N.Feldmeyer Dissertation Endversion 11.05.10

N.Feldmeyer Dissertation Endversion 11.05.10
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht - Karls - Universität
Heidelberg
vorgelegt
von
Diplom-Biologin Nadja Feldmeyer
aus Bruchsal
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht - Karls - Universität
Heidelberg
vorgelegt
von
Diplom-Biologin Nadja Feldmeyer
aus Bruchsal
Tag der mündlichen Prüfung: ................................................
Untersuchungen zur Regulation der Aktivierung humaner
T-Lymphozyten bei Arginindepletion
Gutachter: PD. Dr. Philipp Beckhove
Prof. Dr. Carsten Watzl
Meiner Familie
Die vorliegende Arbeit wurde vom 15.01.2007 – 15.01.2010 am Institut für Immunologie
des Universitätsklinikums der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg in der Abteilung
Zelluläre Immunologie in der Arbeitsgruppe „Zelluläre Immunologie“ unter der Leitung von
Herrn PD Dr. med. Markus Munder angefertigt.
Während dieser Arbeit wurden folgende Veröffentlichungen erstellt:
Nadja Feldmeyer, Guido Wabnitz, Stefan Leicht, Claudia Luckner, Thomas Franz,
Yvonne Samstag and Markus Munder. „Arginine deficiency leads to impaired cofilin
dephosphorylation and actin reorganisation in activated human T Lymphocytes“,
Posterpräsentation, 2nd European Congress of Immunology, Berlin, 13.09. - 16.09.2010
Nadja Feldmeyer, Guido Wabnitz, Stefan Leicht, Claudia Luckner-Minden, Martin
Schiller, Thomas Franz, Yvonne Samstag, Pascale Kropf, Ingrid Müller, Anthony D. Ho,
and Markus Munder. Arginine deficiency leads to impaired cofilin dephosphorylation and
actin reorganization in activated human T lymphocytes. Zur Publikation eingereicht.
Zusammenfassung
I.
Zusammenfassung
Die Verstoffwechslung der semiessentiellen Aminosäure Arginin ist entscheidend beteiligt
an der Regulation der Immunantwort im Verlauf von Infektionen, entzündlichen
Erkrankungen und bei Tumorwachstum. Arginin wird durch die Enzyme Arginase und
Stickstoffmonoxid-Synthase abgebaut, wodurch die Verfügbarkeit der Aminosäure
reguliert wird. Eine lokale Arginindepletion, welche z.B. durch Freisetzung von Arginase 1
aus myeloischen Zellen verursacht wird, führt zur völligen Hemmung der Proliferation und
zahlreicher Effektor-Funktionen aktivierter humaner T-Lymphozyten. Hierbei waren die
intrazellulären Mechanismen, welche zur Suppression zahlreicher T-Zell-Funktionen bei
Argininmangel führen, bei Beginn dieser Promotionsarbeit, weitgehend unklar.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Argininmangel auf die intrazelluläre
Signaltransduktion in aktivierten primären humanen T-Zellen gesunder Blutspender in
vitro untersucht. Durch proteomische Analysen konnte gezeigt werden, dass das Fehlen
der
Aminosäure
Arginin
bei
T-Zell-Aktivierung
zu
einer
signifikant
reduzierten
Dephoshorylierung des Aktin-bindenden Proteins Cofilin führt. Normalerweise führt die
Stimulation
über
den
T-Zell-Rezeptor
und
kostimulatorische
Moleküle
via
Dephosphorylierung zur Aktivierung von Cofilin, welches eine entscheidende Rolle bei der
Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts, der T-Zellproliferation und Zytokinsekretion spielt.
Im Zusammenhang mit der Persistenz der phosphorylierten Form von Cofilin zeigte sich
bei Argininabwesenheit ein veränderter F-Aktingehalt in aktivierten T-Zellen. Außerdem
korrelierte die verminderte Ausbildung der Immunologischen Synapse, der Kontaktzone
zwischen T-Zelle und antigenpräsentierende Zelle, mit der fehlenden Aktin-Bindefähigkeit
von Cofilin. Im Gegensatz dazu ist ein weiterer Cofilin-abhängiger Prozess, die Migration,
bei Argininabwesenheit unbeeinträchtigt. Ferner konnte erstmals eine dichotome
Regulation der Zytokinsynthese und -sekretion in humanen T-Lymphozyten bei
Arginindefizienz gezeigt werden. Während Arginindepletion zu einer signifikanten
Inhibition von Produktion und Sekretion der Zytokine IFN-γ, TNF-β und IL-10 führt, zeigte
sich eine unbeeinträchtigte Synthese der Zytokine IL-2, IL-6 und IL-8.
Weitere Untersuchungen zur frühen (1-30 min) Signaltransduktion bei T-Zell-Aktivierung
zeigten, dass der Kalziumflux unabhängig von der extrazellulären Argininkonzentration
induziert wird. Auch fanden sich keine argininabhängigen Unterschiede in der frühen
Cofilin-Dephosphorylierung sowie bei Aktivierung der für die Cofilin-Dephosphorylierung
verantwortlichen Ras-MEK-ERK- und Ras-PI3K-Akt-Signalwege. Im weiteren Verlauf
zeigte sich dann bei Argininmangel in Assoziation mit der beeinträchtigten CofilinI
Zusammenfassung
Dephosphorylierung eine reduzierte ERK-Phosphorylierung bei prolongierter AktPhosphorylierung.
Diese Alterationen der T-Zell-Signaltransduktion fanden sich gleichartig auch bei
Stimulation der Zellen in einem durch humane Granulozyten-Arginase (aus humanem
Eiter ex vivo gewonnen) von Arginin depletierten Milieu und waren durch Zugabe eines
Arginase-Inhibitors vollständig inhibierbar. Dieses Modell unterstreicht die Relevanz der
beschriebenen T-Zell-Alterationen für die Situation granulozytär dominierter Inflammation
in vivo.
Das
durch
diese
Arbeit
gewonnene,
bessere
Verständnis
intrazellulärer
Regulationsmechanismen humaner T-Lymphozyten bei Arginindefizienz sollte dazu
beitragen, in Zukunft in die unerwünschte Immunsuppression bei Tumorerkrankungen
oder chronischer Inflammation kausal pharmakologisch eingreifen zu können.
II
Abstract
II
Abstract
Metabolism of the semi-essential amino acid arginine is fundamentally involved in
regulation of the immune response during infection, inflammatory diseases and tumour
growth. The availability of arginine is regulated by the enzymes arginase and nitric oxide
synthase. Local arginine depletion, e.g. mediated through the release of arginase 1 by
myeloid cells, results in the total suppression of proliferation and inhibition of several
effector functions of activated human T-lymphocytes. The intracellular mechanisms
leading to the observed suppression of T-cell functions under conditions of arginine
depletion were largely uncharacterised at the start of this thesis.
In this thesis, the effect of arginine depletion on intracellular signal transduction pathways
in activated T cells of healthy human blood donors was investigated. Proteomic analysis
revealed that the absence of the amino acid arginine during T cell activation leads to a
significant reduction in dephosphorylation of the actin-binding protein cofilin. Cofilin is an
essential component in reorganisation of the actin cytoskeleton, T cell proliferation and
cytokine secretion and is activated through dephosphorylation upon stimulation of the T
cell receptor and co stimulatory molecules. Persistence of the phosphorylated form of
cofilin in the absence of arginine results in altered F-actin concentration in activated T
cells. Furthermore, a disturbed formation of the immunological synapse, the contact area
between T cells and antigen presenting cells, correlates with the missing actin binding
capacity of cofilin. In contrast, chemotactic migration (another cofilin-dependent process),
is unaltered in the absence of arginine. In addition, dichotomic regulation of cytokine
synthesis and secretion in human T cells upon arginine depletion was demonstrated for
the first time. While arginine depletion leads to significant inhibition in the production and
secretion of IFN-γ, TNF-ß and IL-10, the synthesis of IL-2, IL-6 and IL-8 is unimpaired.
Furthermore, it was shown that the induction of calcium flux during early signal
transduction (1-30 min) in activated T cells is independent of the extracellular arginine
concentration. Also, cofilin-dephosphorylation itself as well as the Ras-MEK-ERK- and
Ras-PI3K-Akt signal pathways, which lead to cofilin dephosphorylation, are arginineindependent within the first 30 min of T cell activation. Later on, arginine deficiency leads
to reduced phosphorylation of ERK but increased phosphorylation of Akt, and this
correlates with impaired dephosphorylation of cofilin. Finally, the observed alterations of
III
Abstract
the T cell signal transduction pathways were also demonstrated upon T cell stimulation in
a micromilieu that was depleted of arginine by liberated granulocyte arginase from human
pus. This model emphasizes the physiological relevance of the described T cell alterations
for granulocyte-dominated inflammation in vivo.
The results of this thesis advance the understanding of regulatory mechanisms in human
T cells under conditions of arginine deficiency and will hopefully enable improved
pharmacological treatment of unwanted immune suppression caused by tumours and
chronic inflammation.
IV
Inhaltsverzeichnis
III
Inhaltsverzeichnis
I.
ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................. I
II
ABSTRACT .............................................................................................................................. III
III
INHALTSVERZEICHNIS ........................................................................................................... V
1
EINLEITUNG ............................................................................................................................. 1
1.1 DAS IMMUNSYSTEM ............................................................................................................. 1
1.2 DIE ADAPTIVE IMMUNANTWORT ............................................................................................ 2
1.3 DIE T-ZELL-VERMITTELTE IMMUNANTWORT ........................................................................... 3
1.4 DIE IMMUNOLOGISCHE SYNAPSE .......................................................................................... 5
1.5 T-ZELL-AKTIVIERUNG .......................................................................................................... 6
1.5.1
Der T-Zell-Rezeptor-Komplex und Signaltransduktion nach Antigen-Erkennung........ 6
1.5.2
Kostimulation ................................................................................................................ 8
1.6 DAS AKTIN-ZYTOSKELETT .................................................................................................... 9
1.7 ARGINASE: EIN ENZYM DES HARNSTOFFZYKLUS UND DER IMMUNREGULATION...................... 12
1.8 DIE BEDEUTUNG UND FUNKTION DER ARGINASE I IM IMMUNSYSTEM..................................... 14
1.9 DIE BEDEUTUNG DER ARGINASE BEI DER IMMUNANTWORT GEGEN TUMOREN ....................... 16
1.10 SUPPRESSION DER IMMUNANTWORT BEI ARGININDEFIZIENZ ................................................. 16
1.11 BEKANNTE MECHANISMEN DER T-ZELL-SUPPRESSION BEI AMINOSÄUREMANGEL ................. 19
1.12 ZIEL DER ARBEIT ............................................................................................................... 21
2
MATERIAL UND METHODEN................................................................................................ 22
2.1 MATERIAL ......................................................................................................................... 22
2.1.1
Zellen .......................................................................................................................... 22
2.1.2
Antikörper – FACS...................................................................................................... 22
2.1.3
Antikörper – Western Blot........................................................................................... 23
2.1.4
Sonstige Antikörper .................................................................................................... 24
2.1.5
Chemikalien und Reagenzien..................................................................................... 24
2.1.6
Geräte und Laborausstattung..................................................................................... 28
2.1.7
Verbrauchsmaterialien................................................................................................ 30
2.1.8
Software...................................................................................................................... 31
2.1.9
Medien ........................................................................................................................ 31
2.1.10
Puffer und Lösungen .............................................................................................. 32
2.2 METHODEN ....................................................................................................................... 38
2.2.1
Zellkultur ..................................................................................................................... 38
2.2.1.1
2.2.1.2
2.2.1.3
2.2.1.4
2.2.1.5
2.2.1.6
2.2.1.7
2.2.2
Isolierung primärer T-Lymphozyten .................................................................... 38
Isolierung Peripherer Blut Mononukleärer Zellen (PBMC) .......................... 38
Isolierung peripherer Blut-T-Lymphozyten ....................................................... 39
Kultivierung und Einfrieren von Lymphom-Zelllinien ..................................... 40
Einfrieren von Zellpellets........................................................................................ 41
Herstellen der T-Zelllysate .................................................................................... 41
Herstellen der Proben für Western Blot Analysen ......................................... 41
T-Zellstimulation ......................................................................................................... 42
V
Inhaltsverzeichnis
2.2.2.1
2.2.2.2
2.2.2.3
2.2.2.4
2.2.2.5
2.2.3
Proteinkonzentrationsbestimmung ............................................................................. 44
2.2.4
Bestimmung der Arginaseaktivität von humanem Eiter.............................................. 44
2.2.5
Durchflußzytometrie.................................................................................................... 45
2.2.5.1
2.2.5.2
2.2.5.3
2.2.6
Nachweis zytokinproduzierender Zellen mittels intrazellulärer FACSFärbung ....................................................................................................................... 45
Nachweis von filamentösem Aktin mittels intrazellulärer FITC-Phalloidin
FACS-Färbung .......................................................................................................... 46
Bestimmung des Kalziumflux ............................................................................... 47
Proliferationsmessung ................................................................................................ 47
2.2.6.1
2.2.6.2
2.2.7
Einbau von [3H]-Thymidin in die Zellen ............................................................. 47
Durchflußzytometrische Messung der zellulären Proliferation mittels
CFSE-Färbung .......................................................................................................... 48
Bestimmung der Zytokinproduktion ............................................................................ 49
2.2.7.1
2.2.8
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) .............................................. 49
Proteinbiochemie ........................................................................................................ 50
2.2.8.1
2.2.8.2
2.2.9
Western Blot .............................................................................................................. 50
Zweidimesionale Gelelektrophorese .................................................................. 51
Färben von Gelen ....................................................................................................... 54
2.2.9.1
2.2.9.2
2.2.9.3
3
Standardansatz ......................................................................................................... 42
Stimulation von T-Zellen mit anti-CD3/-CD28-gekoppelten Partikeln...... 42
Kurzzeitstimulation mit selbsthergestellten anti CD3/ anti-CD28gekoppelten Partikeln ............................................................................................. 42
Stimulation von T-Zellen mittels Antigenpräsentierender Zellen ............... 43
Stimulation von T-Zellen in Anwesenheit von humanem Eiter .................. 44
Silberfärbung ............................................................................................................. 54
Fluoreszenz-Färbung mit SYPRO®Ruby .......................................................... 54
Colloidal Coomassie-Färbung .............................................................................. 54
2.2.10
Protein-Sequenzierung und Massenspektrometrie................................................ 55
2.2.11
Messung der immunologischen Synapse .............................................................. 55
2.2.12
Migrationsassay ..................................................................................................... 56
2.2.13
Statistische Auswertung ......................................................................................... 56
ERGEBNISSE ......................................................................................................................... 57
3.1 HEMMUNG DER T-ZELLPROLIFERATION BEI ARGININDEFIZIENZ ............................................. 57
3.2 ETABLIERUNG DER 2D-GELELEKTROPHORESE .................................................................... 58
3.3 IDENTIFIZIERUNG VERÄNDERTER PROTEINEXPRESSIONEN IN STIMULIERTEN T-ZELLEN BEI
ARGININDEFIZIENZ ............................................................................................................. 61
3.4 VERGLEICH DER T-ZELLPROLIFERATION BEI STIMULATION MIT ANTI-CD3 / -CD28 UND SEBBELADENEN RAJI B-ZELLEN ............................................................................................... 65
3.5 AUSBILDUNG DER IMMUNOLOGISCHEN SYNAPSE ZWISCHEN T-ZELLEN UND APZ .................. 67
3.6 EINFLUß VON ARGININ AUF DEN F-AKTINGEHALT AKTIVIERTER HUMANER T-LYMPHOZYTEN .. 70
3.7 EINFLUß VON ARGININ AUF DIE CHEMOTAXIS HUMANER T-LYMPHOZYTEN ............................. 73
3.8 REGULATION DER ZYTOKINSYNTHESE UND -SEKRETION IN HUMANEN T-ZELLEN BEI
STIMULATION IN ARGININFREIEM MEDIUM ............................................................................ 75
VI
Inhaltsverzeichnis
3.9 WEITERE ZYTOKINE ........................................................................................................... 85
3.10 UNTERSUCHUNG DER FRÜHEN SIGNALTRANSDUKTION IN HUMANEN T-ZELLEN IN
ABHÄNGIGKEIT VON ARGININ .............................................................................................. 90
3.10.1
Arginin-unabhängige Phosphorylierung von ERK1/2 und Akt bzw.
Dephosphorylierung von Cofilin bei Kurzzeitstimulation humaner T-Zellen.......... 91
3.10.2
Signaltransduktion über Kalzium bei Arginindefizienz ........................................... 94
3.11 REGULATION VON COFILIN, ERK UND AKT BEI ARGININDEPLETION DURCH PMN-ARGINASE AUS
HUMANEM EITER
4
............................................................................................................... 95
DISKUSSION .......................................................................................................................... 99
4.1 VERÄNDERUNG DES PROTEIN-EXPRESSIONSMUSTERS AKTIVIERTER, HUMANEN TLYMPHOZYTEN BEI ARGININDEFIZIENZ ................................................................................ 99
4.2 EINFLUSS VON ARGININMANGEL AUF DAS AKTIN-ZYTOSKELETT HUMANER T-ZELLEN NACH
APZ-BASIERTER STIMULATION ......................................................................................... 102
4.2.1
Beeinträchtigung der Ausbildung der IS durch Arginindefizienz .............................. 102
4.2.2
Keine Beeinträchtigung der Migration humaner T-Lymphozyten in Abhängigkeit von
Arginin....................................................................................................................... 103
4.3 EINFLUSS VON ARGININ AUF DIE ZYTOKINSYNTHESE UND -SEKRETION HUMANER T-ZELLEN. 104
4.3.1
Unterschiedliche Regulation der Zytokinsekretion ................................................... 104
4.4 KEIN EINFLUSS VON ARGININ AUF FRÜHE SIGNALTRANSDUKTIONS-EREIGNISSE IN PRIMÄREN
HUMANEN T-LYMPHOZYTEN ............................................................................................. 105
5
ANHANG ............................................................................................................................... 110
5.1 TABELLEN ....................................................................................................................... 110
6
LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................. 114
7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS............................................................................................. 126
8
DANKSAGUNG..................................................................................................................... 132
VII
Einleitung
1
Einleitung
1.1
Das Immunsystem
Das Immunsystem ist wesentlich für den Erhalt der Integrität des menschlichen
Organismus und schützt diesen vor ubiquitären Pathogenen wie Bakterien, Pilzen
oder Viren und maligne transformierten körpereigenen Zellen. Effektor-Zellen (wie
Makrophagen,
Lymphozyten
Immunsystems
erkennen
und
und
natürliche
eliminieren
Killerzellen
diese
und
(NK-Zellen))
verhindern
unseres
somit
Gewebeschädigungen. Eine wichtige Vorrausetzung dafür ist die Unterscheidung
zwischen
„körpereigenen“
und
„fremden“
Antigenen
durch
spezifische
Oberflächenrezeptoren (wie Toll-like Rezeptoren (TLR) und T-Zell-Rezeptoren (TZR)) der
Immunzellen.
Das Immunsystem ist ein komplexes Netzwerk aus verschiedenen Organen (wie Thymus,
Knochenmark, Milz und Lymphknoten), beweglichen Immunzellen und löslichen SerumBestandteilen. In der Milz, dem Thymus und dem Knochenmark findet die Bildung und
Reifung der Immunzellen statt; in den Lymphknoten hingegen werden diese vor allem
aktiviert. Man unterscheidet zwischen der innaten und der adaptiven Immunantwort, wobei
beide immunologischen Abwehrsysteme vielfältig miteinander interagieren. Innate
Immunantworten, v.a. durch Makrophagen, dendritische Zellen (DZ) und NK-Zellen
erfolgen in der Regel schnell nach Verletzung der Integrität des Organismus, z.B. im
Rahmen einer Infektion. Die innate Immunabwehr basiert z.T. auf unspezifischen
Aktivierungsmechanismen der beteiligten Immunzellen, allerdings wurden in den letzten
Jahren auch spezifische Rezeptor-Liganden-Interaktionen (z.B. via TLR) charakterisiert
(Takeda and Akira 2005).
Das angeborene Immunsystem stellt die erste Barriere nach einer Infektion mit einem
Pathogen dar. Die verantwortlichen Zellen dieses zellulären Abwehrmechanismus sind
Makrophagen und neutrophile Granulozyten. Das Pathogen wird über konservierte
Strukturen erkannt, die von Rezeptoren auf den Makrophagen gebunden werden. Der
Fremdkörper wird nun über Phagozytose aufgenommen und eliminiert. Makrophagen
lösen zusätzlich Entzündungs-Prozesse (Inflammation) aus, die weitere phagozytierende
Zellen wie neutrophile Granulozyten und Effektor-Moleküle zum Infektionsherd rekrutieren.
Bei der Einleitung dieser Immunantwort spielen DZ eine entscheidende Rolle als
Vermittler. Unreife DZs nehmen in der Peripherie Antigene auf, prozessieren diese und
1
Einleitung
präsentieren sie anschließend an spezielle Oberflächenmoleküle, den MHC (engl. major
histocompatibility complex), gebunden. Die aktivierten DZs wandern nun als reife
dendritische Zellen in die angrenzenden Lymphknoten. Im Falle einer spezifischen
Erkennung
des
präsentierten
antigenen
Peptidfragmentes
werden
interagierende
Lymphozyten aktiviert. Die aktivierten Lymphozyten wandern in das infizierte Gewebe ein,
um dort die Infektion zu eliminieren (Murphy et al. 2009). Die adaptive Immunantwort
benötigt etwa eine Woche, um nach klonaler Expansion der antigenspezifischen
Lymphozyten die Infektion zu beseitigen. Bis zu diesem Zeitpunkt wird die Infektion durch
das innate Immunsystem unter Kontrolle gehalten. Bei einer Re-Infektion kann das
adaptive Immunsystem bereits nach 4 h bis 96 h reagieren, da sich bei der Erst-Infektion
Gedächtniszellen gebildet haben. Bei der Immunabwehr wird des Weiteren zwischen
zellulärer und humoraler Antwort unterschieden. Humorale Bestandteile des innaten
Immunsystems sind vor allem Zytokine, Enzyme und das Komplementsystem,
wohingegen phagozytierende Zellen und NK-Zellen die zellulären Komponenten bilden.
Die adaptive humorale Immunität wird durch Antikörper, gebildet von B-Lymphozyten,
vermittelt und die zelluläre Antwort durch Subpopulationen der T-Lymphozyten.
1.2
Die adaptive Immunantwort
Die besonderen Merkmale des adaptiven Immunsystems sind seine Spezifität, Diversität
und die Vermittlung eines langfristigen Schutzes durch das immunologische Gedächtnis.
Neben antigen-präsentierenden Zellen (APZ) stellen zwei Gruppen von Zellen die
wesentlichen Elemente der adaptiven Immunantwort dar: T- und B-Lymphozyten. Die TLymphozyten gewährleisten hierbei die Zell-vermittelte Immunabwehr und unterstützen die
B-Lymphozyten. Die B-Lymphozyten selbst sind durch die Antikörper-Produktion für die
humorale Immunität verantwortlich. Diese Immunzellen besitzen jeweils einen spezifischen
Rezeptor mit einer hochvariablen Region, der bestimmte Oberflächenstrukturen eines
Moleküls (Epitope) erkennt. Die spezifische Erkennung der Antigene erfolgt bei B-Zellen
über membran-gebundene Antikörper, welche die wesentliche Komponente des B-ZellRezeptors (BZR) darstellen und bei T-Zellen durch den T-Zell-Rezeptor (TZR). Die sehr
große
Anzahl
individuell
unterschiedlicher
Lymphozyten
wird
über
somatische
Rekombinationen gewährleistet, durch die jeder einzelne B- und T-Lymphozyt seinen
charakteristischen Antigen-spezifischen Rezeptor erhält. Jeder Lymphozyt kann somit nur
ein ganz bestimmtes Antigen erkennen (Schlüssel-Schloss-Prinzip). Nach adäquater
Stimulierung durch eine APZ tritt der T-Lymphozyt in den Zellzyklus ein. Diese klonale
Vermehrung garantiert eine adäquate und ausreichend starke Immunantwort auf eine
2
Einleitung
bestimmte
Infektion.
B-Lymphozyten
differenzieren
zu
antikörper-produzierenden
Plasmazellen. Die durch die Plasmazellen gebildeten Antikörper können Strukturen wie
z.B. Infektionserreger oder Tumorzellen binden und dadurch entweder direkt inhibieren
oder für die Lyse durch das Komplementsystem bzw. zur Phagozytose durch Fresszellen
markieren. Die Aktivierung der B-Zellen über ein Antigen reicht jedoch meist nicht aus, um
eine somatische Hypermutation und den Isotyp-Klassenwechsel (z.B. von IgM zu IgG)
hervorzurufen und somit eine hoch-affine humorale Immunantwort auszulösen. Hierzu
werden Signale der unterstützenden CD4+ T-Helferzellen (TH-Zellen), einer Untergruppe
der T-Lymphozyten, benötigt. Ohne die zusätzlich stimulierenden Signale, vermittelt durch
Zytokine
der
T-Zellen,
T-Zellen
bestehen
aus
werden
die
B-Lymphozyten
verschiedenen
nicht
Subpopulationen
vollständig
mit
aktiviert.
unterschiedlichen
aktivierungsabhängigen Effektorfunktionen. Ein Teil dieser T-Lymphozyten aktiviert z.B.
Makrophagen und regt B-Zellen zur Antikörper-Produktion an, eine andere Subpopulation
spielt bei der Bekämpfung von intrazellulären Bakterien und Viren eine bedeutende Rolle
(Murphy et al. 2009). Sobald eine Infektion mit Hilfe des adaptiven Immunsystems
beseitigt wurde, sterben die Zellen durch einen programmierten Zelltod (Apoptose). Die
apoptotischen Zellen werden durch Makrophagen aufgenommen und eliminiert. Aus
einigen Effektor-Zellen entstehen jedoch schon während der adaptiven Immunantwort Tbzw. B-Gedächtnis-Zellen. Das immunologische Gedächtnis sorgt in der Regel für einen
langfristigen Schutz vor einer Reinfektion mit dem gleichen Krankheitserreger. Bei einer
erneuten Interaktion mit dem entsprechenden Antigen erfolgt eine viel schnellere und
effektivere sekundäre Immunantwort (Murphy et al. 2009).
1.3
Die T-Zell-vermittelte Immunantwort
Reife naive T-Lymphozyten patrouillieren ständig zwischen den peripheren Lymphorganen
und dem Blut hin und her, bis sie ihrem spezifischen Antigen begegnen, welches sich auf
der Oberfläche von APZ, in Form eines Peptid:MHC-Komplexes befindet. So wird die TZelle über Wechselwirkung des TZR in Assoziation mit Ko-Rezeptoren mit dem
Peptid:MHC-Komplex der APZ aktiviert und differenziert zu einer T-Effektor-Zelle mit
Akquisition neuer Funktionen. T-Zellen mit einem CD4-Korezeptor werden als THelferzellen (TH-Zellen) oder CD4+ T-Zellen bezeichnet, erkennen Antigene, die auf MHCKlasse-II-Molekülen präsentiert werden und vermitteln die Aktivierung von anderen
Leukozyten. T-Zellen, welche den Korezeptor CD8 exprimieren werden als CD8+ T-Zellen
oder zytotoxische T-Zellen bezeichnet, erkennen antigene Peptide im Kontext von MHCKlasse-I-Komplexen und fungieren selbst als Effektor-Zellen, indem sie z. B. virusinfizierte
3
Einleitung
Zellen abtöten. MHC-I wird auf allen kernhaltigen Körperzellen exprimiert und präsentiert
v.a. Peptide aus intrazytoplasmatischen Proteinen.
Nach Aktivierung einer naiven TH-Zelle kommt es nicht nur zu einer klonalen Proliferation,
sondern, je nach Zytokinmilieu im Rahmen der Aktivierung, zu einer Differenzierung in
bestimmte TH-Effektorzell-Phänotypen. Im murinen System wurde z.B. eine dichotome
Differenzierung in sogenannte T Helfer 1 (TH1) bzw. T Helfer 2 (TH2) T-Zellen gut
charakterisiert. TH1-Zellen produzieren vor allem Interferon-γ und IL-2, aktivieren infizierte
Makrophagen und unterstützen B-Zellen bei ihrer Antikörper-Produktion, wohingegen TH2Zellen die Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 produzieren und B-Zellen speziell beim AntikörperIsotypenwechsel zu IgE unterstützen. Eine weitere Untergruppe der TH-Zellen sind die
TH17-Zellen, die IL-17 produzieren und z.B. wesentlich an autoimmuner Inflammation
beteiligt sind. Weiterhin sind verschiedene Subpopulationen regulatorischer T-Zellen (TH3,
TR1, Treg-Zellen) charakterisiert worden, welche über supprimierende Zytokine (z.B. IL-10
und TGF-ß) oder zelluläre Interaktionen die sich entwickelnde oder bereits etablierte TZell-Antwort
supprimieren
können.
Sie
sind
wichtig
für
die
Begrenzung
von
Immunantworten und die Inhibition von Autoimmunreaktionen. Insgesamt gilt allerdings für
alle diese unterschiedlichen T-Zell-Subpopulationen, dass ihre Charakterisierung im
Mausmodell wesentlich klarer ist als beim Menschen.
Um mit den seltenen spezifischen APZ in Kontakt zu kommen, müssen die Lymphozyten
vom Blut in die lymphatischen Organe gelangen. Nach Aktivierung müssen die T-Zellen
wieder aus dem lymphatischen Gewebe durch das vaskuläre Endothel transmigrieren und
in das inflammatorische Gewebe einwandern. Dies geschieht über mehrere Schritte:
Durch die niedrig affine Bindung von Selektinen auf der Oberfläche der Lymphozyten an
das Gefäß-Endothel verlangsamen sich die Zellen und rollen somit an der Gefäßwand
entlang. Die darauffolgende lokale Produktion von Zytokinen wie TNF−α durch die TLymphozyten führt einerseits durch positive Rückkopplung zu einer vermehrten ZytokinProduktion und andererseits zu einer verstärkten Expression von Adhäsionsmolekülen wie
ICAM-1 und VCAM-1 auf den Endothelzellen. Des Weiteren produzieren und sezernieren
die Zellen des Endothels spezifische Chemokine (z.B. SDF-1, IL-8), deren Bindung an die
entsprechenden Rezeptoren auf der T-Zell-Oberfläche zu einer Aktivierung von Integrinen
wie LFA-1 führt. LFA-1 auf T-Zellen tritt mit ICAM-1 auf dem Gefäß-Endothel in
Wechselwirkung, wodurch eine hoch-affine Bindung zwischen den Zellen entsteht. In der
Folge können die T-Zellen durch Zellzwischenräume des Endothels migrieren und
gelangen in das Gewebe (Diapedese) (Murphy et al. 2009, Wittchen 2009). Während
dieses Prozesses ist es für die Zelle essentiell, die dafür benötigten Proteine (z. B.
4
Einleitung
Adhäsions-Moleküle, Chemokin-Rezeptoren) an die Kontaktstelle zur Gefäßwand zu
rekrutieren und ihre Morphologie zu verändern. Dies wird durch ein flexibles Zytoskelett in
der Zelle gewährleistet, das sich bei der Transmigration so umverteilt, dass ein vorderer
und ein hinterer Teil entstehen. Der vordere Teil (Zellfront oder engl. „leading edge“) ist mit
Chemokin-Rezeptoren und Adhäsionsmolekülen angereichert und der Hauptanteil des
Aktin-Zytoskeletts ist dort lokalisiert, wo die Zelle sich nach vorne bewegt. Der hintere Teil
(Uropod) der Zelle, in dem sich Zytoskelett-Elemente und Membran-Ankerproteine der
Ezrin-Radixin-Moesin–Proteinfamilie befinden, wandert nach. Im Gewebe bewegen sich
die T-Zellen amöboid vorwärts, d.h. sie bilden aktin-reiche Ausstülpungen, Pseudopodien,
an der Zellfront, nicht aber am Uropod. Der hintere Teil der Zellen wird durch
Kontraktionskräfte nachgezogen. Während der Interaktion mit der „richtigen“ APZ, zieht
der Lymphozyt den Uropod ein und bildet Pseudopodien aus, um einen engen Kontakt
herzustellen. Diese Verbindung resultiert in der Ausbildung einer aktin-reichen
Kontaktzone in der sich hoch-organisierte Proteincluster (z.B. TZR-Cluster) bilden, die für
die Aktivierung und Funktion der T-Zellen essentiell sind (Burkhardt et al. 2008).
1.4
Die Immunologische Synapse
Während der Aktivierung von T-Zellen kommt es in der Kontaktzone zwischen Lymphozyt
und APZ zur Ausbildung einer komplexen Struktur. Analog zu neuronalen Synapsen wurde
diese Struktur als reife Immunologische Synapse (IS) bezeichnet. Sie ist in zwei Bereiche
unterteilt: eine Zentralregion, die den inneren Aktivierungsbereich cSMAC (engl. central
supramolecular activation cluster) bildet, in dem sich T-Zell-Rezeptoren sowie assoziierte
Ko-Rezeptoren wie CD2 und Signal-Moleküle anreichern und einen peripheren
Adhäsionsring pSMAC (engl. peripheral SMAC), in dem LFA-1 und der Membran-Anker
Talin lokalisiert sind (Burkhardt et al. 2008, Smith-Garvin et al. 2009). Die Ausbildung einer
IS geht gleichzeitig einher mit einer drastischen morphologischen Veränderung und der
Polarisation der Zelle zur Kontaktzone hin. Durch diese Reorganisation des AktinZytoskeletts entsteht eine stabile und enge Verbindung. Dies führt auch zu einer
Umstrukturierung des Mikrotubuli-Organisationszentrums (MTOC, engl. microtubuleorganizing center), von dem sich das Gerüst der Mikrotubuli und des Golgi-Apparats bildet,
durch das die meisten Proteine wandern, die freigesetzt werden sollen. Nur so kann eine
gezielte
Übertragung
von
Signal-Molekülen
erfolgen.
Bei
der
Interaktion
einer
zytotoxischen T-Zelle mit ihrer Zielzelle können somit z.B. die zytotoxischen Granula
5
Einleitung
gezielt an der Kontaktstelle freigesetzt werden. Die IS kann einige Sekunden bis hin zu
mehreren Stunden bestehen. Kurze Verbindungen sind von Vorteil, da dies den T-Zellen
erlaubt, in ihrem Umfeld nach der der jeweiligen relevanten Peptidantigen-präsentierenden
Zelle zu suchen. Eine länger andauernde IS ist wichtig für die Reifung und Poliferation von
naiven T-Zellen und für das Töten von Zielzellen durch zytotoxische T-Zellen. In den
letzten Jahren wurde deutlich, dass nicht nur eine Art der IS existiert, sondern die
unterschiedlichen Strukturen qualitativ und quantitativ variieren (Kummerow et al. 2009).
1.5
T-Zell-Aktivierung
1.5.1
Der T-Zell-Rezeptor-Komplex und Signaltransduktion nach AntigenErkennung
Der T-Zell-Rezeptor ist ein Heterodimer und besteht aus zwei Transmembranglykoproteinketten, die man als α- und β-Kette bezeichnet (einige wenige T-Zellen
exprimieren strukturähnliche γ- und δ-Polypeptidketten). Jede dieser Ketten besitzt einen
variablen und einen konstanten Anteil, wobei die variablen Domänen zusammen die
Bindungsstelle für ein spezifisches Antigen bilden. Der variable, extrazelluläre Anteil ist bei
jeder Zelle individuell und für die hohe Spezifität der Zellen verantwortlich. Durch den TZR
alleine kann jedoch kein Signal in die Zelle weitergeleitet werden, da dessen
zytoplasmatische Enden zu kurz sind. Für die Signalweiterleitung ist der CD3-Komplex
zuständig, der aus den Proteinketten CD3γ, CD3δ und CD3ε besteht sowie der
homodimeren ζ-Kette. Der funktionsfähige TZR ist mit dem CD3-Komplex und den ζKetten
assoziiert
und
wird
als
T-Zell-Rezeptor-Komplex
bezeichnet.
Alle
CD3-
Proteinketten und die ζ-Kette enthalten ein ähnliches Signal-Motif, das sogenannte ITAM
(engl. immunoreceptor tyrosin-based activation motif). Wird der TZR über antigenspezifische Bindung mit seinem Ko-Rezeptor CD4 oder CD8 assoziiert, werden die ITAMSequenzen an ihren Tyrosinresten durch zwei Proteintyrosinkinasen der Src-Familie, Lck
(Korezeptor-assoziiert) und Fyn (TZR-assoziiert) phosphoryliert (Borst et al. 1984, Reth
1989, Smith-Garvin et al. 2009, Murphy et al 2009). An die phosphorylierten ITAMs der ζPolypeptid-Ketten bindet eine weitere Tyrosinkinase, ZAP-70 (ζ-Assoziiertes Protein von
70 kDa), die für die folgende Signalübertragung verantwortlich ist (Weiss and Littman
1994). Daraufhin wird ZAP-70 von Lck phosphoryliert und aktiviert. Diesem Schritt folgt die
Phosphorylierung der Adapterproteine LAT (eng. linker for activation of T cells) und SLP-
6
Einleitung
76 (engl. SH2 domain containing lymphocyte protein of 76 kDa). Die Adapterproteine
besitzen selbst keine enzymatische Funktion, können aber mit ihren SH2-Bindedomänen
zusätzliche Signalmoleküle an die Plasmamembran rekrutieren und somit weitere
Ereignisse stromabwärts initiieren. Hierzu gehören u.a. Aktin-Polymerisation, Induktion von
Calcium-Flux, Aktivierung von Ras und eine veränderte Transkription (Finco et al. 1998,
Samelson 2002). Das Enzym Phospholipase C-γ (PLC-γ) ist eines dieser Signalmoleküle.
Sie spaltet Phospatidylinositolbisphosphat (PIP2), einen Bestandteil der inneren Schicht
der Plasmamembran und erzeugt dabei zwei wichtige Signalmoleküle, Inositol-1,4,5triphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG). Die Aktivierung der PLC-γ führt über mehrere
Signalwege zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und letztendlich zur Produktion von
Zytokinen (s. Abb.1.5.1) (Germain 2001, Murphy et al. 2009, Smith-Garvin et al. 2009).
Initiation TZR-vermittelter
Signale
Biochemische
Zwischenprodukte
Enzyme der
Signaltransduktion
Transkriptionsfaktoren
Abb.1.5.1: Intrazelluläre Signaltransduktion während der T-Zell-Aktivierung. Die Bindung von TZR und
Ko-Rezeptoren an die MHC-Komplexe auf der APZ initiiert die proximale Signaltransduktion, die zur
Phosphorylierung der ζ-Kette, Bindung und Aktivierung von ZAP-70, Phosphorylierung von Adapterproteinen
und Aktivierung zahlreicher zellulärer Enzyme führt. Diese Enzyme aktivieren wiederum
7
Einleitung
Transkriptionsfaktoren, welche die Expression verschiedener Gene stimulieren, die in die T-Zell-Immunantwort
involviert sind (modifiziert nach (Murphy et al 2009).
1.5.2
Kostimulation
Die Signalgebung, die bei Erkennung eines spezifischen Antigens über den TZR-Komplex
(Signal 1) erfolgt, reicht alleine nicht aus, um die Aktivierung naiver T-Zellen auszulösen.
Hierzu wird ein weiteres Signal (Signal 2) über Wechselwirkung eines kostimulatorischen
Rezeptors, z.B. CD28 auf der T-Zelle, mit seinen Liganden, z.B. CD80 und CD86 auf den
APZ benötigt. Somit wird sichergestellt, dass nur „professionelle“ APZ mit passendem
Peptid:MHC-Komplex und gebundenem Ligand, naive T-Zellen aktivieren können. CD28vermittelte Signale unterstützen die T-Zell-Proliferation, Zytokinproduktion und das
Überleben der Zellen. Fehlt das kostimulatorische Signal 2, gehen die T-Lymphozyten in
einen Zustand der Anergie über oder werden apoptotisch (Acuto and Michel 2003, Boise
et al. 1995, Harding et al. 1992, Murphy et al 2009, Mueller et al. 1989, Radvanyi et al.
1996).
Durch
die
zytoplasmatischer
Ligandenbindung
Domäne
an
CD28
phosphoryliert.
werden
Dies
führt
Tyrosinreste
zur
in
dessen
Aktivierung
der
Phospatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und des Adapterproteins Grb2 (engl. growth factor
receptor bound protein 2). PI3K wiederum aktiviert, durch Phosphorylierung von PIP2, die
Serin/Threonin-Kinase Akt (= Proteinkinase B, PKB), welche durch konsekutive
Phosphorylierung verschiedener Substrate zahlreiche Zellantworten reguliert. Über
Aktivierung von Akt wird u.a. der Transkriptionsfaktor NF-κB aktiviert, der zur Expression
anti-apoptotischer Proteine (z.B. Bcl-XL) führt und die Expression der IL-2 mRNA verstärkt
(Acuto and Michel 2003, Boise et al. 1995). Auch die Aktivierung des MAP-KinaseSignalwegs über Grb2 kann zu einer erhöhten IL-2-Produktion führen, wodurch die T-ZellProliferation stimuliert wird. Eine Kostimulation über CD28 verstärkt das TZR-Signal auch
bei niedrig-affiner Peptid:MHC-Wechselwirkung und unterstützt durch Aktivierung der
Transkriptionsfaktoren NF-κB und Ap-1 die Produktion von IL-2 (Kane et al. 2002, Wingren
et al. 1995). Ein weiterer gut charakterisierter, auf T- und NK-Zellen exprimierter
kostimulatorischer Rezeptor ist das zur Immunglobulin-Superfamilie gehörende CD2Protein (Meuer et al. 1984, Moingeon et al. 1989, Selvaraj et al. 1987). Eine Bindung an
den entsprechenden APZ-Liganden CD58 (LFA-3, engl. leucocyte function associated
antigen 3) verstärkt die T-Zell-Aktivierung (Meuer et al. 1984, Moingeon et al. 1989) und
erleichtert die Adhäsion und Interaktion von T-Zellen und APZ (Davis and van der Merwe
1996). Wird die Bindung von CD58 an CD2 durch Antikörper blockiert, wird die Bildung der
Immunologischen Synapse inhibiert. Bemerkenswert ist, dass unter gleichzeitiger
8
Einleitung
Verwendung dreier verschiedener Antikörper gegen CD2 eine vollständige T-ZellAktivierung, ohne das TZR-Signal (alternativer Weg der T-Zell-Aktivierung), ausgelöst
werden kann (Meuer et al. 1984).
Eine Kostimulation über CD2 oder CD28 führt über die Aktivierung des Aktin-bindenden
Proteins Cofilin zur Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Samstag and Nebl 2005). Dies
ist entscheidend für eine vollständige T-Zell-Stimulation, da hierdurch die Signalproteine
und Rezeptoren (wie CD2 und CD28) während eines Kontakts zwischen T-Zelle und APZ
zusammen mit dem TZR an der IS angereichert werden und die IS im weiteren Verlauf der
für die vollständige T-Zell-Aktivierung protrahierten Interaktion zwischen T-Zelle und APZ
stabilisiert wird (Burkhardt et al. 2008, Samstag et al. 2003).
Weitere Ko-Rezeptoren der Immunglobulin-Superfamilie sind CTLA-4 (engl. cytotoxic
lymphocyte antigen 4) und PD-1 (engl. programmed death 1), die im Gegensatz zu CD28
oder CD2 eine inhibierende Wirkung auf die T-Zell-Stimulation ausüben. Diese Rezeptoren
sind wichtig für die Regulation der Immunantwort
(Smith-Garvin et al. 2009). Die
Bedeutung der negativ-regulatorischen Funktion von CTLA-4 zeigt sich bei CTLA-4defizienten Mäusen, die ein letales lymphoproliferatives Syndrom entwickeln (Waterhouse
et al 1995).
1.6
Das Aktin-Zytoskelett
Das Zytoskelett der T-Zelle ordnet sich abhängig von Prozessen wie Zirkulation, Migration
und T-Zellaktivierung, ständig neu an und spielt daher eine entscheidende Rolle im
Rahmen von Immunantworten. Die Bestandteile des T-Zell-Zytoskeletts sind AktinFilamente, Mikrotubuli und Intermediär-Filamente. Das Aktin-Zytoskelett reguliert die
Zellmorphologie, ist an intrazellulären Transport- und Signalprozessen beteiligt und
ermöglicht die Zellfortbewegung. Bei jeder Zellpolarisation werden Aktin-Filamente auf
einer Seite der Zelle abgebaut und auf einer anderen Seite aufgebaut. Im Folgenden
werden die Schritte dieses Kreislaufs und der daran beteiligten Proteine beschrieben
(Mullins et al. 1998, Pollard et al. 2000, Samstag et al. 2003).
Aktin ist eines der am stärksten exprimierten Proteine in eukaryotischen Zellen und hat ein
Molekulargewicht von 43 kDa. Es liegt in der Zelle, entweder an ATP- oder ADP-gebunden
als globuläres Monomer (G-Aktin) oder als filamentöses Polymer (F-Aktin) vor. Jedes
Aktin-Filament besitzt ein schnell wachsendes Plus-Ende und ein langsamer wachsendes
9
Einleitung
Minus-Ende. Das Filament-Wachstum (Polymerisation) wird unter anderem durch
Kontrolle der G-Aktin-Konzentration gesteuert. In der Zelle liegt ATP-gebundenes G-Aktin
als großer Vorrat, an die Proteine Thymosin-ß4 und Profilin gebunden, vor. Der G-AktinThymosin-ß4-Komplex
dient
als
reiner
Monomer-Speicher,
wohingegen
Profilin-
gebundenes Aktin an das wachsende Plus-Ende bestehender Filamente angelagert
werden kann (Gomez-Marquez et al. 1989, Hartwig et al. 1989, Samstag et al. 2003).
Beide Proteine haben eine höhere Affinität zu ATP-Aktin als zu ADP-Aktin. Da Profilin
durch Anlagerung von ATP-G-Aktin an Aktin-Filamente ohne Stimuli die Polymerisation
auslösen kann, müssen die Plus-Enden durch sogenannte Capping-Proteine (CapZ,
Gelsolin) geschützt werden (DiNubile et al. 1995).
Abb.1.6: Der dynamische Aktin-Kreislauf. Bei diesem Kreislauf sind die wichtigsten Schritte bei der
Aktinpolymerisation und Depolymerisation mit den beteiligten Aktin-bindenden Proteinen (in grauer Schrift)
aufgezeigt. ATP-gebundenes Aktin wird durch dunkle Moleküle symbolisiert, die ADP-gebundenen Moleküle
älterer F-Aktinfilamente sind hell dargestellt. Das + Zeichen ist einmal dargestellt, um das schnell wachsende
Ende zu kennzeichnen (Modifiziert nach Samstag, 2003). Eine detailierte Beschreibung des Aktin-Kreislauf
befindet sich im Text.
10
Einleitung
Zur Generierung neuer Aktin-Filamente (Nukleation) wird ein aus 7 Untereinheiten
bestehender Protein-Komplex benötigt, der sogenannte Arp2/3-Komplex (engl. actin
related proteins) (Machesky et al 1994, Svitkina et al 1999). Initiiert wird die Nukleation
durch Bindung des WASP (engl. Wiskott Aldrich Syndrom Protein) an den Arp2/3Komplex, der dadurch aktiviert wird. Die folgende Polymerisation läuft spontan ab, wobei
profilingebundene Aktin-Monomere mit dem WASP/Arp2/3-Komplex assoziieren. Dies
führt zu einer Aktin-Polymerisation, die durch Anlagern von Capping-Proteinen an die
freien Plus-Enden wieder gestoppt wird. Eine weitere Verlängerung (Elongation) der
Filamente kann nur dann erfolgen, wenn die Capping-Proteine durch geeignete Stimuli
entfernt oder die F-Aktin-Stränge geschnitten werden und somit wieder freie Plus-Enden
zur Verfügung stehen. Letzterer Mechanismus wird durch das Aktin-bindende Protein
Cofilin vermittelt. Beim Schneiden eines F-Aktin-Strangs entstehen mehrere kürzere AktinFilamente mit freien Plus-Enden, wodurch es erneut zu einer verstärkten Polymerisation
kommen kann. Cofilin kann F-Aktin jedoch auch depolymerisieren, in dem es die zu ADP
hydrolysierten und somit markierten, älteren Monomere am Minus-Ende abbaut und in den
G-Aktin Vorrat entlässt (Chan et al. 2000, Du and Frieden 1998, Ichetovkin et al. 2002,
Samstag et al. 2003). Die (ADP)-G-Aktin-Monomere werden durch Bindung von Profilin
erneut zu (ATP)-G-Aktin/Profilin-Komplexen, die wieder für die Nukleation bereitstehen.
Profilin konkurriert mit Thymosin-ß4 um (ATP)-G-Aktin und kann dieses aus dem
Thymosin-ß4/Aktin-Komplex lösen und an den freien Plus-Enden anhängen (s. Abb.1.6)
(Pantaloni and Carlier 1993, Pollard and Cooper 1986). Aktin-Filamente bilden ein dichtes
Netzwerk an zytoskelettalem Aktin. Wasp/Arp2/3-Komplexe können die Nukleation auch
an den Seiten bestehender F-Aktin-Stränge auslösen, so dass Filament-Verzweigungen
mit einem Winkel von 70°C und folgend ganze Netzwerke entstehen können.
Aktinbündelnde Proteine wie Plastin, Fascrin und α-Actinin können parallel Bündel von
Aktin-Filamenten erzeugen, wobei α-Actinin die Filamente auch quervernetzen kann
(Samstag et al. 2003).
Eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts ist u. a. bei der T-Zell-Aktivierung für die
Ausbildung der IS erforderlich. Im Folgenden wird beschrieben, in welcher Weise das
Aktin-Zytoskelett durch T-Zell-Aktivierung verändert wird und welche Proteine bei dieser
Signaltransduktion involviert sind. Bei Aktivierung bindet Vav, ein Guanin-NukleotidAustauschfaktor,
an
das
Adapterprotein
SLP76
und
wird
anschließend,
über
Phosphorylierung durch ZAP-70 und Fyn, aktiviert (Fischer et al. 1998a, Valensin et al.
2002). Die Aktivierung von Vav führt wiederum zur Regulation und Aktivierung von G-
11
Einleitung
Proteinen der Ras-Superfamilie wie Rac1, Rho und Cdc42, die über das Aktin-Zytoskelett
die
Zellmorphologie
beeinflussen.
Rac1
und
Cdc42
induzieren
neue
Aktin-
Polymerisationen an der Zellfront, wobei sich Membran-Ausstülpungen (Lamellipodien)
und größere filopodienartige Ausstülpungen bilden, während Rho die Ausbildung von
Stressfasern reguliert (Fischer et al. 1998b). Cdc42 aktiviert außerdem den Arp2/3Komplex (Kenney et al. 1986, Rivero-Lezcano et al. 1995). Dies geschieht über WASP,
das in unstimulierten Zellen durch eine cis- oder trans-Bindung zweier eigener Regionen in
einem inaktivem Zustand gehalten wird, und über Bindung an das Adaptorprotein Nck an
die Membran rekrutiert wird. Dort löst Cdc42 die Auto-Inhibition, wodurch der Arp2/3Komplex an der Zellmembran nahe des TZR aktiviert wird und somit für eine gerichtete
Aktin-Polymerisation sorgt (Cannon et al. 2001, Kim et al. 2000, Rohatgi et al. 2000). Die
dabei entstehenden Filamente werden über Membran-Ankerproteine wie Talin und
Vasculin, an der Plasmamembran befestigt. Diese Membran-Anker binden auch an das
bereits erwähnte Vav (Fischer et al. 1998b). Wenn die Reorganisation des AktinZytoskeletts durch Cytochalasin B, welches zur Aktin-Depolymersiation führt, gestört wird,
kann sich keine Immunologische Synapse ausbilden (Cooper 1987).
1.7
Arginase:
Ein
Enzym
des
Harnstoffzyklus
und
der
Immunregulation
Die Arginase ist ein hydrolytisches Enzym, welches für die Verstoffwechslung von LArginin, einer semiessentiellen Aminosäure, zu Ornithin und Harnstoff verantwortlich ist.
Das in Prokaryonten und Eukaryonten exprimierte Enzym liegt zumeist als trimerer
Komplex aus identischen Untereinheiten vor. Im katalytischen Zentrum jeder Untereinheit
befinden sich zwei Mangan-Ionen (Kanyo et al. 1996). Beim Menschen existieren zwei
Isoenzym-Varianten, die zu 58% in ihrer Sequenz übereinstimmen und dieselbe
biochemische Reaktion katalysieren. Sie unterscheiden sich jedoch in ihrer zellulären
Expression, Regulation und subzellulärer Lokalisation. Eine der Isoformen ist die
zytosolisch gelegene Arginase I (L-Arginin Ureahydrolase), welche im hepatischen
Harnstoffzyklus eine wichtige Rolle spielt, indem sie an der Detoxifikation des
entstehenden Proteinabbauprodukts Ammoniak beteiligt ist (Abb. 1). Die zweite Isoform
Arginase II kommt in Mitochondrien vor, und wird vor allem in extrahepatischen Geweben
wie Gehirn, Niere, Prostata und Dünndarm exprimiert. Das durch Verstoffwechselung von
L-Arginin entstehende Ornithin ist an einer Vielzahl von Stoffwechselwegen beteiligt.
12
Einleitung
Einerseits kann Ornithin über das Enzym Ornithin Decarboxylase (ODC) weiter zu
Polyaminen wie Putrescin, Spermidin und Spermin, die in zahlreichen zellulären
Funktionen (z.B. Proliferation, Zelldifferenzierung) involviert sind, verstoffwechselt werden.
Andererseits kann das Enzym Ornithin-Aminotransferase (OAT) Ornithin in Prolin, einen
essentiellen Bestandteil des Kollagens, metabolisieren (Abb. 1.7.1).
Abb.1.7.1: Regulation und Folgeprodukte des Argininstoffwechsels in murinen Makrophagen.
Dargestellt sind wichtige Folgeprodukte, die bei der Verstoffwechslung von Arginin entstehen und die Enzyme
und Proteine, die diesen Vorgang induzieren. (iNOS: induzierbare Stickstoffmonoxydsynthase; NO:
Stickstoffmonoxyd; OAT: Ornithinaminotransferase; ODC: Ornithindecarboxylase).
Alternativ kann Arginin in einem weiteren Stoffwechselweg durch die StickstoffmonoxidSynthase (NOS) zu Stickstoffmonoxid (NO) und Citrullin metabolisiert werden (Bogdan
2001). Citrullin, ein weiteres Produkt der NOS, kann durch die Enzyme Argininosuccinat
Synthase (ASS) (DiNubile et al.) und Argininosuccinat Lyase (ASL) wiederum zu Arginin
synthetisiert werden (Morris et al. 2003) (Abb.1.7.2). Die Regulation der beiden Argininmetabolisierenden Enzyme Arginase und iNOS wird in murinen myeloischen Zellen durch
die T-Zell-Zytokinexpression gesteuert. Während die Expression der induzierbaren NOS
(iNOS) durch TH-1-Zytokine wie IFN-γ hochreguliert wird, erfolgt eine Induktion der
Arginase durch die TH-2-Zytokine IL-4, IL-10 und IL-13. Bei der NOS-vermittelten NOSynthese entsteht das Zwischenprodukt NG-Hydroxyl-L-Arginin (NOHA), das die ko-
13
Einleitung
exprimierte Makrophagen-Arginase inhibieren und dadurch die Menge des gemeinsamen
Substrates Arginin für die NO-Produktion steigern kann (Hecker et al. 1995).
Abb.1.7.2: Arginase als Teil des Harnstoffzyklus. ASL: Argininosuccinat Lyase; ASS: Argininosuccinat
Synthase. CPS: Carbamoylphosphat Synthase. OTC: Ornithin Transcarbamoylase
1.8
Die
Bedeutung
und
Funktion
der
Arginase
I
im
Immunsystem
Arginase I wird im murinen Immunsystem im Zytosol von Granulozyten, Makrophagen und
DZ induzierbar exprimiert (Munder et al. 1998; Munder et al. 1999). Die Expression der
Enzyme Arginase I und iNOS wird in Makrophagen über T-Zell-Zytokine dichotom reguliert
(s.1.7). Die Induktion von iNOS über TH1-Zytokine führt somit zur NO-vermittelten
Zytotoxizität und Aktivierung der zellulären Immunantwort, wohingegen die Induktion von
Arginase
über
TH2-Zytokine
an
Geweberegeneration,
Wundheilung
und
Fibrosierungsvorgängen beteiligt ist (Bronte and Zanovello 2005). In verschiedenen
murinen Krankheitsmodellen konnte die dichotome Regulation der beiden Argininverstoffwechselnden Enzyme mit dem Verlauf der Krankheit korreliert werden. Diese
Verbindung zeigte sich z.B. in Modellen der viralen Infektion (Mistry et al. 2001), der
14
Einleitung
Sepsis (Carraway et al. 1998), bei Asthma bronchiale (Meurs et al. 2002) und Tumoren
(Bronte et al. 2003b, Liu et al. 2003, Sinha et al. 2005).
Im Rahmen entzündlicher Aktivität zeigt sich die Funktion der Arginase in murinen
Makrophagen deutlich, da das Enzym durch Bakterienbestandteile wie Lipopolysaccharide
(LPS) und Lipoproteine induziert wird (Corraliza et al. 1995).
Das immunsuppressive Wirkprinzip der Arginase myeloischer Zellen wurde bereits vor
mehr als 30 Jahren beschrieben. Die Zugabe myeloischer Zellen aus dem Peritoneum von
Mäusen zu einer murinen gemischten Lymphozytenkultur supprimierte die Zytotoxizität der
murinen Milzzellen. Dies ging einher mit einer induzierten Expression von Arginase in den
Peritonealzellen/ Makrophagen und mit einer vollständigen Verstoffwechslung von Arginin
im Zellkulturmedium der supprimierten Lymphozytenkultur (Kung et al. 1977).
Im Menschen konnte das Arginase-Protein und dessen Aktivität in der mononukleären
(engl. peripheral blood mononuclear cell, PBMC) Zell-Fraktion chirurgischer Patienten
nach schweren Verletzungen nachgewiesen werden (Ochoa et al. 2001). Das Enzym
wurde u.a. auch in aktivierten Monozyten von Patienten mit Autoimmunerkrankungen
(Rouzaut et al. 1999), in Entzündungszellen der Bronchoalveolarflüssigkeit von
Asthmatikern (Zimmermann et al. 2003), sowie in der PBMC-Fraktion von Patienten mit
aktiver Lungentuberkulose nachgewiesen (Zea et al. 2006).
Munder et al. konnten erstmals zeigen, dass hohe Aktivitäten der hepatischen Isoform
Arginase
I
bereits
in
ruhenden,
humanen
neutrophilen
Granulozyten
(engl.
polymorphonuclear neutrophils, PMN) exprimiert werden (Munder et al. 2005). Im
Gegensatz zum murinen Immunsystem, konnte in humanen monozytären Zellen
(Makrophagen oder DZ) weder im unstimulierten noch im stimulierten Zustand, Arginase I
nachgewiesen werden. Die gemessene Arginase-Aktivität in humanen PMNs liegt im Mittel
bei 1600 mU/mg Protein und entspricht etwa der Aktivität in einer Leberzelle (Munder et al.
2005). Sehr hohe Arginase-Aktivitäten von ca. 40.000 mU/ml können auch in zellfreiem
Überstand aus humanem Eiter chirurgischer Patienten gemessen werden (Munder et al.
2006), wobei die im Rahmen der Eiterbildung zerfallenden humanen PMN als
wahrscheinliche Quelle der Arginase I angesehen werden.
15
Einleitung
1.9
Die Bedeutung der Arginase bei der Immunantwort gegen
Tumoren
Tumoren haben spezifische, sogenannte tumor immune escape Mechanismen entwickelt,
um
der
antitumoralen
Immunantwort
effektiv
zu
entgehen.
Hierbei
ist
die
Immunsuppression in der direkten Umgebung des Tumors von großer Bedeutung, von der
wesentlich auch infiltrierende T-Lymphozyten betroffen sind. Die Wechselwirkung
zwischen Leukozyten und Tumorzellen kann einerseits zur Zerstörung des Tumors führen,
andererseits aber auch zur Förderung des Tumorwachstums beitragen (Lewis and Pollard
2006). Regulatorische T-Zellen, die ins Mikromilieu des Tumors einwandern, können z. B.
die anti-tumorale Funktion infiltrierender zytotoxischer T-Zellen direkt hemmen (Curiel
2007). Weiterhin stellte sich die Einwanderung von Arginase-exprimierenden myeloischen
Zellen in das Tumorstroma als ein essentieller Bestandteil des tumor immune escape
heraus. In murinen Tumormodellen konnte eine gemischte Population myeloischer Zellen
verschiedener Entwicklungsstadien nachgewiesen werden. Diese Zellen sind durch die
Expression der Oberflächenmarker CD11b und Gr-1 charakterisiert und können eine
effektive Suppression von T-Zellfunktionen herbeiführen, weshalb sie auch als myeloische
Suppressor-Zellen
(myeloid-derived
suppressor
cells,
MDSC)
bezeichnet
werden
(Rodriguez and Ochoa 2008, Serafini et al. 2006a). Die myeloischen Suppressor-Zellen
exprimieren konstitutiv Arginase I und führen somit zu einer Arginin-Depletion im
Tumormikromilieu (Bronte et al. 2003a, Gallina et al. 2006, Rodriguez et al. 2004, Serafini
et al. 2006b). Humane Arginase-exprimierende myeloische Suppressor-Zellen konnten
u.a. in Patienten mit Nierenzellkarzinom als Zellen mit variabler Expression monozytärer
(CD14) oder granulozytärer (CD15) Marker charakterisiert werden. In Tumor-infiltrierenden
T-Lymphozyten führen sie durch Arginin-Depletion zu einer verminderten Expression der
TZR-ζ-Kette und somit einer Suppression der Immunantwort (Zea et al. 2005). Eine
Suppression von einwandernden T-Zellen ins Tumorstroma wurde ebenfalls bei Patienten
mit Nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom (Rodriguez et al. 2004), Prostatakarzinom
(Bronte et al. 2005) und Multiplem Myelom (Serafini et al. 2006b) beschrieben.
1.10
Suppression der Immunantwort bei Arginindefizienz
In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass die durch Arginase induzierte
Arginin-Depletion
ein
bedeutender
Mechanismus
der
Entzündungs-vermittelten
Immunsuppression ist. Ein Beispiel für eine Entzündungsreaktion, bei der Arginase zu
16
Einleitung
einer Hemmung der Immunantwort führt, ist Asthma (Zimmermann et al. 2003). Bei
Tiermodellen und Patienten mit Asthma bronchiale wurde in den Atemwegen eine erhöhte
Arginase-Aktivität sowie eine reduzierte Argininkonzentration festgestellt. Durch diese
reduzierte Argininkonzentration in der Lunge können nur noch geringe Mengen an NO
synthetisiert werden, da Arginin auch das Substrat für die NO-Synthase ist. Die lokale
Arginindepletion
führt
via
NO-Mangel
konsekutiv
zu
einer
Hemmung
der
Bronchialdilatation (Maarsingh et al. 2009, Ricciardolo et al. 2004). Zusätzlich kann die
erhöhte Arginase-Aktivität durch reduzierte NO-Produktion und vermehrter Synthese von
Ornithin über die Bildung von Kollagen und Prolin den fibrotischen Umbau der Lunge
fördern (Zimmermann and Rothenberg 2006).
Bakterien
und
Parasiten
haben
sich
den
Effekt
der
Argininverarmung
als
Überlebensstrategie zunutze gemacht, indem sie ihre eigene Arginase oder die des Wirtes
zur Depletion von L-Arginin verwenden (Vincendeau et al. 2003). Helicobacter pylori
besitzt z.B. ein Gen (rocF), welches für eine konstitutiv exprimierte Arginase codiert,
welche via Arginindepletion die Produktion von antibakteriellem NO durch die NOSynthase in Makrophagen inhibiert (Gobert et al. 2001). Bei einer persistierenden Infektion
mit Krankheitserregern wie z.B. Leishmanien, die bevorzugt Makrophagen befallen, kommt
es durch eine erhöhte Arginaseexpression und folgende Arginindepletion im Mikromilieu
des Infektionsherds zu einer lokalen Immunsuppression in vivo. Dies führt zu einer
verminderten T-Zell-Immunantwort in den Läsionen der Patienten und somit zu einer
reduzierten Bekämpfung des Parasiten, da die Wirtszellen aufgrund der induzierten
Überexpression von Arginase weniger toxisches NO produzieren können und mehr
Polyamine gebildet werden, welche die Proliferation des Parasiten fördern können (Bronte
and Zanovello 2005, Muller et al. 2008). Die Hemmung der Arginase sowie die Injektion
von Arginin hemmen diese Immunsuppression und resultieren in einer effizienteren
Kontrolle der Parasitenvermehrung (Modolell et al. 2009).
Im Verlauf granulozytärer Entzündungen kommt es zum nekrotischen Zellzerfall der früh in
das entzündete Gewebe eingewanderten humanen Granulozyten, bei der auch
intrazelluläre Bestandteile freiwerden, bevor die Eliminierung durch Makrophagen erfolgt.
Die hieraus resultierende lokale Verstoffwechselung der semiessentiellen Aminosäure
Arginin zu Ornithin führt zur Argininverarmung im Mikromilieu von T-Lymphozyten. Durch
den spezifischen Arginase-Inhibitor N-ω-Hydroxy-nor-L-Arginin (nor-NOHA) kann diese
Reaktion
vollständig
gehemmt
werden.
Ausschließlich
Arginin
ist
von
einem
enzymatischen Abbau durch intrazelluläre Granulozytenbestandteile betroffen, andere
Aminosäuren sind unbeeinträchtigt (Munder et al., 2006). T-Zellen, die in einem Arginin-
17
Einleitung
defizienten Milieu aktiviert werden, sind vollständig in ihrer Proliferation und partiell in
anderen Funktionen (z.B. Zytokinsekretion) gehemmt. Die Arbeitsgruppe Munder konnte
zeigen, dass bei Aktivierung von T-Lymphozyten in Argininmangelmedium, die Expression
der Aktivierungsmarker CD25 und HLA-DR vermindert und die Expression von CD69
verstärkt wird. Zusätzlich wird die Expression der TZR-ζ-Kette reduziert und die Synthese
des Zytokins IFN-γ signifikant gehemmt. Die Vitalität der Zellen ist in dem untersuchten
Aktivierungszeitraum von 48 h jedoch nicht beeinflusst. Der Defekt bei Argininmangel ist
vermutlich posttranskriptionell, da z.B. bei Suppression der IFN-γ-Synthese die mRNATranskriptmenge bei Fehlen von Arginin nicht reduziert ist. Bei Aktivierung der T-Zellen in
Zellkulturmedium, welches mit humanem zellfreiem Eiterüberstand präinkubiert wurde (ein
Modell für granulozytäre Inflammation in vivo) konnte durch die Arginase-induzierte
Arginindepletion eine vergleichbare T-Zell-Suppression beobachtet werden (Munder et al.
2006).
Erstmals wurde diese spezifische Rolle der Aminosäure Arginin für die T-Zell-Aktivierung
von der Arbeitsgruppe um Ochoa untersucht, die einen partiellen Verlust der TZR-ζ-Kette
in humanen T-Lymphozyten bei Fehlen von Arginin beschrieben (Rodriguez et al. 2002).
Weiterhin konnten sie zeigen, dass T-Zellen bei Argininabwesenheit in der G0-G1 Phase
des Zellzyklus verharren, einhergehend mit einer fehlenden Hochregulation der
Expression von Cyclin D3 und der Cyclin-abhängigen Kinase CDK4 (Rodriguez et al.
2007). Beim Menschen konnte bei Tumoren, Autoimmunität und chronischer Inflammation
eine unvollständige T-Zell-Aktivierung in Assoziation mit einem partiellen Verlust der TZRζ-Kette beschrieben werden (Baniyash 2004). Bestimmte Mikroorganismen scheinen
diesen Mechanismus der T-Zellsuppression durch Arginin-Defizienz als Abwehrstrategie
gegen das (humane) Immunsystem zu nutzen. So verursacht beispielsweise eine Infektion
mit Heliobacter pylori erhöhte Arginase-Spiegel mit konsekutivem Argininabbau. Dieser
korreliert mit einer verminderten Expression der TZR-ζ-Kette und somit einer ineffizienten
adaptiven Immunantwort sowohl in Jurkatzellen als auch in primären humanen TLymphozyten (Zabaleta et al. 2004). Der Argininmangel und die damit assoziierte
Hemmung der T-Zell-Immunantwort ist auch beteiligt an der Suppression mütterlicher antifetaler Immunantwort während einer Schwangerschaft. Dies verhindert möglicherweise
einen immunologisch vermittelten Abort in Versuchstieren (Weiner et al. 1996). Auch beim
Menschen konnte zum Zeitpunkt der Geburt eine höhere Aktivität des Arginase-Proteins
im peripheren Blut der Schwangeren sowie innerhalb der Plazenta nachgewiesen werden.
Während die plazentar exprimierte Arginase vermutlich für die Verfügbarkeit von
Polyaminen entscheidend ist, wird die Invasion von T-Lymphozyten über die lokale
18
Einleitung
Arginindepletion der von Granulozyten exprimierten Arginase unterdrückt (Kropf et al.
2007).
Ferner sind auch humane NK-Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Infektions- und
Tumorabwehr spielen und u. a. die Frühphase entzündlicher Reaktionen dominieren, bei
Argininmangel teilweise in ihrer Funktion supprimiert. Im Gegensatz zu den T-Zellen
reagieren diese jedoch deutlich weniger sensitiv auf Arginindefizienz (Proliferation: EC50
der NK-Zellen ca. 2 μM, EC50 der T-Zellen ca. 20 μM). Eine ungenügende Konzentration
der Aminosäure Arginin im Mikromilieu der NK-Zellen führt, analog zur T-Zell-Suppression,
zu
einem
nahezu
vollständigen
Proliferationsverlust
und
einer
Hemmung
der
Zytokinsynthese (Oberlies et al. 2009). Letzterer Defekt wird vergleichbar mit der
Suppression
der
T-Zell-Zytokine
(Munder
et
al.
2006)
auch
bei
NK-Zellen
posttranskriptionell reguliert (Oberlies et al. 2009). Die beeinträchtigte Proliferation und
Zytokinsythese humaner NK-Zellen bei Argininmangel stellen möglicherweise einen antiinflammatorischen Regulationsmechanismus gegen unkontrollierte NK-Zell-Aktivierung
und –Expansion dar (Oberlies et al. 2009).
1.11
Bekannte
Mechanismen
der
T-Zell-Suppression
bei
Aminosäuremangel
Um auf zellulären Stress wie Aminosäuredepletion reagieren zu können, haben einzellige
Eukaryonten einen Mechanismus, die sogenannte „general control response“, entwickelt.
Hierbei binden freie, d.h. nicht an Aminosäuren gebundene tRNA-Moleküle (welche
indirekt den Pool intrazellulärer Aminosäuren widerspiegeln) in eine Bindungstasche des
Proteins GCN2 Kinase. Dies führt zu einer Phosphorylierung und hierdurch bedingten
Aktivierung von GCN2 (pGCN2) sowie nachfolgend über eine Phosphorylierung der αUntereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors (eIF2-α) zu einer Hemmung von elF2B
und damit der Entstehung des 43S Pre-Initiations-Komplex (Met-tRNA, GTP, elF2) und in
der Folge zur Inhibierung der Translations-Initiation (s. Abb 1.11). Hierdurch wird die
zelluläre Protein-Synthese gehemmt, während die Transkription von Genen der
Aminosäure-Biosynthese verstärkt wird (Hinnebusch 1994). In Säugetierzellen werden
verschiedene elF2α-Kinasen (u.a. auch GCN2) exprimiert, die durch unterschiedliche
intrazelluläre Stressfaktoren aktiviert werden. Auch in humanen T-Lymphozyten kann die
Expression von GCN2 nachgewiesen werden. Bei T-Zellen, die in Abwesenheit von
Arginin in vitro stimuliert wurden, kann die phosphorylierte Form der GCN2-Kinase
19
Einleitung
detektiert werden. Dies deutet auf eine Beteiligung der GCN2-Kinase bei der Reaktion auf
Argininmangel hin (Oberlies et al. 2009).
Abb. 1.11: Prinzip der GCN2-Kinase-Regulation bei Aminosäuremangel. Bei Aminosäuremangel
entstehen unbeladene tRNAs und nachfolgend wird via Phosphorylierung der GCN2-Kinase und elF2α eine
Hemmung der Translationsinitiation vermittelt (s auch Text).
Bei Aminosäuremangel werden in verschiedenen Zelltypen weitere Transkriptionsfaktoren
wie ATF-2, ATF-4 und CHOP verstärkt exprimiert, sowie der mTOR (engl. mammalian
target of rapamycin)-p70S6Kinase-Signaltransduktionsweg inhibiert (Averous et al. 2004,
Rohde et al. 2001). Über Bindung an sogenannte AARE-Sequenzen (engl. amino acid
response element) im Promotor der Transkriptionsfaktoren kommt es zu deren Aktivierung
und in der Folge reagieren die Zellen mit einer Inhibierung des Zellzyklus auf einen
Aminosäuremangel (Averous et al. 2004). Ferner führt die IL-13-vermittelte Induktion der
Expression von Arginase I in murinen Makrophagen zu einer intra- und extrazellulären
Arginin-Depletion und nachfolgend zur Inhibierung der iNOS-Translation (El-Gayar et al.
2003). Auch in Astrozyten ist die Translation der iNOS bei Argininmangel gehemmt. Diese
Inhibierung wird durch Aktivierung der GCN2-Kinase mit konsekutiver Phosphorylierung
von elF2α vermittelt (Lee J. et al. 2003). Ebenfalls wird durch Aktivierung der GCN2Kinase, die zu einer Induktion des Transkriptionsfaktors CHOP führt, die Proliferation
muriner CD8+ T-Lymphozyten bei Tryptophanmangel, welcher durch das Enzym
Indoleamin Dioxygenase (IDO) induziert wurde, gehemmt (Munn et al. 2005). Vermutlich
20
Einleitung
als ausgleichender Regulations-Mechanismus, führt Aminosäuremangel zusätzlich zur
Induktion der Aminosäure-Transportproteine, CAT-1 und CAT-2, in der Zellmembran
verschiedener Zelltypen (Aulak et al. 1999). Außerdem haben Säugetierzellen einen
spezifischen Mechanismus entwickelt, mit dem sie über die Steuerung von micro-RNA auf
Aminosäuremangel reagieren können. So wird in humanen Leberzell-Karzinomzellen bei
Argininmangel durch Ablösen der an die CAT-1 mRNA gebundenen micro-RNA miR-122,
welche eine Hemmung der Translation verursacht, die Induktion der CAT-1 Translation
vermittelt (Bhattacharyya et al. 2006).
1.12
Ziel der Arbeit
Die Aminosäure Arginin ist fundamental an der Regulation der Immunantwort bei
Infektionen, entzündlichen Erkrankungen und Tumorwachstum beteiligt. Arginindefizienz
führt zur völligen Hemmung der Proliferation und zahlreicher Effektor-Funktionen
aktivierter T-Lymphozyten (Munder et al. 2006). Bisher ist jedoch nur wenig darüber
bekannt, welche intrazellulären Signalwege bei Argininmangel zur Inhibition der zellulären
Funktionen im humanen Immunsystem führen.
Ziel dieser Promotionsarbeit war es, in primären humanen T-Lymphozyten Proteine zu
charakterisieren,
Zellsuppression
welche
beteiligt
an
sind.
der
durch
Aufgrund
Arginin-Depletion
des
hervorgerufenen
posttranskriptionellen
Defektes
Tbei
Argininmangel (Munder et al. 2006) sollte zunächst eine proteomische vergleichende
Analyse humaner T-Lymphozyten bei Aktivierung in An- oder Abwesenheit von Arginin
durchgeführt werden. Hierbei sollten insbesondere Proteine untersucht werden, die bei
Argininmangel in humanen T-Lymphozyten vermehrt exprimiert werden. Nach 2DGelelektrophorese und Sequenzierung sollten funktionelle Untersuchungen die Rolle der
identifizierten Proteine im Kontext der T-Zell-Aktivierung bei Argininmangel weiter klären.
Eine bessere Kenntnis der Regulationsmechanismen bei Argininmangel sowie die
Identifikation zentraler „Schalter“ in humanen T-Lymphozyten sollte es ermöglichen, in
unerwünschte Immunsuppression bei Tumorerkrankungen oder chronischer Inflammation
kausal pharmakologisch eingreifen zu können.
21
Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1
Zellen
Primäre humane T-Lymphozyten
s. Kapitel 3.2.1
Raji
Burkitt Lymphom B-Zellen
Jurkat
T-Zell-Lymphomzellen
2.1.2
Antikörper – FACS
Antikörper
Herkunft
anti- human CD3 PE
BD Pharmigen, Heidelberg
anti- human CD3 FITC
BD Pharmigen, Heidelberg
anti- human CD3 PerCP
BD Biosciences, Heidelberg
anti- human CD69 FITC
BD Biosciences, Heidelberg
anti- human CD69 PE
BD Biosciences, Heidelberg
anti- human IL-2 PE
BD Biosciences, Heidelberg
anti- human IFNγ FITC
BD Biosciences, Heidelberg
Phalloidin-FITC
Sigma-Aldrich, Steinheim
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate,
Invitrogen, Karlsruhe
succinimidyl ester (5(6)-CFDA), CFSE
Indo 1-AM
Sigma, Steinheim
Isotypkontroll-Antikörper: muriner
BD Pharmingen, Heidelberg
IgG2b-FITC
Isotypkontroll-Antikörper: muriner
BD Pharmingen, Heidelberg
IgG1-PE
22
Material und Methoden
2.1.3
Antikörper – Western Blot
Alle Antikörper wurden in PBS + 5 % BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt. Die
Verdünnungen der Erst-Antikörper wurden bei 4°C gelagert und mehrfach verwendet.
Antikörper
Herkunft
Ziege-anti-Maus IgG-HRP
Santa Cruz Biotechnology,
(Sekundärantikörper)
Heidelberg
Ziege-anti-Kaninchen IgG-HRP
Santa Cruz Biotechnology,
(Sekundärantikörper)
Heidelberg
Anti-phosho-Ezrin (Thr567)/Radixin (Thr564)/
Cell Signaling Technology,
Anti-Moesin (Thr558)
Danvers, USA
Anti-Moesin
Cell Signaling Technology,
Danver, USA
Anti-Coronin 1a
Abcam, Cambridge, England
Anti-α-Tubulin
Cell Signaling Technology,
Danvers, USA
Anti-Vimentin
Sigma-Aldrich, Steinheim
Anti-pVimentin (Ser6)
Stressgen, Michigan, USA
Anti-Cofilin
Cell Signaling Technology,
Danver, USA
Anti-pCofilin
Cell Signaling Technology,
Danver, USA
Anti-ERK1/ 2 (K-23)
Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
Anti-pERK1/2
Cell Signaling Technology,
Danver, USA
23
Material und Methoden
Anti-Akt
Cell Signaling Technology,
Danver, USA
Anti-pAkt
Cell Signaling Technology,
Danver, USA
2.1.4
Sonstige Antikörper
Antikörper
Herkunft
Ziege-anti-Maus IgG + IgM
Dianova, Hamburg
(Kreuzvernetzender Antikörper)
Anti-CD3 (OKT3), monoklonaler Antikörper
Eigenherstellung, Institut für
Immunologie Heidelberg, AG Samstag
Isotypkontroll-Antikörper: muriner IgG2a
BD Pharmingen, Heidelberg
Anti-CD28
BD Pharmingen, Heidelberg
2.1.5
Chemikalien und Reagenzien
α-Isonitrosopropiophenon
Sigma, Steinheim
Acrylamide-Bisacrylamid Rotiphorese
Roth, Karlsruhe
Agarose
Biozym Scientific GmbH,
Oldendorf
Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Merck, Darmstadt
Ammoniumpersulfat
Sigma, Steinheim
Anti-CD3/CD28 microbeads, T cell expander
Invitrogen, Karlsruhe
Anti-CD3-/-CD28-gekoppelten
eigene Herstellung in Kooperation
paramagnetischen Kügelchen
mit der AG Samstag des Instituts für
Immunologie, Heidelberg
24
Material und Methoden
Bovines Serum Albumin
Serva, Heidelberg
Bio-lyte® 3/10 Ampholyte
Biorad, München
Brefeldin A
AppliChem, Darmstadt
Bromphenolblau
Merck, Darmstadt
Chaps
Sigma, Steinheim
Coomassie brilliant blue R
Serva, Heidelberg
CXCL12/SDF-1α (Chemokin)
R&D Systems, WiesbadenNordenstadt
Destreak™Reagent
GE Healthcare, München
Dialysiertes FCS
PAA, Pasching
Dimethylsulfoxid
Sigma-Aldrich, Steinheim
1,4-Dithiotreitol (DTT)
Roche Diagnostics, Mannheim
Dualcolour Elektrophorese-Standard
Biorad, München
EDTA
J.T. Baker, Deventer, Niederlande
ELISA Kit IFN-γ
BD Biosciences, Heidelberg
ELISA Kit IL-2
BD Biosciences, Heidelberg
Entwickler, Reagenz A / B
Agfa, Mortsel, Belgien
Essigsäure
J.T. Baker, Deventer,
Niederlande
Ethanol absolut
J.T. Baker, Deventer, Niederlande
FACSFlow™
Biorad, München
Fetales Kälberserum
PAN Biotech, Aidenbach
FicoLite H®
Linaris, Wertheim-Bettingen
Fixierer
Agfa, Mortsel, Belgien
Formaldehyd
Merck, Darmstadt
Glycin
AppliChem, Darmstadt
Harnstoff
Gerbu, Gaiberg
25
Material und Methoden
Iodoacetamid
Sigma, Steinheim
Ionomycin
Merck, Darmstadt
Isopropanol
Riedel-de-Haen, Seelze
Kaliumhydrogenkarbonat (KHCO3 )
Roth, Karlsruhe
L-Arginin Hydrochlorid
Sigma, Steinheim
L-Glutamin
Gibco - Invitrogen, Karlsruhe
Leupeptin
Sigma, Steinheim
Molekulargewichts-Marker
(Precisions Plus Protein™, All Blue Standard)
Biorad, München
Luminol
Sigma, Steinheim
Magnesiumchlorid (MgCl2)
AppliChem, Darmstadt
Manganchlorid (MnCl2)
AppliChem, Darmstadt
Methanol
JT Baker, Deventer, Niederlande
Milchpulver
Roth, Karlsruhe
Mineralöl
Biorad, München
Natriumazid (NaN3)
Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid (NaCl)
AppliChem, Darmstadt
Natriumfluorid (NaF)
Merck, Darmstadt
Natriumheparin
Braun, Melsungen
Natriumhydrogenkarbonat (NaHCO3)
Roth, Karlsruhe
Natrium-Pervanadat (Na3VO4)
Sigma, Steinheim
Natronlauge (NaOH)
J.T. Baker, Deventer, Niederlande
N-ω-Hydroxy-nor-L-Arginin (norNOHA)
Bachem, Ubendorf
ortho-Phosphorsäure 85 %
VWR Prolabo, Fontanay sous Bois,
Frankreich
p-Coumarsäure
Sigma, Steinheim
Paraformaldehyd
Merck, Darmstadt
PBS-Dulbecco ohne Ca2+ und Mg2+
Biochrom AG, Berlin
26
Material und Methoden
PBS-Dulbecco Pulver für 10 l
Biochrom AG, Berlin
Penicillin-Streptomycin-Lösung
Gibco - Invitrogen, Karlsruhe
Protein Assay, Reagenz A / B / S
Biorad, Hercules, USA
RPMI 1640-Medium argininfrei
PromoCell, Heidelberg
RPMI 1640-Medium
Gibco - Invitrogen, Karlsruhe
Salzsäure (HCl)
JT Baker, Deventer, Niederlande
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Sigma, Steinheim
Saponin
Sigma, Steinheim
Sample Buffer Laemmli (2 x)
Sigma, Steinheim
Schwefelsäure 96 %
Grüssing, Filsum
SEB
Sigma, Steinheim
Substrat Reagenz Set
BD Biosciences, Heidelberg
SYBRO® Ruby Protein Gel Stain
Biorad, München
Szintillationsflüssigkeit
Perkin Elmer, Zaventem, Belgien
Thio-Harnstoff
Sigma, Steinheim
3
Amersham Biosciences, Little
H-Thymidin 5,0 CI/mmol
Chalfont, GB
Tris, Pufferan®
Roth, Karlsruhe
Triton X-100
Sigma, Steinheim
Trypanblau
Biochrom AG, Berlin
Tween® 20
Roth, Karlsruhe
Wasserstoffperoxid (H2O2) 30 %
Merck, Darmstadt
27
Material und Methoden
2.1.6
Geräte und Laborausstattung
Aqua tridest Aufbereitungsanlage
Quantum EX(QTUM 000 EX),
Millipore, Schwalbach
Autoklav Typ A5-70598
Webeco, Bad Schwartau
Biofuge fresco
Heraeus Instruments, Hanau
Brutschrank CO2 Inkubator
Sanyo, München
Cell Harvester 96
Tomtec, Hamden, USA
Centrifuge 5417R
Eppendorf, Hamburg
Cup loading Tray (für 2D-Gelelektrophorese)
Biorad, München
Dampfsterilisator Typ 300EC Varioklav
H+P Labortechnik GmbH,
Oberschleißheim
Dynal MPC 2 (Magnet)
Dynal Biotech, Oslo, Norwegen
Eismaschine Typ AF 100
Scotsman, Milano, Italien
Eisschrank − 20°C
Liebherr Comfort, Ochsenhausen
Eisschrank − 80°C Ultra Low Freezer
New Brunswick Scientific, USA
Elektrophorese Einheit-SE 600, Protean2
Biorad, München
Electrophoresis Power Supply EPS 3500
Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg
ELISA Lesegerät Tecan Sunrise
Tecan, Crailsheim
FACSCalibur
Becton Dickinson, Heidelberg
FACScan
Becton Dickinson, Heidelberg
Gamma Bestrahlungsanlage
STS Steuertechnik und
Strahlenschutz
GmbH,
Braunschweig
Gelelektrophorese Kammer
BioRad, München
(Protean II Cell)
Heizblock
Eppendorf, Hamburg
28
Material und Methoden
ImageStream® (FACS-Gerät mit
Amnis, Seattle, WA, USA
integriertem Mikroskop)
Kühlschrank 4°C
Liebherr
Comfort,
Ochsenhausen
Magnetrotator
IKA Combimag RCO IKA, Staufen
Microplate Scintillation Counter
Packard Instrument Co., Zaventem,
Belgien
Mikroskop Zeiss ID02
Zeiss, Oberkochen
Minigelkammer (Mini-Protean II)
BioRad, München
Mini Zentrifuge
Qualitron inc, Korea
Minifuge RF
Heraeus Instruments, Hanau
Mixing Rotor
Renner GmbH, Dannstett
Multistep-Pipette
Eppendorf, Hamburg
Neubauer Zählkammer
Brand, Wertheim
pH-Meter-Typ CG 837
Schott, Mainz
Photoentwicklungskassette
Amersham Bioscience, Little
Chalfont, GB
Photoentwicklungsmaschine CP 1000
Agfa, Mortsel, Belgien
Pipetboy acu Pipettierhilfe
Integra Biosciences, Fernwald
Pipetten, einstellbar
Eppendorf, Hamburg und Gilson,
Middleton, USA
ProteanXLSystem
Biorad, München
ReadyStrip IPG Strip, 11cm und 17cm
Biorad, München
Reinluftsterilbank LaminAir
Heraeus Instruments, Hanau
Schüttler Ultra Rocker
Biorad, München
Semi Dry Blotting Transferkammer
Biorad, München
Sepatech Megafuge 2.0R und 1.0R
Heraeus Instruments, Hanau
Vortex-Genie 2
neoLab, Heidelberg/ Wellesley, USA
Wasserbad, Julabo U3
Buddeberg GmbH, Mannheim
29
Material und Methoden
2.1.7
Verbrauchsmaterialien
Adapter für S-Monovette
Sarstedt, Nümbrecht
Butterfly-21
Venisystems, Sligo, Irland
Combitips 0,5 ml steril
Eppendorf, Hamburg
Combitips 2,5 ml unsteril
Eppendorf, Hamburg
ELISA-Platten (96 Loch)
Greiner, Frickenhausen
Filterplatten für Counter Unifilter-96
PerkinElmer, Zaventem, Belgien
und Bodenverschlussfolien
Flachbodenplatten 96 Loch Polystyrol
Greiner, Frickenhausen
HTS Transwell®- 96 Well Plate, 3µm
Corning, Amsterdam, Niederlande
Hybond TM und Hyperfilm TM
Amersham Bioscience, Little
Chalfont, GB
Magnetsäulen MACS LS
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Mehrkanalpipetten Research®,
Multistep-Pipette
Eppendorf, Hamburg
Pipetten, serologisch
Greiner, Frickenhausen
Pipettenspitzen
Greiner, Frickenhausen
Pipettenspitzen Gelsaver
Kisker, Steinfurt
Polypropylen Röhrchen mit Schraub-
Greiner, Frickenhausen
verschluss, 15 ml und 50 ml
Reaktionsgefäß Cryo-Tube 1,5 ml
neoLab, Heidelberg
Reaktionsgefäß 1,5 ml
Sarstedt, Nümbrecht
Röhrchen, 5 ml für die Durchflusszytometrie
BD Falcon, Bedford, USA
Spritzen 50 ml
BD Plastipak, Drogheda, Irland
Sterilfilter, 0,2 µm Porenweite
Whatman, Dassel
Verschlussfilme für Filterplatten
Perkin Elmer, Zaventem, Belgien
Verschlussfilme für Mikrotiterplatten
Roth, Karlsruhe
30
Material und Methoden
Whatman-Papier
Sartorius, Göttingen
Zählplatten
Hycor Biomedical, Garden Grove,
USA
Zellkulturflaschen und Zellkulturplatten
2.1.8
Nunc, Roskilde, Dänemark
Software
Adobe Photoshop
Adobe Systems Inc., Delaware, USA
CellQuest Pro
BD Bioscience, Heidelberg
Excel, Word, Powerpoint
Microsoft, Redmond, USA
GraphPad Prism 5.0
Proteomweaver
2.1.9
Biorad, München
Medien
Zum Ansetzen der Puffer und Lösungen wurde Aqua bidest. verwendet. Die
Aufbewahrung aller Medien und Puffer, falls nicht anders deklariert, erfolgte bei 4°C in
Dunkelheit.
Vollmedium
RPMI-Medium wurde
mit 1% Penicillin/Streptomycin,
1% L-Glutamin und
10%
hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum versetzt. Alle zugesetzten Substanzen wurden
steril filtriert zugegeben.
Argininfreies Medium (Arg(–)Medium)
Argininfreies RPMI-Medium wurde mit 10 % dialysiertem FCS, 2 mM L-Glutamin, 1 %
PenStrep und 10 µM MnCl2 versetzt und sterilfiltriert.
31
Material und Methoden
Argininhaltiges Medium (Arg(+)Medium)
Argininfreies RPMI-Medium wurde mit 10 % dialysiertem FCS, 2 mM L-Glutamin, 1 %
PenStrep, 1 mM L-Arginin , und 10 µM MnCl2 versetzt und sterilfiltriert.
Waschmedium
Argininfreies Medium wurde mit 1% Penstrep versetzt und steril filtriert.
2.1.10 Puffer und Lösungen
T-Zellpuffer
PBS + 2 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA)
MACS-Puffer
PBS + 0,25 % humanes Serumalbumin
FACS-Puffer (intrazelluläre F-Aktinfärbung)
540 µl PBS werden mit 60 µl einer 10% Triton-X-100 Lösung und 400 µl einer 12% PFALösung versetzt.
FACS-Saponin-Puffer (intrazelluläre Färbung und Oberflächenfärbung)
Zu 500 ml PBS werden 25 ml filtriertes, hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, 2,5 g BSA,
0,5 g Saponin und 3,5 ml 10% NaN3 zugesetzt.
Paraformaldehyd (12%)
12 g Paraformaldehyd werden in 90 ml Millipore Wasser mit einem Tropfen NaOH versetzt
und bei 62°C unter Rühren gelöst. Nach Abkühlung auf RT werden zu dieser Lösung 10
ml 10x PBS zugegeben, die Lösung wird filtriert und bei 4°C gelagert.
32
Material und Methoden
Erstantikörper-Puffer (ELISA)
8,4 g NaHCO3 und 3,56 g Na2CO3 werden in 1 l H2O gelöst, der pH-Wert kontrolliert und
ggf. auf pH 9,5 eingestellt. Anschließend wird die Lösung bei 4°C in Dunkelheit
aufbewahrt.
ELISA-Blockpuffer
(Puffer zum Verdünnen der Proben und zum Blockieren unspezifischer Bindungen) In 90
ml PBS werden 10 ml hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum gelöst (d.h. finale
Konzentration: 10 %). Dieser Puffer wird erst direkt vor Verwendung hergestellt.
ELISA-Waschpuffer
0,05 % Tween-20 werden in PBS gelöst.
TKM-Lysepuffer
Endkonzentration
Stock
5 ml Ansatz
Tris/HCL pH 7,5
50 mM
1M
250 µl
KCl
25 mM
1M
125 µl
MgCl2
5 mM
1M
25 µl
Na3VO4
1 mM
100 mM
50 µl
NaF
5 mM
1000 mM
25 µl
Leupeptin
20 µg/ ml
1 mg/ ml
100 µl
Aprotinin
20 µg/ ml
2 mg/ ml
50 µl
1%
10 %
500 µl
NP40
33
Material und Methoden
Thiourea-Laufpuffer
Endkonzentration
Stock
2ml (6 Strips)
Urea-Thiourea-Stock
9M
9,6 M
1890 µl
Chaps
1%
40 %
50 µl
DTT
65 µM
2,6 M
50 µl
Ampholine (BioRad)
0,2 %
40 %
10 µl
Thiourea-Stocklösung
2,252 g Urea und 0,837 g Thiourea und 2,5 ml Milliporewasser wurden in ein 15 ml
Falconröhrchen gegeben und bei 37°C gelöst.
Äquilibrierungs-Puffer
Es werden 5,4 g Urea und 4,5 g Glycerol eingewogen mit 3 ml einer 10% SDS-Lösung und
501 µl Resolving Gelpuffer versetzt und bis auf 15 ml mit Milliporewasser aufgefüllt. Der
Ansatz muss bei 37°C gelöst werden und kann bis zu weiteren Verwendung bei – 20°C
gelagert werden. Als Resolving Gelpuffer wurde die Tris Lösung I für Western-Blot (s.u.)
verwendet. Anschließend wurde dem Puffer ein wenig Bromphenolblau zugegeben, um
später die Lauffront im Gel zu erkennen.
Tris-Lösung I (Trenngel-Tris)
Tris-Base
1,5 mol/l
SDS
0,4 %
91 g Tris wurden in 300 ml H2O gelöst und der pH-Wert wurde mit einer 1 M HCl-Lösung
auf 8,8 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung auf ein Endvolumen von 500 ml mit
H2O aufgefüllt und 2 g SDS zugegeben. Zum Schluss wurde die Lösung steril filtriert.
34
Material und Methoden
Tris-Lösung II (Sammelgel-Tris)
Tris-Base
0,5 mol/l
SDS
0,4 %
6,05 g Tris wurden in 40 ml H2O gelöst und der pH-Wert wurde mit einer 1 M HCl- Lösung
auf 6,8 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung auf ein Endvolumen von 100 ml mit
H2O aufgefüllt und 0,4 g SDS zugegeben. Zum Schluss wurde die Lösung steril filtriert.
Trenngel (12 % finale Acrylamidkonzentration)
kleines Gel (10 ml)
großes Gel (25 ml)
1 mm dick
1,5 mm dick
4 ml
10 ml
30 % Acrylamid-Bisacrylamid-Gemisch l
2,5 ml
6,25 ml
Tris-Lösung I
3,5 ml
8,75 ml
H2O
100 µl
250 µl
6 µl
15 µl
10 % Ammoniumpersulfat (APS)
N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin
(TEMED)
Sammelgel (5% finale Acrylamidkonzentration)
kleines Gel (4 ml)
großes Gel (3 ml)
1,5 mm dick
1 mm dick
0,665 ml
0,500 ml
1 ml
0,75 ml
Tris-Lösung II
2,335 ml
1,75 ml
H2O
40 µl
30 µl
4 µl
3 µl
30 % Acrylamid- Bisacrylamid-Gemisch
10 % Ammoniumpersulfat (APS)
N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin
(TEMED)
35
Material und Methoden
SDS-Laufpuffer (10 fach)
Tris-Base
Glycin
SDS
30,26 g/l
144 g/l
1%
Es wurden 30,26 g Tris, 144 g Glycin und 50 ml einer 20 %igen SDS-Lösung miteinander
vermischt und mit H2O auf 1000 ml aufgefüllt. Zur Herstellung des einfach konzentrierten
SDS-Laufpuffers wurde diese Stammlösung 1 : 10 mit Wasser verdünnt.
TBS (5 fach)
Tris-Base
NaCl
50 mmol/l
250 mmol/l
24 g Tris und 175,3 g NaCl wurden in 4 l H2O gelöst. Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung
(12 mol/l) auf 8,0 eingestellt.
TBST
1 l TBS (5 fach) wurde mit 4 l Wasser verdünnt. Anschließend wurden 0,5% Tween-20
zugegeben.
Western-Blot-Puffer
Tris-Base
5,82 g
Glycin
2,93 g
10 % SDS
3,75 ml
Methanol
200 ml
Zur Herstellung der Lösung werden die Bestandteile gemischt und mit H2O auf 1 l
aufgefüllt.
Konservierlösung
Die Membranen werden in einer 0,1 % Natriumazidlösung in TBST aufbewahrt.
36
Material und Methoden
Blockpuffer
Zur Herstellung einer 5 % Magermilch-Blockpufferlösung werden 2,5 g Magermilchpulver
in 50 ml TBST gelöst.
ECL-Reagenz
Stammlösungen
Menge
Zur Herstellung einer 250 mM-Lösung wurden 5 g Luminol
0,5 ml
(3-Amino-phtalhydrazid) in 113 ml DMSO gelöst.
Zur Herstellung einer 90 mM-Lösung wurde 1 g p-Coumarsäure
0,266 ml
(trans-4-Hydroxy-Zimtsäure) in 67,7 ml DMSO gelöst.
Eine einmolare Trislösung wurde mit HCL auf den pH-Wert
5 ml
8,5 eingestellt.
Diese drei Lösungen werden in den angegebenen Mengen gemischt, mit H2O auf
50 ml
aufgefüllt und bei 4°C in einer dunklen Flasche aufbewahrt. Direkt vor dem Einsatz als
Reagenz werden zu 10 ml dieser Lösung 3,05 µl Wasserstoffperoxid (H2O2) gegeben.
Boratpuffer
0,1M Borsäure pH 8,3
Lösungen zur Bestimmung der Arginaseenzymaktivität
Tris-HCl-Lösung
Zur Herstellung einer Tris-HCl-Lösung mit einer Konzentration von 50 mmol/l wurden 3,03
g Tris-Base in 500 ml H2O gelöst und anschließend mit 5 mol/l HCL auf einen pH-Wert von
7,5 eingestellt.
Manganchloridlösung (MnCl2)
Zur Herstellung einer MnCl2-Lösung von 10 mmol/l wurden 0,19 g MnCl2 in 100 ml
H2O gelöst.
37
Material und Methoden
L-Argininlösung
Zur Herstellung einer L-Argininlösung mit einer Konzentration von 0,5 mol/l wurden 10,53
g L-Arginin in 100 ml H2O gelöst und mit 5 mol/l NaOH auf einen pH-Wert von 9,7
eingestellt. Die Aufbewahrung der aliquoten Teile erfolgte bei -20°C.
Säuregemisch
Es wurden 320 ml H2O mit 135 ml Phosphorsäure (H3PO4, 85 %) und 45 ml
Schwefelsäure (H2SO4, 97 %) gemischt und bei 4°C gelagert.
α-Isonitrosopropiophenon-Lösung (ISPF-Lösung)
Zur Herstellung einer 6 % ISPF-Lösung wurden 3 g ISPF in 50 ml 100 % Ethanol gelöst.
Harnstoff-Stammlösung
Zur Herstellung der Harnstoff-Stammlösung von 600 µg/ ml wurden 60 mg Harnstoff in 100
ml H2O gelöst. Die Aufbewahrung der aliquoten Teile erfolgte bei -20°C.
2.2
Methoden
2.2.1
Zellkultur
2.2.1.1 Isolierung primärer T-Lymphozyten
Primäre T-Lymphozyten wurden aus heparinisiertem Vollblut von freiwilligen gesunden
Spendern beider Geschlechter gewonnen, die gemäß den institutionellen Richtlinien der
Verwendung zu Forschungszwecken zustimmten. Der überwiegende Teil der Spender
gehörte der Altersgruppe von 24 bis 35 Jahren an.
2.2.1.2 Isolierung Peripherer Blut Mononukleärer Zellen (PBMC)
Primäre PBMCs (im Wesentlichen Monozyten, NK-Zellen, B- und T-Lymphozyten, selten
Granulozyten-Verunreinigungen)
wurden
durch
Dichtegradienten-Zentrifugation
von
frischem heparinisiertem Vollblut gesunder Spender gewonnen. Zunächst wurde das Blut
in Aliquots zu 20 ml in je ein 50 ml Greiner-Röhrchen mit 15 ml T-Zellpuffer (PBS/ 2 mM
EDTA) verdünnt. Zur Dichtegradientenbildung wurde mit 15 ml Ficoll-Hypaque
unterschichtet und bei 1280 g (ohne Bremse für 20 min bei RT) zenrifugiert. PBMCs
38
Material und Methoden
erschienen darauf als weißer Ring auf dem Ficoll-Gradienten, während Erythrozyten und
Granulozyten aufgrund ihrer höheren Dichte am Boden des Röhrchens sedimentierten.
Die PBMCs wurden in ein neues Greiner-Röhrchen überführt, in das zuvor 10 ml TZellpuffer vorgelegt worden war und die PBMCs wurden mit 660 g für 15 min sedimentiert.
Anschließend wurden die PBMC Aliquots in einem Greiner-Röhrchen vereinigt und weitere
2-mal mit T-Zellpuffer durch Zentrifugation (300 g für 10 min bei 4°C) gewaschen, um
Ficollreste und Blutplättchen zu entfernen. Auf diese Weise standen aus 500 ml Vollblut je
nach Spender zwischen 800 und 1200 Mio. PBMCs zur Verfügung. Die Zählung der Zellen
erfolgte in einer Neubauer Zählkammer, wobei die Zellen 1:10 mit 2% Essigsäure verdünnt
wurden.
2.2.1.3 Isolierung peripherer Blut-T-Lymphozyten
Primäre T-Lymphozyten wurden mittels T-Zell-Negativselektion über magnetische
Kügelchen (MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) aus den PBMCs isoliert. Es wurde
gemäß Protokoll des Herstellers gearbeitet. Die PBMCs wurden direkt nach Ermitteln der
Zellzahl abzentrifugiert (300 g für 10 Minuten bei 4°C). Das Pellet wurde in MACS-Puffer
resuspendiert (40 µl pro 107 Zellen), die der Zellzahl entsprechenden Menge (10 µl pro
107 Zellen) des Antikörpergemisches (biotin-konjugierte Antikörper gegen CD14, CD16,
CD19, CD36, CD56, CD123 und Glycophorin A) hinzupipettiert, gemischt und 10 min bei
4°C inkubiert. Hierbei wurden im Zellgemisch vorhandene Monozyten, NK-Zellen, BLymphozyten sowie verbleibende Granulozyten und Erythrozyten gezielt markiert.
Anschließend wurde zu diesem Antikörper-Zellgemisch nochmals MACS-Puffer (30 µl pro
107 Zellen) und ein mit Magnetkügelchen gekoppelter Zweitantikörper gegen Biotin (20 µl
pro 107 Zellen) hinzu gegeben und weitere 15 min bei 4°C inkubiert. Diese Suspension
wurde dann zum Waschen um das 10 – 20-fache Volumen mit MACS-Puffer auf 50 ml
aufgefüllt und bei 300 g 10 min sedimentiert. Das Pellet wurde in 3 – 6 ml MACS-Puffer
(5x105 Zellen/ 3 ml) resuspendiert. Die nicht magnetisch markierten T-Lymphozyten
wurden nun über MACS-Säulen (je 3 ml Zellsuspension/ Säule), welche in einen starken
Magneten eingespannt wurden von den restlichen Zellen getrennt. Die erhaltene TZellsuspension wurde anschließend mit MACS-Puffer auf ein Volumen von 40 ml
aufgefüllt. Ein Aliquot (90 µl) dieser Zellsuspension wurde mit 10 µl Trypanblau 1:10
gemischt und die Zellzahl mikroskopisch bestimmt. Anschließend wurden die Zellen für 5
min. bei 300 g sedimentiert, in einer Dichte von 3x106 Zellen/ ml in Vollmedium
resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt. Die aufgereinigten T-Lymphozyten
39
Material und Methoden
wurden dann bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank 1 – 5 Tage bis zur weiteren
Verwendung in Kultur gehalten.
Die per Durchflußzytometrie bestimmte Reinheit betrug immer > 96 % CD3+- Zellen (s.
Abb.).
Abbildung: Durchflusszytometrische Reinheitskontrolle aufgereinigter T-Zellen. Der Anteil der CD3+-Zellen ist
in diesem Fall größer 98 %.
2.2.1.4 Kultivierung und Einfrieren von Lymphom-Zelllinien
Die Lymphom-Zelllinien Raji (B-Zell-Lymphom) und Jurkat (T-Zell-Lymphom) wurden mit
einer Zelldichte zwischen 5x104 und 5x105 Zellen/ ml in Zellkulturflaschen kultiviert. Die
Zellen wurden in Vollmedium vermehrt und 2-mal pro Woche 1:5 mit Vollmedium verdünnt.
Die Zellzahl und -vitalität wurde mittels einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Hierzu
wurden die Zellen mit einer Trypanblau-Lösung 1:2 verdünnt und ein Großquadrat
ausgezählt (=> Zellzahl/ ml = gezählte Zellzahl x Verdünnungsfaktor (hier: 2) x 104).
Zur Langzeitlagerung wurden 5 x 106 Zellen pelletiert, in 1 ml kaltem FCS + 10% DMSO
aufgenommen und sofort in ein Kryo-Röhrchen (Nunc) überführt und für mind. eine Stunde
bei -20°C eingefroren. Anschließend wurden die Zellen bei -80°C und zur dauerhaften
Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff gelagert. Zum Auftauen wurden die Kryo-Röhrchen
bei 37°C aufgetaut und der Inhalt in 50 ml warmes Vollmedium überführt. Nach
anschließendem Waschen in Vollmedium wurden die Zellen in 10 ml Vollmedium
aufgenommen und in Zellkulturflaschen bei 37°C/5% CO2 inkubiert.
40
Material und Methoden
2.2.1.5 Einfrieren von Zellpellets
Die aufgereinigten T-Zellen wurden teilweise bis zur Lyse direkt als Zellpellets bei – 80°C
eingefroren. Dazu wurden 20 – 100x106 Zellen abzentrifugiert (240 g, 6 min bei 4°C), das
Pellet in kaltem PBS resuspendiert, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und zweimal
mit PBS gewaschen. Anschließend wurde das Pellet sofort in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei – 80°C gelagert.
2.2.1.6 Herstellen der T-Zelllysate
Zum Herstellen der T-Zelllysate wurden die eingefrorenen Zellpellets bei RT aufgetaut und
sofort in der entsprechenden Menge TKM-Lysepuffer resuspendiert, auf einem VortexSchüttler gemischt und für 1h bei 4°C auf einem Schüttler lysiert. Falls möglich, wurden
die Zellpellets nicht eingefroren, sondern sofort lysiert. Um auf eine Proteinkonzentration
von 110 µg in höchstens 40 µl Lysepuffer zu kommen (da ansonsten die Salzkonzentration
in Kombination mit dem Laufpuffer zu hoch ist) mussten die in argininfreiem Medium
stimulierten Zellen und die unstimulierten Zellen (t=0h) im Verhältnis 400 x 106 Zellen/ ml
und die in argininhaltigem Medium stimulierten Zellen in 150 x 106 Zellen/ ml lysiert
werden. Zelltrümmer und Zellkerne wurden durch 15 min Zentrifugation mit 2850 g bei 4°C
entfernt und der klare Überstand vorsichtig abgenommen, in ein neues 1,5 ml
Reaktionsgefäß überführt und als Lysat verwendet. Hiervon wurden 5 µl für die
Proteinkonzentrationsbestimmung entnommen. Das Lysat wurde bei - 80°C bis zur
weiteren Verwendung gelagert.
2.2.1.7 Herstellen der Proben für Western Blot Analysen
Zur Herstellung von Lysaten für eine Western Blot Analyse wurde die entsprechende
Menge von den TKM-Lysaten (s. 3.2.1.6), die einer Proteinkonzentration von 20 µg
entsprach, entnommen. Diese wurde im Verhältnis 1 : 1 mit zweifach SDS (Sample Buffer)
gemischt und 5 min bei 95°C gekocht. Gleich anschließend wurden die Proben bei – 20°C
eingefroren oder in ein Polyacrylamidgel geladen und eine Gelelektrophorese durchgeführt
(s. 3.2.7.1).
41
Material und Methoden
2.2.2
T-Zellstimulation
2.2.2.1 Standardansatz
Soweit nicht anders beschrieben, wurden alle Stimulationsexperimente unter sterilen
Bedingungen in 96-Loch-Rundbodenplatten durchgeführt. Es wurden jeweils pro
Vertiefung 200µl (+Arginin) oder (-Arginin)-Medium vorgelegt. In je 4 Vertiefungen
(Stimulation mit Beads) oder 6 Vertiefungen (Stimulation mit APZ) wurden 1x106 primäre
humane periphere Blut-T-Lymphozyten verteilt. Die B-Zellen wurden in den Ansätzen 1:2
(1,6x105 T-Zellen : 1,6x105 B-Zellen/ 96-Well-Vertiefung) eingesetzt und auf je 6
Vertiefungen aufgeteilt, um eine Aktivierung der T-Zellen sicherzustellen und ein
überwachsen der Zellen zu vermeiden. Die Zellen wurden in dieser Konzentration
eingesetzt, da diese Zellzahl mindestens notwenig war, um die folgenden Messungen
durchzuführen. Für jedes Experiment wurden die T-Lymphozyten und ,wenn erforderlich,
Raji Lymphom B-Zellen in gleicher Dichte als Kontrollen mitgeführt.
2.2.2.2 Stimulation von T-Zellen mit anti-CD3/-CD28-gekoppelten Partikeln
Zum Experimentansatz wurden im Verhältnis 1 : 5 (ein Partikel auf fünf T-Zellen) die mit
anti-CD3 und anti-CD28 gekoppelten paramagnetischen Kügelchen (anti-CD3/-CD28gekoppelte Partikel; anti-CD3/-CD28) hinzu gegeben. Diese aktivieren die humanen TZellen über den CD3-Komplex sowie als ein kostimulatorisches Signal über CD28.
2.2.2.3 Kurzzeitstimulation mit selbsthergestellten anti CD3/ anti-CD28-gekoppelten
Partikeln
Kurzzeitstimulationen von 15 min bis 1h für Western Blot Analysen wurden mit
selbsthergestellten anti-CD3/-CD28 in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr.
Yvonne Samstag (Institut für Immunologie der Universität Heidelberg) durchgeführt. Für
die Kopplung wurden 3 µg Antikörper pro 25 µl Kügelchen (Menge: 1 x 107) verwendet.
Zuerst wurden 300 µl Kügelchen in 1 ml Boratpuffer
gewaschen. Hierzu wurde das
Reaktionsgefäß in einen Magneten gespannt und der Überstand abgesaugt. Boratpuffer,
Metallkügelchen und Ziege anti-Maus IgG und IgM Antikörper (Dianova), wurden in oben
genannter Konzentration zusammengegeben und 15 min bei RT auf dem Rotor inkubiert.
Anschließend wurden 0,1% BSA zugegeben und 19 h bei RT auf dem Rotor inkubiert. Das
Reaktionsgefäß wurde dann in den Magneten eingespannt und der Überstand abgesaugt.
Es wurde 2 x für 5 min bei RT auf dem Rotor mit PBS/ 0,1% BSA gewaschen, für 5 min bei
42
Material und Methoden
430 g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die Metallkügelchen wurden in 300 µl
PBS/ 0,1% BSA aufgenommen, die Zweitantikörper anti-CD28 (10 µg/ ml) und OKT3 (0,5
µg/ ml) zugegeben und für 1h bei RT auf dem Rotor inkubiert. Es wurde 2x mit PBS/ 0,1%
BSA gewaschen und die Kügelchen in 300 µl des Waschpuffers aufgenommen. Für die
Stimulationsansätze wurden je 30 µl Kügelchen für 5 Mio. T-Zellen in 150µl Medium
verwendet. Die Zellen waren zuvor über Nacht in argininhaltigem oder argininfreiem
Medium präinkubiert worden und auf 30 x 106 Zellen pro ml eingestellt. Die Stimulation
erfolgte für die verschiedenen Zeiten (15min, 30min und 1h) in 1,5 ml Reaktionsgefäßen
bei 37°C auf dem Heizblock. Als Kontrolle wurden 3 x 106 T-Zellen ohne Kügelchen
parallel zu den entsprechenden Zeiten inkubiert. Nach Inkubation wurde 1 x für 3 min bei
430 g mit PBS gewaschen. Anschließend wurden jeweils 5 x 106 T-Zellen mit Kügelchen
in 18 µl und die 3 x 106
T-Zellen ohne Metallkügelchen in 28 µl TKM-Lysepuffer
aufgenommen. Nach 20 min Lyse auf Eis wurde der Zellschrott bei 24000 g für 15 min
sedimentiert. Der Überstand abgenommen und mit 3 x SDS-Puffer versetzt, für 5 min bei
95°C aufgekocht und sofort auf das SDS-Gel aufgetragen oder bei –20°C bis zur weiteren
Verwendung eingefroren.
2.2.2.4 Stimulation von T-Zellen mittels Antigenpräsentierender Zellen
Als antigenpräsentierende Zellen wurden Raji B-Zellen verwendet. Diese wurden vor
jedem Einsatz zunächst in der Blutbank des Instituts für Immunologie mit 30 Gy
Gammastrahlen bestrahlt, um deren Zellteilung zu hemmen. Vor Zugabe zum
Stimulationsansatz wurden die Zellen mit dem Superantigen Staphylococcus aureus
Enterotoxin B (SEB) beladen. Dazu wurden die Zellen zentrifugiert, das Zellpellet in
Vollmedium in einer Zellkonzentration von 4 -10 x 106 Zellen/ ml resuspendiert und das
Superantigen SEB (finale Konzentration je 1 µg/ ml), zugegeben. Nach 15 min Inkubation
bei 37°C im Brutschrank wurden die Zellen zweimal in argininfreiem Medium gewaschen,
in der entsprechenden Menge argininfreien Mediums resuspendiert und mit dem
Multistepper im Verhältnis T-Zellen/B-Zellen 1:2 (je 10µl/ Vertiefung; 1,6 x 105 B-Zellen)
gleichmäßig in je 6 Vertiefungen verteilt. Als Kontrollen wurden B-Zellen ohne SEBPräinkubation mit und ohne T-Zellen in das Assay eingesetzt.
43
Material und Methoden
2.2.2.5 Stimulation von T-Zellen in Anwesenheit von humanem Eiter
Um die in vitro gewonnenen Daten in einem ex vivo System zu überprüfen, wurde
humaner Eiter verwendet. Der Eiter stammte aus Abszessdrainagen chirurgischer
Patienten. Er wurde abzentrifugiert und anschließend aus dem zellfreien Überstand die
Arginaseaktivität
bestimmt
(s.3.2.4).
Die
Eiterüberstände
wurden
bis
zu
einer
Arginaseaktivität von 300 mU/ml in Arg(+)Medium verdünnt und das Arg(+)Medium für 1216 h mit den verdünnten Eiterüberständen präinkubiert, damit das vorhandene Arginin
umgesetzt werden konnte. Parallel erfolgte ein Versuchsansatz mit Eiterüberständen und
1 mM nor-NOHA, einem Arginaseinhnibitor, um die Verstoffwechselung des Arginins zu
verhindern. Zu den Standardansätzen mit anti-CD3/-CD28 Stimulation wurden dann 300
mU/ml Eiterüberstandsuspension mit oder ohne nor-NOHA hinzugegeben.
2.2.3
Proteinkonzentrationsbestimmung
Um bei den Experimenten jeweils eine vergleichbare Menge an Protein einsetzten zu
können, wurde eine Proteinkonzentrationsbestimmung mit einem kommerziellen Protein
Assay (Biorad, München) durchgeführt. Hierzu wurden jeweils 5 µl der zu bestimmenden
Zelllysate entnommen, 1 : 4 mit dem jeweils verwendeten Lysepuffer verdünnt und in eine
96-Loch-Flachbodenplatte wurden pro Loch je 5µl Probe in Dreifachbestimmungen
gegeben. Die Proteinstandardverdünnungsreihe wurde zweifach pipettiert. Proben und
Standard wurden dann mit einem Gemisch aus Biorad-Reagenz A und S versetzt, und
zusammen mit Biorad-Reagenz B für 20 min bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Die
Messung erfolgte anschließend mit Hilfe eines ELISA-Lesegeräts bei einer Wellenlänge
von 690 nm. Die Auswertung erfolgte anhand der Standardkurve.
2.2.4
Bestimmung der Arginaseaktivität von humanem Eiter
In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß wurden 100 µl des zellfreien Eiterüberstands mit 20 µl
MnCl2-Lösung vermischt. Zur Aktivierung der Arginase wurde dieses Gemisch für 8 min
auf 56°C erhitzt. Als Substrat wurden nun je 100 µl L-Argininlösung zugegeben und bei
37°C inkubiert. Nach 120 min wurde die enzymatische Reaktion mit je 800 µl
Säuregemisch abgestoppt. Parallel dazu wurden Harnstoff-Standardverdünnungen von 010 mmol/l in H2O hergestellt und je 100 µl Lösung mit 900 µl Säuregemisch versetzt.
Proben und Standards wurden anschließend mit je 40 µl α-Isonitrosopropiophenon-Lösung
erst für 30 min bei 95°C und in einem weiteren Schritt für 30 min bei 4°C abgedunkelt
inkubiert. Je nach Harnstoffkonzentration entstand so eine rot-violette Farbreaktion
44
Material und Methoden
unterschiedlicher Intensität. Zur quantitativen Erfassung der Enzymaktivität wurden nun
aus jedem Reaktionsgefäß 200 µl in eine 96 Loch-Flachboden-Mikrotiterplatte überführt.
Im ELISA-Lesegerät wurden diese Proben nun bei der Absorption von 540 nm
(Referenzwellenlänge
690
nm)
gemessen,
und
anhand
des
Standards
die
Harnstoffkonzentration berechnet. Daraus ergab sich nun die Arginaseaktivität, denn eine
Einheit (U) der Enzymaktivität ist definiert durch die Bildung von 1 µmol Harnstoff pro min.
2.2.5
Durchflußzytometrie
Durchflußzytometrische Analysen wurden mit einem LSR II, einem FACSCalibur und
einem FACSan (BD Bioscience) durchgeführt. Zur Geräteeinstellung (Kompensation) bei
Mehrfarbenanalysen wurde für jeden verwendeten Fluoreszenz-Farbstoff ein KontrollAnsatz gemessen, für den ein stark exprimiertes Oberflächenmolekül gefärbt wurde (z.B.
CD3 für T-Zellen). Anhand dieser Ansätze wurde die Farbkompensation eingestellt.
2.2.5.1 Nachweis zytokinproduzierender Zellen mittels intrazellulärer FACSFärbung
Zum Nachweis der intrazellulären Zytokinproduktion auf Einzelzellniveau, wurden die
Zellen jeweils vier Stunden vor der Färbung mit Brefeldin A (10 µg/ ml) behandelt, dass die
Verschmelzung von endogenen Vesikeln mit der Zellmembran verhindert. Dadurch
verbleiben die Zytokine im Prä-Golgi bzw. Golgi-Kompartiment intrazellulär und können
über eine intrazelluläre Färbung mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Für
diese Messung wurden zunächst pro Ansatz 5x105 bis 1x106 Zellen in FACS-Röhrchen
geerntet und mit 1560 g für 5 min bei RT sedimentiert. Zur Fixierung wurde das
trockengesaugte
Zellsediment
in
100
µl
vorgewärmten
4%
Paraformaldehyd
aufgenommen. Nach 10 min Inkubation bei RT wurden die Zellen durch Zugabe von 2 ml
FACS-Puffer mit 0,1% (w/v) Saponin gewaschen (Zentrifugation bei 1560 g, 5 min bei RT),
nach wiederholter Zugabe von 2 ml FACS-Saponin-Puffer und 10 min Inkubation bei RT
permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen sedimentiert (Zentrifugation bei 1560 g, 5
min), der Überstand abgesaugt und das Zellsediment in 50 µl FACS-Saponin-Puffer
(FACS-Puffer/ 0,1% Saponin) aufgenommen. Nach 30 min Inkubation im Dunkeln bei RT,
wurde 1 ml FACS-Puffer/ 1% Saponin pro Probe zugegeben und für weitere 5 min
inkubiert. Anschließend wurden nicht-gebundene Antikörper im Überstand der Zellen
durch zweimaliges Waschen (Zentrifugation bei 1560 g für 5 min) mit FACS-Puffer und
darauffolgendes Absaugen entfernt. Das Zellsediment wurde daraufhin in 150 µl FACS-
45
Material und Methoden
Puffer/ 0,1% Saponin aufgenommen und direkt danach gemessen oder in 200 µl PBS/ 1%
Paraformaldehyd aufgenommen und bis zur Messung bei 4°C gelagert. Die Messung
erfolgte mit dem Durchflußzytometer FACSCalibur (Becton Dickinson).
Antikörpergemisch für die Bestimmung IL-2 produzierender Zellen: anti-IL-2-PE, antiCD69-FITC, anti-CD3-PerCp; Isotypkontrolle: IgG1-PE, anti-CD69-FITC, anti CD3-PerCp.
Antikörpergemisch für die Bestimmung IFNγ produzierender Zellen: anti-IFNγ-FITC, antiCD69-PE, anti-CD3-PerCp; Isotypkontrolle: IgG2b-FITC, anti-CD69-PE, anti-CD3-PerCp.
2.2.5.2 Nachweis von filamentösem Aktin mittels intrazellulärer FITC-Phalloidin
FACS-Färbung
Um den Gehalt an intrazellulärem filamentösem Aktin (F-Aktin) zu bestimmen, wurden die
Zellen nach den verschiedenen Zeitpunkten (15 min, 30 min, 1 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96
h) in FACS-Röhrchen geerntet und mit FITC-markiertem Phalloidin - ein an F-Aktin
bindendes Pilzgift - gefärbt. Für diese Färbung wurden je 5 x 105 – 1 x 106 Zellen je Ansatz
in ein FACS-Röhrchen überführt, bei 1560 g für 5 min sedimentiert und der Überstand
abgesaugt. Für die F-Aktin-Bestimmung der frühen Zeitpunkte (15 min, 30 min und 1 h)
wurden die T-Zellen über Nacht in argininhaltigem oder argininfreiem Medium präinkubiert,
jeweils 5 x 105 bis 1x106 Zellen in je 90 µl argininhaltigem oder argininfreiem Medium
resuspendiert und direkt in FACS–Röhrchen verteilt. Nach Zugabe von SEB-beladenen
Raji-B-Zellen (s. 3.2.2.4) bzw. antikörpergekoppelten Kügelchen (s. 3.2.2.2) für 30 sec bei
560 g zentrifugiert und für die genannten Zeiten bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert. Die Pellets
wurden anschließend in je 100 µl argininfreiem oder argininhaltigem Medium
resuspendiert und für 15 min bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert, da F-Aktin sehr anfällig auf
Scheerkräfte reagiert. Nach dieser Ruhephase wurden je 100 µl Puffer mit FITC-Phalloidin
(PBS/ 0,6% Triton X-100/ 4,8% PFA/ 0,05 mg/l FITC-Phalloidin/ 5µl anti-CD3-PE)
zugegeben und 10 min bei RT inkubiert. Die Kontrollen wurden in 100 µl Puffer ohne
Antikörper bzw. bei den Einstellkontrollen jeweils mit dem entsprechenden Farbstoff
resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen bei 700 g für 5 min sedimentiert, der
Überstand abgesaugt und in 150 µl PBS (bei unmittelbarer durchflusszytometrischer
Messung) oder in 200 µl PBS/ 1% PFA resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt, sofern erst
später die durchflußzytometrische Analyse erfolgte. Die Messung wurde mit dem
Durchflußzytometer FACSCalibur durchgeführt.
46
Material und Methoden
2.2.5.3 Bestimmung des Kalziumflux
Die intrazelluläre Kalziummenge der T-Zellen nach Stimulation, wurde anhand der
unterschiedlichen Emissionsmaxima des INDO-1 Farbstoffs mittels des FACS-Geräts LSR
II gemessen. Wird Kalzium freigesetzt, bindet INDO-1 daran und in der Folge ändert sich
die Absorptionswellenlänge (395 nm) im Vergleich zum ungebundenen Farbstoff (495 nm).
Damit einher geht eine Veränderung der Fluoreszenzintensität, die als Quotient F395/
F495 unabhängig von der Farbstoffbeladung der Zelle die Veränderung in der
intrazellulären Ca2+-Konzentration anzeigt. Für diese Messung wurden zunächst je 1 x 107
Zellen über Nacht in argininhaltigem oder argininfreiem Medium präinkubiert, anschließend
in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt und bei 390 g für 5 min sedimentiert. Das Pellet
wurde in je 1 ml argininfreiem bzw. 1 ml argininhaltigem Medium resuspendiert und für 10
min bei 37°C im Wasserbad erwärmt. Zu der Zellsuspension wurden nun je 2 µl des
Kalzium-Indikatorfarbstoffs INDO-1 zugegeben und für 45 min im Wasserbad bei
Dunkelheit inkubiert. Anschließend wurde 1 µl anti-CD3 (1µg/ml) bzw. in einem separaten
Ansatz 2 µl IgG2a (1µg/ml) als Isotypkontrolle hinzugegeben und unter gleichen
Bedingungen weitere 15 min inkubiert. Es folgte ein Zentrifugations- und ein Waschschritt
(560 g , 5 min) bei dem mit je 1 ml argininhaltigem bzw. argininfreiem Medium gewaschen
wurde. Die Zellpellets wurden dann in je 10 ml entsprechendem Medium resuspendiert
und bis zum Ende der Messung im Wasserbad aufbewahrt. Zur Messung wurde je 1 ml
der Zellsuspension entnommen und in ein FACS-Röhrchen überführt. Die Probe wurde
sofort gemessen. Als erstes wurde das Grundlevel für 2 min gemessen. Das Röhrchen
wurde wieder aus dem Gerät entnommen und es wurden 2 µl (3,6 µg/ml)
kreuzvernetzender Ziege-anti-Maus-IgG+IgM-Antikörper zugegeben, gemischt und für
weitere 3 min gemessen. Als Positivkontrolle wurde abschließend 1 µl Ionomycin (1 µM)
hinzugegeben für maximalen Ca2+ Einstrom und erneut 1 min gemessen. Während des
kompletten Vorgangs wurde die Messung nicht angehalten. Zwischen den einzelnen
Proben wurde 1-mal mit FACSFlow gewaschen. Die Ergebnisse wurden mit der Software
FlowJo ausgewertet.
2.2.6
Proliferationsmessung
2.2.6.1 Einbau von [3H]-Thymidin in die Zellen
Als Maß für die Induktion der Zellproliferation wurde die DNA-Synthese anhand von
Tritium-Thymidin-Einbau in die DNA quantifiziert. Dazu wurden in einer 96 LochRundbodenplatte 1 x 105 T-Zellen pro Vertiefung unter den Standardversuchsbedingungen
47
Material und Methoden
mit oder ohne Stimulation, je Bedingung in Triplikaten, bei 37° C inkubiert. Nach 48 h
wurden dann pro Loch 50 µl Überstand vorsichtig abpipettiert und für Zytokinanalysen bei 20° C eingefroren. Die verbleibende Zellsuspension wurde für weitere 15 bis 18 h mit [3H]Thymidin (gelöst in Arginin(–)Medium) in einer finalen Konzentration von 1 µCi/ ml pro
Vertiefung inkubiert (Zugabe von 20 µl einer [3H]-Thymidin-Stammlösung (10 µCi/ ml). Die
sich im Zellzyklus befindenden Zellen bauen hierbei das radioaktiv-markierte Thymidin in
ihre DNA ein. Bei der anschließenden Ernte mit einem automatischen Zellerntegerät
bleiben die Zellen auf dem Glasfilter hängen, und das nicht-inkorporierte [3H]-Thymidin
wurde
herausgewaschen.
Die
Radioaktivität
der
Filter
wurde
nun
in
einem
Radioaktivzähler als Ereignisse pro Minute (counts per minute, cpm) gemessen. Diese
korrelieren mit der DNA-Replikationsaktivität und somit mit der Proliferation der Zellen.
2.2.6.2 Durchflußzytometrische Messung der zellulären Proliferation mittels CFSEFärbung
Für die Messung der Proliferation in Anwesenheit der Raji B-Zellen wurden die T-Zellen
direkt vor dem Einsetzen in die Zellkultur und nach einmaligem Waschen mit PBS, für
15 min bei 37°C/ 5% CO2 mit dem Fluoreszenzmarker CFSE (Carboxy-FluoreszeinSuccinimidyl-Ester) (finale Konzentration 0,5 µM in PBS) inkubiert. Nach anschließender
Zentrifugation bei 300 g für 5 min, wurde der Überstand abgesaugt, das Zellpellet in 10 ml
Vollmedium resuspendiert und für 30 min bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert. Nach zweimaligen
Waschen in argininfreiem Medium wurden die markierten T-Zellen gleichmäßig verteilt und
für 96 h bei 37°C/ 5%CO2 stimuliert bzw. in Kultur gehalten (Kontrollansätze) (s.3.2.2).
CFSE, das initial Membran-permeabel aber nicht fluoreszierend ist, diffundiert in die
T-Zellen, wird intrazellulär durch Esterasen modifiziert und reagiert mit intrazellulären
Amingruppen, so dass der nun fluoreszierende Farbstoff intrazellulär verbleibt. Bei jeder
Zellteilung wird der Farbstoff dann auf die beiden Tochterzellen verteilt. Die Fluoreszenz
der Zellen nimmt dementsprechend um so mehr ab, je öfter sie sich geteilt haben. Am
Ende der jeweiligen T-Zell-Kulturen (nach 96 h Inkubationszeit) wurden die Zellen im
Durchflußzytometer (FACSan) analysiert und ein Proliferationsprofil der jeweiligen
Population erstellt.
48
Material und Methoden
2.2.7
Bestimmung der Zytokinproduktion
Die Zytokinproduktion der T-Zellen in den verschiedenen Bedingungen wurde auf Ebene
der Zytokinsekretion mittels ELISA und in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. Dr.
Hanns-Martin
Lorenz
(Medizinische
Klinik
5,
Universität
Heidelberg)
mittels
Durchflusszytometrie analysiert. Es wurde hierfür das Durchflusszytometer „EPICS XLTM
flow cytometer“ und der "FlowCytomix Kit" (Bender MedSystems, Vienna, Austria) für eine
parallele durchflußzytometrische Bestimmung von 15 Zytokinen verwendet (Heyder et al
2009).
2.2.7.1 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Nach
Stimulation
der
Zellen
für
verschiedene
Zeiten
wurden
50
µl
des
Zellkulturüberstands vorsichtig abgenommen, mit ELISA-Blockpuffer (PBS/ 10 % FCS) 1 :
1 – 1 : 20 je nach Bedarf verdünnt und die Menge an darin gelöstem Zytokin mit einem
kommerziell erhältlichen ELISA-System (BD Biosciences, Heidelberg) bestimmt. Dazu
wurde der Erst-Antikörper (unmarkierter anti-Zytokin-AK) gemäß den Herstellerangaben in
Erstantikörper-Puffer (s. 3.1.9) gelöst und während der Inkubation über Nacht bei 4°C auf
96 Loch-ELISA-Platten am Plattenboden gebunden. Nach dreimaligem Waschen mit
ELISA-Waschpuffer und kräftigem Ausklopfen wurden die Platten mit 200 µl pro Loch
ELISA-Blockpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Dieser Schritt sorgt
dafür, dass alle unspezifischen Bindungsstellen am Erst-Antikörper und an der ELISAPlatte blockiert werden, und somit nur noch die spezifische Antigenbindungsstelle des
Erst-Antikörpers zur Verfügung steht. Nach drei weiteren Waschschritten wurden je 50 µl
der Standardverdünnungsreihe in Doppelansätzen bzw. je 50 µl der Probenverdünnung in
Triplikaten auf die mit Erst-Antikörpern beschichteten Platten pipettiert und nochmals für
zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit können sich die in den
Standard- bzw. Probenverdünnungen gelösten Antigene (d. h. die von den Zellen zuvor
sezernierten, im Überstand befindlichen Zytokinmoleküle) spezifisch an die an der Platte
gebundenen Antikörper in Form eines Antigen-Antikörper-Komplexes anlagern. Nach fünf
weiteren Waschschritten zur Entfernung von nicht gebundenem Zytokin und anderen
Bestandteilen des Überstands wurden je 50 µl Detektionsgemisch pro Vertiefung zum
Nachweis von gebundenem Zytokin in die ELISA-Platten pipettiert und für eine Stunde bei
Raumtemperatur inkubiert. Dieses Detektionsgemisch besteht aus einem biotinylierten
Detektions-Antikörper, welcher spezifisch gegen ein anderes Antigen des Zytokins
gerichtet ist als der Erst-Antikörper, und einer Streptavidin-konjugierten Meerrettich-
49
Material und Methoden
Peroxidase (HRP). Der Detektions-Antikörper bindet somit am plattengebundenen Zytokin,
und Streptavidin assoziiert mit Biotin, sodass das Detektionsenzym Peroxidase ebenfalls
indirekt (und korrelierend zur Menge des gebundnen Zytokins) an der Platte gebunden
vorliegt. Anschließend folgten weitere Waschschritte, bevor eine Lösung aus Substrat A
und B (ELISA-KIT) dazu pipettiert wurde. Das Enzym HRP oxidiert nun während der
Inkubationszeit von
20 - 30 min im Dunkeln das in der Substratlösung enthaltene ortho-
Phenyldiamin (OPD) und führt so zur Bildung eines Farbstoffs. Nach Abstoppen der
Reaktion mit H2SO4 wurde die Farbintensität photometrisch bei 405 nm (570 nm
Referenzfilter) am ELISA-Lesegerät gemessen und die Zytokinkonzentration über eine
Standardkurve berechnet. Bei der Auswertung wurde die anfängliche Verdünnung der
Proben berücksichtigt.
2.2.8
Proteinbiochemie
2.2.8.1 Western Blot
2.2.8.1.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Mittels Polyacrylamidgelen können Proteine nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Dazu
werden Acrylamid und Bisacrylamid unter dem Einfluss von Ammoniumpersulfat und
TEMED zwischen zwei Glasplatten polymerisiert und quervernetzt. Zwischen zwei
vertikalen Glasplatten wurde dazu zuerst das 6 % SDS-PAGE Trenngel gegossen und mit
Isobutanol
zur
Bildung
einer
glatten
Gelgrenze
überschichtet.
Nach
erfolgter
Polymerisation des Trenngels wurde das Isobutanol wieder abgegossen und das Trenngel
mit dem Sammelgel überschichtet. Mit einem Probenkamm wurden im Sammelgel
Aussparungen für die Proteinproben erzeugt. Die Elektrophorese-Kammer wurde nun
zusammengebaut und mit SDS-Laufpuffer aufgefüllt. Die Proteinlösungen wurden
aufgetaut, noch einmal aufgekocht (95° C, 5 min) oder direkt nach Probenaufbereitung (s.
3.2.1.7) in einer Konzentration von jeweils 20 µg Protein pro Geltasche vorsichtig in die
Aussparungen pipettiert. Parallel wurde in eine Tasche ein Proteingrößenstandard
aufgetragen. Anschließend erfolgte die Elektrophorese, zuerst für ca. 25 min bei 75 Volt,
um die Proteine durch das Sammelgel wandern zu lassen, und dann für ca. 50 min bei
einer Spannung von 170 Volt, um die Proteine anhand ihrer Größe im Trenngel
aufzutrennen.
50
Material und Methoden
2.2.8.1.2 Western Blotting
Nach dem Elektrophoreselauf wurden die aufgetrennten Proteine mittels Semi Dry Blotting
vom Gel auf eine hydrophobe Polyvinyldifluorid (PVDF) Membran, (Hybond-PTrägermembran, Amersham, Little Chalfont, GB) übertragen. Dazu wurden vier mit
Western-Blot-Puffer getränkte Whatman-Filter auf die Transferkammer (Biorad, München)
gelegt. Das aus den Glasplatten heraus gelöste Gel wurde in Puffer äquilibriert und
blasenfrei auf die Filter gelegt, gefolgt von der Hybond-P-Membran, die zuvor für 5 min in
Methanol eingeweicht und für 5 min in Western-Blot-Puffer äquilibriert wurde. Darauf
wurden wiederum vier mit Puffer getränkte Filter gelegt und die Transferkammer
geschlossen. Der Elektrotransfer erfolgte bei 90 mA für eine Stunde mittels Semi Dry
Blotting. Dabei werden die Proteine in gleicher Anordnung wie auf dem Gel auf die PVDFMembran übertragen. Die Membran mit den darin fixierten Proteinen wurde sofort
weiterverarbeitet oder in Konservierlösung bei 4° C aufbewahrt.
2.2.8.1.3 Detektion durch spezifische Antikörper
Die PVDF-Membran wurde mehrfach in TBST gespült, unspezifische Bindungsstellen
wurden durch einstündige Inkubation in Blockpuffer (5 % Magermilch in TBST) abgedeckt
und die Membran erneut dreimal in TBST gewaschen. Anschließend wurde der
spezifische Primärantikörper gegen das zu detektierende Protein in TBST/ 5% BSA/
0,1% NaN3 1:1000 verdünnt und zusammen mit der Membran in Folie eingeschweißt über
Nacht bei 4°C auf einem Taumelroller inkubiert. Nach erneutem Waschen der Membran
wurde zum Nachweis des gebundenen Primärantikörpers der passende Peroxidasemarkierte Sekundärantikörper (1:3000 in Blockpuffer verdünnt) zugegeben. Nach
Inkubation von 1 h auf dem Schüttler folgten weitere Waschschritte und die
Überschichtung der Membran mit ECL-Reagenz für die Detektion des jeweils
nachzuweisenden Proteins. Die Detektion der gebundenen Antikörper erfolgte mittels einer
Peroxidase-katalysierten Lumineszenzreaktion, wobei das entstehende Licht in der
Dunkelkammer über Filmpapiere aufgefangen wurde. Die entwickelten Filme zeigen
schwarze Banden mit steigender Intensität, je mehr Protein auf der Membran vorhanden
war.
2.2.8.2 Zweidimesionale Gelelektrophorese
Die Auftrennung von Proteinen durch zweidimensionale Gelelektrophorese (Isoelektrische
Fokussierung (IEF)/SDS-PAGE) wurde mit Hilfe des PROTEAN IEF CellSystems von
BioRad durchgeführt. Hierbei werden die Proteine in der 1. Dimension (s. 2.2.8.2.1) nach
51
Material und Methoden
ihrem isoelektrischen Punkt und in der 2. Dimension (s. 2.2.8.2.3) nach dem
Molekulargewicht
aufgetrennt.
Diese
Methode
gehörte
nicht
zu
den
Labor-
Standardmethoden und musste neu etabliert werden.
1.Dimension
2.Dimension
Isoelektrische Fokussierung
SDS-PAGE
Abb.2.2.8.2: Prinzip der 2D-Gelelektrophorese (Quelle: T. Burmester & T. Hankeln, Johannes Gutenberg
Universität Mainz (http://molgen.biologie.uni-mainz.de /Downloads/PDFs/Genomforsch/ Protein2-2005.pdf)
2.2.8.2.1 1. Dimension
In der 1. Dimension werden die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt durch
Fokussierung entlang eines immobilisierten pH-Gradienten (IEF-Gelstreifen, Biorad)
aufgetrennt. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurde die T-Zelllysatmenge
entnommen, die 110 µg Protein entsprach und mit 300 µl Thiourea-Laufpuffer gemischt.
Anschließend wurden diese Proben jeweils in der Vertiefung eines FokussierungsSchlittens verteilt. Darauf wurden je ein ReadyStrip™IPG Streifen mit einem linearisierten,
immobilisierten pH Gradienten von pH 4 bis pH 7 (17 cm) aufgelegt und mit 1500 µl
Mineralöl überschichtet. Nach dem Lauf (s. 3.2.8.2.2) wurden die Streifen entweder bei –
20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert oder direkt für die 2. Dimension (SDS-PAGE)
äquilibriert. Dazu wurden die Streifen für 30 min. in 1 ml Äquilibrierungspuffer (6 M
Harnstoff; 0,375 M Tris-HCl pH 8,8; 2% SDS; 20% Glyzerin) mit 1% DTT und
anschließend weitere 30 min. in 1 ml Äquilibrierungspuffer mit 4% Iodoacetamid inkubiert.
Danach wurden die Streifen auf die 2. Dimension aufgebracht (12%iges 1 mm dickes Gel
(s. 3.2.8.2.3), Diskontinuierliche Gelelektrophorese), ProteanXL 1 mm (BioRad, mit einer
Markertasche) und mit handwarmer 1%iger „Low melting Agarose“ fixiert. Der Lauf erfolgte
bei konstanten 50 V für 1000 Vh über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Gele fixiert
52
Material und Methoden
(Methanol: Essigsäure: Wasser – 40 : 10 : 50) und mit SybroRuby (s.3.2.9.2) bzw. Silber
gefärbt (s. 3.2.9.1).
2.2.8.2.2 Laufbedingungen der 1. Dimension
Programm:
Aktive Rehydrierung : 50 V
Auftrennung : Spannung linear steigend 1 min bis 200 V
200 V, 2 h halten
Spannung linear steigend 1 min bis 500 V
500 V, 2 h halten
Spannung linear steigend bis 2000 V
2000 V, 1 h halten
Spannung linear steigend 3 h bis 8000 V
8000 V, für 100 000 V h
Spannung schnell abfallend auf 1000 V
Die Gesamtlaufzeit beträgt für dieses Programm 125 kVh. Der Lauf wurde über Nacht
gestartet. Alle Laufschritte wurden bei 20°C durchgeführt. Am Ende wurden solange die
1000 V gehalten bis das Gerät ausgeschaltet und die Streifen entnommen wurden. Somit
wurden die Proteine an ihrem isoelektrischen Punkt gehalten.
2.2.8.2.3 2. Dimension - Diskontinuierliche Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur Auftrennung der Proteingemische der 1. Dimension nach ihrem Molekulargewicht
wurde eine reduzierende, diskontinuierliche Gelelektrophorese verwendet. Dazu wurden
Glasplatten
(ProteanXLSystem
von
BioRad)
nach
Angaben
des
Herstellers
zusammengesetzt und ein 1 mm Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet.
Nachdem das Trenngel polymerisiert war, wurde das Isopropanol mit Milliporewasser
abgespült und mit Hilfe eines Filterpapiers trockengesaugt. Anschließend wurden die
Streifen der 1. Dimension auf die 2. Dimension aufgebracht. Die fertigen Gele wurden in
die Gel-Apparaturen eingespannt und mit SDS-Laufpuffer überschichtet. Der Lauf erfolgte
bei 50 Volt für 1000 Vh über Nacht mit Wasserkühlung.
53
Material und Methoden
2.2.9
Färben von Gelen
2.2.9.1 Silberfärbung
Als sehr sensitive Methode zur Darstellung und weiteren Analyse von Proteinspots wurde
eine Silberfärbung durchgeführt. Hierzu wurden die Gele nach dem Lauf für 45 min fixiert
(Methanol: Essigsäure: Wasser – 40 : 10 : 50). Anschließend wurde die Säure durch 3maliges Waschen mit Milliporewasser entfernt und das Gel mit 0,02% (w/v)
Natriumthiosulfat für eine Minute sensibilisiert. Nach erneutem zweimaligem Waschen mit
Milliporewasser wurde 30 min mit 0,1% (w/v) Silbernitrat bei 4°C inkubiert. Anschließend
wurde das ungebundene Silbernitrat mit Milliporewasser entfernt und das Gel mit
Entwickler (0,04% (v/v) Formaldehyd, 2% (w/v) Natriumkarbonat) inkubiert, bis die
erwünschte Färbung eingetreten war. Die Reaktion wurde mit 1%iger (v/v) Essigsäure
gestoppt und das Gel anschließend in 1%iger (v/v) Essigsäure bei 4°C gelagert.
2.2.9.2 Fluoreszenz-Färbung mit SYPRO®Ruby
Um die gewünschten Proteine auf den 2-D-Gelen präparativ identifizieren zu lassen,
wurde die SYPRO®Ruby Fluoreszenz-Färbung angewendet. Diese Färbung beruht auf der
Anbindung des Fluoreszenz-Farbstoffes an basische Aminosäuren. Das Gel wurde dabei
zuerst für 45 min fixiert (Methanol: Essigsäure: Wasser – 40 : 10 : 50) und anschließend
für mindestens 3 h oder über Nacht in der SYPRO®Ruby Lösung gefärbt. Hierbei wurde
das 10-fache Gelvolumen an SYPRO®Ruby Lösung eingesetzt, die Färbung fand in einer
Plastikschale statt. Zur Reduzierung des Hintergrundes wurde erneut für 30 min in 10%
(v/v) Methanol, 7% (v/v) Essigsäure gewaschen, bevor das Gel anschließend in einem
Fluoreszenzscanner eingescannt wurde.
2.2.9.3 Colloidal Coomassie-Färbung
Zum Anfärben von Gelen, aus denen Spots mittels Massenspektrometrie analysiert
werden sollten, wurde ebenfalls eine modifizierte Coomassie-Färbung verwendet. Zum
Färben mit Colloidal Coomassie wurden die Gele über Nacht unter Schütteln in eine
Färbelösung (0,08% Coomassie Brilliant Blue G250, 1,6% Orthophosphorsäure, 8%
Ammoniumsulfat, 20% Methanol) gegeben. Anschließend wurden sie mit Milliporewasser
durch mehrfaches Waschen entfärbt, bis der Hintergrund klar wurde. Die gefärbten Gele
54
Material und Methoden
wurden dann mit etwas Milliporewasser/ 1% Natriumazid in Folie eingeschweißt und bis
zur weiteren Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
2.2.10 Protein-Sequenzierung und Massenspektrometrie
Proteinmikrosequenzierung und Massenspektrometrie wurde in Zusammenarbeit mit der
Arbeitsgruppe Franz am EMBL (European Molecular Biology Laboratory) in Heidelberg
durchgeführt. Es wurden fünf Proteinspots ausgewählt, welche bei Stimulation der T-Zellen
mit anti-CD3 / -CD28 (s. 3.2.2.2) in Argininabwesenheit im Gegensatz zu unstimulierten
und in Anwesenheit von Arginin stimulierten Zellen stärker exprimiert wurden. Die
Proteinspots wurden aus einem präparativen SyproRuby gefärbten 2D-Gel mittels eines
„Spot-Picker-Robotors“ (EXQuest Spot Cutter, Biorad) ausgestochen und anschließend
wurden die Proteine im Gel mit Trypsin verdaut. Die Identifizierung der Proteine erfolgte
über die massenspektrometrische Methode MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/
ionisation’ (MALDI) ‘time-of-flight’ (TOF); MALDI MICRO MX™, Waters) (Shevchenko et
al. 2000). Die Analyse erfolgte im Mass Peptide Fingerprint Verfahren. Hierbei werden die
Massen der entstandenen Peptide mit den Massen eines theoretischen Verdaus in der
SWISS-PROT-Datenbank verglichen.
2.2.11 Messung der immunologischen Synapse
Um
die
Ausbildung
der
immunologischen
Synapse
bei
T-Zellaktivierung
über
antigenpräsentierende Zellen zu untersuchen, wurden Raji Lymphom B-Zellen und TLymphozyten aus peripherem Blut verwendet. Die Analyse erfolgte mittels ImageStream®
(Amnis, Seattle, USA), einem FACS-Gerät mit integriertem Fluoreszenz-Mikroskop.
Ansätze und Analysen wurden von der kooperierenden Arbeitsgruppe Prof. Dr. Y.
Samstag/Institut für Immunologie der Universität Heidelberg, durchgeführt. Hierzu wurden
zunächst T-Zellen bei 37°C/ 5% CO2 über Nacht in argininfreiem bzw. argininhaltigem
Medium präinkubiert und am nächsten Tag, wie in Hosseini et al (Hosseini et al. 2009) und
Klemke et al (Klemke et al. 2008) beschrieben, mit Superantigen beladenen Raji B-Zellen
inkubiert und die Kolokalisation von zellmembranständigen Proteinen (CD3, CD2) mittels
ImageStream® gemessen.
55
Material und Methoden
2.2.12 Migrationsassay
Zur Bestimmung der argininabhängigen Migrationsfähigkeit humaner T-Lymphozyten
wurden 1 x 106 primäre T-Lymphozyten zunächst in je 3 ml des entsprechenden Mediums
resuspendiert und in einer 24 Loch-Flachbodenplatte über Nacht bei 37°C/ 5% CO2
präinkubiert. Die Zellen wurden anschließend in 96 Loch-Transwellplatten (Corning,
Niederlande) ausgesät. Das untere Kompartiment der Transwellplatte wurde mit je 200 µl
argininfreiem bzw. argininhaltigen Medium mit oder ohne Zusatz des Chemokins SDF-1α
(100ng/ ml) befüllt. Der Ansatz ohne Zugabe von SDF-1α diente zur Bestimmung der
Spontanmigration der T-Zellen. In die oberen Kompartimente wurde jeweils 75 µl der
Zellsuspension (entspricht 5 x 104 Zellen) gegeben. Die Migrationseffizienz wurde
bezogen auf den 100% Wert, für den in das untere Kompartiment je 5 x 104 Zellen und
Medium hinzugegeben wurden. Sämtliche Bestimmungen erfolgten jeweils in Triplikaten.
Nach 4 – 5 h Inkubation bei 37°C und 5 % CO2 wurde das obere Kompartiment vorsichtig
abgenommen und je 150 µl aus dem unteren Kompartiment in ein FACS-Röhrchen
überführt. Direkt vor der Messung wurden auf jedes Röhrchen gleichmäßig mit dem
Multistepper je 50 µl FACS-Puffer der zuvor mit 1-2 Tropfen unmarkierter Plastikkügelchen
versehen wurde, verteilt. Nun wurde anhand einer bestimmten Anzahl an eingelesenen
Plastikkügelchen (z.B. 25000) die Anzahl der gewanderten Zellen gemessen. Über das
Verhältnis gemessene Kügelchen / Zellen wurde anhand des 100%-Wertes der
prozentuale Anteil an gewanderten Zellen ermittelt und verglichen. Eine statistische
Auswertung erfolgte mit GraphPad über student’s t-Test (Mean +/- SD).
2.2.13 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistikprogramms GraphPad Prism 5.0
(Graphpad Software Inc., San Diego, USA). Zum Vergleich von zwei Parametern wurde
der gepaarte Student’s t-test mit einem Signifikanzniveau von p = 0,05 verwendet. Es
wurden die Kombinationen T-Zellen in argininhaltigem oder argininfreiem Medium mit antiCD3/ -CD28-gekoppelten Partikel und T-Zellen in argininfreiem oder argininhaltigen
Medium mit Superantigen beladenen B-Zellen stimuliert verglichen und auf Signifikanz
geprüft.
56
Ergebnisse
3
Ergebnisse
3.1
Hemmung der T-Zellproliferation bei Arginindefizienz
In den letzten Jahren stellte sich durch zahlreiche Publikationen heraus, dass die ArgininDepletion ein zentraler physiologischer Mechanismus der inflammations-assoziierten
Immunsuppression ist. Erstmals wurde von der Gruppe um Ochoa die spezifische
Bedeutung der Aminosäure Arginin für die Stimulierbarkeit humaner T-Zellen untersucht
und beschrieben, dass die Abwesenheit von Arginin zu einem Verlust der Expression der
TCR-ζ−Kette (Rodriguez et al. 2002) sowie einem Arrest der Zellen in der G0-G1 Phase
des Zellzyklus führt (Rodriguez et al. 2007). In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt
werden, dass humane Granulozyten die konstitutiv exprimierte Arginase I freisetzen
können und die konsekutive extrazelluläre Arginindepletion u.a. zu einer völligen
Hemmung der Proliferation stimulierter humaner T-Zellen führt. Bei pharmakologischer
Hemmung der Arginase und Arginin-Supplementation wird diese T-Zell-Inhibition bei
granulozytär dominierter Inflammation verhindert (Munder et al. 2006). Zunächst wurden
daher
die
früher
publizierten
Daten
zur
Inhibition
der
T-Zell-Proliferation
bei
Arginindepletion aktuell verifiziert. Hierzu wurden humane primäre T-Lymphozyten in Anoder Abwesenheit von Arginin stimuliert und die Proliferation mittels [3H]-Thymidinassays
analysiert (s. Kap. 2.2.6.1). In Abb. 3.1 ist eine repräsentative [3H]-Thymidin-Messung
gezeigt, welche beispielhaft die früheren Daten (Munder et al. 2006) bestätigt. Man kann
deutlich an der inkorporierten Radioaktivität (als Ausdruck der DNA-Synthese) erkennen,
dass die aktivierten T-Zellen in Argininanwesenheit proliferieren (37480 ± 8896 Counts/
Minute (cpm)), wohingegen sich die Zellen bei Abwesenheit von Arginin (82 ± 19 cpm)
nicht teilen. Als Kontrollen wurden unstimulierte T-Zellen gemessen.
57
Ergebnisse
p= 0.0 171
50000
Counts pro Minute
40000
Abb.3.1: Proliferationsmessung humaner
T-Zellen mittels [3H]-Thymidin-Assay.
Statistische Auswertung mittels gepaartem
Student´s t-Test (Mittelwert +/- SD) eines
repräsentativen [3H]-Thymidin-Assays. TZellen wurden mit anti-CD3/-CD28 stimuliert
(schwarze Balken), unstimulierte Zellen als
Kontrolle. Dargestellt ist ein repräsentatives
Experiment von insgesamt 42 separaten
Experimenten.
30000
20000
10000
3.2
T
-A
rg
rg
A
T+
28
t ian
T+
T+
an
t i-
C
C
D
D
3/
3/
-C
-C
D
D
28
+A
-A
rg
rg
0
Etablierung der 2D-Gelelektrophorese
Zur Analyse der Frage, welche intrazellulären Mechanismen für die durch Arginindefizienz
vermittelte Suppression der T-Zellimmunantwort verantwortlich sind, wurde die Methode
der 2D-Gelelektrophorese (Kap. 2.2.8.2) angewandt. Dabei werden Proteingemische
zunächst nach der isoelektrischen Ladung der einzelnen Proteine und anschließend nach
ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Nach Färbung der Gele können hierbei Unterschiede
im Proteinexpressionsmuster verschiedener Proben sichtbar gemacht werden. Diese
Methode musste jedoch in meiner Arbeitsgruppe zunächst etabliert werden. Im Folgenden
wird die Etablierung anhand eines für T-Zellen vorgesehenen Protokolls, das von der
Arbeitsgruppe Prof. Dr. Y. Samstag / Institut für Immunologie der Universität Heidelberg
zur Verfügung gestellt wurde, beschrieben. Zunächst wurden mit dem TKM-Lysepuffer TZelllysate aus je 1x106 Jurkat T-Zellen hergestellt. Anschließend wurden TKM-T-Zelllysate
aus 1x106 humanen T-Lymphozyten verwendet. Für die isoelektrische Fokussierung wurde
zur Übersicht der pH-Bereich 3 – 10 gewählt. Die nach SDS-PAGE entstandenen Gele
wurde dann silbergefärbt (Abb.3.2).
58
Ergebnisse
SDS-PAGE
ß-Aktin
Isoelektrische Fokussierung
pH 3
pH10
Abb.3.2.1: Silbergefärbtes 2D-Gel des pH-Bereichs pH 3 – pH 10 eines TKM-T-Zelllysat. Humane T-Zellen
wurden für 48 h in argininhaltigem Medium mit anti-CD3/-CD28 stimuliert und dann mit TKM-Lysepuffer lysiert.
Zur Übersicht wurde eine 2D-Gelelektrophorese im pH-Bereich von pH 3 – pH 10 durchgeführt. Die einzelnen
dunklen Punkte (Spots) auf dem Gel zeigen je ein oder mehrere Proteine an. Der mit einem schwarzen Kreis
gekennzeichnete Spot entspricht dem Protein ß-Aktin, welches in allen untersuchten Zellen vorhanden ist und
als Orientierung bei der Auswertung diente. Für das Gel wurde eine Gesamtproteinmenge von 20 µg
aufgetragen.
Nach Erreichen einer zufriedenstellenden Reproduzierbarkeit wurden TKM-Lysate aus
humanen T-Zellen, die zuvor für 48 h in argininhaltigem oder argininfreiem Medium mit
anti-CD3/-CD28 stimuliert wurden, entsprechend analysiert. Als Kontrolle wurden Lysate
von unstimulierten T-Zellen (t= 0 h) analysiert. Pro Gel wurde jeweils die gleiche Menge
von 20 µg Gesamtprotein eingesetzt, was die reproduzierbare Detektion einer Vielzahl von
ausreichend zur Darstellung kommenden Proteinspots erlaubte. Ein breiter pH-Bereich
von pH 3 -10 erwies sich jedoch für eine Analyse individueller Proteinspots als zu
komplex, so dass zahlreiche Proteinspots zu nahe bzw. partiell oder komplett überlappend
zur Darstellung kamen. Es wurden daher engere pH Bereiche von pH 4 – 7 und pH 5 – 8
gewählt. Ferner wurden die Laufzeiten für das SDS-PAGE Gel verlängert, um eine noch
bessere Auftrennung der immer noch zahlreichen Spots zu
erreichen. Parallel hierzu
59
Ergebnisse
wurden Gele im pH Bereich von 7- 10 produziert, die nicht auswertbar waren, da es eine
zu
starke
Streifenbildung
gab,
welche
unter
anderem
durch
eine
zu
hohe
Salzkonzentration entstehen kann. Laut Angaben des Herstellers ist dies durch
„Cuploading“, eine Variante der isoelektrischen Fokussierung, bei der mobile Elektroden
verwendet und die Probe entweder am kathodischen oder anodischen Ende in ein
Plastikcup hineingegeben werden, reduzierbar. Zusätzlich können die Streifen mit einem
sogenannten DestreakReagenz vermindert werden. Dies führte jedoch nicht zum Erfolg.
Letztendlich konnten im Bereich von pH 4 - 7 reproduzierbare Gele hergestellt und partiell
sogar visuell ohne Hilfe eines automatisierten Auswertesystems auf Unterschiede
analysiert werden. Aufgrund mangelnder Quantifizierung der Silbergele, auf denen die
Spotstärke nicht immer gleich der Proteinexpression ist, können hierbei nur in manchen
Fällen Unterschiede erkannt werden und die Gele sind nur z.T. mit den zur Analyse
verwendeten SYPRO®Ruby gefärbten Gele zu vergleichen. Für den in Abb. 3.2.2
gezeigten Spot Nr.2 war es mit dieser Färbetechnik daher z.B. kaum möglich einen
Unterschied zu erkennen.
(+)Arginin
(-)Arginin
1
SDS-PAGE
1
2
2
Isoelektrische Fokussierung
+ (pH 5)
(pH 7) -
+ (pH 5)
(pH 7) -
2D-SDS-PAGE – (Silberfärbung)
60
Ergebnisse
Abb.3.2.2: Ausschnitt silbergefärbter Gele im pH-Bereich pH 5 – pH 7. Primäre humane T-Zellen wurden
48 h mit anti CD3/-CD28 in argininfreiem [(-)Arginin] oder argininhaltigem [(+)Arginin] Medium stimuliert. Die
T-Zelllysate wurden dann mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt. Der gekennzeichnete (schwarzer Kreis)
Spot 2 wurde später als phospho-Cofilin identifiziert (s. Tab. 3.3 und Abb. 3.3A). Der Spot Nr. 1 (ß-Aktin) dient
zur Orientierung auf dem jeweiligen Gel. Diese Gele konnten in fünf unabhängigen Experimenten mit T-Zellen
verschiedener Blutspender reproduziert werden.
Nachdem die Reproduzierbarkeit der Gele gewährleistet war, wurden die interessanten
Proteinspots mittels massenspektrometrischer Methoden identifiziert. Nach Testung
verschiedener Färbeverfahren (Silberfärbung, Colloidal Coomassie) wurde schließlich für
die präparative Analyse die sensitive, SYPRO®Ruby Fluoreszenzfärbung verwendet. Für
diese Färbung musste die Proteinmenge für ein präparatives Gel auf 100 µg erhöht
werden. Parallel wurde auch das Laufprogramm für die Fokussierung verändert um die
Auftrennung weiter zu optimieren und streifenfreiere Gele zu bekommen. Es wurde dann
aus
präparativen
Identifizierung
von
SYPRO®Ruby
fünf
gefärbten
Proteinspots
Gelen
durchgeführt,
eine
die
massenspektrometrische
bei
Argininabwesenheit
reproduzierbar stärker ausgeprägt waren (Tab. 3.3 und Abb. 3.3). Die Auswertung der
Gele erfolgte per Auge und der Software Proteomweaver von BioRad.
3.3
Identifizierung
veränderter
Proteinexpressionen
in
stimulierten T-Zellen bei Arginindefizienz
Nach Etablierung der 2D-Gelelektrophorese wurden primäre humane T-Zellen für 48 h in
argininfreiem oder argininhaltigen Medium mit anti-CD3/-CD28 stimuliert. Aus den TZelllysaten wurden SYPRO®Ruby gefärbte 2D-Gele hergestellt. Insgesamt konnten in
einem Gel bei Stimulation von T-Zellen fünf Proteinspots, die bei Argininmangel stärker
exprimiert waren und zuvor auch reproduzierbar in den silbergefärbten Gelen zu
detektieren waren, identifiziert und mittels Massenspektrometrie sequenziert werden. Aus
den fünf Proteinspots liessen sich sieben verschiedene Proteine identifizieren (s.Tab. 3.3).
61
Ergebnisse
Spot
Protein
1
Alpha-Tubulin, Vimentin
2
Moesin
3
WD Repeat Protein 1
4
Coronin-1A, GLSK (Glutaminase Kidney Isoform)
5
phospho-Cofilin-1
Tab.3.3: Massenspektrometrisch identifizerte Proteine mit Überexpression bei Argininabwesenheit
Interessanterweise steht der Großteil dieser Proteine in Zusammenhang mit dem
Zytoskelett der T-Zellen. Die Unterschiede in der Proteinexpression wurden im folgenden
mittels Westernblotanalyse unter Verwendung spezifischer Antikörper überprüft (Kap.
2.2.8.1). Hierbei stellte sich heraus, dass nur eines der Proteine, die inaktive
phosphorylierte Form des Cofilin-1, bei Argininabwesenheit stärker exprimiert wird. Die
Phosphorylierung
von
Cofilin
im
Bezug
auf
unstimulierte
T-Zellen
(100%
Dephosphorylierung) ist bei Argininmangel nur um 25,5 ± 18,8% reduziert, wohingegen die
Phosphorylierung bei Argininanwesenheit um 67,5 ± 20,1% reduziert ist (Vergleich der
Dephosphorylierung bei An- und Abwesenheit von Arginin: p=0.0029; n= 7 unabhängige
Experimente) (Abb.3.3C). Im Gegensatz dazu, konnte bei α-Tubulin eine verstärkte
Expression bei Argininanwesenheit gezeigt werden. Alle weiteren Proteine zeigten keine
Unterschiede in der Proteinexpression (Abb. 3.3B.) in Abhängigkeit von Arginin. Die
SYPRO®Ruby gefärbten Gele in Abb. 3.3 zeigen das Proteinmuster von stimulierten TZell-Lysaten bei Argininanwesenheit, Argininmangel und von T-Zell-Lysaten unstimulierter
Zellen im Vergleich. Die Proteinspots, aus denen die identifizierten Proteine sequenziert
wurden, sind mit schwarzen Kreisen gekennzeichnet.
62
Ergebnisse
A.
(+)Arginin
in
(-)Arginin
2
1
3
6
4
6
2
1
4
5
SDS-PAGE
3
5
+ (pH 5)
(pH 7) - + (pH 5)
(pH 7) -
Kontrolle (0h)
2
1
6
3
4
5
+ (pH 5)
Isoelektrische Fokussierung
(pH 7) -
2D-SDS-PAGE – (SYBRO®Ruby-Färbung)
63
Ergebnisse
B.
0h
48h
0h
(+)Arginin (-)Arginin
48h
(+)Arginin
(-)Arginin
pCofilin
α-Tubulin
Cofilin
ERK1/2
ERK1/2
Moesin
pMoesin
ERK1/2
ERK1/2
Vimentin
ERK1/2
Coronin-1a
ERK1/2
64
Ergebnisse
C.
p=0.0029
100
Prozent %
80
60
40
20
T+
T=
an
0
tiCD
3/
-C
D2
8+
A
T+
rg
an
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
0
Abb.3.3: 2D-Gelelektrophorese zur Analyse der bei Argininabwesenheit stärker exprimierten Proteine
und Bestätigung mittels Westernblot. Primäre humane T-Zellen wurden in argininhaltigem [(+)Arginin] oder
argininfreiem [(-)Arginin] Medium mittels anti-CD3/-CD28 stimuliert. Als Kontrolle (0h) wurden unstimulierte
Zellen zum Zeitpunkt t=0 h lysiert. A. Gezeigt werden Ausschnitte von drei repräsentativen SYPRO®Ruby
gefärbten Gelen im pH-Bereich 4-7, je Bedingung ein Gel. Die identifizierten Proteinspots sind mit schwarzen
Kreisen und einer Nummer entsprechend der Tabelle gekennzeichnet. Aus dem Proteinspot Nr. 1 konnten die
Proteine alpha-Tubulin und Vimentin identifiziert werden. Proteinspot Nr. 2 entspricht Moesin, Proteinspot Nr. 3
dem WD repeat Protein 1, Proteinspot Nr. 4 den Proteinen Coronin-1 und GLSK und aus Proteinspot Nr.5
konnte pCofilin sequenziert werden. Zur Orientierung dient Spot Nr. 6, das ß-Aktin. Es wurden je drei
unabhängige Experimente durchgeführt. B. Westernblots je eines repräsentativen Experiments der in der 2DGelanalyse identifizierten Proteine und – falls bekannt - ihrer phosphorylierten Formen: Cofilin, pCofilin, αTubulin, Moesin, pMoesin, Vimetin und Coronin-1a mit ERK1/2-Expression als Ladekontrolle. Es wurden
Westernblots von mindestens drei unabhängigen Experimenten durchgeführt. C. Grafische Darstellung des
Mittelwerts ± Standardabweichung der Westernblotdaten von pCofilin von insgesamt sieben unabhängigen
Experimenten.
3.4
Vergleich der T-Zellproliferation bei Stimulation mit antiCD3 / -CD28 und SEB-beladenen Raji B-Zellen
In den proteomischen Analysen und den folgenden Western Blot Untersuchungen hatte
sich gezeigt, dass bei T-Zell-Aktivierung die Dephosphorylierung des Proteins Cofilin-1 bei
Argininmangel ausbleibt. Der Phosphorylierungsstatus des Proteins Cofilin ist im Rahmen
der T-Zell-Aktivierung wesentlich an der Verknüpfung von T-Zell-Rezeptor-Aktivierung mit
der folgenden Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts beteiligt. In Vorbereitung der unten
dargestellten funktionellen Analysen (insbesondere zur Organisation der Immunologischen
Synapse) musste daher zunächst ein System der T-Zell-Aktivierung durch APZ etabliert
65
Ergebnisse
werden. Insbesondere war die Frage zu klären, ob die profunde Suppression der TZellfunktionen (die bis dato im Rahmen der artifiziellen Stimulation durch Antikörper
analysiert worden war) auch im zellulären APZ-Kontext feststellbar war.
Als antigenpräsentierendes System wurden Raji B-Zellen, die mit dem Superantigen SEB
beladen wurden, verwendet. Die Proliferationsrate primärer humaner T-Zellen in An- oder
Abwesenheit von Arginin wurde bei Stimulation durch beide verschiedenen Methoden
zunächst verglichen. Bei Verwendung der immortalisierten teilungsaktiven B-Zell-Linie
wurde statt der [3H]-Thymidin-Messung die Analyse der zellulären T-Zell-Proliferation
mittels CFSE-Färbung verwendet. Die Teilung der T-Zellen wurde über CFSE-Weitergabe
mit dem Durchflusszytometer gemessen (Kap. 2.2.6.2). Bei beiden Stimulationsarten
wurden T-Zellen, die in argininhaltigem Medium inkubiert wurden, gleichermaßen zur
Proliferation angeregt. In argininfreiem Medium konnte jeweils keine Proliferation
nachgewiesen werden. Insgesamt war die Proliferationsrate bei superantigener APZbasierter Stimulation im Vergleich zur Stimulation mit anti-CD3/-CD28 geringer (Abb.3.4).
(+)Arginin
(-)Arginin
Anti-CD3/-CD28
79,78%
0,57%
APZ/ SEB
38,48%
0,38%
Kontrolle
1,12%
0,83%
CFSE (FL-1)-Gehalt
66
Ergebnisse
Abb.3.4: Bestimmung der Proliferationsrate humaner T-Zellen mittels FACS-Analyse. Humane T-Zellen
wurden mit CFSE gefärbt und für 96 h mit anti-CD3/ -CD28 oder antigenpräsentierenden SEB-beladenen Raji
B-Zellen (APZ/ SEB) in (-)Arginin- oder (+)Argininmedium stimuliert. Als Kontrolle wurden unstimulierte TZellen in den Medien inkubiert. Gezeigt ist der CFSE-Gehalt und die Proliferationsrate in Prozent anhand von
Histogrammen. Die Abnahme des CFSE-Gehaltes, d.h. die kleiner werdenden Peaks nach links, zeigt eine
Teilung der Zellen an. M1 zeigt den Anteil der proliferierten Zellen. Die Prozentangaben beziehen sich auf M1.
Zusammenfassend ist der Proliferationsdefekt humaner T-Lymphozyten bei Abwesenheit
von Arginin auch im Zell-Zell-Kontext der Stimulation durch APZ feststellbar, so dass
dieses System für die weiteren Analysen zum Aufbau der immunologischen Synapse
validiert zur Verfügung stand.
3.5
Ausbildung der immunologischen Synapse zwischen TZellen und APZ
Die Ausbildung der immunologischen Synapse ist eines der wichtigsten Ereignisse
während der T-Zellaktivierung. Hierbei wird das Zytoskelett der Zelle in großem Maße
reorganisiert, um den bestmöglichen Kontakt zur APZ herzustellen. Das identifizierte
Cofilin-1 ist ein Aktin-bindendes Protein, welches an diesem Prozess aktiv beteiligt ist.
Cofilin ist entscheidend für die Aktin-Polymerisation und Depolymerisation und somit auch
für die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts. In vitro kann Cofilin an G- und F-Aktin
binden,
Aktinfilamente
schneiden
und
depolymerisieren
sowie
eine
verstärkte
Polymerisation auslösen (Bamburg 1999, Condeelis 2001). Da bei Argininabwesenheit
aufgrund fehlender bzw. reduzierter Dephosphorylierung die inaktive phoshorylierte Form
dieses Proteins verstärkt vorhanden ist, wurde die Auswirkung dieser fehlenden
Dephosphorylierung
auf
die
Ausbildung
der
Immunologischen
Synapse
mittels
®
ImageStream (Durchflusszytometer mit integriertem Fluoreszenz-Mikroskop, Kap. 2.2.11)
untersucht. Für diese Analyse wurden humane T-Zellen über Nacht in argininhaltigem oder
argininfreiem Medium präinkubiert und am nächsten Tag mit Superantigen beladenen BZellen oder unbeladenen B-Zellen stimuliert. Anschließend wurden die Zellen mit Fokus
auf den T-Zell-/ B-Zellkontakt gemessen, indem die Akkumulation von CD3 und CD2 im
Kontaktbereich
nach
T-Zell-Aktivierung
mittels
spezifischer,
fluoreszenzmarkierter
Antikörper detektiert wurde. Zusätzlich wurden die Zellen mit dem Kernfarbstoff Hoechst
gefärbt, um die Zellen sichtbar zu machen und nur die T-Zell-/ B-Zellpaare untersuchen zu
können.
67
Ergebnisse
Die Messungen zeigten, dass bei Argininmangel die Ausbildung von T-Zell-/BZellkontakten reduziert war (s. Abb. 3.5B). Ferner ist innerhalb der ausgebildeten T-BKontaktzonen eine signifikant verminderte Akkumulation von CD3- und CD2-Rezeptoren
im Kontaktbereich zu messen (s. Abb.3.5 A, C und D).
A.
(+) Arginin
Merge
+SEB
*
T
T
*
B.
Hoechst
CD3
CD2
-SEB
CD2
Merge
*
+SEB
CD3
-SEB
Hoechst
(-) Arginin
T
T
*
C.
CD2/CD3
Vielfacher Anstieg
T-/B-Zellpaare mit
CD2- und CD3-Anreicherung
(%)
T-/B-Zellkontakte
- SEB
+ SEB
- SEB +Arg
-Arg
+SEB
68
Ergebnisse
D.
E.
Vielfacher Anstieg
CD2
Vielfacher Anstieg
CD3
- SEB +Arg -Arg
+ SEB
- SEB +Arg -Arg
+ SEB
Abb.3.5: Ausbildung der immunologischen Synapse in Abhängigkeit von Arginin: Image®Stream
Analyse der Kontaktzone zwischen T-Zellen und antigenpräsentierenden B-Zellen. Humane T-Zellen
wurden mit SEB-beladenen B-Zellen in An- oder Abwesenheit von Arginin koinkubiert und die T-/ B®
Zellkontakte wurden mittels Image Stream untersucht. Hierbei wurde die Ausbildung der Kontakte und die
Ansammlung von CD3 und CD2 in diesem Bereich gemessen. A. Repräsentative Aufnahmen multispektraler
Messungen einzelner Zellkontaktereignisse bei Stimulation in argininfreiem [(-)Arginin] oder argininhaltigem
[(+)Arginin] Medium mit SEB-Superantigen beladenen Raji B-Zellen (untere Reihe) bzw. unbeladenen B-Zellen
(obere Reihe) mittels Image®Stream. Zur Darstellung einzelner Zellen wurden diese mit dem Kernfarbstoff
Hoechst (blau) gefärbt. Um die Akkumulation von CD3 und CD2 in der sich entwickelnden immunologischen
Synapse zu analysieren, wurde mit anti-CD3-PE/TexasRed und mit anti-CD2-FITC gefärbt. Pro Probe wurden
jeweils 20.000 Ereignisse gemessen. Am Ende jeder Messreihe ist eine Überlagerung zu sehen (merge). B.
Die Grafische Darstellung zeigt die kombinierte relative Fluoreszenzintensität innerhalb der Kontaktzone in Anoder Abwesenheit von Arginin, welche die relative Menge reifer immunologischer Synapsen, mit Akkumulation
von CD3 und CD2 repräsentiert. C. Die Grafik zeigt die Anreicherung von CD2 und CD3 kombiniert in der
Kontaktzone in An- und Abwesenheit von Arginin. D. und E. Grafische Darstellung der Einzelwerte der CD2und CD3-Akkumulation im Kontaktbereich bei Argininanwesenheit und Argininabwesenheit. Zur Auswertung
wurde der Student´s t-test angewendet. Gezeigt sind als Werte die Mittelwerte mit Standardabweichung dreier
unabhängiger Experimente.
69
Ergebnisse
3.6
Einfluss von Arginin auf den F-Aktingehalt aktivierter
humaner T-Lymphozyten
F-Aktin ist als Bestandteil des Aktin-Zytoskeletts u.a. entscheidend an dessen
dynamischer Reorganisation bei T-Zell-Aktivierung beteiligt. Durch Polymerisation und
Depolymerisation
von
F-Aktinfilamenten
werden
Prozesse
wie
intrazellulärer
Proteintransport und Zellfortbewegung reguliert. Da sich während der Ausbildung der
Immunologischen Synapse das Zytoskelett der T-Zelle zur APZ hinbewegen muss und
Proteine wie CD3 und CD2 vermehrt an die Kontaktstellen rekrutiert werden, ist es von
großer Bedeutung, dass F-Aktin dementsprechend vermehrt gebildet wird (Samstag et al.
2003).
Um
zu
untersuchen,
ob
die
bei
Argininmangel
feststellbare
fehlende
Dephosphorylierung von Cofilin-1 sowie die verminderte Bildung der Immunologischen
Synapse (Abb.3.5) mit einem veränderten F-Aktingehalt in Verbindung stehen, wurde das
intrazelluläre F-Aktin mittels Durchflusszytometrie (Kap. 2.2.5.2) gemessen. Die Zellen
wurden hierzu mit FITC-markiertem Phalloidin, einem Pilzgift, welches in den Zellen an FAktin bindet und dessen Depolymerisation verhindert, gefärbt. Anhand des gebundenen
fluoreszenz-markierten Phalloidin kann somit über die Fluoreszenzintensität der Gehalt an
F-Aktin in den Zellen bestimmt werden.
Die Auswertung der FACS-Messungen erfolgte anhand des gesamten gemessenen
Zellpools über die charakteristischen Parameter Größe im "forward scatter" (FSC) gegen
Granularität im "side scatter" (SSC). Für die Analyse des intrazellulären F-Aktingehalts
wurde ausgehend von der zuvor ausgewählten T-Zellpopulation auf CD3+ und Phalloidinpositive T-Zellen selektiert, um die B-Zellen auszuschließen. Somit wurde der intrazelluläre
F-Aktingehalt nur in CD3+ T-Zellen analysiert (Abb.3.6.1). Als Kontrollzellen zur Setzung
der Quadrantengates dienten ungefärbte T-Zellen. Bei der Stimulation mit anti-CD3/-CD28
wurde gleich verfahren. Die aufgrund der Selektion angezeigten Mittelwerte geben die
durchschnittliche Fluoreszenz an, d.h. je höher die Fluoreszenz, desto mehr F-Aktin ist in
der Zelle vorhanden. Es folgte eine statistische Analyse (gepaarter Student´s t-Test,
Mittelwert +/- SD), hierbei wurden jeweils die Werte der Ergebnisse einer Stimulationsart
und -zeit für die verschiedenen Medien verglichen (Abb.3.6.2).
Humane T-Lymphozyten wurden mittels anti-CD3/ -CD28 bzw. mittels SEB-beladenen BZellen stimuliert. In 3 - 8 Zeitkinetik-Experimenten wurde der F-Aktingehalt in den T-Zellen
nach 15, 30, 60 min bzw. 6h, 24h und 48h bestimmt. Hierbei zeigte sich ausschließlich
70
Ergebnisse
nach 48 h eine signifikante Veränderung des F-Aktingehaltes in Abhängigkeit von An- oder
Abwesenheit von Arginin (Abb 3.6.2A). Interessanterweise fand sich in Abhängigkeit von
der Stimulationsart (Antikörper-Stimulation bzw. APZ-basiert) jedoch eine diametral
entgegengesetzte Regulation des F-Aktingehaltes. Bei der Stimulation mit anti-CD3/-CD28
fand sich bei Abwesenheit von Arginin ein signifikant (p=0.0133) reduzierter F-Aktingehalt,
während bei Stimulation mit Superantigen-beladenen B-Zellen bei Fehlen von Arginin im
Rahmen der Stimulation signifikant mehr F-Aktin in den humanen T-Zellen nachweisbar
war (p=0.0099) (Abb 3.6.2A). In Abbildung 3.6.2A ist ferner zum Vergleich ein früher
Zeitpunkt nach 15 min Stimulation gezeigt. Hier waren keine signifikanten Unterschiede in
Abhängigkeit vom Arginin bzw. relativ zu unstimulierten Kontrollzellen zu erkennen
A.
B.
B-Zellpopulation
CD3/ Phalloidin
positive Zellen
T-Zellpopulation
C.
Abb.3.6.1: Auswertestrategie für intrazelluläre durchflusszytometrische F-Aktinmessung von T-Zellen.
Zur Untersuchung des intrazellulären F-Aktingehalts wurden je 20 000 Zellen gezählt. A. Die T-Zellen wurden
durch Nachweis der CD3-Expression ausgewählt und nach B. CD3/Phalloidin doppelt positiven Zellen
selektiert. Der Quadrant wurde anhand der Negativkontrolle (ungefärbte T-Zellen) gesetzt. C. Anhand eines
Histogramms wurde die Fluoreszenzintensität des Phalloidins (= F-Aktingehalt) angezeigt.
71
T+
rg
rg
rg
-A
+A
B
T+
B
TA
T+
an
tiC
D
T+
3/
-C
an
D
t i28
C
+A
D
3/
rg
-C
D
2
8T+
A
B
rg
+S
EB
+A
T+
B
rg
+S
EB
-A
rg
T+
A
rg
Prozent %
T+
rg
rg
rg
-A
+A
B
T+
B
TA
T+
an
tiC
D
T+
3/
-C
an
D
t i28
C
+A
D
3/
rg
-C
D
2
8T+
A
B
rg
+S
EB
+A
T+
B
rg
+S
EB
-A
rg
T+
A
rg
Prozent %
Ergebnisse
A.
F-Aktin 15 m in
200
150
100
50
0
F-Aktin 48 h
200
p=0.0010
150
p=0.0133
100
50
0
72
Ergebnisse
B.
Stimulation mit SEB beladenen B-Zellen
Stimulation mit anti-CD3/ -CD28
ohne Arginin
mit Arginin
FITC-Phalloidin
Abb.3.6.2: Messen des intrazellulären F-Aktingehalts der T-Zellen mittels Durchflusszytometrie.
Humane T-Zellen wurden 15 min oder 48 h in argininhaltigem (+Arg) oder argininfreiem (-Arg) Medium mit antiCD3/-CD28 (T+anti-CD3-CD28) oder mit bestrahlten SEB-beladenen B-Zellen (T+B+SEB) stimuliert und
anschließend mit FITC-Phalloidin gefärbt. Als Kontrollen wurden T-Zellen alleine und T-Zellen mit unbeladenen
B-Zellen in den beiden Medien parallel inkubiert. A. Analyse der Daten von jeweils 6 unabhängigen
Experimenten pro Zeitpunkt mittels gepaartem Stundent´s t-Test (Mittelwert +/- Standardabweichung). Die
Werte der in argininhaltigem (T+anti-CD3/-CD28+Arg/ T+B+SEB+Arg) Medium stimulierten Zellen wurden
jeweils auf 100% normiert, um eine bessere interexperimentelle Vergleichbarkeit zu ermöglichen. Auch die
Kontrollen wurden jeweils auf diesen Wert bezogen. B. Overlay-Histogramm eines repräsentativen
Experiments nach 48 h Stimulation mit SEB-beladenen B-Zellen (links) oder anti-CD3/-CD28 (rechts) in
argininhaltigem (rot) oder argininfreiem Medium (grün).
3.7
Einfluss von Arginin auf die Chemotaxis humaner TLymphozyten
Die Migration ist eine wichtige T-Zell-Effektorfunktion, welche auf die Reorganisation des
Aktin-Zytoskeletts angewiesen ist. Bei einer Zellfortbewegung wie der Migration, werden FAktinfilamente auf einer Seite der Zelle abgebaut und auf einer anderen wieder aufgebaut
und in Bewegungsrichtung der Zelle polarisiert. Es bildet sich eine sogenannte Zellfront,
die „leading edge“, in der sich das F-Aktin anreichert und zu einem dichten Netzwerk wird.
Ist die F-Aktinbildung gestört, so könnte sich das auch auf die Migration der T-Zellen, ein
entscheidender Prozess bei der T-Zellantwort, auswirken (Samstag et al. 2003).
Um die chemotaktische Migration primärer humaner T-Zellen zu untersuchen, wurde als
Modellsystem ein Migrationsassay (Kap. 2.2.12) mit dem Chemokin SDF-1α als
Chemotaktikum im Labor etabliert. Für diese Messung wurde ein 2-Kompartiment-System
mit einer oberen und einer unteren Kammer, getrennt durch einen Membranfilter,
verwendet. In die untere Kammer wurde argininhaltiges oder argininfreies Medium mit
oder ohne das Chemokin SDF-1α gegeben. In die obere Kammer wurden die T-Zellen
73
Ergebnisse
gegeben, die in dem jeweiligen Medium über Nacht präinkubiert worden waren. Als
Bezugswert (100%) wurden in die untere Kammer T-Zellen im entsprechenden Medium
gegeben. Die Anzahl der gewanderten T-Zellen wurde nach 5 h im Durchflusszytometer
gemessen.
Es konnten keine Unterschiede in der chemotaktischen Migration der T-Zellen in
Abhängigkeit von extrazellulärem Arginin festgestellt werden. In argininfreiem Medium lag
der prozentuale Anteil der gewanderten Zellen bei durchschnittlich 53 ± 21,1%, in
argininhaltigem Medium bei 50 ± 30%. Die Spontanmigration lag bei (+)Arginin-Medium
bei durchschnittlich 7,8 ± 5,5%, und bei (-)Arginin-Medium bei 9,5 ± 7% (Abb.3.7).
Migrationsassay
100
Proze nt %
80
60
40
20
0
K + Arg
Kontrolle
K - Arg
SDF + Arg
Migration
SDF - Arg
ohne SDF + Arg
ohne SDF - Arg
Spontanmigration
Abb.3.7: Durchflusszytometrische Bestimmung der chemotaktischen Migration humaner T-Zellen.
Humane T-Zellen wurden in argininhaltigem (+Arg) oder argininfreiem (-Arg) Medium in einem
2-Kompartiment-System (obere Kammer: T-Zellen; untere Kammer: Chemokin) mit SDF-1α (SDF+Arg/ -Arg))
oder ohne SDF-1α (ohne SDF+Arg/ -Arg, entspricht der Spontanmigration der T-Zellen in das untere
Kompartiment) inkubiert. Als 100% Wert/ Kontrolle wurden jeweils die eingesetzte Anzahl an T-Zellen in dem
jeweiligem Medium (K+Arg, K-Arg) gemessen. Nach 5 h Inkubation wurde die Anzahl der T-Zellen im unteren
Kompartiment in den verschiedenen Medienbedingungen ausgezählt und in Relation zur maximal möglichen
Migration (= 100%) gesetzt. Die Grafik zeigt die Zusammenfassung von vier unabhängig durchgeführten
Experimenten, dargestellt sind jeweils Mittelwert +/- Standardabweichung. Die statistische Auswertung erfolgte
mittels Student´s t-Test. Die Kontrollwerte wurden auf 100% gesetzt.
74
Ergebnisse
3.8
Regulation der Zytokinsynthese und -sekretion in humanen
T-Zellen bei Stimulation in argininfreiem Medium
3.8.1 Extrazelluläres IFN-γ und IL-2
Das Fehlen von Arginin führt zu einer signifikanten Suppression der Synthese von IFN-γ
durch primäre humane T-Lymphozyten (Munder et al. 2006). Dieser Suppression liegt
offenbar eine posttranskriptionelle Inhibition zugrunde, da die IFN-γ mRNA Produktion bei
T-Zell-Stimulation unabhängig von der Argininkonzentration ist (Munder et al. 2006). Des
Weiteren ist bekannt, dass die Sekretion von IFN-γ bei Blockierung der Bindefähigkeit von
Cofilin an F-Aktin gestört ist (Eibert et al. 2004). Neben IFN-γ sezernieren humane TLymphozyten bei Aktivierung auch andere spezifische Zytokine. Von großer Bedeutung für
Wachstum, Zellteilung und Expansion einer T-Zellpopulation ist hierbei das Zytokin IL-2,
welches nach Sekretion durch die T-Zellen auto- oder parakrin wesentlich für die
Expansion der T-Zellpopulation ist. Ein Defekt der IL-2 Produktion könnte u.a. die
Suppression der T-Zellproliferation bei Argininmangel partiell oder komplett erklären. Um
festzustellen, ob diese Effektorantwort bei Argininmangel ebenfalls gehemmt ist, wurde
die Synthese von IL-2 und – im Vergleich – IFN-γ nach T-Zellaktivierung mittels ELISA (
Kap. 2.2.7.1) im Zellkulturüberstand gemessen (Abb. 3.8.1 ). Die früheren Untersuchungen
zur Inhibition von IFN-γ wurden ferner durch umfangreiche Zeitkinetik-Analysen sowie um
den Vergleich von zwei unterschiedlichen Stimulationsarten (antikörper-basiert versus
APZ) erweitert.
Die bekannte Suppression der IFN-γ Produktion zeigte sich im Zellkulturüberstand bereits
sehr früh im Rahmen der T-Zell-Aktivierung. Sowohl bei Stimulation mittels anti-CD3/CD28 wie auch bei Aktivierung mittels APZ fand sich bei Argininabwesenheit schon nach
6 h eine signifikant geringere Konzentration an IFN-γ bei beiden Stimulationsarten (antiCD3/-CD28: Reduktion um 52,1 ± 7,1%, p=0.0062; Superantigen beladene B-Zellen:
Reduktion um 37,8 ± 22,5%, p=0.0437). Im Rahmen der protrahierten Stimulation wurden
diese argininabhängigen Unterschiede der IFN-γ Konzentrationen im Zellkulturüberstand
bis hin zum letzten Messzeitpunkt (t= 96 h) immer größer (t= 96 h: anti-CD3/-CD28:
Reduktion um 87,1 ± 6,5%, p=0.0019; Superantigen beladene B-Zellen: Reduktion um
80,4 ± 4,4 %, p=0.001) (Abb. 3.8.1A).
75
Ergebnisse
Bei der Bestimmung von IL-2 im Überstand zeigte sich initial (t= 6h) ebenfalls eine
Reduktion der Zytokinkonzentration bei Arginindepletion (anti-CD3/-CD28: Reduktion um
54,9 ± 20,2 %, p=0.0121; Superantigen beladene B-Zellen: Reduktion um 60.1 ± 15,6%,
p=0.0002). Im weiteren Verlauf des Experimentes war allerdings eine zunehmende
Angleichung der Zytokinkonzentrationen in den Überständen mittels IL-2 ELISA messbar
(Abb. 3.8.1B), so dass schließlich z.B. zum Zeitpunkt t=96 h keine argininabhängigen
Unterschiede in der IL-2 Menge im Überstand mehr messbar waren (anti-CD3/-CD28: IL-2
Konzentration im argininfreien Medium entspricht 120 ± 71,3 % der in argininhaltigem
Medium, p= 0.5642; Superantigen beladene B-Zellen: IL-2 Konzentration im argininfreien
Medium entspricht 162,8 ± 130,3% der in argininhaltigem Medium, p= 0.3416) (Abb.
3.8.1B).
A.
IFN-γ ELISA
p=0.0062
B.
IL-2 ELISA
100
100
80
Proze nt %
80
60
40
20
60
40
20
T+
an
tiC
D
3/
T+
-C
an
D
28
ti+A
C
D
rg
3/
-C
D
28
-A
T+
rg
B
+S
E
B
+A
T+
rg
B
+S
EB
-A
rg
0
6h
0
T+
an
tiCD
3/
-C
D2
T+
8+
an
Ar
tig
CD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B
+A
rg
T+
B+
SE
BAr
g
Prozent %
p=0.0002
p=0.0121
p=0.0437
6h
76
Ergebnisse
150
p=0.0001
p=0.01
Proze nt %
100
80
Prozent %
p=0.6621
p=0.002
60
40
100
50
20
0
-C
D2
T+
8+
an
Ar
tig
CD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B
+A
rg
T+
B+
SE
BAr
g
i-C
D3
/
T+
an
t
T+
an
tiCD
3/
-C
T+
D2
an
8+
tiAr
CD
g
3/
-C
D2
8Ar
T+
g
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B+
SE
BAr
g
0
48h
48h
p=0.001
p=0.0019
p=0.3416
100
300
p=0.5642
Proze nt %
Prozent %
80
60
40
200
100
20
0
i-C
D3
/
-C
D2
T+
8+
an
Ar
tig
CD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B
+A
rg
T+
B+
SE
BAr
g
96h
T+
an
t
T+
an
t
i-C
D3
/
-C
D2
T+
8+
an
Ar
tig
CD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B
+A
rg
T+
B+
SE
BAr
g
0
96h
Abb.3.8.1: Einfluss von Arginin auf die Synthese von IL-2 und IFN-γ nach Stimulation humaner TLymphozyten. Humane T-Zellen wurden 6 h, 48 h und 96 h in argininhaltigem (+Arg, gefüllte Balken) oder
argininfreiem Medium (-Arg, Balken mit Muster) mit anti-CD3/-CD28 (beads) oder mit SEB-beladenen B-Zellen
(B+SEB) stimuliert. Nach den entsprechenden Inkubationszeiten wurden die zellfreien Überstände geerntet
und die Konzentrationen der Zytokine mittels ELISA gemessen. Gepoolte Analyse der IFN-γ (A) und IL-2 (B)
ELISA-Daten mittels gepaartem Student´s t-Test von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Gezeigt
sind je die Mittelwerte +/- Standardabweichungen. Zur besseren Vergleichbarkeit zwischen den einzelnen
Experimenten wurden die Werte für Zellen, die in argininhaltigem Medium stimuliert wurden, auf 100 %
gesetzt.
77
Ergebnisse
3.8.2 Intrazelluläres IFN-γ und IL-2
Nachdem sich in den Messungen zum extrazellulär akkumulierenden IFN-γ und IL-2 in den
ELISA-Experimenten gezeigt hatte, dass – im Gegensatz zu IFN-γ – humane TLymphozyten bei Arginindefizienz nach einer initial verzögerten IL-2 Produktion im
weiteren Verlauf keinen Defekt in der Synthese von IL-2 aufweisen, sollte diese
Diskrepanz zwischen den beiden Zytokinen weiter analysiert werden. Da offenbar kein
genereller Zytokin-Synthesedefekt bei Abwesenheit von Arginin in humanen T-Zellen
vorliegt (Abb 3.8.1B) und ferner die aktivierungsabhängige Transkription von IFN-γ bei
Arginindefizienz vollkommen intakt ist (Munder et al. 2006), könnte die fehlende IFN-γ
Akkumulation im Zellkulturüberstand auf einem posttranskriptionellen Synthesedefekt oder
auf einem Sekretionsdefekt des Translationsproduktes beruhen. Zur Klärung dieser Frage
bot sich hierfür die Technik der intrazellulären Zytokinmessung mittels Durchflußzytometrie
an (Kap.2.2.5.1).
Bei IL-2 zeigte sich bei Stimulation der T-Zellen mittels anti-CD3/ -CD28 bzw. mit SEBbeladenen B-Zellen eine initial (z.B. bei Stimulation mit anti-CD3/-CD28 nach 6h:
Reduktion um 49,1 ± 22,3%) verzögerte Zytokinsynthese intrazellulär. Im weiteren Verlauf
(z.B. bei Stimulation mit anti-CD3/-CD28 nach 48h: Anstieg um 52,4 ± 94,4% im Vergleich
zur Stimulation in argininhaltigen Medium) gleicht sich diese protrahierte IL-2 Expression
bei Abwesenheit von Arginin jedoch an, während an den späten Zeitpunkten (72 h, 96 h)
(Abb. 3.8.2.2B), vermutlich aufgrund der bereits erfolgten vollständigen Sekretion des
Zytokins, keine relevante intrazelluläre Expression von IL-2 mehr messbar ist. Ein
repräsentatives Experiment wird jeweils in Abb. 3.8.2.1A. (Antikörper-basierte Stimulation)
und Abb.3.8.2.1B. (APZ-basierte Stimulation) gezeigt.
Im Fall von IFN-γ ist die Reduktion der zytokinproduzierenden T-Zellen initial zum
Zeitpunkt t=6 h bei Stimulation in argininfreiem und argininhaltigem Medium vergleichbar,
wobei tendenziell bei Argininmangel weniger Zellen IFN-γ intrazellulär exprimieren
(Stimulation mit anti-CD3/-CD28: Reduktion um 24,9 ± 15,7%; SEB Stimulation: 22,8 ±
23,75%). Im weiteren Verlauf ist bei Stimulation in Argininabwesenheit nach 48 h eine
reduzierte Frequenz IFN-γ+ T-Zellen im Vergleich zur Stimulation in argininhaltigem
Medium messbar (Stimulation mit anti-CD3/-CD28: Reduktion um 40,2 ± 38,9%; SEB
Stimulation: 49,8 ± 33,7% in argininfreiem Medium) (Abb.3.8.2.2A). Zu den späteren
Zeitpunkten (72 h, 96 h) ist – vergleichbar den Ergebnissen von IL-2 – auch keine
relevante intrazelluläre Expression von IFN-γ mehr feststellbar. Ein repräsentatives
78
Ergebnisse
Experiment wird jeweils in Abb. 3.8.2.1C. (Antikörper-basierte Stimulation) und
Abb.3.8.2.1D. (APZ-basierte Stimulation) gezeigt.
79
Ergebnisse
A.
Stimulation mit anti-CD3/-CD28
IL-2
(+)Arginin
(-)Arginin
4,43%
1,98 %
6h
9,68%
8,71%
24h
0,35%
3,72%
48h
0,14 %
0,89 %
72h
0,27 %
0,64 %
96h
80
Ergebnisse
B.
Stimulation mit SEB beladenen B-Zellen
IL-2
(+)Arginin
(-)Arginin
3,33 %
3,86 %
6h
5,48 %
3,65 %
24h
1,65 %
9,77 %
48h
0,28 %
0,75 %
72h
0,12 %
0,93 %
96h
81
Ergebnisse
C.
Stimulation mit anti-CD3/-CD28
IFN-γ
(+)Arginin
(-)Arginin
3,85 %
3,67 %
6h
2,16 %
1,40 %
24h
1,78 %
0,32 %
48h
1,11 %
1,2 %
72h
0,25%
1.6 %
96h
82
Ergebnisse
D.
Stimulation mit SEB beladenen B-Zellen
IFN-γ
(+)Arginin
(-)Arginin
1,48 %
0,7 %
6h
3,52 %
2,37 %
24h
5,46 %
1,0%
48h
0,69 %
2,27 %
72h
0,11 %
0,2 %
96h
83
Ergebnisse
Abb.3.8.2.1: Bestimmung der intrazellulären Expression von IL-2 und IFN-γ mittels
Durchflusszytometrie. Humane T-Zellen wurden 6 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h in argininhaltigem (+ Arginin)
oder argininfreiem (- Arginin) Medium mit anti-CD3/-CD28 (beads) oder SEB-beladenen B-Zellen stimuliert.
Nach den entsprechenden Inkubationszeiten wurde die intrazelluläre Expression von Il-2 (A. (=Beads)+ B.
(=SEB)) und IFN-γ (C. (=Beads)+ D. (=SEB)) nach entsprechender Färbung mittels durchflusszytometrischer
Analyse bestimmt. Die Quadrantengates wurden entsprechend der Kontrollen (Färbungen mit entsprechenden
Isotypantikörpern) gesetzt. Im rechten oberen Quadranten sind jeweils die Frequenzen der aktivierten (CD69+)
T-Zellen angegeben, welche intrazellulär IFN-γ exprimieren. Die gezeigten Dotblots stammen aus je einem
unabhängigen Experiment von insgesamt 3-8 Experimenten.
A.
IFN-γ intrazellulär
B.
IL-2 intrazellulär
400
150
p=0.0014
p=0.03
Proze nt %
Prozent %
300
100
50
p=0.003
p=0.8247
100
0
i-C
D3
/
-C
D2
T+
8+
an
Ar
tig
CD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B+
SE
BAr
g
T+
an
tiCD
3/
-C
D2
T+
an
8+
tiAr
CD
g
3/
-C
D
28
-A
rg
T+
B+
SE
B
+A
rg
T+
B+
SE
B
-A
rg
0
T+
an
t
200
6h
6h
150
p=0.0093
p=0.4544
400
100
300
Proze nt %
Prozent %
p=0.0052
50
p=0.348
200
100
24h
0
T+
an
tiCD
3/
-C
T+
D2
an
8+
tiAr
CD
g
3/
-C
D
28
-A
rg
T+
B+
SE
B+
Ar
T+
g
B+
SE
BA
rg
T+
an
t
i-C
D3
/-C
T+
D2
an
8+
tiAr
CD
g
3/
-C
D2
8Ar
T+
g
B+
SE
B+
Ar
T+
g
B+
SE
BAr
g
0
24h
84
Ergebnisse
150
p=0.0223
6000
p=0.0195
100
Proze nt %
Prozent %
p=0.0022
50
4000
2000
p=0.0187
48h
0
T+
an
tiCD
3/
-C
D2
T+
an
8+
Ar
tiCD
g
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B
+A
rg
T+
B+
SE
BAr
g
T+
an
t
T+
an
tiCD
3/
-C
D2
8+
A
rg
i-C
D3
/-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B+
SE
BAr
g
0
48h
Abb.3.8.2.2: Quantifizierung und statistische Auswertung der intrazellulären Expression von IFN-γ und
IL-2 in aktivierten humanen T-Zellen in Abhängigkeit von Arginin. Analysiert wurden sämtliche
Experimente zur intrazellulären Zytokinexpression (n= 3-8 für SEB-Stimulation, n= 3-8 für anti-CD3/-CD28Stimulation) Gezeigt werden jeweils die Mittelwerte +/- Standardabweichungen der intrazellulär Zytokinexprimierenden T-Zellen (in %) für IFN-γ (A) und IL-2 (B). Die statistische Auswertung zur Ermittlung der
Signifikanz (p-Werte sind in den einzelnen Diagrammen oberhalb der jeweiligen Balken angegeben) erfolgte
mit Hilfe des gepaarten Student’s t-test.
Diese Daten sprechen zusammenfassend gegen einen Sekretionsdefekt als Ursache der
reduzierten extrazellulären IFN-γ Konzentration bei T-Zell-Stimulation in Argininmangel.
Offenbar liegt vielmehr eine posttranskriptionelle Synthesestörung für IFN-γ vor. Im
Gegensatz hierzu ist die Synthese von IL-2 im Wesentlichen unbeeinträchtigt durch das
vollständige Fehlen der Aminosäure Arginin.
3.9
Weitere Zytokine
Nachdem die detaillierten Analysen zur Produktion der Zytokine IL-2 und IFN-γ gezeigt
hatten, dass bei Arginindefizienz zytokinspezifische Regulationsmechanismen in humanen
T-Zellen vorliegen, sollten weitere wichtige pro- und antiinflammatorische Zytokine
diesbezüglich analysiert werden. Hierzu bot sich die Technik der Zytokin-Quantifizierung
mittels Multiplex-Analyse an, da so aus einer Probe parallel viele Zytokine gemessen
85
Ergebnisse
werden können. Es wurden T-Zellen für 24 h oder 96 h in argininhaltigem oder
argininfreiem Medium stimuliert und die Zellkulturüberstände anschließend für die
Multiplex-Analysen
(Kooperation
mit
Herrn
Dr.
Martin
Schiller;
Medizinische
Universitätsklinik Heidelberg) geerntet. Als validierende Kontrolle im Vergleich zu den
Untersuchungen mittels ELISA (3.8.1) und intrazellulärer durchflußzytometrischer Analyse
(3.8.2) wurden erneut auch die Zytokine IL-2 und IFN-γ mittels Multiplex-Analyse bestimmt.
In drei voneinander unabhängigen Experimenten mit primären humanen T-Lymphozyten
von
unterschiedlichen
gesunden
Blutspendern
zeigte
sich
eine
reproduzierbare
Dichotomie in der Zytokinregulation bei Arginin-Defizienz. Es fand sich – analog der für
IFN-γ beobachteten Suppression bei Argininmangel (z.B. nach t=24 h bei Antikörperbasierter Stimulation: Reduktion um 90,5 ± 5,4%; p=0.0012) – auch bei den Zytokinen
TNF-β und IL-10 eine ausgeprägte Suppression der Synthese bei Fehlen der Aminosäure
Arginin (Abb. 3.9A). Die Inhibition ist dabei sowohl bei antikörper-basierter wie auch bei
APZ-basierter T-Zell-Stimulation sowohl früh (24 h) wie auch spät (nach 96 h)
gleichermaßen messbar (z.B. bei IL-10 bei Stimulation mit SEB-beladenen B-Zellen, t=24
h: Reduktion um 92,1 ± 7,4%; p<0.0021; t=96 h: Reduktion um 95,1 ± 4,9%; p=0.0009)
(Abb. 3.9A). Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die Zytokine IL-2, IL-6 und IL-8 eine
gleichartige, durch Fehlen von Arginin im Wesentlichen unbeeinträchtigte Sekretion in den
Zellkulturüberstand (z.B. bei IL-2, antikörper-basierter Stimulation, t=96 h: 106,6 ± 38,6 %
des Wertes bei Argininanwesenheit) (Abb.3.9C). Für TNF-α fand sich lediglich eine
partielle Suppression zum späten Zeitpunkt bei antikörper-basierter Stimulation (Reduktion
um 54,3 ± 35,7% bei Stimulation mit anti-CD3/-CD28), so dass hier die Zuteilung zu einer
der beiden vorigen Zytokin-Gruppen (Suppression / Keine Suppression) nicht ganz klar ist
(Abb. 3.9B).
Die Zytokine IL-4, IL-5, IL-1ß und IL-12p70 wurden von den T-Zellen reproduzierbar bei
unseren Aktivierungsbedingungen nicht sezerniert (Tab.3 im Anhang).
86
50
50
0
0
TNF- ß 24 h
150
p= 0.0155
100
50
50
0
0
Ar
g
p= 0.0002
Ar
g
p= 0.0821
T+
B+
SE
B-
IFN- y 24 h
T+
B+
SE
B-
pg/m l
pg/m l
pg/m l
100
i-C
D3
/-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
i-C
D3
/-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
t iCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
an
t
T+
an
tiCD
3/
-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B+
SE
BAr
g
150
T+
an
t
Ar
g
pg/m l
p= 0.0012
T+
B+
SE
B-
i-C
D3
/-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
an
t
Ergebnisse
A.
150
IFN- y 96 h
p= 0.3018
100
150
TNF- ß 96 h
p= 0.0107
100
87
pg/m l
100
pg/m l
150
p= 0.0139
50
0
0
TNF- alpha 24 h
200
200
p= 0.1813
150
50
50
0
0
T+
B+
SE
B
-A
rg
50
EB
+A
rg
IL- 10 24 h
T+
B+
S
100
-A
rg
g
p= 0.0021
CD
3/
-C
D2
8
-C
D2
8+
Ar
pg/m l
pg/m l
150
T+
an
t i-
T+
an
tiCD
3/
T+
B+
SE
BAr
g
i-C
D3
/-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
an
t
p= 0.0001
T+
an
tiCD
3/
-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B+
SE
BAr
g
T+
an
tiCD
3/
-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B+
SE
BAr
g
Ergebnisse
150
IL- 10 96 h
p= 0.0009
100
B.
TNF- alpha 96 h
p= 0.9083
p= 0.6219
p= 0.1191
100
88
rg
p= 0.2077
50
0
1000
1000
800
400
p= 0.3535
600
200
200
0
0
g
200
EB
-A
r
pg/ml
IL- 8 24 h
T+
B+
S
p= 0.6
T+
an
t iC
D
3/
-C
D
T+
28
+A
an
tirg
CD
3/
-C
D
28
-A
rg
T+
B
+S
EB
+A
rg
T+
B
+S
EB
-A
rg
pg/ml
100
pg/ml
i-C
D3
/-C
D2
T+
8+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B+
SE
BAr
g
T+
an
t
p= 0.3255
CD
3/
-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B
+S
EB
+A
rg
T+
B
+S
EB
-A
rg
-A
rg
+A
600
CD
3/
-C
D2
8
-C
D
28
pg/ml
150
T+
an
t i-
T+
an
ti-
T+
an
t iCD
3/
Ergebnisse
C.
IL- 8 96 h
p= 0.5226
200
150
p= 0.4251
100
50
0
IL- 6 96 h
IL- 6 24 h
p= 0.2771
800
p= 0.3784
400
89
Ergebnisse
IL- 2 96 h
IL- 2 24 h
200
p= 0.6914
200
p= 0.6675
p= 0.047
150
50
0
0
T+
an
t
i-C
D3
/-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
50
Ar
g
100
T+
B+
SE
B-
pg/m l
100
T+
an
tiCD
3/
-C
D2
8+
T+
Ar
an
g
tiCD
3/
-C
D2
8Ar
g
T+
B+
SE
B+
Ar
g
T+
B+
SE
BAr
g
pg/ml
150
p= 0.7937
Abb.3.9: Multiplex-Zytokinmessung mittels Durchflusszytometrie. Humane T-Zellen wurden 24 h oder 96
h in argininhaltigem (+Arg) oder argininfreiem Medium (-Arg) mit anti-CD3/-CD28 (T+anti-CD3/-CD28) oder mit
SEB Superantigen-beladenen B-Zellen (T+B+SEB) stimuliert und die Zytokine im Überstand mittels Multiplex
Analyse im Durchflusszytometer gemessen. A. und B. Statistische Auswertung unter Anwendung des
gepaarten Student´s t-Test. Es werden jeweils die Mittelwerte +/- Standardabweichung (als Balken mit
Fehlerbalken dargestellt) von insgesamt drei unabhängigen Experimenten gezeigt. Bei TNF-ß wurden für den
Zeitpunkt 24 h nur zwei Experimente durchgeführt, so dass keine Berechnung der Signifikanz erfolgte.
3.10 Untersuchung der frühen Signaltransduktion in humanen TZellen in Abhängigkeit von Arginin
In T-Zellen werden zahlreiche Signaltransduktionsprozesse unmittelbar nach Aktivierung
des TZR +/- Kostimulation aktiviert. Dies geschieht initial über die Phosphorylierung der
CD3-ζ-Kette des TZR-Komplex, die Bindung und Aktivierung der Tyrosinkinase ZAP-70
und die Phosphorylierung von Adaptorproteinen wie SLP-76 und LAT. Die folgende
Aktivierung der PLC-γ führt zur Produktion der wichtigen Signalmoleküle IP3 und DAG. IP3
aktiviert wiederum den Kalziumsignalweg und DAG ist an der Aktivierung der PKC-θ und
des kleinen G-Proteins Ras beteiligt. Letztendlich führen alle Signalwege zur Aktivierung
der Transkriptionsfaktoren NFAT, NF-κB und AP-1, die zusammen u.a. die Transkription
des IL-2-Gens initiieren, welches für die Proliferation der T-Zellen essentiell ist (SmithGarvin et al. 2009).
90
Ergebnisse
3.10.1 Arginin-unabhängige Phosphorylierung von ERK1/2 und Akt bzw.
Dephosphorylierung von Cofilin bei Kurzzeitstimulation humaner TZellen
Die Aktivierung von Cofilin via Dephosphorylierung über T-Zell-Kostimulation erfordert das
Zusammenspiel zweier Signaltransduktionswege, die Ras-MEK-ERK- und Ras-PI3KSignalkaskaden, vermittelt durch die GTPase Ras. Durch Aktivierung von Ras über PKC
werden zwei Ras-Effektoren, MEK und PI3K via Phosphorylierung aktiviert. PI3K
phosphoryliert des Weiteren die Proteinkinase B (PKB)/Akt. Eine Inhibierung von ERK
oder PI3K hat die fehlende, kostimulations-induzierte Dephosphorylierung von Cofilin zur
Folge (Samstag and Nebl 2005, Wabnitz et al. 2006). Die Phosphorylierung von Akt
spiegelt die Aktivität von PI3K wieder, während die Phosphorylierung von ERK1/2 ein
Marker für die Aktivität der MAPK/ERK Kinase (MEK) ist.
Zur Analyse der frühen Signaltransduktion via Akt und ERK1/2 bzw. der konsekutiven
Dephosphorylierung von Cofilin wurden humane T-Zellen für 15 min, 30 min oder 60 min
stimuliert. Nach Inkubation wurden die Zellen, die an anti-CD3/-CD28 gekoppelte Partikel
gebunden hatten, über einen Magneten selektiert. Somit konnten spezifisch die T-Zellen
untersucht werden, die bei diesen kurzen Stimulationszeiten tatsächlich aktiviert wurden.
Die Expression der genannten Proteine sowie deren phosphorylierte Formen, wurde
mittels Westernblot analysiert.
Die quantitative Auswertung der densitometrischen Analysen von insgesamt 3
verschiedenen Experimenten zeigte, dass ein Fehlen von Arginin keinen Einfluss auf die
Dephosphorylierung
von
Cofilin
bis
zum
Zeitpunkt
t=30
min
bzw.
die
stimulationsabhängige Phosphorylierung (und damit Aktivierung) von ERK und Akt hat.
Ferner zeigte sich bei Cofilin nach t=60 min eine tendenziell zunehmend verminderte
Dephosphorylierung bei Argininabwesenheit (t=15min: p=0.6353; t=30min: p=0.3103 und
t=60min: p=0.287; jeweils Vergleich der Dephosphorylierung in An- und Abwesenheit von
Arginin) (Abb. 3.10.1B). Ein repräsentatives Experiment ist in Abb 3.10.1A dargestellt, eine
zusammenfassende Darstellung der densitometrischen Messungen ist in Abb.3.10.1B
aufgeführt.
91
Ergebnisse
A.
Stimulationszeit
---
-
Arginin
15min
+
-
30min
+
-
60min
+
-
+
Cofilin
pCofilin
Erk
pErk
Akt
pAkt
.
B.
p C o filin
p=0.7663
p=0.3103
p=0.6353
p=0.287
T + B e ad s + A rg
T + B e ad s -A r g
100
50
60
30
15
0
0
% Phosphorylierung
150
S timulationsz eit in min
92
Ergebnisse
pEr k
p=0.1982
% Phosphorylierung
200
p=0.3437
p=0.877
150
100
50
p=0.4424
60
30
0
15
0
Stimulationsz e it in min
pAkt
p=0.266
% Phosphorylierung
15 0
p=0.367
p=0.3367
10 0
50
p=0.8738
60
30
15
0
0
S ti mu la t io n s z e it i n m in
Abb.3.10.1: Westernblotanalyse der Proteine pCofilin, pErk und pAkt bei Kurzzeitstimulation von
humanen T-Zellen. Humane T-Zellen wurden für 15 min, 30 min oder 60 min in argininfreiem (T+ anti-CD3/CD28+Arg = graue Balken) oder argininhaltigem (T+ anti-CD3/-CD28-Arg = Balken mit Muster) Medium mit
anti-CD3/-CD28 stimuliert. Als Kontrolle wurden unstimulierte T-Zellen (t=0h) in beiden Medien ÜN
präinkubiert. A. Western Blot-Bilder eines repräsentativen Experiments von insgesamt drei unabhängigen
Experimenten. B. Quantitative Auswertung der Expressionsstärke der einzelnen Western Blot Banden nach
densitometrischer Analyse. Gezeigt werden die Werte von 3-4 unabhängigen Experimente mit Mittelwert +/Standardabweichung (als Balken mit Fehlerbalken dargestellt).
93
Ergebnisse
3.10.2 Signaltransduktion über Kalzium bei Arginindefizienz
Eine weitere T-Zell-Signaltransduktionskaskade, die aktivierungsabhängige Zunahme des
intrazellulären Calcium, wurde mit dem Calcium-Indikatorfarbstoff INDO-1 mittels
Durchflusszytometrie (Kap. 2.2.5.3) untersucht. Hierzu wurden humane T-Zellen über
Nacht in argininhaltigem oder argininfreiem Medium präinkubiert und am nächsten Tag mit
dem Calcium-Indikatorfarbstoff INDO-1 gefärbt. Anschließend wurden die Antikörper antiCD3
oder
IgG2a
(Isotypkontrolle)
zu
den
Ansätzen
gegeben.
Während
der
Probenmessung wurde, zur Bestimmung der intrazellulären Ca2+-Konzentration nach TZell-Aktivierung, ein kreuzvernetzender Antikörper (nach Messen des Grundlevels; 200
Sekunden) und als Positivkontrolle Ionomycin (nach Messen der Kalziumkonzentration
nach Aktivierung; 400 Sekunden) zugegeben.
In drei voneinander unabhängigen Experimenten zeigten sich jeweils keine Unterschiede
im Anstieg der Ca2+-Konzentration bei T-Zell-Stimulation in An- oder Abwesenheit von
Arginin. (Abb.3.10.2).
Ratio: Indo-1Violett-A/Indo-1blau-A
Ionomycin
350
320
(+) Arginin
290
(-) Arginin
260
Isotypkontrolle
0
100
200
Time
300
400
Abb.3.10.2: Calciumfluxmessung mittels Durchflusszytometrie. Humane T-Zellen wurden über Nacht in
argininhaltigem [(+)Arginin] oder argininfreiem [(-)Arginin] Medium präinkubiert und die Calciumkonzentration
mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die Auswertung erfolgte mittels der Software FlowJo. In der Grafik
sind die Messergebnisse eines repräsentativen, von insgesamt drei unabhängigen, Experimenten als Overlay
dargestellt. Der Zeitraum 0-200 Sekunden zeigt den Ruhepegel der Calciumkonzentration. Von 200 – 400
Sekunden wird die Calciumkonzentration nach Stimulation mit OKT3 angezeigt, wobei der kreuzvernetzende
Antikörper direkt vor der Messung, zum Zeitpunkt t=200 Sekunden, hinzugegeben wurde. Ab 400 Sekunden
kann der veränderte Gehalt von Kalzium nach Zugabe von Ionomycin (als Positivkontrolle zum Zeitpunkt t=400
Sekunden appliziert) beobachtet werden. Die in argininfreiem Medium stimulierten Zellen sind als grüne Linie,
die in argininhaltigem als blaue Linie und die Isotypkontrolle als rote Linie dargestellt. Die Werte auf der YAchse geben das Verhältnis des Ca2+-gebunden zum Ca2+-ungebunden INDO-1-Farbstoff an. Je höher die
2+
2+
Werte, desto mehr Ca wurde gebunden, was wiederum mit der zytosolischen Ca -Konzentration korreliert.
94
Ergebnisse
3.11
Regulation von Cofilin, ERK und Akt bei Arginindepletion
durch PMN-Arginase aus humanem Eiter
Abschließend sollte die Regulation des Proteins Cofilin in einer Zellkulturbedingung
analysiert werden, welche die physiologische Situation einer granulozytär dominierten
Inflammation mit Freisetzung der Arginase I aus humanen PMN und konsekutiver
Verstoffwechslung von Arginin abbildet. Hierfür wurde zellfreier Überstand aus humanem
Eiter (gewonnen aus Abszesspunktaten chirurgischer Patienten, siehe Munder et al. 2006)
gewonnen, die Arginase-Aktivität bestimmt und Zellkulturmedium mit einem Aliquot dieses
zellfreien Eiterüberstands (finale Arginase-Aktivität: 300 mU/ml) für 24 h inkubiert. In einem
Parallelansatz wurde zusätzlich der Arginaseinhibitor nor-NOHA hinzugegeben, um die
Verstoffwechslung von Arginin durch PMN-Arginase zu unterbinden. Als Positivkontrolle
dienten Kultivierungsansätze mit argininhaltigem Medium, als Negativkontrolle wurden TZellen in argininfreiem Medium aktiviert. T-Zellen wurden für 48 h in den verschiedenen
Medien mit anti-CD3/-CD28 stimuliert. Zu jedem Experiment wurde parallel die T-ZellProliferation in allen verwendeten Medien mittels [3H]-Thymindinassay gemessen, wobei
früher publizierte Daten aktuell verifiziert wurden (Munder et al. 2006). In der dargestellten
repräsentativen Proliferationmessung in Abb. 3.11.1 ist deutlich zu erkennen, dass TZellen, die in präinkubiertem argininhaltigen Medium mit humanem Eiterüberstand
stimuliert wurden, einen kompletten Proliferationsverlust zeigen, entsprechend dem bei
Argininabwesenheit (+Eiterübertstand: 60 ± 12 cpm; -Arg: 60 ± 15 cpm). Dieser Verlust
wird jedoch bei Zugabe des Arginaseinhibitors nor-NOHA vollständig rekonstituiert (68929
± 1121 cpm), vergleichbar der Proliferation in argininhaltigem Medium (48921 ± 2182
cpm).
95
Ergebnisse
80000
Counts pro M inute
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
T+
Ei
T+
te
r
Ei
te
r+
no
rN
O
HA
T+
Ar
g
TAr
g
0
Abb. 3.11.1: Vollständige Hemmung der Proliferation durch Zugabe von humanem Eiterüberstand:
Proliferationsmessung humaner T-Zellen mittels 3H-Thymindin-Assay. Humane T-Zellen wurden für 48 h
in argininfreiem (-Arg), argininhaltigem (+Arg; schwarzer Balken), mit humanem zellfreien Eiterüberstand
(+Eiter) und nor-NOHA (+Eiter, +nor-NOHA; grauer Balken) präinkubierten argininhaltigem Medium mit antiCD3/-CD28 stimuliert. Grafisch dargestellt ist die Auswertung (Mittelwert ± SD) eines repräsentativen
Experiments (Gesamtzahl: drei).
In parallelen Ansätzen wurden die T-Zellen geerntet, lysiert und die Expression von Cofilin,
phospho-Cofilin sowie die aktivierungsabhängige Phosphorylierung von ERK und Akt
mittels Western Blot untersucht.
Die Quantifizierung der densitometrischen Analysen von insgesamt 3 unabhängigen
Experimenten zeigte eine reduzierte Dephosphorylierung von Cofilin bei Abwesenheit von
Arginin (Reduktion der Phosphorylierung um 42 ± 12,5% im Vergleich zu 77,5 ± 17,1% bei
Stimulation in argininhaltigem Medium) sowie gleichermaßen bei Eiter-induzierter
Arginindepletion (Reduktion der Phosphorylierung um 36,8 ± 22,2% im Vergleich zu 62,6
± 29,4% bei Zugabe des Arginase-Inhibitors nor-NOHA), in Relation gesetzt zu der
maximalen Phosphorylierung bei unstimulierten T-Zellen (t=0 h). Ein repräsentatives
Einzelexperiment wird in Abb. 3.11A, und die quantitative Auswertung aller Experimente ist
in Abb. 3.11B gezeigt).
Interessanterweise wird die aktivierungs-induzierte Phosphorylierung von Akt und ERK1/2
in Abhängigkeit von Arginindepletion gegenläufig reguliert. Während ERK1/2 bei
Anwesenheit von Arginin sowie bei T-Zell-Stimulation in mit zellfreiem Eiterüberstand und
96
Ergebnisse
nor-NOHA präinkubiertem argininhaltigen Medium, aktivierungs-abhängig phosphoryliert
wird, ist die Phosphorylierung bei Arginindefizienz sowie bei Arginindepletion durch
zellfreien Eiterüberstand gleichermaßen reduziert (Reduktion um 76,9 ± 18,8 % in ()Arginin-Medium im Vergleich zu (+)Arginin-Medium; Reduktion um 89,3 ± 2,1 % bei
Zugabe von zellfreiem Eiterüberstand im Vergleich zu präinkubiertem Medium mit
Eiterüberstand + norNOHA). Im Gegensatz hierzu ist eine reduzierte Phosphorylierung
von Akt bei Anwesenheit von Arginin zu beobachten (Reduktion um 49,3 ± 30,2 % in
(+)Arginin-Medium im Vergleich zu (-)Arginin-Medium; Reduktion um 64,1 ± 18,8 % bei
Zugabe von Eiterüberstand + nor-NOHA im Vergleich zu präinkubiertem Medium mit
zellfreiem Eiterüberstand). In Abb. 3.11A ist jeweils ein repräsentatives Experiment von
drei unabhängigen Experimenten gezeigt, Abb.3.11B zeigt die quantitative Auswertung
aller Experimente.
A.
B.
pCofilin
48h
p=0.0348
100
Cofilin
pCofilin
p=0.0196
80
60
40
20
0
T+
T+
Ei
te
Ei
r
te
r+
N
O
H
A
+nor-NOHA
T+
A
rg
+Eiter +Eiter
TA
rg
+Arg
T=
0
-Arg
% Phosphorylierung
0h
97
Ergebnisse
pERK1/2
p=0.0192
48h
p=0.0002
100
100
40
20
60
40
20
0
te
Ei
T=
g
T+
Ei
te
T+
T+
Ar
g
Ar
T-
T=
0
0
0
HA
pERK1/2
60
80
r
ERK1/2
80
NO
+nor-NOHA
r+
+Arg +Eiter +Eiter
% Phosphorylierung
-Arg
% Phosphorylierung
0h
pAkt
p=0.1057
p=0.0277
40
20
HA
te
r
0
+N
T+
Ei
te
r
T+
Ar
g
T=
g
0
60
Ei
20
80
T+
40
100
0
% Phosphorylierung
60
0
pAkt
80
Ar
Akt
100
T-
+nor- NOHA
% Phosphorylierung
-Arg +Arg +Eiter +Eiter
O
48h
T=
0h
Abb.3.11:
Arginindepletion
durch
Arginase
I
aus
humanem
Eiter:
Analyse
des
Phosphorylierungsstatus der Proteine Cofilin, Akt und Erk in aktivierten humanen T-Zellen. Humane TZellen wurden für 48 h in argininhaltigem (+Arg), argininfreiem (-Arg), mit humanem zellfreien Eiterüberstand
(+Eiter) und nor-NOHA (+Eiter, +nor-NOHA) präinkubierten argininhaltigem Medium stimuliert. A. Gezeigt
werden Western Blot Bilder der Proteine Cofilin, pCofilin, Akt, pAkt, Erk und pErk eines repräsentativen
Experiments von drei unabhängigen Durchführungen. B. Grafische Darstellung der densitometrischen Analyse
der Phosphorylierung der jeweiligen Proteine. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden für pCofilin die Werte auf
T=0 (=100%Phosphorylierung), bei pERK1/2 auf +Arg/ +Eiter+norNOHA (=100% Phosphorylierung) und für
pAkt auf -Arg/ +Eiter (=100% Phosphorylierung) bezogen.
98
Diskussion
4
Diskussion
Die semiessentielle Aminosäure Arginin ist fundamental an der Regulation der
Immunantwort beteiligt. Arginin wird über zwei alternative Stoffwechselwege metabolisiert.
Einerseits kann Arginin durch das Enzym Arginase zu Ornithin und Harnstoff hydrolysiert
werden, wobei Polyamine und Prolin als Folgeprodukte entstehen, welche u.a. für die
Geweberegeneration wichtig sind. Andererseits wird Arginin durch das Enzym NOSynthase zu NO verstoffwechselt, welches eine anti-bakterielle Wirkung besitzt und zur
Abwehr von Pathogenen dient (Bronte and Zanovello 2005). Die lokale Arginindepletion
durch Arginase 1, freigesetzt von PMNs, führt in humanen T-Lymphozyten sowie NKZellen zur Hemmung wichtiger Effektorfunktionen wie Proliferation und Zytokinsynthese
und verhindert somit eine korrekte T-Zell-Immunantwort (Munder et al. 2006). Diese
Immunsuppression durch Arginindepletion konnte auch unter physiologischen (Kropf et al.
2007) und pathologischen Bedingungen (Rodriguez et al. 2005, Rodriguez et al. 2004, Zea
et al. 2006) gezeigt werden. Während die Suppression des adaptiven Immunsystems
phänotypisch mittlerweile recht gut charakterisiert ist, sind die Mechanismen der
intrazellulären Signaltransduktion, die bei Arginindefizienz zu einer Suppression der T-ZellImmunantwort führen, bislang im Wesentlichen unbekannt.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte mittels proteomischer Analyse zum ersten Mal gezeigt
werden, dass die Beeinträchtigung der T-Zell-Antwort durch Argininmangel mit einer
Inhibition der Dephosphorylierung und damit Aktivierung des Aktin-bindenden Proteins
Cofilin assoziiert ist.
4.1
Veränderung des Protein-Expressionsmusters aktivierter,
humanen T-Lymphozyten bei Arginindefizienz
Die Herunterregulation der TZR-ζ-Kette wurde als ein potentieller Mechanismus
beschrieben, welcher die T-Zell-Inhibition bei Argininmangel vermitteln könnte (Rodriguez
2002; siehe auch Abschnitt 1.10). Neben der bei Argininmangel in vitro nachgewiesenen
Störung der nach Aktivierung normalerweise erfolgenden Reexpression von TZRζ lassen
sich auch in vivo bei Patienten mit Tumorerkrankungen, Autoimmunität und chronischer
Inflammation regelhaft T-Lymphozyten nachweisen, welche durch einen partiellen Verlust
der TZR-ζ-Kette charakterisiert sind (Baniyash 2004). Eine Reduktion der TZR-ζ-
99
Diskussion
Kettenexpression wurde bei zahlreichen Tumorentitäten auch in den NK-Zellen beobachtet
(Baniyash 2004). Die verminderte Expression der TZR-ζ-Kette scheint jedoch ein
Begleitphänomen
zu
sein,
da
die
Proliferation
aktivierter
T-Lymphozyten
bei
Argininabwesenheit ebenso gehemmt ist, wenn die Stimulation anstelle über den TZR,
über direkte, TZR-unabhängige intrazelluläre Freisetzung von Kalzium (durch Ionomycin)
und Aktivierung der PKC (durch PMA) erfolgt (Munder et al. 2006). Ferner konnte gezeigt
werden, dass die durch Arginindefizienz induzierte Beeinträchtigung der Zytokinsekretion
aktivierter T-Zellen (Munder et al. 2006) sowie NK-Zellen (Oberlies et al. 2009)
posttranskriptionell reguliert wird, da eine Quantifizierung der mRNA-Menge jeweils keine
Unterschiede in Abhängigkeit von Arginin zeigte.
Einen phylogenetisch alten zellulären Reaktionsmechanismus auf Aminosäuremangel
stellt die sogenannte „general control response“ dar. Mit Hilfe dieses Mechanismus zur
Regulation der Translationsinitiation können Eukaryonten auf zellulären Stress wie
Aminosäuredepletion reagieren, indem die zelluläre Protein-Synthese gehemmt und die
Transkription von Genen der Aminosäure-Biosynthese verstärkt wird (Hinnebusch 1994).
Bei
CD8+
murinen
T-Lymphozyten
konnte
gezeigt
werden,
dass
durch
Tryptophandefizienz zu einer Phosphorylierung der GCN2K führt und dass diese Kinase
die konsekutive Inhibition der T-Zell-Proliferation vermittelt. So konnten murine GCN2Kdefiziente CD8+ T-Lymphozyten (isoliert aus einer GCN2K-/- Maus) auch bei Fehlen von
Tryptophan proliferieren, während Wildtyp-T-Zellen auf Tryptophanverarmung mit einem
Zellzyklusarrest reagierten (Munn et al. 2005). Bei Argininmangel konnte in humanen
polyklonalen T-Lymphozyten ebenfalls eine Phosphorylierung der GCN2K nachgewiesen
werden, wobei der Nachweis einer kausale Beteiligung der Kinase im Rahmen der T-ZellInhibition im humanen System noch aussteht (Oberlies et al. 2009).
Vor
diesem
Hintergrund
konnten
in
der
vorliegenden
Arbeit
sieben
Proteine
massenspektrometrisch identifiziert werden, die bei T-Zell-Aktivierung bei kompletter
Arginindefizienz
im
Vergleich
zur
Aktivierung
im
Kontext
physiologischer
Argininkonzentration stärker exprimiert waren. Die Verifizierung dieser Ergebnisse in
unabhängigen
Experimenten
mittels
Westernblot
unter
Verwendung
spezifischer
Antikörper zeigte jedoch, dass nur eines dieser Proteine, die phosphorylierte inaktive Form
des aktin-bindenen Proteins Cofilin, bei Argininabwesenheit signifikant stärker im Vergleich
zur Aktivierung bei Anwesenheit von Arginin exprimiert wird. (vgl. 3.3).
100
Diskussion
Cofilin hat ein Molekulargewicht von 19 kDa und gehört zur ADF (engl. actin
depolymerising
factor)/Cofilin
(engl.
cofilamentous
structure
with
actin)-Familie
aktinbindender Proteine. Das in allen eukaryotischen Zelltypen ubiquitär exprimierte
Protein, kommt in drei Formen vor: ADF, Cofilin-1 (Hauptform in Nicht-Muskel-Zellen) und
Cofilin-2 (Hauptform in Muskelzellen) und ist essentiell für das Überleben der Zellen (Abe
et al. 1996, Billadeau and Burkhardt 2006, Iida et al. 1993, Moon et al. 1993, Samstag et
al. 1996, Vartiainen et al. 2002). Cofilin ist entscheidend für die Aktinpolymerisation und
Depolymerisation und somit ein zentraler Regulator der dynamischen Reorganisation des
Aktinzytoskeletts.
Ferner
ist
die
Umstrukturierung
des
Aktinzytoskeletts
eine
entscheidende Komponente im Rahmen der T-Zell-Aktivierung (Billadeau et al. 2007,
Burkhardt et al. 2008, Samstag et al. 2003). Cofilin ist als Schlüsselprotein der AktinReorganisation folglich ein Hauptregulator der T-Zellaktivierung.
Wie in Kap.1.6 erwähnt, kann Cofilin in vitro an G- und F-Aktin binden, Aktinfilamente
schneiden und depolymerisieren sowie eine verstärkte Polymerisation auslösen (Bamburg
1999, Condeelis 2001). In älteren Aktinfilamenten ist das ATP zu ADP hydrolysiert und
diese werden damit für den Abbau durch Cofilin markiert, welches eine höhere Affinität zu
ADP-Aktin-Monomeren besitzt (Carlier 1987, Pollard and Cooper 1986). Weiterhin führt
eine Bindung von Cofilin an F-Aktin zu einer Veränderung der Aktinfilamentwindungen,
was in einem vermehrten Schneiden der Filamente resultiert und die Bindung von Aktin an
andere Proteine beeinflusst (McGough et al. 1997). Die Aktinbindefähigkeit von Cofilin, die
bei T-Zellaktivierung eine wichtige Rolle spielt (Eibert et al. 2004), wird durch
Phosphorylierung am Serin3-Rest negativ reguliert, d.h. phospho-Cofilin ist die inaktive
Form des Proteins (Moriyama et al. 1996). In untransformierten humanen T-Lymphozyten
führt eine Blockierung der Cofilin-F-Aktin-Interaktion, mittels zellpermeabler homologer
Peptide, zu einer gehemmten Proliferation und Zytkokinproduktion (Eibert et al. 2004). Die
Bindung von Cofilin an F-Aktin kann ausschließlich in aktivierten T-Zellen detektiert
werden, da Cofilin in unstimulierten Zellen größtenteils phosphoryliert im Zytoplasma (Lee
K. H. et al. 2000) oder an PIP2 gebunden an der PM (van Rheenen et al. 2009) vorliegt.
Aufgrund dieser Erkenntnisse war zu vermuten, dass die bei Argininabwesenheit
reduzierte Dephosphorylierung von Cofilin (vgl.3.3) und folgende Reduktion der Bindung
von Cofilin an F-Aktin, zu einer Beeinträchtigung der T-Zell-Immunantwort führen würde.
101
Diskussion
4.2
Einfluss von Argininmangel auf das Aktin-Zytoskelett
humaner T-Zellen nach APZ-basierter Stimulation
4.2.1
Beeinträchtigung der Ausbildung der IS durch Arginindefizienz
Die Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts während der T-Zell-Aktivierung führt zu einer
Polarisation der T-Zelle in Richtung der APZ, wobei sich im Kontaktbereich der Zellen die
IS ausbildet, in der sich TZRs und Signalmoleküle anreichern. Die Ausbildung dieser
Kontaktzone spielt eine entscheidende Rolle bei der T-Zell-Aktivierung und der
Differenzierung zu T-Effektorzellen (Delon and Germain 2000). In T-Zell/-B-Zellkonjugaten,
die über Stimulation mit Superantigen induziert wurden, ist Cofilin in der peripheren Region
der IS lokalisiert. Die Hemmung der Cofilin-F-Aktin-Interaktion in vitro führt zu einer
verminderten Ausbildung der IS im Kontaktbereich zwischen humanen T-Zellen und APZ
(Eibert et al. 2004).
Nachdem gezeigt wurde, dass die Dephosphorylierung des Proteins Cofilin-1 bei T-ZellAktivierung in Abwesenheit von Arginin ausbleibt, wurde die argininabhängige Ausbildung
der IS zwischen T-Zelle und APZ untersucht. Hierfür wurde ein weiteres System zur
Stimulierung der T-Zellen über Antigenpräsentierende SEB-beladene Raji B-Zellen
etabliert. Es zeigte sich, dass die profunde Suppression der T-Zellfunktionen bei
Argininmangel auch im APZ-basierten System feststellbar ist (vgl.3.4) und dieses somit für
weitere Analysen validiert zur Verfügung stand.
Die
Analyse
der
Ausbildung
antigenpräsentierender
B-Zelle
einer
in
IS
im
Abhängigkeit
Kontaktbereich
von
Arginin
von
T-Zelle
ergab,
dass
und
bei
Arginindefizienz ein signifikant geringerer Anteil an T-Zell-/B-Zellkontakten gebildet wird.
Des Weiteren wurden innerhalb der ausgebildeten Kontaktzonen zwischen T- und BZellen eine verminderte Akkumulation von CD3- und CD2-Rezeptoren gemessen (vgl.
3.5), die ein Merkmal für die Ausbildung der IS sind. Diese Ergebnisse zeigten, dass die
fehlendende Dephosphorylierung von Cofilin bei Argininmangel mit einer reduzierten
Ausbildung der Kontaktzone zwischen T-Zellen und APZs assoziiert ist und korrelieren mit
den publizierten Daten, die zeigten, dass die IS bei Blockierung der Cofilin-/F-AktinInteraktion vermindert ausgebildet wird (Eibert et al. 2004).
Zur weiteren Untersuchung des Einflusses der stark reduzierten Dephosphorylierung von
Cofilin wurde der intrazelluläre F-Aktingehalt der T-Zellen gemessen. Die Analysen
102
Diskussion
zeigten,
dass
die
F-Aktinmenge
humaner
T-Zellen
ausschließlich
nach
48h
argininabhängig und stimulationsabhängig reguliert wird. In T-Lymphozyten, die
antikörper-basiert stimuliert wurden, wurde bei Argininmangel eine signifikant geringere
Konzentration an F-Aktin gemessen, während bei APZ-basierter Stimulation bei
Argininabwesenheit mehr F-Aktin in den T-Zellen akkumulierte (vgl. 3.6). Es bleibt zu
klären, welche unterschiedlichen intrazellulären Vorgänge diese stimulationsabhängige FAktin-Regulation bedingen. Klar ist jedoch, dass sich der F-Aktingehalt bei T-ZellAktivierung in argininfreier Umgebung nach 48h Stimulation signifikant verändert und der
Argininmangel somit den Aktin-Kreislauf beeinflusst. Dieser Phänotyp korrelierte mit der
reduzierten Cofilin-Dephosphorylierung und war der reduzierten Ausbildung der IS zeitlich
nachgeschaltet.
4.2.2
Keine Beeinträchtigung der Migration humaner T-Lymphozyten in
Abhängigkeit von Arginin
Ein weiterer Prozess, der bei T-Zell-Aktivierung eine entscheidende Rolle spielt, ist die
Migration der T-Lymphozyten durch das Endothel der Blutgefäßwand in periphere Gewebe
(z.B. an einen Infektionsort). Auch hierbei findet eine Reorganisation des AktinZytoskeletts statt, an welcher der dynamische F-Aktinkreislauf beteiligt ist (Samstag et al.
2003). Für diesen Migrationsprozess ist die Schneideaktivität von Cofilin erforderlich, um
die Richtung der Membranausstülpungen und dadurch die Wanderrichtung der Zelle zu
bestimmen, indem die Bildung freier Plus-Enden, die für die Aktinpolymerisation benötigt
werden, initiiert wird (Ghosh et al. 2004, Mouneimne et al. 2006, Sidani et al. 2007). In
invasiven Subpopulationen von Tumorzellen aus Brusttumoren ist die Expression von
Cofilin und anderen Proteinen des Cofilin-Signalwegs, wie z.B. LIMK, hochreguliert (Wang
J. et al. 2004) und der Aktivierungsstatus von Cofilin ist direkt verbunden mit Invasion,
Intravasation und Metastasierung (Wang W. et al. 2006). Die Hemmung der Cofilinaktivität
in Karzinomzellen mittels siRNA (Hotulainen et al. 2005) oder Expression der konstitutiv
aktiven LIMK-Domäne (Zebda et al. 2000) inhibiert die Zellmotilität. Eine Suppression der
Cofilinexpression mittels siRNA reduziert die Invasion der Karzinomzellen durch
verminderte Ausbildung und Stabilität von Invadopodien (Yamaguchi et al. 2005).
Bei Analyse der Migrationsfähigkeit der T-Zellen bei Aktivierung über das Chemokin SDF1α in Ab- und Anwesenheit von Arginin, konnten keine Unterschiede festgestellt werden
(vgl. 3.7). Dieser komplexe Prozess der Zellmotilität ist demnach unabhängig von Arginin
103
Diskussion
und sollte es humanen T-Lymphozyten erlauben, auch bei inflammationsassoziierter
Arginindepletion in vivo prinzipiell chemotaktischen Gradienten folgend zu migrieren. Diese
Daten kontrastieren mit der supprimierten chemotaktischen Motilität primärer humaner TLymphozyten bei Cofilin-Defekt im Rahmen von oxidativem Stress (Klemke et al. 2008).
4.3
Einfluss
von
Arginin
auf
die
Zytokinsynthese
und
-sekretion humaner T-Zellen
Die Zytokinsekretion und -synthese sind weitere wichtige Effektorfunktionen von TLymphozyten, die für eine vollständige Immunantwort erforderlich sind. Nach Aktivierung
sezernieren T-Zellen u.a. die wichtigen Zytokine IL-2 und INF-γ. IL-2 ist wesentlich für die
Proliferation und Differenzierung der T-Zellen, und wirkt als auto- und parakriner
Wachstumsfaktor, indem der aktivierungs-abhängig hochregulierte, hochaffine IL-2Rezeptor auf den T-Zellen das Zytokin detektiert. INF-γ dagegen beeinflusst v.a. die
Differenzierung von T-Lymphozyten. In PBMC von Patienten mit Nierenzellkarzinom
konnte einhergehend mit einer erhöhten Arginase-Aktivität bzw. Arginindepletion u.a. eine
verminderte Produktion von IL-2 und IFN-γ beobachtet (Zea et al. 2005) werden. Ferner
führt das Fehlen von Arginin bei primären humanen T-Lymphozyten (Munder et al. 2006)
und NK-Zellen (Oberlies et al. 2009) zur Suppression der IFN-γ-Synthese. Da die
Transkription der IFN-γ-mRNA jedoch unabhängig von der Argininkonzentration ist, scheint
dieser Suppression eine posttranskriptionelle Inhibierung zugrunde zu liegen (Munder et
al. 2006, Oberlies et al. 2009). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Sekretion von
IFN-γ beeinträchtigt ist, wenn die Bindefähigkeit von Cofilin an F-Aktin blockiert wird (Eibert
et al. 2004).
4.3.1
Bei
Unterschiedliche Regulation der Zytokinsekretion
der
Analyse
der
Zytokinsekretion
im
Zellkulturüberstand
für
verschiedene
Stimulationszeiten von 6h bis 96h und Antikörper- sowie APZ-basierter Stimulation, konnte
für IL-2 und IFN-γ eine dichotome Regulation beobachtet werden. Während IL-2 bei
Argininmangel initial in signifikant geringerer Konzentration im Überstand, bei beiden
Stimulationsarten, nachgewiesen werden konnte, war dieser Unterschied in Abhängigkeit
von Arginin nach längerer Stimulation nicht mehr nachweisbar (vgl. 3.8.1). Es liegt
demnach kein Sekretionsdefekt vor, sondern lediglich eine Verzögerung. Diese
104
Diskussion
protrahierte Sezernierung von IL-2 ist demnach auf den Argininmangel zurückzuführen
und könnte dadurch einzig zu einer verzögerte T-Zell-Immunantwort führen.
Im Gegensatz hierzu zeigte sich bei Argininabwesenheit an allen Messzeitpunkten eine
stark
verminderte
IFN-γ-Konzentration
im
Zellkulturüberstand
(vgl.
3.8.1).
Diese
beobachtete Suppression der INF-γ-Sekretion verifizierte ferner die Daten früherer
Untersuchungen, bei denen humanen T-Zellen in Abhängigkeit von Arginin für 48h mit
plattengebundenen CD3-Antikörper (OKT3) stimuliert wurden (Munder et al. 2006).
Aufgrund
der
beobachteten
zytokinspezifischen
Regulationsmechanismen
bei
Arginindefizienz, interessierten wir uns diesbezüglich für weitere pro- und antiinflammatorische
Zytokine.
Die
parallele
Analyse
zahlreicher
Zytokine
im
Zellkulturüberstand bei kürzerer (24h) und längerer (96h) Stimulationsdauer sowie bei
antikörper- und APZ-basierter Stimulation ergab im Rahmen dieser Promotionsarbeit
erstmals, dass die T-Zell-Zytokine prinzipiell in zwei Klassen eingeteilt werden können: die
argininabhängigen (IFN-γ, TNF-β, IL-10) sowie die argininunabhängigen (IL-2, IL-6, IL-8).
Es
bleibt
zum
gegenwärtigen
Signaltransduktionsmechanismen
diese
Zeitpunkt
unklar,
unterschiedliche
welche
Sensitivität
intrazellulären
der
Zytokine
gegenüber extrazellulärer Arginindepletion bewirken. Offenbar handelt es sich hierbei
allerdings nicht um eine funktionelle Dichotomie hinsichtlich Inflammation / AntiInflammation. So werden z.B. das prototypische inflammatorische Zytokin IFN-γ sowie das
klassische anti-inflammatorische Zytokin IL-10 gleichartig argininabhängig reguliert.
Die durchflusszytometrischen Analysen zur intrazellulären Zytokin-Akkumulation zeigten
ferner, dass es sich beim Defekt der Zytokinsynthese nicht um eine Sekretionsstörung mit
intrazellulärer Akkumulation handelt, sondern in Zusammenschau mit den publizierten
Untersuchungen zur mRNA Expression (Munder et al. 2006) eine posttranskriptionelle
Synthesestörung vorliegt.
4.4
Kein Einfluss von Arginin auf frühe Signaltransduktionsereignisse in primären humanen T-Lymphozyten
Intrazellulärer Calciumflux ist ein frühes Ereignis der T-Zell-Aktivierung. Bei TZRvermittelter Stimulation von T-Lymphozyten kommt es zu einer Aktivierung der PLC-γ mit
konsekutiver hydrolytischer Spaltung von PIP2 in IP3
Die Bindung von IP3 an IP3-
2+
Rezeptoren auf Ca -durchlässigen Ionenkanälen der Membran des endoplasmatischen
105
Diskussion
Retikulum (ER) führt zu einer Freisetzung des Ca2+ aus dem ER-Speicher in das
Zytoplasma sowie einem sekundären Einstrom von extrazellulärem Calcium über Calciumabhängige Calcium-Kanäle der Zellmembran. Die Zunahme von zytoplasmatischem Ca2+
führt letztendlich via Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT zur Expression
verschiedener Gene (z.B. IL-2) und reguliert dadurch die Differenzierung, Proliferation und
Effektorfunktionen der T-Zellen (Oh-hora and Rao 2008, Smith-Garvin et al. 2009). In TLymphozyten von Patienten mit Immundefizienz-Syndrom (SCID, severe combined
immune deficiency), zeigte sich ein funktioneller Defekt der Kalziumkanäle, dem Ca2+Influx, und folgend der Aktivierung von NFAT, welches zu einer signifikanten Reduktion
Calcium-abhängiger Gene führt und schließlich zu einer supprimierten Immunantwort (Ohhora and Rao 2008, Savignac et al. 2007). Ferner induziert Ca2+ über Aktivierung der
Phosphatase Calcineurin, welche wiederum die Phosphatase SSH1L aktiviert, die
Dephosphorylierung von Cofilin (Wang Y. et al. 2005). Folglich könnte ein Defekt in der
Ca2+-vermittelten Signalkaskade zu einer fehlenden Dephosphorylierung von Cofilin,
assoziiert mit einer Hemmung der T-Zell-Aktivierung, führen. Die im Rahmen dieser
Promotionsarbeit durchgeführten Messungen des aktivierungsabhängigen Calciumfluxes
in humanen T-Lymphozyten zeigten, dass dieser argininunabhängig verläuft (vgl. 3.10).
Somit
ergaben
sich
keine
Anhaltspunkte
dafür,
dass
der
Calcium-abhängige
Calcineurin/NFAT-Signaltransduktionsweg durch Argininabwesenheit beeinflusst wird.
Weitere für die initiale T-Zell-Aktivierung entscheidende Signaltransduktionswege, die RasMEK-ERK- und Ras-PI3K-Akt-Signalkaskaden, werden durch die GTPase Ras vermittelt.
Die Stimulation über den TZR-Komplex und kostimulatorische Moleküle (wie z.B. CD2,
CD28) führt durch Aktivierung von Ras über PKC via Phosphorylierung der Ras-Effektoren
MEK und PI3K zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, welche über Expression
essentieller Gene die T-Zell-Effektorantwort regulieren können. Das Zusammenspiel
dieser beiden Signalwege ist für die kostimulations-induzierte Aktivierung von Cofilin
erforderlich, da die Inhibierung von MEK oder PI3K eine fehlende Dephosporylierung zur
Folge hat (Samstag and Nebl 2005, Wabnitz et al. 2006). Aus den Western Blot
Untersuchungen zur frühen Phosphorylierung (0-30 min nach Beginn der T-ZellStimulation) wurde klar, dass zumindest initial keine argininabhängigen Alterationen dieser
wichtigen Kinase-Phosphorylierungen (und damit assoziiert deren Aktivierung) in humanen
T-Zellen
feststellbar
sind.
Diese
Ergebnisse
kontrastierten
mit
dem
Phosphorylierungsstatus der aktivierten T-Zellen zu späteren Zeitpunkten. Die hier
festgestellte fehlende ERK-Phosphorylierung bei Arginindefizienz bei persistierender AktPhosphorylierung bei Argininabwesenheit (und vice versa bei Anwesenheit von Arginin)
106
Diskussion
lässt sich potentiell mit einer fehlenden negativen Rückkopplung von dephosphoryliertem
Cofilin auf die (die Dephosphorylierung unterhaltende) PIK3 Kinase-Aktivität erklären.
Die Regulation des Phosphorylierungszyklus von Cofilin ist sehr komplex und wird von
zahlreichen Faktoren beeinflusst. Da sich die fehlende Dephosphorylierung von Cofilin erst
zu einem späteren Zeitpunkt während der T-Zell-Aktivierung entwickelt (vgl. 3.3 und 3.11),
sind möglicherweise zeitverzögert Alterationen der Aktivität der Serin-Kinasen LIMK 1 und
2 (engl. LIM motif containing protein kinases) (Arber et al. 1998, Yang et al. 1998) in
welche Cofilin via Phosphorylierung inaktivieren können (Arber et al. 1998, Yang et al.
1998),
in
diesen
Prozess
mit
involviert.
Auch
eine
Inhibierung
der
Cofilin-
dephosphorylierenden T-Zell-Phosphatasen PP1 oder PP2A (Ambach et al. 2000) könnte
eine verminderte Aktivität von Cofilin im weiteren Verlauf der T-Zell-Aktivierung zur Folge
haben. Hier sind zusätzliche detaillierte Untersuchungen zur T-Zell-Signaltransduktion bei
Arginin-Defizienz sicher interessant und zielführend.
Ferner kann die Aktivität von Cofilin nach Dephosphorylierung durch PIP2 inhibiert werden.
Die Bindung von PIP2 blockiert die Aktin-Bindungsstelle von Cofilin. Im aktiven Zustand
befindet sich Cofilin u.a. auch im Bereich der Plasmamembran (PM), wobei das Protein
dort an PIP2 gebunden und inaktiviert wird. Wird PIP2 durch PCLγ hydrolysiert, wird Cofilin
lokal im Bereich der PM wieder in seiner aktiven Form freigesetzt und diffundiert von der
PM ins Zytosol. Ein Teil dieses Cofilin wird jedoch nachfolgend durch LIMK via
Phosphorylierung erneut inaktiviert (van Rheenen et al. 2009). Zwar konnten wir initial
keine Alterationen des PLCγ-abhängigen Calciumfluxes messen, dies schließt natürlich
nicht eine Alteration des Phosphatidylinositol-Metabolismus im weiteren Verlauf der T-ZellAktivierung aus. Ein weiterer Mechanismus, durch den die Cofilin-Aktivität kontrolliert wird
ist die Änderung des intrazellulären pH-Wertes. Bei einem pH-Wert über 8 wirkt Cofilin
stärker depolymerisierend als bei einem niedrigeren pH-Wert (Yonezawa et al. 1985).
Zusätzlich ist auch die Konzentration von Cofilin in der Zelle entscheidend für eine
Polymerisation oder Depolymerisation von F-Aktin. Sind Aktinfilamente nur mit wenig
Cofilinmolekülen bedeckt, ist die Schneideaktivität hoch, binden viele Moleküle an Aktin,
so ist diese Aktivität nicht mehr messbar (Andrianantoandro and Pollard 2006, Van Troys
et al. 2008). Für die im pathophysiologischen Kontext von oxidativem Stress auftretende TZell-Suppression ist kürzlich ebenfalls eine Inaktivierung von Cofilin beschrieben worden
(Klemke et al. 2008). Hierbei fand sich bei erhaltener Cofilin-Dephosphorylierung eine
intramolekulare Disulfidbrückenbindung, welche dazu führte, dass trotz Bindung von
107
Diskussion
Cofilin an F-Aktin keine Depolymerisierung des F-Aktins induziert werden konnte (Klemke
et al. 2008).
4.5 Inhibition der Cofilin-Dephosphorylierung bei granulozytärer
Inflammation.
Das Enzym Arginase kann bei Patienten mit chronischen Entzündungen (z.B. Asthma)
(Zimmermann and Rothenberg 2006), mit Infektionekrankheiten (z.B. mit Helicobacter
pylori oder Bacillus anthracis) (Raines et al. 2006, Zabaleta et al. 2004) und bei
Tumorpatienten (z.B. Magen- und Lungenkarzinom) (Rodriguez et al. 2004, Wu et al.
1994) in erhöhten Mengen gemessen werden. Des Weiteren konnten auch in humanem
Abszesseiter bzw. zellfreiem Eiterüberstand chirurgischer Patienten sehr hohe ArginaseAktivitäten nachgewiesen werden (Munder et al. 2006). Da Eiterbildung den Prototyp einer
granulozytär-dominierten Entzündung darstellt, sind als Quelle der nachgewiesenen
Arginase I im Eiter am ehesten die zerfallenen neutrophilen Granulozyten anzunehmen
(Munder et al. 2006). T-Zellen, die in Zellkulturmedium stimuliert wurden, das mit
zellfreiem
Eiterüberstand
präinkubiert
wurde,
waren
in
ihrer
Proliferation
und
Zytokinsekretion ebenso supprimiert wie T-Lymphozyten, die in argininfreiem Medium
stimuliert wurden. Die kausale Rolle der Arginase im Eiter zeigte sich dadurch, dass durch
die Zugabe des Arginase-Inhibitors nor-NOHA die gehemmte Proliferation der TLymphozyten wieder hergestellt werden konnte (vgl. 3.11) (Munder et al. 2006).
Um die Regulation des Proteins Cofilin unter der pathophysiologischen Bedingung einer
granulozytär dominierten Inflammation in Zellkultur zu untersuchen, wurden T-Zellen für 48
h in argininhaltigem Medium inkubiert, dem zuvor humaner zellfreier Eiterüberstand
zugefügt wurde. Es zeigte sich dabei, dass die fehlende Dephosphorylierung von Cofilin
auch bei T-Zell-Aktivierung im Kontext Eiter-induzierter Arginindepletion feststellbar ist. Die
kausale Rolle der Arginase zeigte sich hier erneut durch Reversibilität von T-Zell
Proliferation und Cofilin-Dephosphorylierung bei Zugabe des Arginase-Inhibitors norNOHA. Interessant sind sicher künftige Untersuchungen zum Phosphorylierungsstatus von
Cofilin in humanen T-Lymphozyten im Rahmen verschiedener inflammatorischer
Zustände, bei Infektionserkrankungen und Tumoren. Hierbei sind bei bereits bekannter
Argininverarmung Störungen der Cofilin-Dephsophorylierung sowie der nachgeschalteten
zentralen T-Zell-Funktionen zu erwarten. Therapeutische Ansätze zur Inhibierung
inflammationsassoziierter Immunsuppression sollten sich daher neben der Inhibierung der
108
Diskussion
Arginase bzw. Supplementation von Arginin auch mit der Möglichkeit beschäftigen, die
Dephosphorylierung des Proteins Cofilin pharmakologisch zu modulieren.
109
Anhang
5
Anhang
5.1
Tabellen
T+B+SEB-Arg
T+B+Arg
T+B-Arg
T+Arg unstim.
T-Arg unstim.
512
10
2054
2162
2690
219
0
0
58
1
1779
1
0
0
0 ,5
1
158
1
0
0
490
204
1458
1
0
0
276
1
2180
1
9 9 1 2 ,7
18030
2650
13482
21303
9616
6408
5873
8190
1699
13101
15502
13128
3328
0
801
0
664
445
456
1
0
235
0
299
198
96
1
0
0
0 ,5
1
102
1
0
0 ,5
1
72
1
8365
11470
9966
7677
6946
10491
5259
7708
16815
8996
3894
6026
9186
7635
204
1044
708
594
892
1757
614
72
496
168
1
264
38
1286
72
0 ,5
1
1
0
0
514
55
0 ,0 5
1
1
0
0
510
4100
2460
1917
12280
6946
1704
11200
6808
888
1960
100
64
0
336
0
0
0
0
0
3877
2271
3344
3698
6064
14582
5229
7541
8240
10354
3404
11882
514
1208
176
0
0
1120
48
0
0
0
20
0
0
0
0
0
T+Beads-Arg
1 3 4 8 ,6
9 8 ,1 1
3828
5260
5703
444
T+Beads+Arg
T+B+SEB+Arg
A.
7 6 8 ,3
6 6 ,8 5
452
4 2 ,3 5
7371
1458
2828
285
111548
16840
11580
6447
996
4208
13545
9888
5906
2198
31824
15448
20468
8184
9417
4238
10623
2286
2554
8694
72h
2 9 .1 0 .2 0 0 9
0 5 .0 2 .2 0 0 9
1 7 .0 5 .2 0 0 9
7100
3346
3925
96h
0 7 .0 6 .2 0 0 9
0 8 .0 2 .2 0 0 9
1 7 .0 5 .2 0 0 9
0 4 .1 0 .2 0 0 9
4475
2220
10485
2272
E x p e r im e n t
6h
2 9 .1 0 .2 0 0 9
1 4 .1 0 .2 0 0 9
2 3 .0 6 .2 0 0 8
3 0 .0 6 .2 0 0 8
0 6 .0 7 .2 0 0 8
0 8 .0 9 .2 0 0 8
24h
1 3 .1 0 .2 0 0 9
0 3 .0 6 .2 0 0 9
1 3 .0 5 .2 0 0 9
2 4 .0 6 .2 0 0 8
0 1 .0 7 .2 0 0 8
0 7 .0 7 .2 0 0 8
0 9 .0 9 .2 0 0 8
48h
1 3 .0 5 .2 0 0 9
0 8 .0 7 .2 0 0 8
0 2 .0 7 .2 0 0 8
1 0 .0 9 .2 0 0 8
0 4 .0 2 .2 0 0 8
2 4 .0 2 .2 0 0 8
2 4 .0 6 .2 0 0 8
110
Anhang
Experiment
6h
12.05.2005
27.05.2004
05.05.2004
21.04.2004
T+Beads+Arg
T+Beads-Arg
T+B+SEB+Arg
T+B+SEB-Arg
T+B+Arg
T+B-Arg
T+Arg unstim.
T-Arg unstim.
B.
81,3
375
5092,74
1230
40
150
2764,74
2213
1056
486
2793
342
918
360
1031
174
280
44,7
1925
1229
0
0
333
98
104
0
2664
1072
0
105
2759
2020
24h
08.07.2005
13.05.2005
28.05.2004
06.05.2004
22.04.2004
3290
1834
2923
5823
1795
368
120
634
2138
729
5590
2226
5606
4093
1371
1278
357
3154
2568
713
1209
640
862
1021
815
0
42,6
90
237
158
0
0
0
207
296
0
0
39
719
9
48h
14.05.2005
24.02.2005
04.02.2005
29.05.2004
07.05.2004
23.04.2004
4632
19638
5047
4866
5179
5970
1328
3666
212
642
918
752
5696
16794
17487
2736
5076
3826
12711
5803
1668
14244
3702
2473
3925
1494
69,8
682
186
729
1395
565
32
0
30
0
53
17
37
0
25
0
166
148
72h
17.05.2005
06.02.2009
25.02.2005
3494
5338
11313
25
0
3228
1205
51672
12702
168
3027
5109
135
4436
9905
15
183
1116
0
0
0
0
0
0
96h
29.07.2005
17.05.2005
02.03.2005
08.02.2005
7404
4972
4152
3568
715
336
846
306
9872
5976
2787
4956
2216
1485
609
720
2376
2858
257
933
277
193
44
12
0
88
0
12
0
95
0
0
Tab. zu 3.8: Orginaldaten der IL-2 und IFNy ELISA-Messungen nach Zeiten und Datum aufgelistet.
Teilweise wurden Daten nicht in die Auswertung genommen, wenn die Proliferation der T-Zellen ungenügend
oder völlig unterschiedlich waren (Lücken). Die Zeit ist in Stunden (h) angegeben. Stimulation der T-Zellen mit
anti-CD3/CD28 (T+Beads) in argininhaltigem (+Arg) oder arginfreiem Medium (-Arg), Stimulation mit
Superantigen beladenen B-Zellen (T+B+SEB); T-Zellen mit unbeladenen B-Zellen (T+B) und T-Zellen alleine
(T unstim.) als Kontrollen. A. Zeigt die Orginaldaten der IIL-2 ELISA-Messungen. B. Zeigt die Orginaldaten der
IFNy ELISA-Messungen.
111
Argneg+SEB
303,9
743,5
369,2
blank 75,9
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 195,8
1267,2
754,3
137,3
1883,6
1967,7
909,5
1698,3
750,0
178,4
1670,3
959,1
663,8
3510,6
2414,9
853,2
2946,8
952,1
952,1
3840,4
2819,1
748,9
4031,9
2276,6
1361,7
840,7
2847,5
1128,8
112,5
230,5
457,6
194,9
1320,3
267,8
121,0
184,7
140,2
237,3
235,3
142,4
166,1
164,1
116,3
290,2
172,5
203,9
189,4
2144,9
1406,5
700,9
354,2
225,7
331,8
1500,0
1635,5
1121,5
197,7
273,4
446,7
3700,0
1866,7
1145,0
885,0
621,7
1008,3
268,3
543,3
276,7
198,3
263,3
425,0
75,6
84,1
81,9
65,4
82,4
76,4
164,3
94,4
101,9
85,6
97,9
65,0
Zytokin: IL-8
1007,4
867,0
1219,5
1106,4
520,2
853,7
1883,0
2010,6
2097,6
1127,7
2000,0
1609,8
blank 114,9
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Zytokin: IL-10
130,3
1403,4
1782,6
118,5
134,1
76,2
152,4
1762,7
747,0
125,3
364,4
107,0
blank 126,3
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Zytokin: IL-12p70
132,2
132,7
53,5
154,3
64,9
45,3
202,0
331,4
71,2
162,7
292,2
51,3
blank 172,4
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Zytokin: TNFß
195,3
223,8
154,7
59,8
203,3
495,3
101,4
175,7
2483,3
1653,3
2470,6
2083,3
823,3
2211,8
2550,0
2050,0
2270,6
1618,3
2666,7
1552,9
Zytokin: TNF-alpha
blank 114,8
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 67,1
Zytokin: IL-1beta
blank 37,1
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Argneg+SEB
blank 61,7
14.10.2009
29.9.2009
750,0
655,2
543,6
Argpos+SEB
blank 172,4
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 42,72
Zytokin: TNFß
500,0
295,3
379,0
Argneg+Beads
blank 126,3
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 42
Zytokin: IL-12p70
206,3
357,8
605,1
Experimente 96h
Zytokin: IL-6
Argpos+Beads
blank 114,9
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 56,3
Zytokin: IL-10
Argpos+SEB
blank 37,1
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 54,4
Zytokin: IL-8
Argneg+Beads
Experimnete 24h
Zytokin: IL-6
Argpos+Beads
Anhang
blank 61,7
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Zytokin: TNF-alpha
blank 114,8
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Zytokin: IL-1beta
71,3
67,9
256,3
80,9
54,3
234,7
107,9
96,3
254,2
80,4
109,0
279,5
blank 75,9
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
112
467,3
578,2
2090
blank 442,7
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Argneg+SEB
Argneg+SEB
400,9
508,2
2030
Argpos+SEB
blank 75,1
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 30,5
454,5
301,8
1890
Argneg+Beads
blank 48,3
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 36,1
Zytokin: IFNy
301,8
408,2
2085
Experimente 96h
Zytokin: IL-4
Argpos+Beads
blank 128
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 37,3
Zytokin: IL-2
Argpos+SEB
blank 442,7
14.10.2009
29.9.2009
15.07.2009
blank 1570
Zytokin: IL-5
Argneg+Beads
Experimnete 24h
Zytokin: IL-4
Argpos+Beads
Anhang
450,0
490,9
379,1
477,3
519,1
391,8
576,4
610,0
408,2
369,1
407,3
440,0
148,3
198,0
128,8
131,2
137,8
142,4
147,8
251,2
196,3
126,8
125,1
105,4
6317,3
4096,2
5721,2
4605,8
4278,8
5990,4
7240,4
6163,5
2884,6
3307,7
3894,2
6923,1
3615,4
1021,5
4953,8
904,6
4784,6
1250,8
2923,1
3200,0
4415,4
1309,2
3030,8
1923,1
Zytokin: IL-5
120,0
125,4
46,7
135,9
112,7
43,1
96,1
169,3
48,6
115,9
132,9
52,5
blank 128
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Zytokin: IL-2
6317,3
3211,5
4346,2
3192,3
4288,5
3346,2
5375,0
6932,7
5727,3
2919,2
4858,6
3333,3
blank 48,3
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Zytokin: IFNy
2230,8
400,0
3984,6
701,5
4384,6
584,6
4461,5
3338,5
842,5
66,8
1425,2
203,1
blank 75,1
19.10.2009
02.10.2009
05.10.2009
Tab. zu 3.9: Originalmessdaten der Multiplex Zytokinmessungen. Auflistung nach Zytokinen, Zeit und
Datum. Abkürzungen: Stimulation der T-Zellen mit anti-CD3/-CD28 (T+Beads) in argininhaltigem (+Arg) oder
argininfreiem Medium (-Arg), Stimulation mit Superantigen SEB beladenen B-Zellen (T+B+SEB); T-Zellen mit
unbeladenen B-Zellen (T+B) und T-Zellen alleine (T unstim.) als Kontrollen. Gezeigt werden die Originaldaten
der Multiplex Zxtokinmessung.
113
Literaturverzeichnis
6
Literaturverzeichnis
Abe H, Obinata T, Minamide LS, Bamburg JR. 1996. Xenopus laevis actin-depolymerizing
factor/cofilin: a phosphorylation-regulated protein essential for development. J Cell Biol
132: 871-885.
Acuto O, Michel F. 2003. CD28-mediated co-stimulation: a quantitative support for TCR
signalling. Nat Rev Immunol 3: 939-951.
Ambach A, Saunus J, Konstandin M, Wesselborg S, Meuer SC, Samstag Y. 2000. The
serine phosphatases PP1 and PP2A associate with and activate the actin-binding protein
cofilin in human T lymphocytes. Eur J Immunol 30: 3422-3431.
Andrianantoandro E, Pollard TD. 2006. Mechanism of actin filament turnover by severing
and nucleation at different concentrations of ADF/cofilin. Mol Cell 24: 13-23.
Arber S, Barbayannis FA, Hanser H, Schneider C, Stanyon CA, Bernard O, Caroni P.
1998. Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase.
Nature 393: 805-809.
Aulak KS, Mishra R, Zhou L, Hyatt SL, de Jonge W, Lamers W, Snider M, Hatzoglou M.
1999. Post-transcriptional regulation of the arginine transporter Cat-1 by amino acid
availability. J Biol Chem 274: 30424-30432.
Averous J, Bruhat A, Jousse C, Carraro V, Thiel G, Fafournoux P. 2004. Induction of
CHOP expression by amino acid limitation requires both ATF4 expression and ATF2
phosphorylation. J Biol Chem 279: 5288-5297.
Bamburg JR. 1999. Proteins of the ADF/cofilin family: essential regulators of actin
dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol 15: 185-230.
Baniyash M. 2004. TCR zeta-chain downregulation: curtailing an excessive inflammatory
immune response. Nat Rev Immunol 4: 675-687.
Bhattacharyya SN, Habermacher R, Martine U, Closs EI, Filipowicz W. 2006. Relief of
microRNA-mediated translational repression in human cells subjected to stress. Cell 125:
1111-1124.
Billadeau DD, Burkhardt JK. 2006. Regulation of cytoskeletal dynamics at the immune
synapse: new stars join the actin troupe. Traffic 7: 1451-1460.
114
Literaturverzeichnis
Billadeau DD, Nolz JC, Gomez TS. 2007. Regulation of T-cell activation by the
cytoskeleton. Nat Rev Immunol 7: 131-143.
Bogdan C. 2001. Nitric oxide and the immune response. Nat Immunol 2: 907-916.
Boise LH, Minn AJ, Noel PJ, June CH, Accavitti MA, Lindsten T, Thompson CB. 1995.
CD28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-XL.
Immunity 3: 87-98.
Borst J, Coligan JE, Oettgen H, Pessano S, Malin R, Terhorst C. 1984. The delta- and
epsilon-chains of the human T3/T-cell receptor complex are distinct polypeptides. Nature
312: 455-458.
Bronte V, Zanovello P. 2005. Regulation of immune responses by L-arginine metabolism.
Nat Rev Immunol 5: 641-654.
Bronte V, Serafini P, Mazzoni A, Segal DM, Zanovello P. 2003a. L-arginine metabolism in
myeloid cells controls T-lymphocyte functions. Trends Immunol 24: 302-306.
Bronte V, et al. 2005. Boosting antitumor responses of T lymphocytes infiltrating human
prostate cancers. J Exp Med 201: 1257-1268.
Bronte V, Serafini P, De Santo C, Marigo I. 2003b. IL-4-induced arginase 1 suppresses
alloreactive T cells in tumor-bearing mice. J Immunol 170: 270-278.
Burkhardt JK, Carrizosa E, Shaffer MH. 2008. The actin cytoskeleton in T cell activation.
Annu Rev Immunol 26: 233-259.
Cannon JL, Labno CM, Bosco G, Seth A, McGavin MH, Siminovitch KA, Rosen MK,
Burkhardt JK. 2001. Wasp recruitment to the T cell:APC contact site occurs independently
of Cdc42 activation. Immunity 15: 249-259.
Carlier MF. 1987. Measurement of Pi dissociation from actin filaments following ATP
hydrolysis using a linked enzyme assay. Biochem Biophys Res Commun 143: 1069-1075.
Carraway MS, Piantadosi CA, Jenkinson CP, Huang YC. 1998. Differential expression of
arginase and iNOS in the lung in sepsis. Exp Lung Res 24: 253-268.
Chan AY, Bailly M, Zebda N, Segall JE, Condeelis JS. 2000. Role of cofilin in epidermal
growth factor-stimulated actin polymerization and lamellipod protrusion. J Cell Biol 148:
531-542.
115
Literaturverzeichnis
Condeelis J. 2001. How is actin polymerization nucleated in vivo? Trends Cell Biol 11:
288-293.
Cooper JA. 1987. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J Cell Biol 105: 14731478.
Corraliza IM, Soler G, Eichmann K, Modolell M. 1995. Arginase induction by suppressors
of nitric oxide synthesis (IL-4, IL-10 and PGE2) in murine bone-marrow-derived
macrophages. Biochem Biophys Res Commun 206: 667-673.
Curiel TJ. 2007. Tregs and rethinking cancer immunotherapy. J Clin Invest 117: 11671174.
Davis SJ, van der Merwe PA. 1996. The structure and ligand interactions of CD2:
implications for T-cell function. Immunol Today 17: 177-187.
Delon J, Germain RN. 2000. Information transfer at the immunological synapse. Curr Biol
10: R923-933.
DiNubile MJ, Cassimeris L, Joyce M, Zigmond SH. 1995. Actin filament barbed-end
capping activity in neutrophil lysates: the role of capping protein-beta 2. Mol Biol Cell 6:
1659-1671.
Du J, Frieden C. 1998. Kinetic studies on the effect of yeast cofilin on yeast actin
polymerization. Biochemistry 37: 13276-13284.
Eibert SM, Lee KH, Pipkorn R, Sester U, Wabnitz GH, Giese T, Meuer SC, Samstag Y.
2004. Cofilin peptide homologs interfere with immunological synapse formation and T cell
activation. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 1957-1962.
El-Gayar S, Thuring-Nahler H, Pfeilschifter J, Rollinghoff M, Bogdan C. 2003. Translational
control of inducible nitric oxide synthase by IL-13 and arginine availability in inflammatory
macrophages. J Immunol 171: 4561-4568.
Finco TS, Kadlecek T, Zhang W, Samelson LE, Weiss A. 1998. LAT is required for TCRmediated activation of PLCgamma1 and the Ras pathway. Immunity 9: 617-626.
Fischer KD, Tedford K, Penninger JM. 1998a. Vav links antigen-receptor signaling to the
actin cytoskeleton. Semin Immunol 10: 317-327.
Fischer KD, et al. 1998b. Vav is a regulator of cytoskeletal reorganization mediated by the
T-cell receptor. Curr Biol 8: 554-562.
116
Literaturverzeichnis
Gallina G, et al. 2006. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with
immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest 116: 2777-2790.
Germain RN. 2001. The T cell receptor for antigen: signaling and ligand discrimination. J
Biol Chem 276: 35223-35226.
Ghosh M, Song X, Mouneimne G, Sidani M, Lawrence DS, Condeelis JS. 2004. Cofilin
promotes actin polymerization and defines the direction of cell motility. Science 304: 743746.
Gobert AP, McGee DJ, Akhtar M, Mendz GL, Newton JC, Cheng Y, Mobley HL, Wilson
KT. 2001. Helicobacter pylori arginase inhibits nitric oxide production by eukaryotic cells: a
strategy for bacterial survival. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 13844-13849.
Gomez-Marquez J, Dosil M, Segade F, Bustelo XR, Pichel JG, Dominguez F, Freire M.
1989. Thymosin-beta 4 gene. Preliminary characterization and expression in tissues,
thymic cells, and lymphocytes. J Immunol 143: 2740-2744.
Harding FA, McArthur JG, Gross JA, Raulet DH, Allison JP. 1992. CD28-mediated
signalling co-stimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T-cell clones.
Nature 356: 607-609.
Hartwig JH, Chambers KA, Hopcia KL, Kwiatkowski DJ. 1989. Association of profilin with
filament-free regions of human leukocyte and platelet membranes and reversible
membrane binding during platelet activation. J Cell Biol 109: 1571-1579.
Hecker M, Nematollahi H, Hey C, Busse R, Racke K. 1995. Inhibition of arginase by NGhydroxy-L-arginine in alveolar macrophages: implications for the utilization of L-arginine for
nitric oxide synthesis. FEBS Lett 359: 251-254.
Hinnebusch AG. 1994. The eIF-2 alpha kinases: regulators of protein synthesis in
starvation and stress. Semin Cell Biol 5: 417-426.
Hosseini BH, Louban I, Djandji D, Wabnitz GH, Deeg J, Bulbuc N, Samstag Y, Gunzer M,
Spatz JP, Hammerling GJ. 2009. Immune synapse formation determines interaction forces
between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proc
Natl Acad Sci U S A 106: 17852-17857.
Hotulainen P, Paunola E, Vartiainen MK, Lappalainen P. 2005. Actin-depolymerizing factor
and cofilin-1 play overlapping roles in promoting rapid F-actin depolymerization in
mammalian nonmuscle cells. Mol Biol Cell 16: 649-664.
117
Literaturverzeichnis
Ichetovkin I, Grant W, Condeelis J. 2002. Cofilin produces newly polymerized actin
filaments that are preferred for dendritic nucleation by the Arp2/3 complex. Curr Biol 12:
79-84.
Iida K, Moriyama K, Matsumoto S, Kawasaki H, Nishida E, Yahara I. 1993. Isolation of a
yeast essential gene, COF1, that encodes a homologue of mammalian cofilin, a low-M(r)
actin-binding and depolymerizing protein. Gene 124: 115-120.
K. Murphy PT, M. Walport. 2009. Janeway Immunologie. Heidelberg: Spektrum
Akademischer Verlag.
Kane LP, Lin J, Weiss A. 2002. It's all Rel-ative: NF-kappaB and CD28 costimulation of Tcell activation. Trends Immunol 23: 413-420.
Kanyo ZF, Scolnick LR, Ash DE, Christianson DW. 1996. Structure of a unique binuclear
manganese cluster in arginase. Nature 383: 554-557.
Kenney D, Cairns L, Remold-O'Donnell E, Peterson J, Rosen FS, Parkman R. 1986.
Morphological abnormalities in the lymphocytes of patients with the Wiskott-Aldrich
syndrome. Blood 68: 1329-1332.
Kim AS, Kakalis LT, Abdul-Manan N, Liu GA, Rosen MK. 2000. Autoinhibition and
activation mechanisms of the Wiskott-Aldrich syndrome protein. Nature 404: 151-158.
Klemke M, Wabnitz GH, Funke F, Funk B, Kirchgessner H, Samstag Y. 2008. Oxidation of
cofilin mediates T cell hyporesponsiveness under oxidative stress conditions. Immunity 29:
404-413.
Kropf P, et al. 2007. Arginase activity mediates reversible T cell hyporesponsiveness in
human pregnancy. Eur J Immunol 37: 935-945.
Kummerow C, Junker C, Kruse K, Rieger H, Quintana A, Hoth M. 2009. The
immunological synapse controls local and global calcium signals in T lymphocytes.
Immunol Rev 231: 132-147.
Kung JT, Brooks SB, Jakway JP, Leonard LL, Talmage DW. 1977. Suppression of in vitro
cytotoxic response by macrophages due to induced arginase. J Exp Med 146: 665-672.
Lee J, Ryu H, Ferrante RJ, Morris SM, Jr., Ratan RR. 2003. Translational control of
inducible nitric oxide synthase expression by arginine can explain the arginine paradox.
Proc Natl Acad Sci U S A 100: 4843-4848.
118
Literaturverzeichnis
Lee KH, Meuer SC, Samstag Y. 2000. Cofilin: a missing link between T cell co-stimulation
and rearrangement of the actin cytoskeleton. Eur J Immunol 30: 892-899.
Lewis CE, Pollard JW. 2006. Distinct role of macrophages in different tumor
microenvironments. Cancer Res 66: 605-612.
Liu Y, Van Ginderachter JA, Brys L, De Baetselier P, Raes G, Geldhof AB. 2003. Nitric
oxide-independent CTL suppression during tumor progression: association with arginaseproducing (M2) myeloid cells. J Immunol 170: 5064-5074.
Maarsingh H, Zaagsma J, Meurs H. 2009. Arginase: a key enzyme in the pathophysiology
of allergic asthma opening novel therapeutic perspectives. Br J Pharmacol 158: 652-664.
McGough A, Pope B, Chiu W, Weeds A. 1997. Cofilin changes the twist of F-actin:
implications for actin filament dynamics and cellular function. J Cell Biol 138: 771-781.
Meuer SC, Hussey RE, Fabbi M, Fox D, Acuto O, Fitzgerald KA, Hodgdon JC, Protentis
JP, Schlossman SF, Reinherz EL. 1984. An alternative pathway of T-cell activation: a
functional role for the 50 kd T11 sheep erythrocyte receptor protein. Cell 36: 897-906.
Meurs H, McKay S, Maarsingh H, Hamer MA, Macic L, Molendijk N, Zaagsma J. 2002.
Increased arginase activity underlies allergen-induced deficiency of cNOS-derived nitric
oxide and airway hyperresponsiveness. Br J Pharmacol 136: 391-398.
Mistry SK, Zheng M, Rouse BT, Morris SM, Jr. 2001. Induction of arginases I and II in
cornea during herpes simplex virus infection. Virus Res 73: 177-182.
Modolell M, et al. 2009. Local suppression of T cell responses by arginase-induced Larginine depletion in nonhealing leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis 3: e480.
Moingeon P, Chang HC, Sayre PH, Clayton LK, Alcover A, Gardner P, Reinherz EL. 1989.
The structural biology of CD2. Immunol Rev 111: 111-144.
Moon AL, Janmey PA, Louie KA, Drubin DG. 1993. Cofilin is an essential component of
the yeast cortical cytoskeleton. J Cell Biol 120: 421-435.
Moriyama K, Iida K, Yahara I. 1996. Phosphorylation of Ser-3 of cofilin regulates its
essential function on actin. Genes Cells 1: 73-86.
Morris CR, Morris SM, Jr., Hagar W, Van Warmerdam J, Claster S, Kepka-Lenhart D,
Machado L, Kuypers FA, Vichinsky EP. 2003. Arginine therapy: a new treatment for
pulmonary hypertension in sickle cell disease? Am J Respir Crit Care Med 168: 63-69.
119
Literaturverzeichnis
Mouneimne G, DesMarais V, Sidani M, Scemes E, Wang W, Song X, Eddy R, Condeelis
J. 2006. Spatial and temporal control of cofilin activity is required for directional sensing
during chemotaxis. Curr Biol 16: 2193-2205.
Mueller DL, Jenkins MK, Schwartz RH. 1989. Clonal expansion versus functional clonal
inactivation: a costimulatory signalling pathway determines the outcome of T cell antigen
receptor occupancy. Annu Rev Immunol 7: 445-480.
Muller I, Hailu A, Choi BS, Abebe T, Fuentes JM, Munder M, Modolell M, Kropf P. 2008.
Age-related alteration of arginase activity impacts on severity of leishmaniasis. PLoS Negl
Trop Dis 2: e235.
Mullins RD, Heuser JA, Pollard TD. 1998. The interaction of Arp2/3 complex with actin:
nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of
filaments. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 6181-6186.
Munder M, et al. 2006. Suppression of T-cell functions by human granulocyte arginase.
Blood 108: 1627-1634.
Munder M, Mollinedo F,Calafat J, Canchado J. 2005. Arginase I is constitutively
expressed in human granulocytes and participates in fungicidal activity. Blood 105: 25492556.
Munn DH, Sharma MD, Baban B, Harding HP, Zhang Y, Ron D, Mellor AL. 2005. GCN2
kinase in T cells mediates proliferative arrest and anergy induction in response to
indoleamine 2,3-dioxygenase. Immunity 22: 633-642.
Murphy K, Travers P, Walport M. 2009. Janeway Immunologie. Heidelberg: Spektrum
Akademischer Verlag.
Oberlies J, Watzl C, Giese T, Luckner C, Kropf P, Muller I, Ho AD, Munder M. 2009.
Regulation of NK cell function by human granulocyte arginase. J Immunol 182: 5259-5267.
Ochoa JB, Bernard AC, O'Brien WE, Griffen MM, Maley ME, Rockich AK, Tsuei BJ,
Boulanger BR, Kearney PA, Morris Jr SM, Jr. 2001. Arginase I expression and activity in
human mononuclear cells after injury. Ann Surg 233: 393-399.
Oh-hora M, Rao A. 2008. Calcium signaling in lymphocytes. Curr Opin Immunol 20: 250258.
Pantaloni D, Carlier MF. 1993. How profilin promotes actin filament assembly in the
presence of thymosin beta 4. Cell 75: 1007-1014.
120
Literaturverzeichnis
Pollard TD, Cooper JA. 1986. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of
mechanisms and functions. Annu Rev Biochem 55: 987-1035.
Pollard TD, Blanchoin L, Mullins RD. 2000. Molecular mechanisms controlling actin
filament dynamics in nonmuscle cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct 29: 545-576.
Radvanyi LG, Shi Y, Vaziri H, Sharma A, Dhala R, Mills GB, Miller RG. 1996. CD28
costimulation inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T cell response. J Immunol
156: 1788-1798.
Raines KW, Kang TJ, Hibbs S, Cao GL, Weaver J, Tsai P, Baillie L, Cross AS, Rosen GM.
2006. Importance of nitric oxide synthase in the control of infection by Bacillus anthracis.
Infect Immun 74: 2268-2276.
Reth M. 1989. Antigen receptor tail clue. Nature 338: 383-384.
Ricciardolo FL, Sterk PJ, Gaston B, Folkerts G. 2004. Nitric oxide in health and disease of
the respiratory system. Physiol Rev 84: 731-765.
Rivero-Lezcano OM, Marcilla A, Sameshima JH, Robbins KC. 1995. Wiskott-Aldrich
syndrome protein physically associates with Nck through Src homology 3 domains. Mol
Cell Biol 15: 5725-5731.
Rodriguez PC, Ochoa AC. 2008. Arginine regulation by myeloid derived suppressor cells
and tolerance in cancer: mechanisms and therapeutic perspectives. Immunol Rev 222:
180-191.
Rodriguez PC, Quiceno DG, Ochoa AC. 2007. L-arginine availability regulates Tlymphocyte cell-cycle progression. Blood 109: 1568-1573.
Rodriguez PC, Zea AH, Culotta KS, Zabaleta J, Ochoa JB, Ochoa AC. 2002. Regulation of
T cell receptor CD3zeta chain expression by L-arginine. J Biol Chem 277: 21123-21129.
Rodriguez PC, Hernandez CP, Quiceno D, Dubinett SM, Zabaleta J, Ochoa JB, Gilbert J,
Ochoa AC. 2005. Arginase I in myeloid suppressor cells is induced by COX-2 in lung
carcinoma. J Exp Med 202: 931-939.
Rodriguez PC, et al. 2004. Arginase I production in the tumor microenvironment by mature
myeloid cells inhibits T-cell receptor expression and antigen-specific T-cell responses.
Cancer Res 64: 5839-5849.
Rohatgi R, Ho HY, Kirschner MW. 2000. Mechanism of N-WASP activation by CDC42 and
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate. J Cell Biol 150: 1299-1310.
121
Literaturverzeichnis
Rohde J, Heitman J, Cardenas ME. 2001. The TOR kinases link nutrient sensing to cell
growth. J Biol Chem 276: 9583-9586.
Rouzaut A, Subira ML, de Miguel C, Domingo-de-Miguel E, Gonzalez A, Santiago E,
Lopez-Moratalla N. 1999. Co-expression of inducible nitric oxide synthase and arginasesin
different human monocyte subsets. Apoptosis regulated by endogenous NO. Biochim
Biophys Acta 1451: 319-333.
Samelson LE. 2002. Signal transduction mediated by the T cell antigen receptor: the role
of adapter proteins. Annu Rev Immunol 20: 371-394.
Samstag Y, Nebl G. 2005. Ras initiates phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)/PKB
mediated signalling pathways in untransformed human peripheral blood T lymphocytes.
Adv Enzyme Regul 45: 52-62.
Samstag Y, Eibert SM, Klemke M, Wabnitz GH. 2003. Actin cytoskeletal dynamics in T
lymphocyte activation and migration. J Leukoc Biol 73: 30-48.
Samstag Y, Dreizler EM, Ambach A, Sczakiel G, Meuer SC. 1996. Inhibition of constitutive
serine phosphatase activity in T lymphoma cells results in phosphorylation of pp19/cofilin
and induces apoptosis. J Immunol 156: 4167-4173.
Savignac M, Mellstrom B, Naranjo JR. 2007. Calcium-dependent transcription of cytokine
genes in T lymphocytes. Pflugers Arch 454: 523-533.
Selvaraj P, Plunkett ML, Dustin M, Sanders ME, Shaw S, Springer TA. 1987. The T
lymphocyte glycoprotein CD2 binds the cell surface ligand LFA-3. Nature 326: 400-403.
Serafini P, Borrello I, Bronte V. 2006a. Myeloid suppressor cells in cancer: recruitment,
phenotype, properties, and mechanisms of immune suppression. Semin Cancer Biol 16:
53-65.
Serafini P, Meckel K, Kelso M, Noonan K, Califano J, Koch W, Dolcetti L, Bronte V,
Borrello I. 2006b. Phosphodiesterase-5 inhibition augments endogenous antitumor
immunity by reducing myeloid-derived suppressor cell function. J Exp Med 203: 26912702.
Shevchenko A, Loboda A, Ens W, Standing KG. 2000. MALDI quadrupole time-of-flight
mass spectrometry: a powerful tool for proteomic research. Anal Chem 72: 2132-2141.
Sidani M, et al. 2007. Cofilin determines the migration behavior and turning frequency of
metastatic cancer cells. J Cell Biol 179: 777-791.
122
Literaturverzeichnis
Sinha P, Clements VK, Ostrand-Rosenberg S. 2005. Reduction of myeloid-derived
suppressor cells and induction of M1 macrophages facilitate the rejection of established
metastatic disease. J Immunol 174: 636-645.
Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. 2009. T cell activation. Annu Rev Immunol 27:
591-619.
Takeda K, Akira S. 2005. Toll-like receptors in innate immunity. Int Immunol 17: 1-14.
Valensin S, Paccani SR, Ulivieri C, Mercati D, Pacini S, Patrussi L, Hirst T, Lupetti P,
Baldari CT. 2002. F-actin dynamics control segregation of the TCR signaling cascade to
clustered lipid rafts. Eur J Immunol 32: 435-446.
van Rheenen J, Condeelis J, Glogauer M. 2009. A common cofilin activity cycle in invasive
tumor cells and inflammatory cells. J Cell Sci 122: 305-311.
Van Troys M, Huyck L, Leyman S, Dhaese S, Vandekerkhove J, Ampe C. 2008. Ins and
outs of ADF/cofilin activity and regulation. Eur J Cell Biol 87: 649-667.
Vartiainen MK, Mustonen T, Mattila PK, Ojala PJ, Thesleff I, Partanen J, Lappalainen P.
2002. The three mouse actin-depolymerizing factor/cofilins evolved to fulfill cell-typespecific requirements for actin dynamics. Mol Biol Cell 13: 183-194.
Vincendeau P, Gobert AP, Daulouede S, Moynet D, Mossalayi MD. 2003. Arginases in
parasitic diseases. Trends Parasitol 19: 9-12.
Wabnitz GH, Nebl G, Klemke M, Schroder AJ, Samstag Y. 2006. Phosphatidylinositol 3kinase functions as a Ras effector in the signaling cascade that regulates
dephosphorylation of the actin-remodeling protein cofilin after costimulation of
untransformed human T lymphocytes. J Immunol 176: 1668-1674.
Wang J, Xi L, Hunt JL, Gooding W, Whiteside TL, Chen Z, Godfrey TE, Ferris RL. 2004.
Expression pattern of chemokine receptor 6 (CCR6) and CCR7 in squamous cell
carcinoma of the head and neck identifies a novel metastatic phenotype. Cancer Res 64:
1861-1866.
Wang W, Mouneimne G, Sidani M, Wyckoff J, Chen X, Makris A, Goswami S, Bresnick
AR, Condeelis JS. 2006. The activity status of cofilin is directly related to invasion,
intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol 173: 395-404.
Wang Y, Shibasaki F, Mizuno K. 2005. Calcium signal-induced cofilin dephosphorylation is
mediated by Slingshot via calcineurin. J Biol Chem 280: 12683-12689.
123
Literaturverzeichnis
Weiner CP, Knowles RG, Stegink LD, Dawson J, Moncada S. 1996. Myometrial arginase
activity increases with advancing pregnancy in the guinea pig. Am J Obstet Gynecol 174:
779-782.
Weiss A, Littman DR. 1994. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 76:
263-274.
Wingren AG, Parra E, Varga M, Kalland T, Sjogren HO, Hedlund G, Dohlsten M. 1995. T
cell activation pathways: B7, LFA-3, and ICAM-1 shape unique T cell profiles. Crit Rev
Immunol 15: 235-253.
Wittchen ES. 2009. Endothelial signaling in paracellular and transcellular leukocyte
transmigration. Front Biosci 14: 2522-2545.
Wu CW, Chi CW, Ho CK, Chien SL, Liu WY, P'Eng F K, Wang SR. 1994. Effect of
arginase on splenic killer cell activity in patients with gastric cancer. Dig Dis Sci 39: 11071112.
Yamaguchi H, et al. 2005. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of
the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J Cell Biol 168: 441-452.
Yang N, Higuchi O, Ohashi K, Nagata K, Wada A, Kangawa K, Nishida E, Mizuno K. 1998.
Cofilin phosphorylation by LIM-kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization.
Nature 393: 809-812.
Yonezawa N, Nishida E, Sakai H. 1985. pH control of actin polymerization by cofilin. J Biol
Chem 260: 14410-14412.
Zabaleta J, McGee DJ, Zea AH, Hernandez CP, Rodriguez PC, Sierra RA, Correa P,
Ochoa AC. 2004. Helicobacter pylori arginase inhibits T cell proliferation and reduces the
expression of the TCR zeta-chain (CD3zeta). J Immunol 173: 586-593.
Zea AH, Culotta KS, Ali J, Mason C, Park HJ, Zabaleta J, Garcia LF, Ochoa AC. 2006.
Decreased expression of CD3zeta and nuclear transcription factor kappa B in patients with
pulmonary tuberculosis: potential mechanisms and reversibility with treatment. J Infect Dis
194: 1385-1393.
Zea AH, et al. 2005. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma
patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Res 65: 3044-3048.
Zebda N, Bernard O, Bailly M, Welti S, Lawrence DS, Condeelis JS. 2000.
Phosphorylation of ADF/cofilin abolishes EGF-induced actin nucleation at the leading edge
and subsequent lamellipod extension. J Cell Biol 151: 1119-1128.
124
Literaturverzeichnis
Zimmermann N, Rothenberg ME. 2006. The arginine-arginase balance in asthma and lung
inflammation. Eur J Pharmacol 533: 253-262.
Zimmermann N, et al. 2003. Dissection of experimental asthma with DNA microarray
analysis identifies arginase in asthma pathogenesis. J Clin Invest 111: 1863-1874.
125
Abkürzungsverzeichnis
7
Abkürzungsverzeichnis
2D
Zweidimensional
A
Ampere (Einheit der Stromstärke)
AARE
engl. Amino acid response element
Abb.
Abbildung
ADF
engl. actin depolymerising factor
ADP
Adenosindiphosphat
AG
Arbeitsgemeinschaft
AK
Antikörper
Akt
Serin/Threonin Kinase (Proteinkinase B)
AP-1
engl. Activation protein-1
APS
Ammoniumpersulfat
APZ
Antigen-präsentierende Zelle(n)
Aqua bidest.
Aqua bidestillata (zweifach destiliertes Wasser)
Arg(-)Medium
argininfreies Zellkulturmedium
Arg(+)Medium
argininhaltiges Zellkulturmedium
Arp2/3
engl. Actin related proteins
ASL
Argininosuccinat Lyase
ASS
Argininosuccinat Synthase
ATF
engl. Activating transcription factor
ATP
Adenosintrisphosphat
BSA
Bovines Serumalbumin
BZR
B-Zell-Rezeptor
bzw.
beziehungsweise
C°
Celsius
ca.
zirka
Ca2+
Calcium
CAT
engl. Cationic amino acid transporter
CD
engl. Cluster of Differentiation (System zur
Bezeichnung von Differenzierungsantigenen)
126
Abkürzungsverzeichnis
CD2
Adhäsion und aktivierender Rezeptor auf T- und
NK-Zellen;
Ligand: CD58
CD80
Ligand für CD28 und CTLA-4 (B7.1)
CD86
Ligand für CD28 und CTLA-4 (B7.2)
Cdc-42
engl. Cell division cycle 42
cdk
engl. cyclin-dependent kinase
CFSE
Carboxy-Fluoreszein-Succinimidyl-Ester
CHOP
engl. C/EBP-homologe proteine
CML
chronisch-myeloische Leukämie
CO2
Kohlenstoffdioxid
cpm
engl. counts per minute (radioaktive Ereignisse pro
Minute)
cSMAC
engl. central supramolecular activation cluster
CTLA-4
engl. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4
DAG
Diacylglycerin
d. h.
das heißt
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
engl. deoxyribonucleic acid
DTT
1,4-Dithiotreitol
DZ
dendritische Zelle(n)
EC
Effektive Konzentration
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
eIF2-α
eukaryotischer Initiationsfaktor 2α
ELISA
engl. enzyme linked immuno sorbent assay
ER
Endoplasmatisches Retikulum
ERK
engl. extracellular-regulated kinase
FACS
engl. fluorescence activated cell sorting
FACScan
engl. Fluorescence Activated Cell Scanner
F-Aktin
filamentöses Aktin
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat (Fluoreszenz-Farbstoff)
FSC
Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht,
Messparameter des FACScan R)
127
Abkürzungsverzeichnis
Fyn
Proteintyrosinkinase
g
Gramm
G-Aktin
globuläres Aktin
Gr-1
engl. granulocyte-differentiation antigen 1
Grb2
engl. growth factor receptor bound protein 2
GTP
Guanosintriphosphat
Gy
Gray (Strahlenintensität)
h
hora (Stunde)
H2O
Wasser (Millipore)
HLA
Humanes Leukozytenantigen
HRP
engl. horseradish peroxidase
ICAM
engl. Intracellular adhesion molecule
IDO
Indolamin 2,3-Dioxygenase
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
iNOS
induzierbare Stickstoffmonoxydsynthase
IEF
Isoelektrische Fokussierung
IP3
Inositol-1,4,5-trisphosphat
IS
Immunologische Synapse
ITAM
engl. Immunoreceptor tyrosine-based activation
motif
kDa
kilo Dalton (Einheit des Molekulargewichtes)
konz.
konzentriert
L
Liter
LAT
engl. Linker for aktivation of T cells
Lck
engl. Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
LFA-1
engl. Lymphocyte function-associated antigen
LIMK
engl. LIM motif containing protein kinase
LPS
Lipopolysaccharid
m
milli (x 103)
M
mol/l (Einheit der Konzentration)
MAPK
engl. Mitogen activated protein kinase
min
Minute(n)
128
Abkürzungsverzeichnis
mol
molar (Einheit der Stoffmenge)
MEK
MAPK-Kinase
MHC
engl. Major histocompatibility complex
µ
mikro (x 106)
min
Minute(n)
mRNA
engl. Messenger RNA
MSC
engl. Myeloid suppressor cell
mTOR
engl. Mammalian target of rapamycin
MW
arithmetischer Mittelwert
NaCl
Natriumchlorid
Nck
engl. Non-catalytic region of tyrosine kinase
adaptor protein 1
NFAT
engl. Nuclear factor of activated t-cells
NF-κB
engl. Nuclear factor κ-B
NK-Zellen
natürliche Killerzellen
NO
nitric oxide (Stickstoffmonoxid)
NOS
Stickstoffmonoxidsynthase
nor-NOHA
Nφ-Hydroxy-nor-L-Arginin
Nr.
Nummer
OAT
Ornithin-Amino-Transferase
ODC
Ornithin-Decarboxylase
p
Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der
Ähnlichkeiten zweier Datengruppen
PBMC
engl. pheripheral blood mononuclear cells
(mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)
PBS
Phosphate Buffered Saline
PD-1
engl. programmed death 1
PE
Phycoerythrin (Fluoreszenz-Farbstoff)
PenStrep
Penicillin/ Streptomycin
PerCp
Phycoerythrin (Fluoreszenz-Farbstoff)
PFA
Paraformaldehyd
pGCN2
an Threonin 898 phosphorylierte GCN2-Kinase
PI3K
Phosphatidylinositol-3-Kinase
PIP
Phosphatidylinositolphosphat
129
Abkürzungsverzeichnis
PKC
Proteinkinase C
PLC
Phospholipase C
PM
Plasmamembran
PMA
Phorbol-12-Myristate-13-Acetat
PMN
engl. polymorphonuclear neutrophils (humane
Granulozyten)
pSMAC
engl. peripheral supramolecular activation cluster
Rac
kleines GTP-Bindeproteine
Raji
Burkitt Lymphom B-Zellen (Raji)
Ras
kleines G-Protein mit GTPase-Aktivität
Rho
GTPase
rpm
rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT
Raumtemperatur
s.
siehe
SD
Standardabweichung
SDF-1α
engl. Stromal cell-derived factor 1α
SDS
engl. Sodium Dodecylsulfat
SDS-PAGE
engl. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis
SEB
Staphylococcus aureus Enterotoxin B
siRNA
small interfering RNA
SLP-76
engl. SH2 domain containing leukocyte protein of
76 kDa
SSC
engl. Side Scatter (Seitwärtsstreulicht,
Messparameter des FACS)
SSH
Slingshotphosphatase
T, t
engl. time
Tab.
Tabelle
TEMED
N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin
TESK
engl. testicular protein kinase (testikuläre
Proteinkinase
TGF-β
engl. transforming growth factor β
TNF
Tumornekrosfaktor
130
Abkürzungsverzeichnis
TH
T-Helferzelle
TLR
Toll-like Rezeptor
tRNA
engl. transporter RNA
Tris
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
TZR
T-Zellrezeptor
U
engl. Unit (Einheit)
u. a.
unter anderem
unstim.
unstimuliert
v. a.
vor allem
Vav
Guanosinnukleotid-Austauschfaktor
VCAM
engl. vascular cell ahesion molecule
vgl.
vergleiche
Wasp
engl. Wiskott-Aldrich syndrome proteine
ZAP-70
engl. z-associated protein of 70 kDa
z. B.
zum Beispiel
z. T.
zum Teil
z. Z.
zur Zeit
131
Danksagung
8
Danksagung
Mein herzlicher Dank gilt meinem Arbeitsgruppenleiter Herrn PD Dr. Markus Munder für
die Bereitstellung des interessanten Themas und die Betreuung während der Erstellung
meiner Dissertation.
Bei Herrn Prof. Dr. med. Stefan Meuer möchte ich mich für die Möglichkeit, meine
Doktorarbeit am Institut für Immunologie durchführen und die vorhandenen Geräte
verwenden zu dürfen, bedanken.
Für die sehr gute Einarbeitung und stete Hilfsbereitschaft während der Anfertigung meiner
Doktorarbeit möchte ich mich herzlichst bei Frau Claudia Luckner-Minden bedanken.
Für die Bereitschaft als Erstgutachter meiner Dissertation und Prüfer für meine Disputation
zu fungieren, möchte ich mich besonders bei Herrn PD Dr. Philipp Beckhove bedanken.
Bei Herrn Prof. Carsten Watzl möchte ich mich sehr herzlich für die Übernahme des
Zweitgutachtens und die Bereitschaft als einer meiner Prüfer zu fungieren bedanken.
Für die stets nette Kooperation und Hilfsbereitschaft möchte ich mich herzlichst bei der
Arbeitsgruppe von Frau Prof. Yvonne Samstag am Institut für Immunologie des
Universitätsklinikum Heidelberg bedanken, besonders bei Herrn Dr. Guido Wabnitz, Frau
Dipl.-Biologin Beate Jahraus und Herrn Henning Kirschgessner.
Mein herzlicher Dank gilt Herrn Dr. Thomas Franz, Herrn Stefan Leicht und Sabrina
Rüggeberger der Core Facility am Embl in Heidelberg für die nette Kooperation und die
Massenspektrometrischen Analysen meiner 2D-Gele.
132
Danksagung
Bei Frau Michelle Bhairo, Frau Johanna Ried und Frau Katharina Kapp möchte ich mich
herzlich für die nette Arbeitsatmosphäre bedanken.
133
Erklärung
Ich versichere hiermit, dass ich die vorgelegte Dissertation selbst verfasst und mich keiner
anderer als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient habe. Des
Weiteren versichere ich, dass ich an keiner anderen Stelle ein Prüfungsverfahren
beantragt bzw. die Dissertation in dieser oder anderer Form bereits anderweitig als
Prüfungsarbeit verwendet oder einer anderen Fakultät als Dissertation vorgelegt habe.
Rheinstetten, 11.05.2010
134
Was this manual useful for you? yes no
Thank you for your participation!

* Your assessment is very important for improving the work of artificial intelligence, which forms the content of this project

Download PDF

advertisement