HiSeq 4000 System Guide Translated into German (15066496 v01 DEU)

HiSeq 4000 System Guide Translated into German (15066496 v01 DEU)

HiSeq

®

4000 Systemhandbuch

Nur für Forschungszwecke.

Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.

ILLUMINA EIGENTUMSRECHTLICH GESCHÜTZT

Katalognummer SY-401-9003DOC

Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

August 2015

Anpassen einer kurzen Ende-zu-Ende-Workflow-Anleitung mit dem Custom Protocol Selector support.illumina.com/custom-protocol-selector.html

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Infinium, iScan, iSelect,, MiSeq, MiSeqDx, MiSeq FGx, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina,

SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, die kürbisorange Farbe und das Streaming-Basen-Design sind Marken von Illumina, Inc. und/oder ihren Tochtergesellschaften in den USA und/oder anderen Ländern. Alle anderen Namen, Logos und Marken sind Eigentum der jeweiligen Eigentümer.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Versionshistorie

Dokument

Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496_DEU v01

Teile-Nr. 15066496_DEU Rev. A

Datum

August

2015

Februar

2015

Beschreibung der Änderung

Aktualisierte Softwarebeschreibungen für HiSeq

Control Software (HCS) v3.3.52, durch die die folgenden Funktionen hinzugefügt werden:

• Option zur Sequenzierung einer Single-Read-

Fließzelle.

• Option zum Verbinden mit BaseSpace Onsite.

• Sensoranzeigen, die den

Datenübertragungsstatus des

Laufkopierdiensts und von BaseSpace anzeigen.

Das Feld „PE Reagent Kit ID“ auf dem Bildschirm

„Reagents“ (Reagenzien) wurde zu „Cluster Kit

ID“ umbenannt.

Aktualisierte Anweisungen für gestaffelte Läufe auf Fließzelle A und B.

Option zum Angeben einer benutzerdefinierten

Anzahl von SBS-Zyklen auf dem Bildschirm

„Reagents“ (Reagenzien) und aktualisierte

Standards für verbleibende Zyklen.

Folgende neue Informationen wurden hinzugefügt:

• Anweisungen für die Vorbereitung von SBS-,

Paired-End- und Indizierungsreagenzien.

• Anweisung zum Reinigen des

Fließzellenhalters mit Wasser vor dem

Reinigen mit Alkohol.

• Hinweis zum Entsorgen der

Wartungswaschlösung gemäß den lokalen

Behördenstandards.

Dauer und erwartete Volumina für den

Wartungswaschlauf korrigiert.

Erste Version.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Inhaltsverzeichnis

Versionshistorie

Inhaltsverzeichnis

Kapitel 1 Überblick

Einleitung

Weitere Ressourcen

Gerätekomponenten

Überblick über die Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien

Kapitel 2 Erste Schritte

Starten des HiSeq 4000

Anpassen der Systemeinstellungen

Anzeigen und Senden von Gerätedaten

Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien

Kapitel 3 Vorbereiten von Reagenzien

Einleitung

Vorbereiten von SBS-Reagenzien

Vorbereiten von Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien

Kapitel 4 Sequenzierung

Einleitung

Sequenzierungsworkflow

Eingeben von Laufparametern

Laden und Vorfüllen von Reagenzien

Einsetzen der Sequenzierungsfließzelle

Überwachen des Laufs

Entladen von Reagenzien

Durchführen eines Wasserwaschlaufs

Durchführen einer Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks

Kapitel 5 Wartung

Durchführen eines Wartungswaschlaufs

Versetzen des Geräts in den Leerlauf

Ausschalten des Geräts

Anhang A Fehlerbehebung

Protokolldatei

Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration

Durchführen einer Fluidikprüfung

Unterbrechen oder Beenden eines Laufs auf dem HiSeq 4000

Gestaffelte Läufe auf Fließzelle A und Fließzelle B

Mögliche Primer-Rehybridisierung für Read 1

Anhang B Echtzeitanalyse

Überblick über die Echtzeitanalyse

Echtzeitanalyse-Workflow

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Anhang C Ausgabedateien

Sequenzierung von Ausgabedateien

Plattennummerierung

Index

Technische Unterstützung

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Kapitel 1  Überblick

Überblick

Einleitung

Weitere Ressourcen

Gerätekomponenten

Überblick über die Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien

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HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Einleitung

Das HiSeq

®

4000-System kombiniert innovative Technik mit bewährter Leistung für einen maximalen Durchsatz und niedrigste Kosten für im Produktionsmaßstab tätige

Genomlabore.

Funktionen

}

Bildgebung von zwei Oberflächen: Das HiSeq 4000-System verwendet ein

Epifluoreszenzsystem mit zwei Kameras und vier Sensoren, das über eine moderne

Scan-Technologie zur Darstellung von zwei Oberflächen ausgestattet ist.

} Strukturierte Fließzelle: Eine strukturierte Fließzelle ermöglicht das Generieren von

Sequenzierungs-Clustern in einer geordneten Anordnung. Dies sorgt für mehr Ausgabe-

Reads und generierte Daten.

}

Zwei Fließzellen: Das HiSeq 4000 ist ein System für zwei Fließzellen, das die

Durchführung von Sequenzierungen für eine oder beide Fließzellen gleichzeitig und mit unterschiedlichen Read-Längen ermöglicht.

} Reagenzienkühler mit hoher Aufnahmekapazität: Die Reagenzienkammer ist ein hochleistungsfähiger Kühler, der ausreichend Reagenzien für den gesamten

Sequenzierungslauf aufnehmen kann.

}

Integrierte Fluidik für Paired-End-Läufe: Die integrierte Paired-End-Fluidik liefert

Reagenzien aus der Reagenzienkammer für die Read-2-Resynthese und die indizierte

Sequenzierung an die Fließzelle.

} Steuerungsoptionen auf der Benutzeroberfläche: Die Benutzeroberfläche der

Gerätesoftware bietet Optionen zum Einrichten des Laufs und Bedienen des Geräts

über den Touchscreen-Monitor bzw. die integrierte Tastatur.

}

Base-Calling in Echtzeit: Die Gerätesoftware extrahiert Intensitäten aus Bildern und führt das Base-Calling mit Qualitäts-Score auf dem Gerätecomputer durch, sodass Sie während des Laufs Qualitätskennzahlen überwachen können und bei der anschließenden Datenanalyse wertvolle Zeit sparen.

Die nachgeschaltete Analyse von Sequenzierungsdaten kann mit Illumina-

Analysesoftware oder Software-Programmen von Drittanbietern auf einer benutzerdefinierten Infrastruktur durchgeführt werden.

}

BaseSpace ®

-Integration: Der Sequenzierungsworkflow ist mit BaseSpace, der Genomik-

Computing-Umgebung von Illumina für Datenanalyse, Speicherung und

Zusammenarbeit, integriert. Beim Durchführen des Laufs werden die Ausgabedateien in Echtzeit nach BaseSpace oder BaseSpace Onsite gestreamt.

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Weitere Ressourcen

Die folgenden Dokumente stehen auf der Website von Illumina zum Herunterladen zur

Verfügung.

Ressource

HiSeq 4000- und HiSeq 3000-

Systemhandbuch zur

Standortvorbereitung (Dokument-

Nr. 15066492)

HiSeq 4000- und HiSeq 3000-

Sicherheits- und Compliance-

Handbuch (Dokument-

Nr. 15066491)

Beschreibung

Enthält Spezifikationen für den Laborplatz, die elektrischen

Anforderungen und die Umgebungsbedingungen.

Bietet Informationen zu Gerätekennzeichnungen und

Compliance-Zertifizierungen sowie sicherheitsbezogene

Informationen.

Auf der HiSeq 4000-Supportseite der Illumina-Website können Sie auf Dokumentationen,

Software-Downloads, Online-Schulungen und häufig gestellte Fragen zugreifen.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Gerätekomponenten

Das HiSeq 4000-System umfasst das Gerät, einen Monitor, einen Gerätesteuerungscomputer und Zubehör wie eine Tastatur, eine Maus und einen Barcodescanner. Das Gerät besteht aus vier Hauptkomponenten: dem Optikmodul, der Fließzellenkammer, der Fluidikkammer und der Reagenzienkammer. Eine beleuchtete Statusleiste zeigt den Betriebsstatus an.

Abbildung 1 Externe Komponenten

A Optikmodul: Enthält optische Komponenten, die die Darstellung zweier Oberflächen der

Fließzelle ermöglichen, indem A, C, G und T gleichzeitig mithilfe von Epifluoreszenz aufgenommen werden. Der Anregungslaserstrahl tritt durch das Objektiv und die

Fluoreszenz wird gleichzeitig vom selben Objektiv erfasst.

B Fließzellenkammer: Enthält den vakuumgesteuerten Fließzellentisch, der die Fließzelle während des Sequenzierungslaufs in Position hält.

C Fluidikkammer: Enthält Fluidikpumpen, die die Reagenzien in die Fließzelle und anschließend in den Abfallbehälter leiten.

D Statusleiste: Zeigt den Gerätestatus anhand von drei Farben an. Blau bedeutet, dass das

Gerät läuft, Orange weist darauf hin, dass das Gerät überprüft werden muss, und Grün zeigt an, dass das Gerät für den nächsten Lauf bereit ist.

E Reagenzienkammer: Enthält Reagenzien-Racks mit Reagenzien für Sequenzierungsläufe und die Waschlösung für Gerätewaschläufe.

Fließzellenkammer

In der Fließzellenkammer sind der Fließzellentisch, die thermischen Stationen, das

Vakuumsystem und die Fluidikanschlüsse für die einzelnen Fließzellen untergebracht.

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Abbildung 2 Fließzellentisch mit zwei Fließzellen

A

Fließzelle A

B

Fließzelle B

C

Fließzellenregler A

D

Fließzellenregler B

Fließzelle A befindet sich auf der linken, Fließzelle B auf der rechten Seite. Jede Fließzelle befindet sich auf dem Fließzellentisch, der von der Steuerungssoftware in das optische

Modul hineingefahren bzw. aus diesem herausgefahren wird. Der Fließzellentisch muss in der vordersten Position positioniert sein, um die Tür der Fließzellenkammer öffnen zu können und eine Fließzelle einzusetzen oder zu entfernen.

Die Fließzelle befindet sich auf dem Fließzellenhalter, wobei die Einlass- und

Auslassöffnungen nach unten zeigen, und wird durch das Vakuum unter jedem

Fließzellenhalter in Position gehalten. Der beleuchtete Fließzellenregler, der sich vor jedem

Fließzellenhalter befindet, steuert das Vakuum. Wenn der Fließzellenregler grün leuchtet, sitzt die Vakuumdichtung sicher.

Reagenzienkammer

Bei der Reagenzienkammer handelt es sich um einen Reagenzienkühler mit drei

Reagenzien-Racks: zwei Racks für SBS-Reagenzien und ein Rack für Indizierungs- und

Paired-End-Reagenzien. Mithilfe der Sipper-Griffe werden die Sipper in die

Reagenzflaschen abgesenkt.

}

SBS-Reagenzien-Racks: Fassen konische 250-ml-Flaschen. Der Reagenzien-Rack für

Fließzelle A befindet sich in der Mitte und das Rack für die Fließzelle B liegt ganz rechts. Die Nummern der Positionen auf dem Reagenzien-Rack entsprechen den

Anschlüssen auf einem internen Reagenzien-Selektor-Ventil.

}

Rack für Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien: Befindet sich in der linken

Position. Es verfügt über zwei Reihen mit nummerierten Positionen, die konische 15ml-Röhrchen mit Paired-End-Reagenzien und Indizierungsreagenzien enthalten. Die linke Reihe enthält die Reagenzien für Fließzelle A und die rechte Reihe die Reagenzien für Fließzelle B.

} Reagenzienkühler: Die Reagenzien-Racks sind im Reagenzienkühler untergebracht, in dem eine Innentemperatur von 2 °C bis 8 °C herrscht.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Abbildung 3 Reagenzienkammer

A Sipper-Griffe

B Reagenzien-Rack für Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien

C Reagenzien-Rack für SBS-Reagenzien für Fließzelle A

D Reagenzien-Rack für SBS-Reagenzien für Fließzelle B

HiSeq 4000 Software

Auf dem Gerätecomputer sind drei Software-Anwendungen installiert:

}

HiSeq 4000 Control Software: Die Benutzeroberfläche der HiSeq Control Software

(HCS) führt Sie durch die Schritte für die Einrichtung eines Sequenzierungslaufs.

Während des Laufs steuert die Software die Geräte-Hardware und die Fluidik, legt

Temperaturen fest und liefert eine visuelle Zusammenfassung von

Qualitätsstatistikwerten.

}

Echtzeitanalyse-Software: Die in die Steuerungssoftware integrierte Echtzeitanalyse

(RTA)-Software führt das Base-Calling durch und weist jeder Base für jeden Zyklus einen Qualitäts-Score zu. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter

Echtzeitanalyse

auf Seite 55 .

} Sequenzierungsanalyse-Viewer-Software: Der Sequenzierungsanalyse-Viewer (SAV) liefert detaillierte Qualitätsstatistikwerte.

Statussymbole

In der oberen rechten Ecke jedes Bildschirms befinden sich Statussymbole, die Sie über

Änderungen der Bedingungen, Fehler oder Warnungen während der Laufkonfiguration oder des Laufs informieren.

Statussymbol Statusname

Status okay

Beschreibung

Keine Änderung. Das System funktioniert normal.

Information

Achtung

Nur zur Information. Es ist keine Aktion erforderlich.

Informationen, die möglicherweise Ihre Aufmerksamkeit erfordern.

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Statussymbol Statusname

Warnung

Fehler

Beschreibung

Warnungen stoppen einen Lauf nicht, erfordern jedoch möglicherweise eine Aktion, bevor der Lauf fortgesetzt werden kann.

Fehler stoppen einen Lauf in der Regel und erfordern im

Allgemeinen eine Aktion, bevor der Lauf fortgesetzt werden kann.

Wenn eine Bedingungsänderung auftritt, blinkt das entsprechende Symbol, um Sie darauf aufmerksam zu machen.

} Wählen Sie das Symbol aus, um das Statusfenster zu öffnen und eine Beschreibung der

Bedingung anzuzeigen.

}

Wählen Sie Acknowledge (Bestätigen), um die Meldung zu akzeptieren, und Close

(Schließen), um das Dialogfeld zu schließen.

Aktivitäts- und Sensoranzeigen

In der unteren rechten Ecke des Begrüßungsbildschirms befinden sich mehrere Symbole, die mithilfe von Gerätesensoren die Geräteaktivität und den Status bestimmter Komponenten angeben.

Abbildung 4 Aktivitätsanzeigen

Von links nach rechts befinden sich Aktivitätsanzeigen für die X-, Y- und Z-Motoren, die

Elektronik-Funktionalität, die Kamera, das Fluidiksystem und Verarbeitungsfunktionen.

Abbildung 5 Sensoranzeigen

Von links nach rechts stellen Sensoranzeigen die Temperatur der Fließzelle A, die

Temperatur des Reagenzienkühlers, den Datentransferstatus, den Cloud-Status von

BaseSpace und die Temperatur von Fließzelle B dar.

Datenübertragungsstatus

Die HiSeq-Softwaresuite umfasst den Laufkopierdienst, der die Datenübertragung zum

Ausgabeordner verwaltet. Eine BaseSpace-Option sendet Gerätestatus- und

Sequenzierungsdaten an BaseSpace oder BaseSpace Onsite.

Zwei der Sensoranzeigen auf der Softwareoberfläche zeigen den Übertragungsstatus des

Laufkopierdiensts und von BaseSpace an.

Laufkopierdienst

Der Übertragungsstatus des Kopierlaufdiensts bestimmt, ob Sie einen neuen Lauf starten oder das Ausgabelaufwerk sicher formatieren können.

Statussymbol Beschreibung

Daten werden übertragen. Formatieren Sie das Ausgabelaufwerk erst, wenn die Übertragung abgeschlossen wurde.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Statussymbol

Beschreibung

Daten werden übertragen, aber die Netzwerkverbindung ist langsam. Sie können einen Sequenzierungslauf einrichten und das Ausgabelaufwerk formatieren, wenn die Übertragung abgeschlossen wurde.

Laufkopierdienst ist deaktiviert.

Laufkopierdienst ist aktiviert, es werden jedoch keine Daten übertragen.

BaseSpace

Eine BaseSpace-Sensoranzeige gibt den Status von BaseSpace an. Eine blaue Wolke bedeutet eine aktive Verbindung zu BaseSpace. Eine graue Wolke zeigt an, dass die

Software keine Verbindung zu BaseSpace herstellen kann. Die folgende Tabelle bietet weitere Details zu jedem Statussymbol.

Statussymbol

Beschreibung

Nicht mit BaseSpace verbunden.

Mit BaseSpace verbunden, jedoch keine Datenübertragung.

Mit BaseSpace verbunden. Es werden Daten für vier Läufe oder weniger

übertragen.

Mit BaseSpace verbunden. Es werden Daten für fünf Läufe oder mehr

übertragen.

Während dieses Symbol angezeigt wird, verhindert die Steuerungssoftware, dass neue Läufe eine Verbindung zu BaseSpace herstellen.

Verbindung zu BaseSpace getrennt. Daten für die Übertragung befinden sich in der Warteschlange.

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Überblick über die Sequenzierungs-

Verbrauchsmaterialien

Für das Durchführen eines Laufs auf dem HiSeq 4000 ist ein HiSeq 3000/4000-SBS-Kit erforderlich.

HiSeq 4000 Name des Kits

HiSeq 3000/4000-SBS-Kit (300 Zyklen)

HiSeq 3000/4000-SBS-Kit (150 Zyklen)

HiSeq 3000/4000-SBS-Kit (50 Zyklen)

Katalog-Nr.

FC-410-1003

FC-410-1002

FC-410-1001

Jedes Kit beinhaltet Sequenzierungsreagenzien, die auf HiSeq verwendet wurden, mit ausreichend Reagenzien für die Sequenzierung einer Fließzelle. Sequenzierungsreagenzien werden in 250-ml-Flaschen bereitgestellt, die direkt auf die Reagenzien-Racks geladen werden. Die Reagenzienetiketten haben eine Farbcodierung, um Ladefehler zu verringern.

Strukturierte Fließzelle

Das HiSeq 4000-System verwendet eine strukturierte Fließzelle mit Milliarden von geordneten Nanowells, die in das Glas der Fließzelle eingearbeitet sind. Die geordnete

Anordnung erhöht die Anzahl der Ausgabe-Reads und der generierten

Sequenzierungsdaten.

Die strukturierte Fließzelle wird in HiSeq 3000/4000-Cluster-Kit bereitgestellt.

Abbildung 6 Beispiel: Cluster auf einer strukturierten Fließzelle

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Kapitel 2  Erste Schritte

Erste Schritte

Starten des HiSeq 4000

Anpassen der Systemeinstellungen

Anzeigen und Senden von Gerätedaten

Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien

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Starten des HiSeq 4000

1 Starten Sie den Gerätesteuerungscomputer.

2 Melden Sie sich mit dem Standard-Benutzernamen und dem Standard-Kennwort beim

Betriebssystem an und warten Sie, bis es geladen ist.

}

Benutzername: sbsuser

} Kennwort: sbs123

Wenn die Anmeldung mit den Standarddaten fehlschlägt, erkundigen Sie sich bei

Ihrem zuständigen Administrator nach dem Benutzernamen und dem Kennwort für

Ihren Standort.

3 Schalten Sie den Netzschalter auf der linken Seite des Geräts in die Position ON (EIN).

Warten Sie mindestens eine Minute, bis das Gerät ordnungsgemäß konfiguriert und das Gerätelaufwerk „DoNotEject“ initialisiert ist.

4 Schließen Sie das Fenster, das bei der Initialisierung von DoNotEject geöffnet wird.

Falls das Fenster nicht geöffnet wird, suchen Sie unter „Arbeitsplatz“ nach dem

Gerätelaufwerk „DoNotEject“.

HINWEIS

Werfen Sie niemals das Flash-Laufwerk „DoNotEject“ aus, das sich im Gehäuse des

Geräts befindet, und ändern Sie die darauf gespeicherten Dateien nicht. Das Laufwerk enthält Hardwarekonfigurationsdateien und wird jedes Mal initialisiert, wenn Sie das

Gerät einschalten.

5 Archivieren Sie die auf dem Gerätecomputer befindlichen Daten aller vorherigen Läufe in einem Netzwerkverzeichnis. So wird sichergestellt, dass ausreichend freier

Speicherplatz vorhanden ist.

6 Öffnen Sie HiSeq Control Software (HCS) mithilfe des Symbols auf dem Computer-

Desktop.

Wenn die Initialisierung der Software abgeschlossen ist, wird der

Begrüßungsbildschirm geöffnet. Links unten im Bildschirm wird das

Initialisierungssymbol angezeigt.

Gerätesteuerungscomputer: Best Practices

} Schalten Sie den Computer nicht ein, während das Gerät läuft. Schalten Sie immer zuerst den Computer ein, bevor Sie das Gerät einschalten.

}

Schalten Sie das Gerät nicht aus, während die Gerätesteuerungssoftware läuft.

}

Warten Sie nach dem Ausschalten des Geräts eine Minute, bevor Sie es wieder einschalten.

} Schließen Sie die USB-Kabel des Geräts, des Bildschirms und der Tastatur an die USB-

Ports auf der Rückseite des Computers an, bevor Sie den Computer einschalten.

}

Schließen Sie die USB-Kabel des Barcodescanners und der Maus an die USB-Ports auf der Vorderseite des Computers an.

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Anpassen der Systemeinstellungen

Die Steuersoftware beinhaltet anpassbare Systemeinstellungen für Laufordner und LIMS-

Einstellungen. Das Fenster „Menu Options“ (Menüoptionen) bietet Einstellungen zur

Definition der Lauf-ID-Vorlage, der Standardordner-Speicherorte, zum Senden von

Gerätezustandsdaten an Illumina und an einen LIMS-Server sowie zum Festlegen von

Benutzernamen und Passwort

Um die Ihre Anzeige der Steuersoftwareoberfläche anzupassen, wählen Sie Menu | View

(Menü | Anzeige). Sie können die Benutzeroberfläche im Vollbildmodus oder in einem

Fenster anzeigen oder sie minimieren.

Definieren von Laufordnereinstellungen

1 Wählen Sie auf dem Begrüßungsbildschirm Menu | Tools | Options (Menü |

Werkzeuge | Optionen), um das Fenster „Menu Options“ (Menüoptionen) zu öffnen.

2 Um die Benennungskonvention für die Laufordnernamen anzupassen, ändern Sie die

Einstellungen im Feld Run ID Template (Lauf-ID-Vorlage). Wählen Sie Reset

(Zurücksetzen), um das Feld zu löschen.

3 Um Standardausgabe-Speicherorte einzurichten, geben Sie einen Speicherort für jeden der folgenden Ordner an:

} Default Output Folder (Standardausgabeordner): Der Standardspeicherort, in dem

Läufe der Fließzelle A gespeichert werden.

}

Default Output Folder2 (Standardausgabeordner2): Der Standardspeicherort, in dem

Läufe der Fließzelle B gespeichert werden.

HINWEIS

Illumina empfiehlt einen Netzwerkspeicherort für die Ausgabeordner. Wenn der

Speicherort jedoch von dem HiSeq-Vorlagenordner abweicht, können Sie einen

Speicherort auf dem Laufwerk O:\ angeben. Verwenden Sie nicht die Laufwerke S:\ oder C:\. Das S:\-Laufwerk ist für den Betrieb des Geräts reserviert und das C:\-

Laufwerk ist zu klein.

4 Um einen Speicherort für die LIMS-Vorlagenformulare einzurichten, geben Sie den

Speicherort im Feld Run Setup Folder (Laufeinrichtungsordner) ein.

5 Wählen Sie OK, um Ihre Arbeit zu speichern und das Menüoptionen-Fenster zu schließen. Wählen Sie Cancel (Abbrechen), um den Vorgang ohne zu speichern abzuschließen.

Einrichten von LIMS-Einstellungen

1 Wählen Sie auf dem Begrüßungsbildschirm Menu | Tools | Options (Menü |

Werkzeuge | Optionen), um das Fenster „Menu Options“ (Menüoptionen) zu öffnen.

2 Geben Sie folgende LIMS-Einstellungen ein:

}

LIMS Server (LIMS-Server): Der Name des Servers für Interaktionen mit dem unterstützten Illumina-LIMS.

} LIMS User name (LIMS-Benutzername): Der Benutzername, der für die

Authentifizierung beim Illumina-LIMS verwendet wird.

}

LIMS Password (LIMS-Kennwort): Das Kennwort, das für die Authentifizierung beim Illumina-LIMS verwendet wird.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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3 Wählen Sie OK, um Ihre Arbeit zu speichern und das Menüoptionen-Fenster zu schließen. Wählen Sie Cancel (Abbrechen), um den Vorgang ohne zu speichern abzuschließen.

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Anzeigen und Senden von Gerätedaten

Die Schaltfläche „Menü“ auf dem Begrüßungsbildschirm und das Fenster mit den

Menüoptionen bieten Optionen zum Anzeigen und Senden von Gerätedaten.

}

Um Informationen zur Geräte-Hardware und den Software-Versionen sowie

Kontaktinformationen für technische Unterstützung anzuzeigen, wählen Sie Menu |

About (Menü | Info).

}

Um zuzulassen, dass das Gerät für jeden Lauf Informationen an BaseSpace sendet

(empfohlen), wählen Sie Menu | Tools | Options (Menü | Werkzeuge | Optionen) und aktivieren Sie anschließend das Kontrollkästchen Send instrument health data to

Illumina to help Illumina improve its products (Gerätezustandsdaten an Illumina senden, um bei der Verbesserung der Produkte zu helfen).

Alle Informationen bleiben vertraulich.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Vom Benutzer bereitzustellende

Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterial

Alkoholtupfer,

70 % Isopropyl oder

Ethanol, 70 %

Ballonflasche,

Fassungsvermögen mindestens

6 Liter

250-ml-Zentrifugenröhrchen

Anbieter

VWR, Katalog-Nr. 95041-714

Allgemeiner Laborlieferant

Allgemeiner Laborlieferant

Konische 15-ml-Röhrchen

Konische 50-ml-Röhrchen, selbststehend (optional)

Einweg-Handschuhe, ungepudert

Labortücher, fusselfrei

Corning, Katalognummer 430776 SBS- und PE-Reagenzien-

Racks, Positionen mit PW1.

Gerätewaschlauf.

Corning, Katalognummer 430052 PE-Reagenzien-Racks,

Positionen mit PW1.

Gerätewaschlauf.

Sammeln und Messen der

Abfallvolumina.

Corning, Katalognummer 430921 Lagern der Fließzellen.

Allgemeiner Laborlieferant

VWR, Katalog-Nr. 21905-026

Zweck

Reinigen der Fließzelle und des Fließzellentisches.

Vorbereitung der Lösung für den Wartungswaschlauf.

Allgemeine Verwendung.

VWR, Katalog-Nr. 52846-001

Reinigen des

Fließzellenhalters.

Reinigen der Fließzelle.

Linsenpapier, 4 x 6 Zoll

(10,2 x 15,2 cm)

Pipettenspitzen, 200 µl Allgemeiner Laborlieferant

Pipettenspitzen, 1000 µl Allgemeiner Laborlieferant

Aufteilen von

Reagenzienvolumina.

Aufteilen von

Reagenzienvolumina.

Wartungswaschlauf.

ProClin 300, 50 ml

Tween 20, viskose Flüssigkeit,

100 ml

Pinzette, viereckige

Kunststoffspitze

Sigma-Aldrich, Katalog-Nr.

48912-U

Sigma-Aldrich, Katalog-Nr.

P7949

McMaster-Carr, Katalog-Nr.

7003A22

Wasser, Laborqualität, 18 M Ohm Millipore

Wartungswaschlauf.

Entfernen der Fließzellen-

Dichtungen.

SBS- und PE-Reagenzien-

Racks, Positionen mit PW1.

Gerätewaschlauf.

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Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Kapitel 3  Vorbereiten von Reagenzien

Vorbereiten von Reagenzien

Einleitung

Vorbereiten von SBS-Reagenzien

Vorbereiten von Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien

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HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Einleitung

Bevor Sie den Lauf einrichten, bereiten Sie alle Reagenzien für die Sequenzierung vor: SBS-

Reagenzien, Indizierungsreagenzien und Paired-End-Reagenzien. Die Anweisungen für die

Reagenzienvorbereitung sind bei allen Kit-Versionen gleich. Laden Sie alle Reagenzien, wenn Sie von der Software während der Laufeinrichtung dazu aufgefordert werden. Sie müssen während des Laufs nicht zum Gerät zurückkehren, um Reagenzien zu laden.

Reagenzien können während der Clusterbildung vorbereitet werden. Anweisungen zum

Vorbereiten der Fließzelle, der Cluster-Reagenzien und zum Durchführen der

Clusterbildung finden Sie im cBot-Systemhandbuch (Dokument-Nr. 15006165_DEU).

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Vorbereiten von SBS-Reagenzien

SBS-Reagenzien werden zu Beginn des Laufs auf das Gerät geladen. Verwenden Sie die folgenden Anweisungen zum Auftauen und Prüfen von SCM, HIM und HSM.

Auftauen von SBS-Reagenzien

1 Entfernen Sie HCM, HIM und HSM aus dem Lagerort bei einer Temperatur von -25 °C bis -15 °C und tauen Sie sie bei 2 °C bis 8 °C ca. 16 Stunden lang auf.

Alternativ können Sie HIM und HSM in einem raumtemperierten Wasserbad mit deionisiertem Wasser 90 Minuten lang auftauen. Tauen Sie HCM in einem separaten

Wasserbad auf.

HINWEIS

Ersetzen Sie Ihre Handschuhe nach jedem Arbeitsschritt mit HCM.

2 Invertieren Sie jede Flasche zum Mischen.

3 Prüfen Sie HSM und stellen Sie sicher, dass keine Verwirbelungsmuster zu sehen sind.

4 Legen Sie HIM und HSM nach dem Auftauen auf Eis, bis Sie die Reagenzien laden.

Legen Sie HCM separat auf Eis, um eine Kreuzkontamination zu verhindern.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Vorbereiten von Indizierungs- und Paired-End-

Reagenzien

Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien werden zu Beginn des Laufs auf das Gerät geladen. Sie werden während der Indizierung der Reads und dem Read-2-Resyntheseschritt eines Sequenzierungsdurchlaufs verwendet.

Befolgen Sie die Anweisungen zum Vorbereiten von Indizierungs- und Paired-End-

Reagenzien nur dann, wenn Sie eine Paired-End-Fließzelle oder indizierte Bibliotheken auf einer Single-Read-Fließzelle sequenzieren.

WARNUNG

Die Reagenzien enthalten Formamid, ein aliphatisches Amid, dass in Verdacht steht, ein fortpflanzungsgefährdendes Toxin zu sein. Es kann daher durch Inhalation, orale

Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder Kontakt mit den Augen zu Personenschäden kommen. Tragen Sie Schutzausrüstung, einschließlich Augenschutz, Handschuhen und

Laborkittel. Behandeln Sie gebrauchte Reagenzien als chemischen Abfall und ensorgen

Sie sie gemäß den geltenden Sicherheitsvorschriften Ihrer Region. Informationen zu

Umwelt, Gesundheit und Sicherheit finden Sie im SDS für dieses Kit unter support.illumina.com/sds.html

.

Auftauen und Vorbereiten von Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien

1 Nehmen Sie die folgenden Reagenzien aus dem Lagerort mit einer Temperatur von -25 bis -15 °C heraus.

}

Für einen Lauf auf einer Paired-End-Fließzelle: HAM, HDR, HLM2, HP11, HP14,

HPM und HRM. Für nicht indizierte Bibliotheken ist HP14 nicht erforderlich.

}

Für einen Lauf auf einer Single-Read-Fließzelle: HDR, HP12 und HRM.

2 Tauen Sie die Reagenzien in einem Becher mit deionisiertem Wasser mit

Raumtemperatur 20 Minuten lang auf.

3 Invertieren Sie jedes Röhrchen zum Mischen.

4 Zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei 1.000 rpm.

5 Stellen Sie die folgenden Reagenzien auf Eis: HAM, HLM2 und HRM.

6 Lagern Sie folgende Reagenzien bei Raumtemperatur: HDR, HP11, HP12, HP14 und

HPM.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Kapitel 4  Sequenzierung

Sequenzierung

Einleitung

Sequenzierungsworkflow

Eingeben von Laufparametern

Laden und Vorfüllen von Reagenzien

Einsetzen der Sequenzierungsfließzelle

Überwachen des Laufs

Entladen von Reagenzien

Durchführen eines Wasserwaschlaufs

Durchführen einer Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks

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HiSeq 4000-Systemhandbuch

21

Einleitung

Um auf dem HiSeq 4000-System einen Lauf durchzuführen, bereiten Sie alle Reagenzien vor und halten Sie sich an die Eingabeaufforderungen der Software zum Einrichten des

Laufs. Zu den Schritten für das Einrichten des Laufs gehören das Eingeben der

Laufparameter, das Laden und Vorfüllen der Reagenzien, das Laden der Fließzelle und das

Durchführen einer Fluidikprüfung.

Die Schritte für die Laufkonfiguration sind in drei Registerkarten unterteilt: „Run

Configuration“ (Laufkonfiguration), „Pre-Run Setup“ (Vorlaufkonfiguration) und „Initiate

Run“ (Lauf initiieren).

} Die Laufkonfigurationsbildschirme enthalten Dropdown-Listen, Kontrollkästchen oder

Textfelder zur Angabe der Laufparameter. Scannen Sie die Fließzellen- oder

Reagenzien-Kit-ID mit dem tragbaren Barcodescanner ein oder geben Sie die ID über die Touchscreen-Tastatur

Textfeldern.

ein. Das Tastatursymbol befindet sich rechts neben den

} Wählen Sie Next (Weiter), um zum nächsten Bildschirm zu wechseln, oder Back

(Zurück), um zum vorherigen Bildschirm zurückzukehren.

}

Sie können jederzeit während der Laufkonfiguration Cancel (Abbrechen) wählen, um die Laufkonfiguration zu beenden und zum Begrüßungsbildschirm zurückzukehren.

Rufen Sie die Spezifikationen für das HiSeq 4000 auf der Illumina-Website auf, um

Informationen über die Laufzeit sowie andere Performance-Spezifikationen zu erhalten.

Gestaffelte Läufe

Sie können einen neuen Lauf auf Fließzelle A bzw. Fließzelle B starten, während auf der benachbarten Fließzelle gerade ein Lauf ausgeführt wird. Weitere Informationen finden Sie unter

Gestaffelte Läufe auf Fließzelle A und Fließzelle B auf Seite 53

.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Sequenzierungsworkflow

Bereiten Sie die Fließzelle und die Reagenzien für den Lauf vor.

Weitere Informationen finden Sie unter

Vorbereiten von Reagenzien auf

Seite 17

.

Geben Sie die Laufparameter gemäß den Anweisungen auf der

Benutzeroberfläche der Steuerungssoftware ein.

Laden Sie die SBS-Reagenzien für Read 1 und Read 2. Laden Sie falls erforderlich Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien.

Überprüfen Sie den ordnungsgemäßen Fluss mit einer gebrauchten

Fließzelle.

Füllen Sie die SBS-Reagenzien vor und messen Sie den Vorfüllabfall.

Laden Sie eine Hiseq 3000/4000-Cluster-Fließzelle und überprüfen Sie den ordnungsgemäßen Fluss.

Starten Sie den Sequenzierungslauf.

[Optional] Prüfen Sie nach Zyklus 2 den Bericht zur ersten Base und fahren

Sie anschließend mit Read 1 fort.

Wenn der Lauf abgeschlossen ist, entladen Sie die Reagenzien.

Führen Sie einen Gerätewaschlauf durch.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Eingeben von Laufparametern

Starten Sie die Laufeinrichtung, indem Sie Laufparameter für eine Reihe von Bildschirmen auf der Registerkarte „Run Configuration“ (Laufkonfiguration) eingeben. Die Software führt

Sie durch jeden der Bildschirme, wenn Sie die BaseSpace-Konnektivität angeben,

Verbrauchsmaterial-IDs eingeben, Indexing-Optionen auswählen und andere Parameter für den Lauf aufzeichnen.

Bildschirm „Storage“ (Speicherung)

1 Wählen Sie im Begrüßungsbildschirm die Option Sequence (Sequenz), um den

Bildschirm „Storage“ (Speicherung) zu öffnen.

2 [Optional] Stellen Sie wie folgt eine Verbindung zu BaseSpace oder BaseSpace Onsite her.

a Wählen Sie Connect to BaseSpace (Mit BaseSpace verbinden).

b Wählen Sie BaseSpace oder BaseSpace Onsite.

c Wenn Sie BaseSpace ausgewählt haben, wählen Sie eine der folgenden Optionen:

}

Storage and Analysis (Speicherung und Analyse): Sendet zwecks Remote-

Überwachung und Datenanalyse Laufdaten an BaseSpace. Zur Verwendung dieser Option ist ein Probenblatt erforderlich.

}

Run Monitoring Only (Nur Laufüberwachung): Sendet nur InterOp-Dateien an

BaseSpace, sodass Sie Ihren Lauf remote überwachen können.

d Melden Sie sich mit der E-Mail-Adresse Ihres MyIllumina-Kontos und Ihrem

Kennwort bei BaseSpace oder BaseSpace Onsite an.

3 Wählen Sie Browse (Durchsuchen) und navigieren Sie zum Speicherort des bevorzugten Ausgabeordners.

4 Stellen Sie sicher, dass die Miniaturbildeinstellung Save All Thumbnails (Alle

Miniaturbilder speichern) lautet.

Die Software speichert automatisch alle Miniaturbilder. Ein Miniaturbild ist eine

Auswahl von Bildern aus vielen Platten in jeder Plattenspalte bzw. in jedem

Bildstreifen, die in einem Miniaturbild zusammengefasst werden.

5 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

Bildschirm „Flow Cell Setup“ (Einrichtung der Fließzelle)

Im Bildschirm „Flow Cell Setup“ (Einrichtung der Fließzelle) werden Informationen über die Fließzelle aufgezeichnet, die für Ihren Lauf verwendet wird. Alle Felder müssen ausgefüllt werden.

1 Scannen Sie die Fließzellen-ID (Barcodenummer) oder geben Sie die Fließzellen-ID

(Barcodenummer) der zu sequenzierenden Fließzelle ein.

2 Wählen Sie den entsprechenden Fließzellentyp aus, HiSeq 3000/4000 PE oder

HiSeq 3000/4000 SR.

3 Geben Sie einen Namen für den Versuch ein, der auf jedem Bildschirm erscheint und anhand dessen der aktuell durchgeführte Lauf identifiziert werden kann.

4 Geben Sie den Benutzernamen ein.

5 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Bildschirm „Advanced“ (Erweitert)

1 [Optional] Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Confirm First Base (Erste Base bestätigen).

Ein Bericht zur ersten Base wird automatisch für jeden Lauf nach Zyklus 2 generiert und im Stammverzeichnis des Laufordners gespeichert. Wenn Sie diese Option wählen, können Sie den Bericht zur ersten Base bestätigen, bevor Sie mit dem Lauf fortfahren. Anderenfalls wird der Lauf fortgesetzt, ohne dass das

Bestätigungsdialogfeld angezeigt wird.

2 [Optional] Wählen Sie im Fließzellenbild diejenigen Lanes aus, die Sie aus dem Lauf entfernen möchten.

Standardmäßig werden keine Lanes entfernt. Das PhiX-Alignment wird für alle Lanes automatisch durchgeführt.

3 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

Rezeptbildschirm

Aus den im Rezepturbildschirm eingegebenen Informationen wird automatisch eine

Rezeptur generiert.

1 Wählen Sie eine Index-Option aus:

} No Index (Kein Index): Führt einen nicht indizierten Single-Read- oder Paired-End-

Lauf durch.

}

Single Index (Einfacher Index): Führt einen Single-Read- bzw. Paired-End-Lauf mit einem Index-Read durch.

}

Dual Index (Doppelter Index): Führt einen Single-Read- bzw. Paired-End-Lauf mit 2

Index-Reads durch.

} Custom (Benutzerdefiniert): Führt einen Single-Read- bzw. Paired-End-Lauf mit einer benutzerdefinierten Anzahl an Zyklen für die Index-Reads durch.

2 Geben Sie die Anzahl der Zyklen für Read 1 und ggf. Read 2 ein.

HINWEIS

Die Anzahl der in einem Read ausgeführten Zyklen ist um einen Zyklus höher als die

Anzahl der analysierten Zyklen. Wenn Sie beispielsweise 125 Zyklen für Read 1 durchführen möchten, geben Sie 126 ein.

3 Wenn Sie die Indizierungsoption Custom (Benutzerdefiniert) ausgewählt haben, geben

Sie die Anzahl der Zyklen für jeden Index-Read ein.

HINWEIS

Read-Längen müssen nicht identisch sein.

4 Bestätigen Sie die folgenden Standardchemieeinstellungen, die je nach ausgewähltem

Indextyp automatisch ausgefüllt werden.

}

SBS: Hiseq 3000/4000 SBS Kit (Hiseq 3000/4000-SBS-Kit): Gibt die SBS-Chemie an, die für Read 1 und Read 2 verwendet wird.

} Index: Hiseq 3000/4000 Sequencing Primer (Hiseq 3000/4000-Sequenzierungs-

Primer) oder HiSeq 3000/4000 Dual Index Sequencing Primer (HiSeq 3000/4000-

Doppel-Index-Sequenzierungs-Primer): Gibt die Chemie an, die für Index-Reads verwendet wird.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

25

} PE-Durchlaufzeit: HiSeq 3000/4000 PE  oder HiSeq 3000/4000 PE  Dual Index

(HiSeq 3000/4000-PE-Doppel-Index): Gibt die Chemie an, die für die Paired-End-

Resynthese verwendet wird.

5 Um ein benutzerdefiniertes Rezept zu verwenden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen

Existing Recipe (Vorhandenes Rezept).

Bildschirm „Sample Sheet“ (Probenblatt)

Probenblätter sind optional, es sei denn, Sie verwenden BaseSpace, um eine Datenanalyse durchzuführen.

1 Wählen Sie Browse (Durchsuchen), um zum Speicherort der Probenblätter zu navigieren.

2 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

Bildschirm „Reagents“ (Reagenzien)

Im Bildschirm „Reagents“ (Reagenzien) werden Informationen über das Reagenzien-Kit aufgezeichnet, das für Ihren Lauf verwendet wird.

1 Scannen Sie die Barcode-ID des SBS-Reagenzien-Kits oder geben Sie sie ein.

2 Scannen Sie für Paired-End-Läufe die Cluster-Kit-ID oder geben Sie sie ein.

3 Wählen Sie das SBS-Reagenzien-Kit für den Lauf aus:

}

Wählen Sie 300 Cycles (300 Zyklen) für ein Kit für 300 Zyklen. Die Anzahl der verbleibenden Zyklen ist standardmäßig 325.

}

Wählen Sie 150 Cycles (150 Zyklen) für ein Kit für 150 Zyklen. Die Anzahl der verbleibenden Zyklen ist standardmäßig 174.

} Wählen Sie 50 Cycles (50 Zyklen) für ein Kit für 50 Zyklen. Die Anzahl der verbleibenden Zyklen ist standardmäßig 74.

}

Wählen Sie Custom (Benutzerdefiniert) für ein unvollständiges Kit oder für mehrere

50-Zyklen-Kits aus. Geben Sie im Feld „Cycles Remaining“ (Verbleibende Zyklen) die Anzahl der SBS-Zyklen ein, für die die Reagenzien ausreichen sollen.

HINWEIS

Das Feld „Cycles Remaining“ (Verbleibende Zyklen) wird je nach SBS-Kit-ID automatisch ausgefüllt. Die Software zählt von der eingegebenen Zyklenanzahl abwärts.

Ist die Zyklenanzahl gering, werden Sie aufgefordert, frische Reagenzien zu laden.

4 Wählen Sie Prime SBS Reagents (SBS-Reagenzien vorfüllen), um die Reagenzien vorzufüllen.

5 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

Überprüfungsbildschirm

1 Überprüfen Sie die Laufparameter auf dem Überprüfungsbildschirm.

2 Wählen Sie Next (Weiter), um fortzufahren oder Back (Zurück), um die Parameter zu

ändern.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Laden und Vorfüllen von Reagenzien

Nach der Eingabe der Laufparameter sind die nächsten Schritte für die Laufkonfiguration das Laden der SBS-, Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien sowie das Vorfüllen der

Reagenzien durch das Fluidiksystem. Die Software führt Sie in mehreren

Voreinstellungsbildschirmen durch diese Schritte.

Laden von SBS-Reagenzien

1 Invertieren Sie jede Reagenzienflasche mehrere Male zum Mischen.

VORSICHT

Füllen Sie HCM zuletzt nach, nachdem Sie alle anderen Reagenzien geladen haben, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. Entsorgen Sie nach Handhabung von HCM

Ihre Handschuhe und ersetzen Sie sie durch ein neues Paar.

2 Ersetzen Sie den Verschluss auf jeder Flasche durch einen Trichterverschluss.

3 Öffnen Sie die Tür der Reagenzienkammer.

4 Heben Sie die Sipper für den Sequenzierungsreagenzien-Rack wie folgt an.

a Ziehen Sie den Sipper-Griff zu sich hin und schieben Sie ihn dann nach oben.

b Schieben Sie den Griff in die Aussparung am oberen Ende der Schiene.

Vergewissern Sie sich, dass der Griff fest in der Aussparung sitzt.

5 Schieben Sie den Reagenzien-Rack aus der Reagenzienkammer.

6 Platzieren Sie die einzelnen Reagenzienflaschen in die nummerierten Positionen des

Racks. Stellen Sie sicher, dass sich die konische Seite der Flasche in der Aussparung auf dem Boden des Racks befindet.

Tabelle 1 SBS-Reagenzienpositionen

Position

Reagenzien Beschreibung

1

2

HIM

PW1

HT-Inkorporationsmischung

25 ml PW1 oder Wasser in Laborqualität

3

4

HSM

HB1

HT-Scan-Mischung

HT-SBS-Puffer 1

5

6

7

8

HB2

HB2

HCM

HB2

HT-SBS-Puffer 2

HT-SBS-Puffer 2

HT-Aufspaltungsmischung

HT-SBS-Puffer 2

7 Ziehen Sie ein neues Paar ungepuderte Latexhandschuhe an.

8 Schieben Sie den Reagenzien-Rack in die Reagenzienkammer, indem Sie ihn an der erhöhten Führung unten in der Kammer ausrichten.

9 Senken Sie die Sipper wie folgt in die Sequenzierungs-Reagenzienflaschen ab: a Ziehen Sie den Sipper-Griff zu sich hin und schieben Sie ihn dann nach unten.

b Inspizieren Sie die Sipper, um sicherzustellen, dass sie beim Eintauchen in die

Trichterverschlüsse nicht verbogen werden.

c Schieben Sie den Griff in die Aussparung am unteren Ende der Schiene.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Laden von Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien

1 Invertieren Sie jede Flasche zum Mischen.

2 Heben Sie die Sipper für den Paired-End-Reagenzien-Rack wie folgt an.

a Ziehen Sie den Griff zu sich hin und schieben Sie ihn dann nach oben.

b Schieben Sie den Griff in die Aussparung am oberen Ende der Schiene.

Vergewissern Sie sich, dass der Griff fest in der Aussparung sitzt.

3 Schieben Sie den Rack mithilfe des Rack-Griffs aus der Reagenzienkammer.

4 Entfernen Sie die Verschlüsse von den einzelnen Reagenzröhrchen und stellen Sie das

Röhrchen in die entsprechend nummerierte Position bzw. in die Position mit der Farbe, die der Farbe des Etiketts entspricht.

Tabelle 2 Paired-End-Fließzelle

Position

Reagenzien

10

11

HRM

HLM2

13

14

HAM

HPM

15

16

HDR

HP11

17

HP14*

Beschreibung

HT-Resynthese-Mischung

HT-Linearisierungs-Mischung 2

HT-Amplifikations-Mischung

HT-Amplifikations-Vormischung

HT-Denaturierungsmischung (enthält Formamid)

Primer-Mischung – Read 2

Indizierungsprimermischung

*HP14 ist nur für indizierte Läufe erforderlich. Falls HP14 nicht verwendet wird, laden Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml PW1 oder Wasser in Laborqualität.

Tabelle 3 Single-Read-Fließzelle

Position

Reagenz*

10

15

17

HRM

HDR

HP12

Beschreibung

HT-Resynthese-Mischung

HT-Denaturierungsmischung (enthält Formamid)

Index 1 Primer-Mischung

* Ein Reagenz ist in den Positionen 10, 15 und 17 nur bei indizierten Läufen erforderlich. Falls das

Reagenz nicht verwendet wird, laden Sie konische 15-ml-Röhrchen mit 10 ml PW1 oder Wasser in Laborqualität.

5 Stellen Sie konische 15-ml-Röhrchen mit 10 ml Wasser in Laborqualität in nicht verwendete Positionen auf dem Paired-End-Rack.

6 Schieben Sie den Rack in die Reagenzienkammer, indem Sie ihn an der erhöhten

Führung unten in der Kammer ausrichten.

7 Senken Sie die Sipper wie folgt in die Paired-End-Reagenzröhrchen ab: a Ziehen Sie den Griff zu sich hin und drücken Sie ihn dann nach unten.

b Inspizieren Sie die Sipper, um sicherzustellen, dass sie beim Eintauchen in die

Röhrchen nicht verbogen werden.

c Schieben Sie den Griff in die Aussparung am unteren Ende der Schiene.

8 Aktivieren Sie das Kontrollkästchen PW1 (25 ml) loaded (PW1 [25 ml] geladen) in

Position 2 und wählen Sie anschließend Next (Weiter) aus.

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Vorfüllen von Reagenzien

Die Schritte zum Vorfüllen der Reagenzien umfassen das Laden der Primer-Fließzelle, das

Verifizieren des ordnungsgemäßen Flusses und abschließend das Starten des

Vorfüllvorgangs.

VORSICHT

Verwenden Sie stets eine gebrauchte Fließzelle zum Vorfüllen von Reagenzien. Sie können eine Fließzelle aus dem vorherigen Lauf verwenden, um die Reagenzien bei einem nachfolgenden Lauf vorzufüllen oder einen Nachwaschlauf durchzuführen.

Laden einer Primer-Fließzelle

1 Scannen Sie die Primer-Fließzellen-ID (Barcodenummer) der Primer-Fließzelle oder geben Sie sie ein.

2 Spülen Sie die gebrauchte Primer-Fließzelle mit Wasser in Laborqualität. Trocknen Sie sie mit einem für Objektive geeigneten Reinigungstuch oder einem anderen fusselfreien

Tuch ab.

3 Reinigen Sie die Fließzelle mit Alkoholtupfern und einem Reinigungstuch für Objektive.

4 Legen Sie die Fließzelle so auf den Fließzellenhalter, dass die Einlass- und

Auslassanschlüsse nach unten weisen und der Barcode sich auf der rechten Seite befindet. Stellen Sie sicher, dass der Pfeil am linken Rand der Fließzelle, der die

Flussrichtung angibt, in Richtung Gerät zeigt.

5 Schieben Sie die Fließzelle vorsichtig bis zum Anschlag in Richtung der oberen und rechten Führungsstifte.

Abbildung 7 Fließzelle an oberen und rechten Führungsstiften ausgerichtet

A

Oberer Führungsstift

B

Rechte Führungsstifte

6 Nehmen Sie die Hand von der Fließzelle, um zu verhindern, dass im Laufe der Zeit eine Verschiebung der Ausrichtung auftritt.

7 Bewegen Sie den Fließzellenregler langsam in Position 1. Dadurch wird das Vakuum aktiviert und die Fließzelle wird in Position gehalten.

Wenn der Fließzellenregler grün blinkt, ist das Vakuum aktiviert. Falls der Regler nicht grün leuchtet, lesen Sie

Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration auf Seite 49

HiSeq 4000-Systemhandbuch

29

Abbildung 8 Fließzellenregler in Position 1

8 Warten Sie fünf Sekunden, und bewegen Sie dann den Fließzellenregler langsam in

Position 2.

Wenn der Fließzellenregler dauerhaft grün leuchtet, ist ein Vakuum entstanden und die

Fließzelle ist einsatzbereit.

Abbildung 9 Fließzellenregler in Position 2

30

9 Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Vacuum Engaged (Vakuum aktiviert) aktiviert ist und wählen Sie anschließend Next (Weiter).

Prüfen des Flusses

Bei der Überprüfung des Flusses wird auch festgestellt, ob die Fließzelle und die

Dichtungen ordnungsgemäß installiert sind und ein Vakuum entstanden ist.

1 Wählen Sie Lösung 2 aus der Dropdown-Liste.

2 Überprüfen Sie die folgenden Standardwerte:

} Volume (Volumen): 125

} Aspirate Rate (Aspirationsrate): 250

}

Dispense Rate (Zufuhrrate): 2000

3 Wählen Sie Pump (Pumpe).

4 Inspizieren Sie die Fließzelle auf Luftblasen, die die Lanes passieren, sowie auf

Undichtigkeiten in der Nähe der Manifolds.

5 Wenn eine erhöhte Anzahl an Luftblasen vorliegt, überprüfen Sie die Dichtungen auf

Behinderungen, senken Sie die Aspirationsrate auf 100 und pumpen Sie weitere 125 µl

Wasser in die Fließzelle. Wenn die Probleme weiterhin bestehen, entfernen Sie die

Fließzelle, wiederholen Sie die Reinigungsschritte und setzen Sie die Fließzelle erneut ein.

6 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

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Positionieren der Schläuche und Starten des Vorfüllvorgangs

1 Entfernen Sie die acht Abfallröhrchen der entsprechenden Fließzelle aus dem

Abfallbehälter.

Abbildung 10 Positionieren der Schläuche

A Abfallröhrchen der Fließzelle für Reagenzienpositionen 1 bis 8

B Schlauch der Kondensatpumpe

2 Platzieren Sie jeden Abfallschlauch in einem separaten leeren 15-ml-Röhrchen.

Der Abfall wird gesammelt und nach dem Vorfüllvorgang gemessen.

3 Wählen Sie Start Prime (Vorfüllvorgang starten). Im Bildschirm „Prime“ (Vorfüllen) können Sie den Vorfüllvorgang überwachen.

4 Messen Sie nach Abschluss des Vorfüllvorgangs den gesammelten Abfall und

überprüfen Sie, ob das Volumen in jedem Röhrchen 1,75 ml bzw. insgesamt 14 ml beträgt.

Das Gesamtvolumen wird wie folgt berechnet:

}

250 µl für jede SBS-Position außer Position 2 (250 x 7 = 1,75 ml)

}

1,75 ml für jede Lane (1,75 x 8 = 14 ml)

5 Setzen Sie die Abfallschläuche wieder in den Abfallbehälter ein.

6 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

31

Einsetzen der Sequenzierungsfließzelle

Zu den Schritten zum Einsetzen der Cluster-Fließzelle für die Sequenzierung gehören das

Entfernen der zum Vorfüllen verwendeten Fließzelle, das Reinigen des Fließzellenhalters, das Einsetzen der Cluster-Fließzelle sowie das Verifizieren des ordnungsgemäßen Flusses.

Entfernen der gebrauchten Fließzelle

1 Bewegen Sie den Fließzellenregler langsam in Position 1, um die Manifolds zu lösen.

Abbildung 11 Fließzellenregler in Position 1

2 Bewegen Sie den Fließzellenregler langsam in Position 0, um die Vakuumdichtung zu lösen und die Fließzelle freizugeben.

Abbildung 12 Fließzellenregler in Position 0

3 Heben Sie die gebrauchte Fließzelle aus der Halterung.

Reinigen des Fließzellenhalters

1 Ziehen Sie ein neues Paar ungepuderte Latexhandschuhe an.

2 Reinigen Sie die Oberfläche des Fließzellenhalters mit einem fusselfreien, mit Wasser in

Laborqualität befeuchteten Tuch, um Salze zu entfernen.

3 Reinigen Sie die Oberfläche des Fließzellenhalters mit einem Alkoholtupfer oder einem fusselfreien, mit Ethanol oder Isopropanol befeuchteten Tuch. Es darf kein Alkohol in die Vakuumöffnungen oder auf die Umgebung der Manifolds gelangen.

4 Trocken Sie den Tisch falls erforderlich mit einem fusselfreien Labortuch.

5 Unterziehen Sie den Fließzellenhalter einer Prüfung, um sicherzustellen, dass sich keine Fussel auf dem Halter befinden und die Vakuumöffnungen nicht blockiert werden.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Abbildung 13 Überprüfen der Vakuumöffnungen

Einsetzen der Sequenzierungsfließzelle

1 Legen Sie die Fließzelle so auf den Fließzellenhalter, dass die Einlass- und

Auslassanschlüsse nach unten weisen und der Barcode sich auf der rechten Seite befindet. Stellen Sie sicher, dass der Pfeil am linken Rand der Fließzelle, der die

Flussrichtung angibt, in Richtung Gerät zeigt.

2 Schieben Sie die Fließzelle vorsichtig bis zum Anschlag in Richtung der oberen und rechten Führungsstifte.

Abbildung 14 Fließzelle an oberen und rechten Führungsstiften ausgerichtet

A Oberer Führungsstift

B Rechte Führungsstifte

3 Nehmen Sie die Hand von der Fließzelle, um zu verhindern, dass im Laufe der Zeit eine Verschiebung der Ausrichtung auftritt.

4 Bewegen Sie den Fließzellenregler langsam in Position 1. Dadurch wird das Vakuum aktiviert und die Fließzelle wird in Position gehalten.

Wenn der Fließzellenregler grün blinkt, ist das Vakuum aktiviert. Falls der Regler nicht grün leuchtet, lesen Sie

Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration auf Seite 49

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Abbildung 15 Fließzellenregler in Position 1

5 Warten Sie fünf Sekunden, und bewegen Sie dann den Fließzellenregler langsam in

Position 2.

Wenn der Fließzellenregler dauerhaft grün leuchtet, ist ein Vakuum entstanden und die

Fließzelle ist einsatzbereit.

Abbildung 16 Fließzellenregler in Position 2

6 Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Vacuum Engaged (Vakuum aktiviert) aktiviert ist und wählen Sie anschließend Next (Weiter).

Prüfen des Flusses

Bei der Überprüfung des Flusses wird auch festgestellt, ob die Fließzelle und die

Dichtungen ordnungsgemäß installiert sind und ein Vakuum entstanden ist.

1 Wählen Sie Lösung 5 aus der Dropdown-Liste.

2 Geben Sie die folgenden Standardwerte ein:

}

Volume (Volumen): 250

}

Aspirate Rate (Aspirationsrate): 250

} Dispense Rate (Zufuhrrate): 2000

3 Wählen Sie Pump (Pumpe).

4 Inspizieren Sie die Fließzelle auf Luftblasen, die die Lanes passieren, sowie auf

Undichtigkeiten in der Nähe der Manifolds.

5 Wenn eine erhöhte Anzahl an Luftblasen vorhanden ist, überprüfen Sie die Manifold-

Dichtungen auf Obstruktionen und wiederholen Sie den Vorgang mit Lösung 6, um zu verhindern, dass die Lösung an Position 5 aufgebraucht wird. Senken Sie die

Aspirationsrate auf 100 und pumpen Sie weitere 250 µl in die Fließzelle.

6 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

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7 Stellen Sie sicher, dass der Fließzellenregler grün leuchtet, und schließen Sie dann die

Tür der Fließzellenkammer.

8 Achten Sie darauf, dass die Kontrollkästchen Vacuum Engaged (Vakuum aktiviert) und Door Closed (Tür geschlossen) aktiviert sind, und wählen Sie Next (Weiter).

9 Wählen Sie Start (Start), um den Sequenzierungslauf zu starten.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Überwachen des Laufs

Sie können die Laufkennzahlen auf dem Laufübersichtsbildschirm überwachen.

Abbildung 17 Laufübersichtsbildschirm

A Statusleiste: In der Statusleiste können Sie prüfen, wie viele Zyklen bereits abgeschlossen sind.

B Fließzellenbild: Im Fließzellenbild sehen Sie, welche Lanes bereits aufgenommen wurden.

C Fluidikdiagramm: Erweitern Sie den Fluidikabschnitt und überwachen Sie die chemischen

Schritte.

D Laufkonfiguration: Überprüfen Sie die Parameter des aktuellen Laufs.

E Analysediagramm: Überprüfen Sie die Qualitäts-Scores pro Zyklus.

F Bilddiagramm: Überprüfen Sie die Intensitäten pro Zyklus. Für jeden gescannten

Bildstreifen wird nur ein Miniaturbild dargestellt. Die anderen Bilder werden in der

Benutzeroberfläche der Software nicht angezeigt.

Bericht zur ersten Base

Wenn Sie während der Einrichtung des Laufs die Option Confirm First Base (Erste Base bestätigen) aktiviert haben, wird das Bestätigungsdialogfeld für die erste Base automatisch nach Abschluss des zweiten Zyklus angezeigt. Der Lauf wird an diesem Punkt angehalten.

1 Überprüfen Sie den Bericht zur ersten Base im Bestätigungsdialogfeld.

2 Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, wählen Sie Continue (Fortfahren).

Sequenzierungsanalyse-Viewer

Die Sequenzierungsanalyse-Viewer-Software zeigt die Sequenzierungskennzahlen, die während des Sequenzierungslaufs generiert werden. Die Kennzahlen werden in Form von

Schaubildern, Diagrammen und Tabellen dargestellt. Der Sequenzierungsanalyse-Viewer wird automatisch geöffnet, wenn die Laufkennzahlen verfügbar sind.

Wählen Sie zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Laufs Refresh (Aktualisieren), um aktualisierte Kennzahlen zu erhalten.

Weitere Informationen finden Sie im Sequenzierungsanalyse-Viewer-Benutzerhandbuch (Teile-Nr.

15020619).

36

Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Entladen von Reagenzien

1 Öffnen Sie die Tür der Reagenzienkammer.

2 Heben Sie die Sipper für den entsprechenden SBS-Rack bzw. Paired-End-Rack wie folgt an: a Ziehen Sie den Sipper-Griff auswärts.

b Heben Sie den Sipper-Griff an und ziehen Sie ihn gleichzeitig auswärts.

c Schieben Sie den Sipper-Griff in die Aussparung am oberen Ende der Schiene.

Vergewissern Sie sich, dass der Sipper-Griff fest in der Aussparung sitzt.

3 Schieben Sie den Reagenzien-Rack mithilfe des Rack-Griffs aus der Reagenzienkammer.

4 Nehmen Sie die Flaschen aus dem Reagenzien-Rack.

WARNUNG

Die Reagenzien enthalten Formamid, ein aliphatisches Amid, dass in Verdacht steht, ein fortpflanzungsgefährdendes Toxin zu sein. Es kann daher durch Inhalation, orale

Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder Kontakt mit den Augen zu Personenschäden kommen. Tragen Sie Schutzausrüstung, einschließlich Augenschutz, Handschuhen und Laborkittel. Behandeln Sie gebrauchte Reagenzien als chemischen Abfall und ensorgen Sie sie gemäß den geltenden Sicherheitsvorschriften Ihrer Region.

Informationen zu Umwelt, Gesundheit und Sicherheit finden Sie im SDS für dieses Kit unter support.illumina.com/sds.html

.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

37

Durchführen eines Wasserwaschlaufs

Nach jedem Sequenzierungslauf ist ein Wasserwaschlauf erforderlich, wobei stattdessen ein

Wartungswaschlauf durchgeführt werden kann (empfohlen). Anweisungen hierzu finden

Sie unter

Durchführen eines Wartungswaschlaufs auf Seite 42

.

Wenn das Gerät seit mindestens einem Tag nicht verwendet wurde, führen Sie einen

Wasserwaschlauf durch, bevor Sie einen neuen Sequenzierungslauf starten.

1 Wählen Sie im Begrüßungsbildschirm die Option Wash | Water (Waschen | Wasser) aus.

2 Wählen Sie Yes (Ja), um Paired-End-Reagenzienpositionen zu waschen, und anschließend Next (Weiter).

3 Laden Sie Wasser in Laborqualität wie folgt in das Gerät: a Füllen Sie acht SBS-Flaschen mit 250 ml Wasser in Laborqualität.

b Füllen Sie 10 PE-Röhrchen mit 12 ml Wasser in Laborqualität.

4 Stellen Sie sicher, dass eine gebrauchte Fließzelle geladen ist. Setzen Sie ggf. eine gebrauchte Fließzelle ein.

5 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

6 Führen Sie eine Fluidikprüfung durch: a Wählen Sie Lösung 2 aus der Dropdown-Liste. Akzeptieren Sie die Standardwerte für die Pumpe.

b Wählen Sie Pump (Pumpe).

c Inspizieren Sie die Fließzelle auf Luftblasen, die die Lanes passieren, sowie auf

Undichtigkeiten in der Nähe der Manifolds.

7 Entfernen Sie die Abfallschläuche der entsprechenden Fließzelle aus dem

Abfallbehälter.

8 Bündeln Sie die Abfallschläuche mit Parafilm. Die Enden müssen nebeneinanderliegen.

9 Platzieren Sie die gebündelten Enden der Abfallschläuche in einer 250-ml-Flasche.

10 Wählen Sie Next (Weiter), um den Wasserwaschlauf zu starten.

Positionen

8 SBS-Positionen

8 SBS-Positionen und 10 Paired-End-Positionen

Ungefähre Laufzeit

20 Minuten

60 Minuten

11 Messen Sie nach Abschluss des Waschlaufs die abgegebenen Volumina.

Positionen

8 SBS-Positionen

8 SBS-Positionen und 10 Paired-End-Positionen

Abgegebenes

Volumen insgesamt

32 ml

72 ml

Abgegebenes

Volumen pro Lane

4 ml

9 ml

12 Entfernen Sie die Umwicklung von den Abfallschläuchen und setzen Sie die Schläuche wieder in die Abfallflasche ein.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Durchführen einer Schnellformatierung des

Ausgabelaufwerks

Nachdem die Datenübertragung abgeschlossen wurde, führen Sie eine Schnellformatierung des Ausgabelaufwerks (O:\) durch. Durch eine Schnellformatierung wird das Laufwerk für einen nachfolgenden Lauf frei gemacht, ohne wichtige System- oder Gerätewartungsdateien zu entfernen.

Bevor ein Lauf beginnen kann, werden mindestens 2 TB für eine Lauflänge von 2 x 151 benötigt. Wenn der verfügbare Speicherplatz während des Laufs den sicheren Grenzwert unterschreitet, stoppt die Software den Lauf und versetzt die Fließzelle in einen sicheren

Status. Nachdem Speicherplatz verfügbar gemacht wurde, wird der Lauf automatisch fortgesetzt.

HINWEIS

Gerätewartungsprotokolle werden auf dem Laufwerk C:\ gespeichert. Daher kann gefahrlos eine Schnellformatierung von Laufwerk O:\ vorgenommen werden, während ein

Gerätewaschlauf durchgeführt wird.

1 Öffnen Sie in Windows „Computer“, um eine Liste der Computerlaufwerke anzuzeigen.

2 Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Laufwerk O:\ und wählen Sie Format

(Formatieren).

3 Aktivieren Sie im Dialogfeld „Format“ (Formatieren) das Kontrollkästchen Quick

Format (Schnellformatierung).

4 Wählen Sie Start.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Kapitel 5  Wartung

Wartung

Durchführen eines Wartungswaschlaufs

Versetzen des Geräts in den Leerlauf

Ausschalten des Geräts

42

45

46

HiSeq 4000-Systemhandbuch

41

Durchführen eines Wartungswaschlaufs

Führen Sie einen Wartungswaschlauf durch, wenn Sie von der Software alle zehn Tage oder nach einem Lauf dazu aufgefordert werden und wenn ein Wartungswaschlauf eine optionale Alternative zu einem Wasserwaschlauf ist (empfohlen).

Ein Wartungswaschlauf dauert ca. 1,5 Stunden. Dabei wird das System mit einer vorbereiteten Lösung aus Tween 20 und ProClin 300 gespült. Durch regelmäßige

Gerätewaschläufe wird die Geräteleistung aufrechterhalten, indem das Fluidiksystem gespült und eine Ansammlung von Salz und eine Kreuzkontamination von Reagenzien und Bibliotheken verhindert wird.

Wenn vor der Durchführung des Wartungswaschlaufs der Bildschirm „Load Gasket“ 

(Dichtung einsetzen) geöffnet wird, tauschen Sie die Dichtungen im vorderen und hinteren

Manifold aus, bevor Sie mit dem Waschlauf fortfahren.

Vorbereiten der Lösung für den Wartungswaschlauf

Bereiten Sie fünf Liter Wartungswaschlauflösung für die Verwendung mit einem Gerät vor.

Die Lösung kann bis zu 30 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt und während dieser Zeit bis zu drei Mal verwendet werden.

Entsorgen Sie die Waschlösung gemäß den geltenden Sicherheitsvorschriften für Ihre

Region.

1 Bereiten Sie 250 ml 10-prozentiges Tween 20 vor, indem Sie die folgenden Volumina kombinieren (fügen Sie zuerst das Wasser hinzu).

}

Wasser in Laborqualität (225 ml)

} Tween 20 (25 ml)

2 Platzieren Sie einen Rührstab in einer leeren Ballonflasche mit einem

Fassungsvermögen von mindestens sechs Litern.

3 Mischen Sie die folgenden Volumina in der Ballonflasche. Fügen Sie das Wasser zuerst hinzu.

}

Wasser in Laborqualität (750 ml)

}

10 % Tween 20 (250 ml)

} ProClin 300 (1,5 ml)

Diese Volumina ergeben eine Lösung aus ca. 2,5 % Tween 20 und 0,15 % ProClin 300.

4 Stellen Sie die Ballonflasche auf eine Rührplatte und rühren Sie so lange, bis die

Mischung gründlich gemischt ist.

5 Fügen Sie der Lösung vier Liter Wasser in Laborqualität zu.

Diese Volumina ergeben eine Waschlösung aus ca. 0,5 % Tween 20 und

0,03 % ProClin 300.

6 Rühren Sie weiter, bis die Lösung gründlich gemischt ist.

7 Legen Sie sie bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Behälter zur Seite, bis Sie bereit sind, die Reagenzienflaschen und -röhrchen mit der Waschlösung zu füllen bzw.

nachzufüllen.

42

Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Tween 20- und ProClin 300-Waschlauf

1 Wählen Sie im Begrüßungsbildschirm die Option Wash | Maintenance (Waschlauf |

Wartung).

2 Leeren Sie die Abfallflasche.

3 Wenn Sie die Wartungswaschlauflösung eines vorherigen Laufs aufbewahrt haben, bereiten Sie die Waschkomponenten wie folgt vor.

a Füllen Sie die gespeicherte Lösung und invertieren Sie sie zum Mischen.

b Laden Sie die Flaschen und Röhrchen in die zugewiesenen Positionen des

Reagenzien-Racks im Gerät.

4 Wenn Sie eine frische Wartungswaschlösung verwenden, bereiten Sie die

Waschlaufkomponenten folgendermaßen vor: a Füllen Sie acht SBS-Flaschen mit 250 ml Wartungswaschlauflösung.

b Füllen Sie zehn PE-Röhrchen mit 12 ml Wartungswaschlauflösung.

c Weisen Sie jeder Flasche und jedem Röhrchen eine Position im Reagenzien-Rack zu. Behalten Sie die Zuweisungen für jeden nachfolgenden Waschlauf vor, um eine

Kreuzkontamination von den auf den Sippern vorhandenen Reagenzien zu verhindern.

5 Wählen Sie Next (Weiter) aus.

6 Entfernen Sie die Fließzelle vom Fließzellentisch und legen Sie sie beiseite.

7 Ziehen Sie ein neues Paar ungepuderte Latexhandschuhe an.

8 Drücken Sie leicht auf eine Seite der vorderen Dichtung, bis die andere Seite angehoben wird. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Dichtung zu fassen und zu entfernen.

Entfernen Sie die hintere Dichtung auf dieselbe Weise.

Abbildung 18 Entfernen der gebrauchten Manifold-Dichtungen

9 Positionieren Sie eine neue Dichtung in den Aussparungen vorne und hinten am

Fließzellenhalter. Drücken Sie sie vorsichtig in Position.

10 Laden Sie die Fließzelle erneut, die Sie zum Einsetzen der neuen Dichtungen entfernt hatten.

11 Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Vacuum Engaged (Vakuum aktiviert) ausgewählt ist und wählen Sie Next (Weiter).

12 Führen Sie eine Fluidikprüfung durch: a Wählen Sie Lösung 2 aus der Dropdown-Liste.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

43

b Akzeptieren Sie die Standardpumpenwerte und wählen Sie Pump (Pumpe).

c Inspizieren Sie die Fließzelle auf Luftblasen, die die Lanes passieren, sowie auf

Undichtigkeiten in der Nähe der Manifolds.

d Wenn Sie einen konstanten Blasenfluss bemerken, ersetzen Sie die Dichtung und wiederholen Sie die Fluidikprüfung.

13 Entfernen Sie die Abfallschläuche der entsprechenden Fließzelle aus dem

Abfallbehälter.

14 Bündeln Sie die acht Abfallschläuche mit Parafilm. Die Röhrchen müssen nebeneinanderliegen.

15 Platzieren Sie die gebündelten Enden der Abfallröhrchen in einer 250-ml-Flasche.

16 Wählen Sie Next (Weiter), um den Wasserlauf zu starten.

17 Wählen Sie nach Abschluss des Waschlaufs Return to Start (Zurück zum Anfang).

18 Messen Sie das abgegebene Volumen.

Positionen

8 SBS-Positionen

10 Paired-End-Positionen

Alle Positionen

Abgegebenes

Volumen

74 ml

52 ml

15,75 ml pro Lane

HINWEIS

Alle Flaschen und Röhrchen werden vollgefüllt, um sicherzugehen, dass die Sipper gespült werden. Das abgegebene Volumen für jede Position variiert jedoch, sodass nach

Abschluss des Waschlaufs die Flaschen und Röhrchen unterschiedliche Volumina enthalten.

19 Entfernen Sie die Umwicklung von den Abfallröhrchen und setzen Sie sie wieder in den Abfallbehälter ein.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Versetzen des Geräts in den Leerlauf

Gehen Sie wie nachfolgend beschrieben vor, wenn das Gerät bis zu zehn Tage im

Leerlaufmodus bleiben soll. Falls das Gerät länger als zehn Tage nicht verwendet werden soll, lesen Sie den Abschnitt

Ausschalten des Geräts auf Seite 46 .

1 Führen Sie einen Wartungswaschlauf durch, um das System zu spülen. Weitere

Informationen finden Sie unter

Durchführen eines Wartungswaschlaufs auf Seite 42

.

2 Lassen Sie die Fließzelle auf dem Fließzellentisch, wobei sich der Fließzellenregler in

Position 2 befinden muss. Die Manifolds verbleiben in der angehobenen Position.

3 Laden Sie 10 ml Wasser in Laborqualität in jede Position im Reagenzien-Rack und senken Sie anschließend die Sipper ab.

4 Führen Sie eine Wasserwaschung durch, bevor Sie das Gerät erneut verwenden.

Weitere Informationen finden Sie unter

Durchführen eines Wasserwaschlaufs auf Seite 38

.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

45

Ausschalten des Geräts

Schalten Sie das Gerät nur aus, wenn es innerhalb der nächsten zehn Tage oder länger nicht benutzt werden soll. Wenn Sie das Gerät innerhalb der nächsten 10 Tage verwenden möchten, lesen Sie den Abschnitt

Versetzen des Geräts in den Leerlauf auf Seite 45 ."

Gehen Sie wie folgt vor, um die Fluidik sicher vorzubereiten und das System auszuschalten.

1 Führen Sie einen Wartungswaschlauf durch, um das System zu spülen. Weitere

Informationen finden Sie unter

Durchführen eines Wartungswaschlaufs auf Seite 42

.

2 Entfernen Sie die Fließzelle vom Fließzellentisch.

3 Wischen Sie die Oberfläche des Fließzellenhalters vorsichtig mit einem Alkoholtupfer oder einem fusselfreien, mit Ethanol oder Isopropanol befeuchteten Tuch ab.

VORSICHT

Es darf kein Alkohol in die Vakuumöffnungen oder auf die Umgebung der Manifolds gelangen. Reinigen Sie den Tisch ggf. mit einem fusselfreien Tuch.

4 Laden Sie 10 ml Wasser in Laborqualität in jede Position im Reagenzien-Rack und senken Sie anschließend die Sipper ab.

5 Schalten Sie das Gerät aus.

6 Wenn Sie das Gerät wieder starten möchten, laden Sie alle Reagenzpositionen mit

Wasser, schalten Sie das Gerät ein und führen Sie einen Wasserwaschlauf durch.

Weitere Informationen finden Sie unter

Durchführen eines Wasserwaschlaufs auf Seite 38

.

46

Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Anhang A  Fehlerbehebung

Fehlerbehebung

Protokolldatei

Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration

Durchführen einer Fluidikprüfung

Unterbrechen oder Beenden eines Laufs auf dem HiSeq 4000

Gestaffelte Läufe auf Fließzelle A und Fließzelle B

Mögliche Primer-Rehybridisierung für Read 1

48

49

50

51

53

54

HiSeq 4000-Systemhandbuch

47

Protokolldatei

In dieser Datei werden alle Fehler festgehalten, die in der Steuerungssoftware auftreten.

Verwenden Sie diese Datei zur Fehlerbehebung.

1 Wählen Sie auf dem Begrüßungsbildschirm Menu | Tools | Show Log File (Menü|

Werkzeuge | Protokolldatei anzeigen).

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration

Problem

Die Software wurde nicht initialisiert.

Der Fließzellenregler ist orange.

Der Fließzellenregler blinkt orange.

Der Fließzellenregler blinkt grün.

Schlechte

Flüssigkeitsabgabe.

Mögliche Ursache

Die Software konnte interne

Hardwaregeräte nicht initialisieren.

Die Fließzelle wurde nicht richtig platziert.

Das Vakuum ist nicht dicht.

Die Manifolds wurden nicht angehoben.

Das Vakuum wirkt zwar, aber unzureichend.

Der Vakuumdruck ist zufriedenstellend.

Möglicherweise

Luftblasen im System.

Aktion

Schließen Sie die Fehlermeldung und starten Sie anschließend die Gerätesoftware neu.

Falls das Problem weiterhin besteht, starten Sie den Gerätecomputer neu. Wenn Sie den

Computer neu starten möchten, schalten Sie das

Gerät zuerst aus, um sicherzustellen, dass das

„DoNotEject“-Laufwerk korrekt erkannt wird.

Falls das Problem nach dem Neustart des

Gerätecomputers weiterhin besteht, schalten Sie das Gerät aus, warten Sie mindestens

60 Sekunden und starten Sie das Gerät anschließend neu.

Entfernen Sie die Fließzelle und wiederholen Sie die Reinigungsschritte.

Stellen Sie sicher, dass die Dichtungen vorhanden sind und gut sitzen.

Setzen Sie die Fließzelle wieder ein.

Falls die vorhergehenden Schritte nicht zum

Erfolg führen, ersetzen Sie die Dichtungen und setzen Sie anschließend die Fließzelle erneut ein.

Entfernen Sie die Fließzelle und wiederholen Sie die Reinigungsschritte.

Stellen Sie sicher, dass die Dichtungen vorhanden sind und gut sitzen.

Setzen Sie die Fließzelle wieder ein.

Falls die vorhergehenden Schritte nicht zum

Erfolg führen, ersetzen Sie die Dichtungen und setzen Sie anschließend die Fließzelle erneut ein.

Stellen Sie den Fließzellenregler auf Position 2.

Positionieren Sie die Fließzelle neu und

überprüfen Sie, ob die Löcher nach unten zeigen.

Suchen Sie im Bereich der Dichtungen nach weißen Ablagerungen. Falls Ablagerungen vorhanden sind, tauschen Sie die Dichtungen aus. Tauschen Sie die Dichtungen vor jedem

Gerätewartungswaschlauf aus.

Überprüfen Sie, ob die Sipper-Einheiten vollständig abgesenkt wurden und jeder Sipper in Kontakt mit den Reagenzien ist.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

49

Durchführen einer Fluidikprüfung

Führen Sie eine Fluidikprüfung während der Geräteinstallation und bei der Behebung von

Fluidikproblemen durch.

1 Wählen Sie im Begrüßungsbildschirm die Option Check (Prüfung).

2 Scannen Sie die Waschfließzellen-ID (Barcodenummer) der Primer-Fließzelle oder geben

Sie sie ein. Stellen Sie sicher, dass Sie für diesen Schritt eine gebrauchte Fließzelle verwenden.

3 Setzen Sie eine gebrauchte Fließzelle in das Gerät ein.

4 Laden Sie 8 SBS-Flaschen mit PW1 oder Wasser in Laborqualität und laden Sie die

Flaschen auf das SBS-Reagenzien-Rack.

5 Wählen Sie Lösung 2 aus der Dropdown-Liste.

6 Überprüfen Sie die folgenden Standardwerte:

} Volume (Volumen): 250

} Aspirate Rate (Aspirationsrate): 250

}

Dispense Rate (Zufuhrrate): 2000

7 Wählen Sie Pump (Pumpe).

8 Inspizieren Sie die Fließzelle auf Luftblasen, die die Lanes passieren, sowie auf

Undichtigkeiten in der Nähe der Manifolds.

9 Wenn eine erhöhte Anzahl an Luftblasen vorliegt, überprüfen Sie die Manifold-

Dichtungen auf Behinderungen, senken Sie die Aspirationsrate auf 100 und pumpen

Sie weitere 250 µl Wasser in die Fließzelle.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Unterbrechen oder Beenden eines Laufs auf dem

HiSeq 4000

Beim Beenden eines Laufs gibt es keine Option, Daten zu speichern oder den Lauf wieder aufzunehmen. Das Unterbrechen eines Laufs ist ggf. erforderlich, um die Laufkomponenten zu überprüfen oder um einen Lauf auf der benachbarten Fließzelle zu konfigurieren.

Weitere Informationen finden Sie unter

Gestaffelte Läufe auf Fließzelle A und Fließzelle B auf

Seite 53 .

Unterbrechen eines Laufs

Das Unterbrechen eines Laufs ist beispielsweise möglich, um die Laufkomponenten, z. B.

die Reagenzienmengen, zu prüfen. Im normalen Betrieb gibt es keinen Grund, einen Lauf zu unterbrechen.

Beim vorübergehenden Unterbrechen eines Laufs kann dieser ohne Datenverlust fortgesetzt werden. RTA v2 nimmt die Verarbeitung nach der Fortsetzung eines unterbrochenen Laufs automatisch wieder auf. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter

Echtzeitanalyse auf

Seite 55 .

1 Wählen Sie auf dem Bildschirm „Run Overview“ (Laufüberblick) Pause

(Unterbrechen), um die Optionen zum Unterbrechen anzuzeigen.

Abbildung 19 Optionen im Menü „Pause“

2 Wählen Sie Normal Pause (Normale Unterbrechung).

3 Wählen Sie zum Bestätigen Yes (Ja). Die Software beendet den aktuellen Chemie- oder

Bildgebungsvorgang und versetzt die Fließzelle in einen sicheren Status.

4 Wählen Sie Resume (Fortsetzen), um den Lauf fortzusetzen.

Wechseln von Reagenzien während des Laufs

Wenn Sie den Lauf mit nicht vollständig gefüllten Reagenzien starten, wählen Sie die

Funktion „Change Reagents“ (Reagenzien wechseln), um den Lauf anzuhalten und die

Reagenzien aufzufüllen.

HINWEIS

Das Vorfüllen der Reagenzien ist nicht erforderlich.

1 Wählen Sie im Menü „Run Overview“ (Laufübersicht) Pause (Anhalten), um das

Menü „Pause“ zu öffnen.

2 Wählen Sie Change Reagents (Reagenzien wechseln).

3 Wählen Sie Yes (Ja), um dem Befehl zu bestätigen.

Die Software beendet den aktuellen Chemie- oder Bildgebungsvorgang, versetzt die

Fließzelle in einen sicheren Zustand und öffnet den Reagenzienbildschirm.

4 Geben Sie die folgenden Parameter ein:

} Die Reagenzien-Kit-ID für die neuen Reagenzien.

}

Die Anzahl der Zyklen, für die die Reagenzien ausreichen sollen.

5 Wählen Sie Next (Weiter), um mit dem Laden der Reagenzien fortzufahren.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

51

Beenden eines Laufs

Wenn Echtzeitanalyse (RTA) beendet wird, wird die Verarbeitung nicht wieder aufgenommen und die Laufdaten werden nicht gespeichert. Daher kann ein Lauf nicht fortgesetzt werden, nachdem er gestoppt wurde.

VORSICHT

Das Beenden eines Laufs auf dem HiSeq 4000-System ist endgültig.

1 Wählen Sie zum Beenden des Laufs Abort (Abbrechen). Bestätigen bzw. brechen Sie die

Ausführung des Befehls ab.

2 Wenn Sie den Befehl bestätigen, wird der Begrüßungsbildschirm angezeigt.

3 Fahren Sie mit dem Verfahren nach einem Lauf fort.

HINWEIS

Falls ein Lauf während Read 1 gestoppt wird, ist es möglich, eine Primer-

Rehybridisierung auf dem cBot-System durchzuführen. Starten Sie nach der Primer-

Rehybridisierung einen neuen Lauf auf dem HiSeq 4000-System, um die Fließzelle zu sequenzieren.

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Gestaffelte Läufe auf Fließzelle A und Fließzelle B

Bei gestaffelten Läufen auf Fließzelle A und B müssen Sie einen neuen Lauf einrichten. Die

Software unterbricht den Lauf auf der benachbarten Fließzelle je nach Bedarf dann automatisch und nimmt ihn wieder auf. Das System wird automatisch in einen sicheren

Zustand versetzt.

1 Richten Sie einen neuen Lauf ein.

HINWEIS

Wenn ein benachbarter Lauf einen Bildgebungsschritt fertigstellt, unterbricht die

Software die benachbarte Fließzelle, bevor Sie Reagenzien laden und vorfüllen können.

2 Sobald Sie die Sequenzierungs-Fließzelle für den neuen Lauf geladen haben, schließen

Sie die Tür der Fließzellenkammer.

3 Wählen Sie Start, um den Sequenzierungslauf zu starten.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

53

Mögliche Primer-Rehybridisierung für Read 1

Wenn die Laufkennzahlen für Read 1 niedrige Clusterzahlen oder niedrige Intensitäten zeigen oder auf andere Probleme hindeuten, können Sie eine Primer-Rehybridisierung für

Read 1 durchführen, um die Fließzelle zu retten. Die Primer-Rehybridisierung für Read 1 wird auf dem cBot-System durchgeführt und beschädigt nicht die Cluster auf der Fließzelle.

Zur Durchführung einer Primerhybridisierung für Read 1 auf einer strukturierten

HiSeq 4000-Fließzelle benötigen Sie folgende Verbrauchsmaterialien von Illumina:

} Hiseq 3000/4000 cBot Multi-Primer-Rehybridisierungs-Kit (Katalog-Nr. GD-310-1001)

}

HiSeq cBot-Manifold (Katalognr. SY-401-2015)

Weitere Informationen finden Sie unter Read 1-Primer-Rehybridisierung auf einer HiSeq

3000/4000-Fließzelle (Teile-Nr. 15058794).

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Anhang B  Echtzeitanalyse

Echtzeitanalyse

Überblick über die Echtzeitanalyse

Echtzeitanalyse-Workflow

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HiSeq 4000-Systemhandbuch

55

Überblick über die Echtzeitanalyse

Das HiSeq 4000 verwendet eine Implementierung der Echtzeitanalyse (RTA)-Software namens RTA v2. RTA v2 wird auf dem Computer des Geräts ausgeführt und extrahiert

Intensitäten aus Bildern, führt das Base-Calling durch und weist dem Base-Call einen

Qualitäts-Score zu. RTA v2 und die Steuerungssoftware kommunizieren über ein HTTP-

Webinterface und gemeinsame Speicherbereiche. Wenn RTA v2 beendet wird, wird die

Verarbeitung nicht wieder aufgenommen und die Laufdaten werden nicht gespeichert.

HINWEIS

Die Demultiplexierungsleistung wird nicht berechnet. Daher wird die Registerkarte „Index“  im Sequenzierungsanalyse-Viewer (SAV) nicht ausgefüllt.

Eingabedateien

RTA v2 erfordert folgende Eingabedateien:

} Die im lokalen Speicher des Systems gespeicherten Plattenbilder.

}

RunInfo.xml, die von der Steuerungssoftware zu Beginn des Laufs automatisch generiert wird. RTA v2 liest aus dieser Datei den Namen des Laufs, die Anzahl der

Zyklen und die Angabe, ob ein Read indiziert ist, sowie die Anzahl der Platten auf der

Fließzelle.

} RTA.exe.config, eine Softwarekonfigurationsdatei im XML-Format.

RTA v2 erhält Befehle von der Steuerungssoftware, die über den Speicherort der Datei

RunInfo.xml und darüber informieren, ob ein optionaler Ausgabeordner angegeben wurde.

Ausgabedateien

Bilder von jedem Kanal werden gespeichert und als Platten an RTA v2 übergeben. RTA v2 generiert von diesen Bildern primäre Ausgabedateien, die mehrere hinsichtlich ihrer

Qualität ausgewertete Base-Call-Dateien und Filterdateien umfassen. Andere Dateien unterstützen die Generierung primärer Ausgabedateien.

} Base-Call-Dateien: Für jede analysierte Platte wird eine komprimierte Base-Call-Datei

(*.bcl) pro Zyklus generiert. Die Base-Call-Datei enthält den Base-Call und den entsprechenden Qualitäts-Score.

}

Filterdateien: Jede Platte liefert Filterinformationen, die pro Platte über den gesamten

Lauf in einer Filterdatei (*.filter) gespeichert werden. Die Filterdatei gibt an, ob Cluster die Filter passiert haben.

} Clusterpositionsdateien: Die Clusterpositionsdatei (s.locs) enthält die X- und Y-

Koordinaten jedes Clusters auf der Fließzelle.

Die primären Ausgabedateien werden für die anschließende Datenanalyse verwendet. Mit der Konvertierungssoftware bcl2fastq können Sie die Demultiplexierung und FASTQ-

Konvertierung durchführen. Verwenden Sie bcl2fastq v2.16 oder höher zum Konvertieren von HiSeq 4000-Daten. Die aktuelle Softwareversion und Informationen zum Download finden Sie auf der HiSeq 4000-Supportseite der Illumina-Website.

RTA v2 liefert Echtzeitkennzahlen zur Laufqualität, die in InterOp-Dateien gespeichert werden. InterOp-Dateien sind Binärdateien mit Kennzahlen zu Platten, Zyklen und zur

Read-Ebene. Sie werden benötigt, um Kennzahlen im Sequenzierungsanalyse-Viewer ansehen zu können. Zur Anzeige von durch RTA v2 generierten Daten verwenden Sie SAV v1.10.2 oder höher.

Details zu jeder Ausgabedatei finden Sie unter

Sequenzierung von Ausgabedateien auf Seite 64 .

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Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Fehlerbehandlung

RTA v2 erstellt Protokolldateien und schreibt sie in den RTALogs-Ordner. Fehler werden in einer Fehlerdatei im *.tsv-Dateiformat aufgezeichnet.

Die folgenden Protokoll- und Fehlerdateien werden nach Abschluss der Verarbeitung an das endgültige Ausgabeziel übertragen.

}

*GlobalLog*.tsv enthält eine Zusammenfassung wichtiger Laufereignisse.

} *LaneNLog*.tsv listet die Verarbeitungsereignisse pro Lane auf.

} *Error*.tsv listet während des Laufs aufgetretene Fehler auf.

}

*WarningLog*.tsv führt während des Laufs aufgetretene Warnungen auf.

Datenübertragung

Während des Laufs fordert RTA v2 eine Datenübertragung vom Laufkopierdienst an, der

Software, die die Übertragung auf den angegebenen Ausgabeordner steuert. Wenn

BaseSpace verwendet wird, sorgt der BaseSpace Broker für die Übertragung von Daten nach BaseSpace. Wenn die Netzwerkverbindung unterbrochen wird, fährt RTA v2 mit der

Verarbeitung fort und speichert die Daten lokal. Die Datenübertragung wird fortgesetzt, wenn die Verbindung wiederhergestellt wurde.

HINWEIS

Stellen Sie sicher, dass Ihre Netzwerkverbindung die Mindestanforderungen zum Senden der Laufdaten an BaseSpace erfüllt. Weitere Informationen finden Sie im Handbuch zur

Laboreinrichtung und Standortvorbereitung für Ihre HiSeq-Konfiguration. Weitere

Informationen finden Sie unter

Weitere Ressourcen auf Seite 3

.

Nach dem die Verarbeitung abgeschlossen wurde, erstellt RTA v2 eine Markerdatei namens RTAComplete.txt. Die Datenübertragung wird abgeschlossen, nachdem diese Datei erstellt wurde. Eine Sensoranzeige im unteren Bereich des Bildschirms zeigt den

Übertragungsstatus an. Weitere Informationen finden Sie unter

Aktivitäts- und Sensoranzeigen

auf Seite 7 .

HiSeq 4000-Systemhandbuch

57

Echtzeitanalyse-Workflow

Matrizenbildung

Registrierung und

Intensitätsextraktion

Farbmatrixkorrektur

Korrektur der empirischen Phasierung

Base-Calling

Qualitätsbewertung

Definiert die Clusterpositionen.

Registrierung und Intensitätsextraktion: Zeichnet die Position der einzelnen Cluster auf der strukturierten Fließzelle auf und ermittelt einen Intensitätswert für jeden Cluster.

Korrigiert Crosstalk zwischen Kanälen.

Korrigiert die Auswirkungen der Phasierung und Vorphasierung.

Legt für jeden Cluster einen Base-Call fest.

Weist jedem Base-Call einen Qualitäts-Score zu.

Matrizenbildung

Der erste Schritt im Workflow ist die Matrizenbildung. Hierbei werden die einzelnen

Clusterpositionen in einer Platte anhand von X- und Y-Koordinaten definiert. Die Matrize wird bei der Registrierung und Intensitätsextraktion im nachfolgenden Schritt zu

Referenzzwecken verwendet.

Aufgrund des Arrays auf der strukturierten Fließzelle sind die Clusterpositionen entsprechend der Anzahl der Reihen, der Anzahl der Spalten und des Abstands zwischen den Nanowells auf der Fließzelle vordefiniert. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter

Strukturierte Fließzelle auf Seite 9 .

Die Clusterpositionen des gesamten Laufs werden in einer Clusterpositionsdatei (s.locs) gespeichert.

Registrierung und Intensitätsextraktion

Die Registrierung und die Intensitätsextraktion werden durchgeführt, nachdem die Matrize mit den Clusterpositionen erstellt wurde.

}

Bei der Registrierung werden die Clusterpositionen in der Matrize an die Positionen auf dem Bild in jedem der vier Farbkanäle übertragen.

} Die Intensitätsextraktion ermittelt für ein bestimmtes Bild einen Intensitätswert für jedes

Cluster in der Matrize.

Wenn die Registrierung für ein Bild in einem Zyklus fehlschlägt, werden für diese Platte in diesem Zyklus keine Base-Calls erzeugt. Sehen Sie sich im Sequenzierungsanalyse-Viewer

(SAV) die Miniaturbilder an und überprüfen Sie, ob die Registrierung bei einzelnen Bildern fehlgeschlagen ist.

Farbmatrixkorrektur

Nach der Registrierung und Intensitätsextraktion korrigiert RTA v2 den Crosstalk zwischen

Kanälen. Crosstalk tritt z. B. auf, wenn ein Cluster Intensität in Kanal C und auch etwas

Intensität in Kanal A zeigt. RTA v2 korrigiert mithilfe einer 4-x-4-Farbmatrix die

Intensitäten, sodass sie nur einen geringen oder keinen Crosstalk aufweisen, und gleicht

Unterschiede in der Gesamtintensität zwischen den Farbkanälen aus.

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Korrektur der empirischen Phasierung

Während der Sequenzierungsreaktion erweitert sich jeder DNA-Strang in einem Cluster um eine Base pro Zyklus. Die Phasierung und Vorphasierung finden statt, wenn eine

Phasenverschiebung eines Strangs mit dem aktuellen Inkorporationszyklus eintritt.

} Eine Phasierung tritt ein, wenn eine Base zurückfällt.

}

Eine Vorphasierung tritt ein, wenn eine Base vorauseilt.

Abbildung 20 Phasierung und Vorphasierung

A Read mit einer phasierenden Base

B Read mit einer vorphasierenden Base

RTA v2 verwendet den Algorithmus zur Korrektur der empirischen Phasierung, um die

Auswirkungen der Phasierung und der Vorphasierung zu korrigieren. Bei diesem

Algorithmus wird während jedes Zyklus des Laufs die Datenqualität maximiert.

Base-Calling

Nachdem die Roh-Intensitäten für Crosstalk, Phasierung und Vorphasierung korrigiert wurden, ist der Farbkanal mit der hellsten Intensität der Base-Call für diesen Cluster in diesem Zyklus. Das Base-Calling auf dem HiSeq 4000 mit RTA v2 beginnt nach Zyklus 3.

Beim Base-Calling wird eine Base (A, C, G, oder T) für jeden Cluster einer bestimmten Platte eines bestimmten Zyklus festgelegt. Base-Calls werden in Base-Call-Dateien (*.bcl) gespeichert. Base-Call-Dateien sind Binärdateien mit einem Byte pro Call und Qualitäts-

Score. Jede Base-Call-Datei enthält den Base-Call und den entsprechenden Qualitäts-Score.

Um einen Base-Call durchzuführen, müssen die Cluster zunächst den Reinheitsfilter passieren. Cluster, die den Filter nicht passieren oder nicht aufgerufen werden können, weil sie außerhalb des Bildes sind oder die Bildregistrierung fehlgeschlagen ist, werden als No-

Calls beschriftet. No-Calls werden mit (N) dargestellt.

Cluster nach Filterung

Während der ersten 25 Zyklen von Read 1 entfernt der Reinheitsfilter Cluster niedriger

Qualität aus den Analysenergebnissen. Cluster passieren den Filter, wenn nicht mehr als ein Base-Call einen Reinheitswert unter 0,6 in den ersten 25 Zyklen aufweist. Die Reinheit ist als das Verhältnis der hellsten Basenintensität dividiert durch die Summe der hellsten und der zweithellsten Basenintensität definiert. Der Prozentsatz der Cluster, die den Filter passieren (Cluster nach Filterung), wird in den Analyseberichten als %PF dargestellt.

Die strukturierte HiSeq 4000-Fließzelle verfügt über ein geordnetes Array von Clustern.

Leere Wells ohne Cluster sowie polyklonale Wells, bei denen mehr als eine Sequenz vorhanden ist, sind in der Roh-Cluster-Anzahl enthalten, passieren aber nicht den Filter.

Daher liefert ein geordnetes Array auf einer strukturierten Fließzelle einen relativ niedrigen

Prozentsatz von Clustern nach Filterung.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Abbildung 21 Leere und polyklonale Wells (in der Roh-Cluster-Anzahl enthalten)

Abbildung 22 Wells mit Clustern, die nicht den Filter passieren (grau dargestellt)

Qualitätsbewertung

Ein Qualitäts-Score oder Q-Score ist eine Prognose über die Wahrscheinlichkeit eines fehlerhaften Base-Calls. Je höher der Q-Score ist, desto höher ist die Qualität des Base-Calls und die Wahrscheinlichkeit, dass dieser korrekt ist.

Der Q-Score ist eine kompakte Möglichkeit, kleine Fehlerwahrscheinlichkeiten zu kommunizieren. Qualitäts-Scores werden als Q(X) dargestellt, wobei X der Score-Wert ist.

Die folgende Tabelle zeigt die Beziehung zwischen dem Qualitäts-Score und der

Fehlerwahrscheinlichkeit.

Q-Score Q(X)

Q40

Q30

Q20

Q10

Fehlerwahrscheinlichkeit

0,0001 (1 in 10.000)

0,001 (1 in 1.000)

0,01 (1 in 100)

0,1 (1 in 10)

HINWEIS

Die Qualitätsbewertung basiert auf einer geänderten Version des Phred-Algorithmus.

Die Qualitätsbewertung berechnet für jeden Base-Call mehrere Fehlerwahrscheinlichkeiten und ermittelt anhand der Prognosewerte den Q-Score aus einer Qualitätstabelle.

Qualitätstabellen werden erstellt, um optimale Qualitätsprognosen für Läufe zu liefern, die auf spezifisch konfigurierten Sequenzierplattformen mit bestimmten Chemieversionen durchgeführt werden.

Nachdem der Q-Score ermittelt wurde, werden die Ergebnisse in Base-Call-Dateien (*.bcl) gespeichert.

Q-Score-Gruppierung

RTA v2 gruppiert die Qualitäts-Scores in bestimmte Bereiche und weist jedem Bereich einen Wert zu. Die Q-Score-Gruppierung reduziert den Speicherplatzbedarf erheblich, ohne die Genauigkeit und Leistung von nachgeschalteten Anwendungen zu beeinträchtigen.

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Die Q-Score-Gruppierung trägt zur Effizienz der Analyseverfahren und

Datenübertragungsanforderungen bei, die mit dem hohen Durchsatz des HiSeq 4000 einhergehen. Die resultierende *.bcl-Datei ist kleiner, da die Komprimierungsalgorithmen die Datei besser komprimieren können. Es werden weniger Daten auf den Gerätecomputer geschrieben und auf einen Speicherort im Netzwerk übertragen, wodurch das Kopieren der

Dateien schneller erfolgt.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Anhang C  Ausgabedateien

Ausgabedateien

Sequenzierung von Ausgabedateien

Plattennummerierung

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HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Sequenzierung von Ausgabedateien

Dateityp

Base-Call-Dateien

Clusterpositionsdateien

Filterdateien

InterOp-Dateien

Konfigurationsdatei für die Echtzeitanalyse

Laufinformationsdatei

Miniaturbilddateien

Dateibeschreibung, Speicherort und Name

Die Analyseergebnisse der einzelnen Platten werden in Base-Call-

Dateien gespeichert. Sie enthalten den Base-Call und den kodierten

Qualitäts-Score.

Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : Die Dateien für jede Platte werden pro Zyklus in den jeweiligen Ordnern gespeichert.

s_[Lane]_[Platte].bcl.gz

, wobei „Lane“ der Platzhalter für die einstellige Nummer der Lane und „Platte“ der Platzhalter für die vierstellige Plattennummer ist. Die Base-Call-Dateien werden mit dem gzip-Tool komprimiert.

Die Clusterpositionsdateien für die einzelnen Platten enthalten die Xund Y-Koordinaten jedes Clusters. Clusterpositionsdateien werden bei der Matrizenbildung generiert.

Data\Intensities : Eine Datei für den gesamten Lauf wird im Ordner

„Intensities“ (Intensität) gespeichert.

s.locs

Die Filterdatei gibt an, ob ein Cluster die Filter passiert hat.

Filterdateien werden bei Zyklus 26 generiert und verwenden

25 Datenzyklen.

Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : Die Dateien werden pro Lane und

Platte in einem entsprechenden Ordner gespeichert.

s_[Lane]_[Platte].filter

Binäre Berichtsdateien, die im Sequenzierungsanalyse-Viewer verwendet werden. InterOp-Dateien werden während des Laufs aktualisiert.

InterOp -Ordner

Die RTA-Konfigurationsdatei wird zu Beginn des Laufs generiert. Sie enthält die Einstellungen für den Lauf.

[Stammordner]

RTAConfiguration.xml

Enthält den Namen des Laufs, die Anzahl der Zyklen in jedem Read, die Angabe, ob der Read indiziert ist, sowie die Anzahl der Bildstreifen und Platten auf der Fließzelle. Die Laufinformationsdatei wird am

Anfang des Laufs generiert.

[Stammordner]

RunInfo.xml

Während der Bildgebung wird bei jedem Zyklus ein Miniaturbild für jeden Kanal und jede Platte in den einzelnen Bildstreifen erzeugt.

Thumbnail_Images\L00[X]\C[X.1] : Für jede Lane wird ein Ordner und für jeden Zyklus ein entsprechender Unterordner angelegt.

s_[Lane]_[Platte]_[Kanal].jpg

: „Platte“ ist der Platzhalter für die vierstellige Zahl, die die Oberfläche, die Bildstreifen und die Platte angibt. Weitere Informationen hierzu finden Sie unter

Plattennummerierung auf Seite 65

.

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Plattennummerierung

Die strukturierte Fließzelle des HiSeq 3000/4000-Systems wird für jeden Zyklus in 112

Platten auf jeder Lane oben und unten aufgenommen. Jede der 8 Lanes hat 2 Bildstreifen mit je 28 Platten. Die Platten werden gemäß ihrer Position nummeriert.

HINWEIS

Ein Bildstreifen ist eine Plattenreihe innerhalb einer Lane der Fließzelle.

Der Plattenname ist eine vierstellige Zahl, die die Position der Fließzelle darstellt.

}

Die erste Ziffer steht für die Oberfläche:

} 1 steht für oben

}

2 steht für unten

}

Die zweite Ziffer steht für den Bildstreifen:

}

1 steht für den ersten Bildstreifen

} 2 steht für den zweiten Bildstreifen

}

Die letzten zwei Ziffern stehen für die Platte: 01 bis 28. Die Plattennummerierung beginnt bei 01 am Ausgabeende der Fließzelle bis 28 am Eingabeende.

Abbildung 23 Plattennummerierung

In diesem Beispiel handelt es sich um eine Platte aus der oberen Oberfläche der

Fließzelle, den zweiten Bildstreifen und die siebte Platte.

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Index

A

Aktivitätsanzeigen 7

Ausgabedateien 64

Ausgabeordner

Standardspeicherorte 13

Ausschalten des Geräts 46

B

Base-Calling 59

BaseSpace

Optionen 24

Probenblatt 26

Verbindung herstellen zu 24

BaseSpace-Symbole

Sensoranzeige

BaseSpace 8

BaseSpace Onsite

Verbindung herstellen zu 24

bcl2fastq

Version 56

Bericht zur ersten Base 36

Berichte

Integration der ersten Base 36

Bildschirm zur Einrichtung der

Fließzelle 24

C

Chemieschritte

Überwachen 36

Cluster

Qualität 59 strukturierte Fließzelle 59

Cluster nach Filterung 59

Clusterpositionen

Matrizenbildung 58

Crosstalk 58

D

Datenkomprimierung 60

Datenübertragung 39, 57

Datenübertragungsstatus

BaseSpace 8

Laufkopierdienst 7

Dokumentation 3, 71

Doppelte Indizierung

Auf Paired-End-Fließzelle 25

Einstellungen im

Rezepturbildschirm 25

E

Echtzeitanalyse

Phasierung 59

Echtzeitanalyse-Software 6

Einschalten 12

Empirische Phasierung 59

Erste Base bestätigen 25

HiSeq 4000-Systemhandbuch

F

Farbmatrixkorrektur 58

Fehler und Warnungen

Statussymbole 6

Fehlerbehebung 49

Fluidik 50

Laden von Fließzellen 49

Registrierung 58

Fehlerprotokoll

RTA v2 57

Steuerungssoftware 48

Fließzelle

Einsetzen 32

Fehlerbehebung 49

Fließzellen-ID 24

gebrauchte entfernen 32

Plattenummerierung 65

strukturiert 9

Fließzellenhalter

Reingen 32

Fließzellenkammer 4

Fluidik, Fehlerbehebung 49

Fluidikkammer 4

Fluidikprobleme

Fehlerbehebung 50

Fluidikprüfung 50

G

Gerät ausschalten 46

Gerät in den Leerlauf versetzen 45

Gerätedaten 15

Gestaffelte Läufe 53

H

Hilfe

Dokumentation 3

technisch 71

HiSeq-Steuerungssoftware

Starten 12

HiSeq Control Software 6

I

Indizierungsschema 26

Integration der ersten Base

Bericht 25

Bestätigung 36

Intensitäten

Überwachen 36

Intensitätsextraktion 58

InterOp-Dateien 56

K

Komponenten

Fließzellenkammer 4

Fluidikkammer 4

67

68

Optikmodul 4

Reagenzienkammer 4

Konfigurationsdatei

Echtzeitanalyse 64

L

Laden von Fließzellen

Luftblasen, Undichtigkeiten 30, 34

Laden von Reagenzien

SBS-Positionen 27

Trichterverschlüsse 27

Lane-Auswahl 25

Lauf

Unterbrechen. 51

Läufe

gestaffelt 53

Stoppen, endgültig 52

Laufinformationsdatei 64

Laufkonfiguration

Chemie-Einstellungen 25

Indizierungseinstellungen 25

Lane-Auswahl 25

Prüfen des Flusses 30, 34

Verbleibende Zyklen 26

Vorfüllen der Reagenzien 26

Laufkopierdienst 57

Laufkopierdienst-Symbole 7

Laufordner

Einstellungen 13

Laufüberwachung 36

LIMS

Authentifizierung 13

Einstellungen 13

LIMS-Server 13

M

Menüoptionen-Fenster 13

Miniaturbilddateien 64

N

Name des Versuchs 24

O

Online-Schulungen 3

Optikmodul 4

P

Phasierung, Vorphasierung 59

Plattennummerierung 65

Probenblatt

BaseSpace 26

Protokolldatei 48

Prüfen des Flusses, Standardwerte 30,

34

Q

Q-Scores 60

Gruppierung 60

Qualitäts-Scores 60

Fehlerwahrscheinlichkeit 60

Gruppierung 60

Überwachen 36

R

Reagenzien

Entladen 37

Kit-ID aufzeichnen 25-26

Reagenzien, Bildschirm 25

Sequenzierung 19

Vorbereiten 18

Vorfüllen 31

Wechseln während eines Laufs 51

Reagenzien ändern 51

Reagenzien, Bildschirm 25-26

Reagenzienkammer 4

Reagenzienpositionen

SBS 27

Registrierung, Clusterpositionen 58

Rehybridisierung, Read 1 54

Reinheitsfilter 59

Rezepturbildschirm 25

RTA v2

Ausgabedateien 56

Beenden 56

Eingabedateien 56

Fehlerbehandlung 57

Stoppen eines Laufs, endgültig 52

Überblick 56

S

SBS-Kits 9

SBS-Reagenzienpositionen 27

Schnellformatierung, Ausgabelaufwerk, verfügbare Festplattenspeicher,

Ausgabelaufwerk

Schnellformatierung 39

Sensoranzeigen 7

Laufkopierdienst 7

Sequencing Analysis Viewer

Version 56

Sequenzierung von

Verbrauchsmaterialien 19

Sequenzierungs-

Verbrauchsmaterialien 9

Sequenzierungs-Workflow 58

Sequenzierungsanalyse-Viewer 6

Überblick 36

Sequenzierungsworkflow 23

Software

Echtzeitanalyse 6

Fehlerbehebung 49

HiSeq Control Software 6

Initialisierung 12

Sequenzierungsanalyse-Viewer 6

Softwareoberfläche

Anzeige 13

Starten 12

Statusalarmsymbol 6

Strukturierte Fließzelle 9

Clusterpositionen 58

Support 71

Symbole

Datenübertragungsstatus 7

Fehler und Warnungen 6

Statusalarm 6

Systemeinstellen

Anpassen 13

Material-Nr. 20000063

Dokument-Nr. 15066496 v01 DEU

Systemeinstellungen

Zugriff 13

T

Technischer Support 71

U

Unterbrechen eines Laufs 51

V

Verbrauchsmaterialien

Illumina Sequenzierungs-Kits 9

Vom Benutzer bereitgestellt 16

Vom Benutzer bereitgestellte

Verbrauchsmaterialien 16

Vorfüllen

Abfallvolumen 31

Optionale Einstellung 26

Vorbereitung 31

W

Wartungsprotokolle 39

Wartungswaschlauf abgegebenes Volumen

Wartungswaschlauf 44

Einrichtung 43

Häufigkeit 42

Wartungswaschlauflösung

Entsorgung 42

Lagern 42

Vorbereiten 42

Waschläufe

Vorbereiten der

Wartungswaschlauflösung 42

Wartungswaschlauf 42

Wasserwaschlauf 38

Wasserwaschlauf

Dauer 38

Durchführen 38 erwartete Volumina 38

Workflow

Sequenzierung 23, 58

HiSeq 4000-Systemhandbuch

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Material-Nr. 20000063

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Technische Unterstützung

Wenn Sie technische Unterstützung benötigen, wenden Sie sich bitte an den technischen

Support von Illumina.

Tabelle 4 Allgemeine Kontaktinformationen für Illumina

Website

www.illumina.com

E-Mail

[email protected]

Tabelle 5 Telefonnummern des Illumina-Kundendiensts

Region

Nordamerika

Australien

Belgien

Dänemark

Deutschland

Finnland

Frankreich

Großbritannien

Irland

Telefonnummer

1.800.809.4566

1.800.775.688

0800.81102

80882346

0800.180.8994

0800.918363

0800.911850

0800.917.0041

1.800.812949

Region

Italien

Neuseeland

Niederlande

Norwegen

Österreich

Schweden

Schweiz

Spanien

Andere Länder

Telefonnummer

800.874909

0800,451.650

0800.0223859

800.16836

0800.296575

020790181

0800.563118

900.812168

+44.1799.534000

Sicherheitsdatenblätter (SDS, Safety Data Sheets) stehen auf der Illumina-Website unter support.illumina.com/sds.html

zur Verfügung.

Produktdokumentationen sind zum Download im PDF-Format über die Website von

Illumina verfügbar. Gehen Sie zu support.illumina.com, wählen Sie ein Produkt aus und klicken Sie anschließend auf Documentation & Literature (Dokumentation und

Literatur).

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71

Illumina

5200 Illumina Way

San Diego, Kalifornien 92122, USA

+1.800.809.ILMN (4566)

+1.858.202.4566 (außerhalb von Nordamerika) [email protected]

www.illumina.com

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