral toxicology of the organoleads.
Neurotoxicology. 5:67-86.
201. Wang AY, Woo J, Lam CW, Wang M, Chan IH, Gao P, Lui SF, Li PK, Sanderson JE.
(2005) Associations of serum fetuin-A with malnutrition, inflammation, atherosclerosis and
valvular calcification syndrome and outcome in peritoneal dialysis patients. Nephrol Dial
Transplant 20:1676-85.
202. Wang S, Fan Y, Han X, Yang J, Bilenki L, Yang X. (2001) IL-12-dependent vascular cell
adhesion molecule-1 expression contributes to airway eosinophilic inflammation in a mouse
model of asthma-like reaction. J Immunol. 166:2741-9.
203. Wedi B, Raap U, Lewrick H, Kapp A. (1998) IL-4-induced apoptosis in peripheral blood
eosinophils. J Allergy Clin Immunol. 102:1013-1020.
204. Wei H, Zhang R, Wang C, Zheng H, Li A, Chou KC, Wei DQ. (2007) Molecular insights
of SAH enzyme catalysis and implication for inhibitor design. J Theor Biol ;244:692-702.
205. Wiggelinkhuizen M, Tilanus ME, Bollen CW, Houwen RH. (2009) Systematic review:
clinical efficacy of chelator agents and zinc in the initial treatment of Wilson disease.
Aliment Pharmacol Ther. 29:947-58.
206. Wolff B, Burns AR, Middleton J, Rot A (1998) Endothelial cell "memory" of
inflammatory stimulation: human venular endothelial cells store interleukin 8 in WeibelPalade bodies J. Exp. Med. 188: 1757–1762
207. Xanthou M, Fotopoulos S, Mouchtouri A, Lipsou N, Zika I, Sarafidou J. (2002)
Inflammatory mediators in perinatal asphyxia and infection. Acta Paediatr Suppl 91:92-97.
208. Yamashina S, Takei Y, Ikejima K, Enomoto N, Kitamura T, Sato N. (2005) Ethanolinduced sensitization to endotoxin in Kupffer cells is dependent upon oxidative stress.
Alcohol Clin Exp Res. 29:246S-250S.
209. Zhu ML, Kyprianou N. (2008) Androgen receptor and growth factor signaling cross-talk
in prostate cancer cells. Endocr Relat Cancer. 15:841-849.
210. Zidenberg-Cherr S, Keen CL. (1991) Essential trace elements in antioxidant processes. In
Dreosti E.I: Trace elements, micronutrients, and free radicals. Totowa, New Jersey:
Humana Press; 107-128.
122
A dolgozathoz kapcsolódó közlemények
Folyóiratcikkek
1.
Bekő G, Hagymási K, Szentmihályi K, Bányai ES, Osztovits J, Fodor J, Fehér J, Blázovics
A. ( 2009) Sex-dependent alterations in erythrocyte trace element levels and antioxidant
status after a month of moderate daily red wine consumption. Eur J Gastroenterol Hepatol.
Sep 25. [Epub ahead of print], IF: 2,08
2.
Bekő G, Treszl A, Róka A, Vásárhelyi B, Mészáros G, Tulassay T, Azzopardi D, Szabó
M.(2009) Changes In Serum Cytokine Levels In Normothermic And Hypothermic Infants
After Perinatal Asphyxia Pediatric Research (revízió alatt) IF:
3.
Bekő G. (2008) Biochip technika a labordiagnosztikában, citokinmérések. Orvosképzés; 4:
309-312
4.
Bekő G, Krkos K, Rácz K Patócs A, Tulassay Zs. (2008) A szérum inzulinszerű
növekedési faktor-1 (IGF-1) referenciatartományának vizsgálata. Magyar Belorvosi
Archivum 5: 400-405.
5.
Gyarmati B, Bekő G, Szalay B, Cseh A, Vásárhelyi B, Treszl A: Maternal cytokine balance
on 3rd postpartum day is not affected by the mode of delivery after healthy pregnancies.
The Journal of International Medical Research (elfogadva 2009 szeptember) IF: 0,821
6.
Molnár MZ, Czira M, Ambrus C, Szeifert L, Szentkirályi A, Bekő G, Rosivall L, Remport
Á, Novák M, Mucsi I. Anemia is associated with mortality in kidney-transplanted patientsa prospective cohort study. Am J Transplant. 2007 818-24, IF: 6,559
7.
Bekő G, Treszl A, Róka A, Vásárhelyi B, Mészáros G, Tulassay T, Azzopardi D, Szabó
M.(2009) Changes In Serum Cytokine Levels In Normothermic And Hypothermic Infants
After Perinatal Asphyxia Pediatric Research (revízió alatt) IF:
8.
Molnáar M. Z, Keszei A, Czira M. E, Rudas A, Újszászi A; Háromszeki B, Kósa J. P,
Lakatos P, Sárváry E, Bekő G, Fornádi K, Kiss I, Remport Á, Novák M, Kövesdy Cs. P,
Kalantar-Zadeh K, Mucsi I. Validation of the Malnutrition-Inflammation Score in a large
cohort of kidney transplantrecipients. American Journal of Kidney Disease 2009 (revízió
alatt) IF:
Lektorált könyvben megjelent cikkek:
123
1. Bekő G, Ostovits J, Visnyei Zs, Szalay F, Sátori A, Blázovics A, Szentmihályi K. (2009)
Significant difference in the concentration of Special metal elements in Wilson’s disease
with different symptoms during penicillamine treatment Trace elements in the food chain 3:
31-35. ISBN 978-963-7067-19-8
2. Nyirády P, Blázovics A, Romics I, May Z, Székely E, Bekő G, Szentmihályi K.
Microelement concentration differences between patients with and without prostate
adenocarcinoma Trace elements in the food chain 2009;3 :26-30. ISBN 978-963-7067-19-8
Idézhető absztraktok és előadások
1.
Bekő G, Osztovits J, Visnyei Z., Szalay F., Sátory A,. Blázovics A, Szentmihályi K.
Significance of measurement and difference of special metal elemens in Wilson’s disease
during penicillinamin treatment. Clin Chem Lab Med 2009;47 Special Supplement PP s1s409
2.
Bekő G, Hagymási K, Szentmihályi K Biró E, Osztovits J, Szalay F, Bárkovits S,
Blazovics A. (2008) How can nutritional factors modify the cytokine pattern and redox
parameters in alcoholic drink consumption women? Clin Chem Lab Med, 46, S351
3.
Bekő G., Bíró E., Kovács M., Mátrai B. Újabb citokin mérési módszerek a
labordiagnosztikában A citokin és növekedési faktor panelek értéke Klin. Kísérl. Lab. Med.
2008 34: 41.
4.
Novák M., Fehér A., Nobilis A., Olajos F., Bekő G. Újszülöttek és koraszülöttek
prokalcitonin és C-reaktív protein szintjének követése az élet korai szakaszában Klin.
Kísérl. Lab. Med. 2008 34: 67.
5.
Bekő G, Osztovics J, Visnyei Z, Csák T, Blázovics A, Kovács M, Szalay F. (2008)
Different cytokine patterns in alcoholic cirrhosis, MCV-related cirrhosis and primary
biliary cirrhosis. Z. Gastroenterol. 46; 488.
6.
Bekő G., Osztovits J., Visnyei Zs., Csák T., Blázovics A., Sátori A., Szalay F. (2008)
Biochip citokin- és növekedési faktor protein array vizsgálatok különböző etiológiájú
májcirrhosisban Magyar Belorvosi Archivum suppl 3; pp 45.
7. Bekő G., Bíró E., Kovács M., Mátrai B. (2008) Újabb citokin mérési módszerek a
labordiagnosztikában A citokin és növekedési faktor panelek értéke Klin. Kísérl. Lab. Med.
34: 41.
8.
Bekő G., Osztovics J., Visnyei Z., Csák T., Blázovics A., Kovács M., Szalay F. (2008)
Different cytokine patterns in alcoholic cirrhosis, MCV-related cirrhosis and primary
124
biliary cirrhosis. 50th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology
Tihany, June 6-11. Z. Gastroenterol. 46, 487-522, pp. 488. .
9.
Bekő G, Csák T, Hagymási K,Osztovits J, Visnyei Zs, Bányai É, Blázovics A. (2007) The
change in the levels of cytokines and growth factors in healthy young adults after regular
red wine consumption. Z Gastroenterol 44: 421-452.
10. Bekő G, Bíró E, Nyirády P, Horváth A, Romics I, Kovács M, Blázovics A. (2007) Levels
of cytokines and growth factors in early prostate cancer Clin Chem Lab Med 45: pp 345.
11. Bekő G, Keserű K.( 2006) Biochip módszerrel meghatározott cytokin és növekedési
faktorok jelentősége májbetegségekben Klin. Kísérl. Lab. Med. 32: 40.
12. Szabó M, Bekő G, Treszl A, Roka A, Vásárhelyi B, Mészáros G, Tulassay T.(2008)
Cytokine balance is shifted to a pro-inflammatory status in postasphyxic neonates treated
with systemic hypothermia when cortisol levels are lower than the median. Acta Pediatrica:
pp. 28-29.
13. Molnar M.Z, Remport A, Czira M. E, Sarvary E, Beko G, Rudas A, Ujszaszi A, Novak M,
Mucsi I. (2009) The role of the malnutrition-inflammation complex syndrome in posttransplant anemia: results of the malnutrition-inflammation complex syndrome in
transplantation-Hungary (minit-hu) study 14th ESOT Congress 2009
14. Blázovics A, Kovács Á, Bekő G, Sátori A, Szilvás Á. The weakest correlation between
redox parameters in colon cancer, 18th IFCC - FESCC European Congress of Clinical
Chemistry and Laboratory Medicine National Congress of the Austrian Society of
Laboratory Medicine and Clinical Chemistry, 7 - 11 June 2009 – Innsbruck Clin Chem Lab
Med 2009;47 Special Supplement PP s1-s409
15. Blázovics A, Fébel H, Székely E, Bekő G, Szóke E, Szentmihályi K, Sárdi É. (2008) Effect
of high resveratrol content red wine versus ethanol on homeostasis in rats. Z. Gastroenterol.
46, 487-522, pp. 489
16. Remport Á, Czira M. E, Rudas A, Ujszászi A, Sárváry E, Bekő G, Mucsi I, Novák M,
Molnár M Z. Assotiation between the malnutrition and inflammation complex syndrome
score and mortality in kidney transplanted (14th ESOT Congress 2009)
17. Fehér A, Olajos F, Nobilis A, Novák M, Bekő G (2009) Monitoring of procalcitonin and
C-reactive protein level of prematures and newborns in the early stage of their lives. Clin
Chem Lab Med 47: S223
18. Bekő G, Blázovics A, Szentmihályi K, Biró E, Sátori A , Romics I, Nyirády P. Daily table
beet consumption modifies the levels of cytokines and growth factors in metastatic prostate
125
cancer. XVIII. International Semmelweis Symposium of Urology 2009 , Uro Onkológia
2009; 4, pp. 22
19. Bekő G, Blázovics A, Szentmihályi K, Bíró E, Romics I, Nyirády P. Biochip cytokine
pattern in early prosate cancer. XVIII. International Semmelweis Symposium of Urology
2009 , Uro Onkológia 2009; 4, pp. 23
20. Blázovics, Hagymási K, Blazics B, Balázs A, Bekő G. Jelentkezik-e szex-függő eltérés az
immunreakciókban kismértékű tartós vörösborfogyasztás alkalmával? XIV. .Congressus
Pharmaceuticus Hungaricus 2009 , Gyógyszerészet 2009; 11, pp 17: S79
21. Blázovics A, Fébel H, Blazics B, Balázs A, Bekő G, Sárdi É, Szentmihályi K. Ambivalens
eredmények a vörösbor hatásával kapcsolatban
patkányokban. XIV. .Congressus
Pharmaceuticus Hungaricus 2009 , Gyógyszerészet 2009; 11, pp 187 : S80
Egyéb előadások
1. Bekő G, Blázovics A., Osztovits J és mtsai: A redox-homeosztázist befolyásoló
fémioneltérések
a
D-penicillaminnal
kezelt
Wilson-kóros
betegekben.
MSZKT
Munkaértekezlet Budapest, 2008. szept. 26.
2. Bekő G, Hagymási K, Székely E és mtsai: Hogyan befolyásolja a kismértékű tartós
vörösborfogyasztás az egészséges fiatalok immunprofilját? KÉKI 330, Tudományos
Kollokvium, 2008. 03. 07.
3. Bekő G, Visnyei Zs, Osztovits J, Csák T, Szalay F, Czabai G. Bárkovits S., Blázovics A.
Penicillamin-kezelt Wilson-kóros betegek redox-státusa. MSZKT konferencia, Pécs, 2007.
október 11-13
4. Bekő G., Szentmihályi K., Hagymási K., Stefanovits-Bányai É., Fodor J., Balázs A., Szalay
F., Blázovics A.: Gender-dependent alteration of metal element homeostasis after onemonth of red wine consumption. Mikroelemek tápanyagkörforgalma és újrahasznosítása
konferencia, Mosonmagyaróvár 2008.
5. Bekő G., Hagymási K., Székely E., Szalay F., Stfanovits-Bányai É., Pintér E., Bárkovits S.,
Blázovics A.: Hogyan befolyásolja a kismértékű és tartós vörösborfogyasztás az egészséges
fiatalok immunprofilját? Táplálkozási Fórum, Budapest, 2007.
126
Disszertációtól független közlemények
Folyóiratcikkek:
1.
Bekő G, Varga I, Gláz E, Sereg M, Feldman K, Tóth M, Racz K, Patocs A. (2009), Cut-off
values of midnight salivary cortisol for the diagnosis of overt hypercortisolism are highly
influenced by methods Clinica Chimica Acta (elfogadva 2009 nov. 30), IF: 2,96 (2008)
2.
Osztovits J, Horváth T, Abonyi M, Tóth T, Visnyei Z, Bekö G, Csák T, Lakatos PL,
Littvay L, Fehér J, Kempler P, Kollai M, Szalay F.(2009) Chronic hepatitis C virus
infection associated with autonomic dysfunction. Liver Int. Nov;29(10):1473-8. IF: 2,908
3.
Mondok A, Varga I, Gláz E, Szűcs N, Tóth M, Patócs A, Bekő G, Rácz K: 11ßhydroxysteroid dehydrogenase activity in acromegalic patients with normal or impaired
carbohydrate metabolism Steroids 2009 Sep;74(9):725-9. IF: 2,588 (2008), IF: 2,588
4.
Mondok A, Tóth M, Patócs A, Szücs N, Igaz P, Pusztai P, Czirják S, Bekő G, Gláz E, Rácz
K, Tulassay Z.(2009) Outcome of somatostatin analogue treatment in acromegaly Orv Hetil
150(31):1457-146262.
5.
Lendvai N, Szabó I, Bekő G, Horányi J, Tarjányi M, Alföldi S, Szabó I, Rácz K, Patócs A.
(2009) SDHD
Génmutációhoz társult extraadrenális phaeochromocytoma. Orv Hetil
150(14):645-649.
6.
Molnár MZ, Czira M, Ambrus C, Szeifert L, Szentkirályi A, Bekő G, Rosivall L, Remport
Á, Novák M, Mucsi I. Anemia is associated with mortality in kidney-transplanted patientsa prospective cohort study. Am J Transplant. 2007 818-24, IF: 6,423
Lektorált könyvben megjelent cikkek:
1. Blázovics Anna, Szilvás Ágnes, Sárdi Éva, Székely Edit, Bekő Gabriella, Szentmihályi
Klára.(2009) Metal homeostasis in colorectal cancer patients after colectomy Trace
elements in the food chain 3; 41-45. ( ISBN 978-963-7067-19-8.)
2. Várkonyi J, Bekő G, Kollai G, Karády I.(2009) The iron-copper relation in myelodysplastic
syndromes. Trace elements in the food chain 3; 407-411. (ISBN 978-963-7067-19-8.)
127
Idézhető absztraktok és előadások
1.
Szentmihályi K, Bekő G, Székely E., May Z, Blázovics A.(2009)Selenium determination
in blood samples of patients with pct and Wilson’s disease by cathodic stripping
voltammetry. Clin Chem Lab Med 2009;47 Special Supplement PP s1-s409 pp.
2.
Cseprekál O, Kis É, Bekő G, Sallay P, Szabó A, Tivadar T, Szabó A, Reusz Gy Arterial
stiffness and disturbed CA-P and bone metabolism after kidney transplantation. 5th
Congress of the International Pediatric Transplant Association 2009 Istanbul
3.
Patócs A, Bekő G, Varga I, Butz H, Glaz E, Tóth M, Racz K: Cut-off values of midnight
salivary cortisol for diagnosis of overt hypercortisolism is highly influenced by assay
methods (ENDO9, Washington DC)
4.
Patócs A., Lendvai N., Szabó Ildikó., Bekő G., Horányi J., Alföldi S. Csírasejtes SDHD
mutációhoz társult extraadrenális paraganglioma első hazai esete Klin. Kísérl. Lab. Med.
2008 34: 42.
5.
Sátori A., Olajos F., Bekő G. A D3-vitamin életkor és évszak függő változásai Klin. Kísérl.
Lab. Med.2008 34: 64.
6.
Kocsis I., Molnár-Világos Gy., Dank M., Bekő G. Cystatin-C szerepe a vesefunkció
monitorozásában, bifoszfonát adjuváns kezelésben részesülő daganatos betegek esetében
Kísérl. Lab. Med. 2008 34:
7.
Mihály Z., Hegedűs V., Gerő D., Bekő G., Lotz G., Szentmihályi K., Monostory K.,
Szijártó A., Blázovics A.: Bioactive agents against systemic low grade inflammation. 50th
Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology Tihany, June 6-11. Z.
Gastroenterol. 46, 487-522, pp. 503, 2008
8.
Blázovics A., Szilvás Á., Székely Gy., Székely E., Bekő G., Barkovits S., Sárdi É.:
Measuring of redox homeostasis, bounded HCHO and protoporphyrine concentrations of
erythrocytes help us to predict early metastasis. Clin. Chem., Lab., Med., 2008/46, Spec.
Suppl. pp. S51-S858,
9.
Bekő G, Molnár-Világos Gy. (2006) Testnedvek vizsgálata IQTM200 vizeletüledék
vizsgáló autómatával Klin. Kísérl. Lab. Med. 2006 32: 41.
10. Bíró E., Tar I., Bekő G. Milyen változást hozott a HbA1c standardizáció a diabeteses
betegek követésében Klin. Kísérl. Lab. Med. 2006 32: Suppl
11. Czira M.E., Molnár M. Zs., Szeifert L., Adorjáni G., Lindner A., Újszászi Á., Bekő G.,
Remport Á., Sárváry E.,Kennedy S., Mucsi I., Novák M. A gyulladás és a depresszió
kapcsolata vesetranszplantált betegekben (Pszichiátriai Kongresszus 2008)
128
Egyéb előadások
12. Hegedűs V., Mihály Z. Szijártó A. Gerő D. Bekő G. Lotz G. Monostory K., Szentmihályi
K., Blázovics A.: Molekuláris biológiai változások kísérletes zsírmájban. MSZKT
Munkaértekezlet 2008. szept. 26., Budapest, Fiatal előadó díj
13. Nyirády P., Horváth A., Blázovics A, Székely E, Szentmihályi K, Sárdi É, Bekő G, Romics
I. Új biokémiai és analitiai módszerek bevezetése a prosztatarák korai felismerésében és
elkülönítő kórismézésében MSZKT Munkaértekezlet 2008. szept. 26., Budapest
14. Blázovics A., Tordai E., Stefanovits-Bányai É., Bekő G., Bárkovits S., Pintér E., Czabai
G., Sárdi É.: A kötött formaldehid koncentrációjának változása „short term” alimentáris
eredetű zsírmájban és alkoholos májkárosodásban patkányban. MSZKT konferencia, Pécs,
2007. október 11-13.
15. Bekő G. Automatával végzett vérképelemzés, II. Hematológiai Továbbképző Konferencia
2008
129
Köszönetnyilvánítás
Mindenek előtt köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, Dr. Blázovics Annának, a
MTA doktorának, aki létrehozta azt a szellemi alkotóműhelyt, ahol az elmúlt évek során levelező
Ph.D. hallgatóként dolgozhattam. Ebben a környezetben lehetőségem volt elsajátítani a
kutatásban nélkülözhetetlen problémaorientált látásmódot és kérdésfelvetést. Bekapcsolódhattam
olyan korszerű műszerek és eszközök használatába, amelyek lehetővé tették az orvosi kutatások
nemzetközi szintű művelését.
Köszönettel tartozom Prof. Dr. Szalay Ferencnek, a MTA doktorának témavezetőmnek,
aki az I.sz. Belgyógyászati Klinikán mindvégig támogatott és biztatott kutatásaimban. Bevont az
Intézetben zajló hepatológiai kutatásokba, a betegekkel kapcsolatos klinikai problémák
felvetésében és a laboratóriumi eredmények értékelésében mindvégig segített.
Munkámat Prof. Dr. emeritus Fehér János MTA doktora programvezetőm mindvégig
támogatta, tanácsai, útmutatásai kimondhatatlanul sokat segített a kutatói léttel járó és
kikerülhetetlenül bekövetkező nehezebb időszakokban.
A citokinszint mérések mellett több ízben került sor egyéb, a Központi Laboratóriumban
nem elérhető módszerek alkalmazására. Igen gyümölcsöző együttműködést sikerült kialakítani
Dr. Ph.D. Szentmihályi Klárával, a MTA Kémiai Kutatóközpont tudományos csoportvezetőjével,
aki fémion-meghatározásokban nyújtott felbecsülhetetlen segítséget. Hálával tartozom a közös
kutatásokért. Prof. Dr. Stefanovits-Bányai Évának, a Budapesti Corvinus Egyetem egyetemi
tanárának.
Dr. Sárdi Éva MTA doktorának, a Budapesti Corvinus Egyetem tudományos
tanácsadójának nagyon köszönöm a metildonor meghatározást, Dr. Ph.D. Székely Editnek, az
Állami Egészségügyi Központ Sürgősségi Laboratóriuma vezetőjének pedig a porfirin méréseket.
A perinatális vizsgálatok során a statisztikai kérdésekben dr.Ph.D. Treszl András, a Semmelweis
Egyetem I.sz. Gyermekklinika kutatócsoportjának tagja volt a segítségemre. A közlemények
megírásával kapcsolatos technikai kérdésekben Dr. Vásárhelyi Barna MTA doktora, az I.sz.
Gyermekklinika kutatólaboratóriumának a vezetője nagyon sokat segített.
Dr. Ph.D. Mucsi Istvánnak a SE I. sz. Belklinika és Magatartástudományi Intézet
docensének is köszönöm az együttműködését és tanácsait.
A Randox-Ltd-től Kovács Margit nyújtott nélkülözhetetlen segítséget a biochipek
beállításánál, a mérésénél, a Bio-Rad Hungary-Ltd-től pedig Mátrai Beátánaknak és Dr. Ph.D.
Csanádi Gyulának tartozom hálával.
Laboratóriumi munkámat jól dokumentált, megfelelően gyűjtött és feldolgozott minták
nélkül nem tudtam volna végezni. Ehhez lelkes és elkötelezett klinikai partnerekre volt szükség.
130
Közülük is ki kell emelnem Dr. Ph.D. Szabó Miklós adjunktust az I.sz. Gyermekgyógyászati
Klinikáról, Dr. Ph.D. Nyirády Péter docenst, az Urológiai Klinikáról, Dr. Ph.D. Abonyi Margit
docenst, Dr. Csák Timeát, Dr. Osztovits Jánost, Dr.Visnyei Zsoltot I.sz. Belgyógyászati
Klinikáról, Dr. Hagymási Krisztinát a II. Belgyógyászati Klinikáról dr. Ph.D. Molnár Miklós
Zsoltot (Transzplantációs Klinika és Fresenius Dialísis Központ) és Dr. Ph.D. Sárvári Enikőt
Transzplantációs Klinikáról. Köszönet illeti mindnyájukat.
A kutatómunka mellett a mindennapok során a klinikai laboratóriumi diagnosztikai
kérdésekkel is meg kellett küzdeni. Azt, hogy a két külön feladatot mégis sikerült együtt ellátni, a
Központi Laboratóriumban dolgozó munkatársaimnak köszönhetem, akik közül Dr. Ph.D. Kocsis
Ibolyát szeretném kiemelni. Dr. Ph.D. Patócs Attilának köszönöm, hogy az Izotóp
Laboratóriumban minden gondot levett a vállamról és emellett még a publikációk elkészültében
is segített. Bíró Edinának és Olajos Ferencnek is hálával tartozom a sok technikai segítségért. A
laboratórium összes dolgozójának köszönöm, hogy mellettem álltak és bíztattak. Bárkovits
Saroltának és Pintér Edinának, a Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinika
asszisztenseinek is hálás vagyok az áldozatos közös munkákért.
A kutatások nem valósulhattak volna meg az ETT 354/2006 és ETT 012/2006 a Randox
Ltd, a BioRad Ltd, Diagnosticum Zrt, Olympus Hungary Kft, Roche Magyarország Kft, Diagon
Kft támogatása nélkül. A betegek számára a céklakészítményt a GPS Powder Kft. biztosította,
amelyet ezúton is hálásan köszönünk.
Végül, de nem utolsósorban, meg kell említsem családom mindvégig kitartó támogatását
és szeretetét. Nélkülük nem készülhetett volna el ez a munka.
131
Download PDF