Calprotectin - Bühlmann Laboratories

TM
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192 tests
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2
6
11
16
21
25
EK-CAL
Code
2)
3)
2014-08-14
Store at 2-8°C until expiration d ate.
Diluted Wash Buffer
Store at 2-8°C until expiration date.
B-CALEX-C50
B-CALEX-C200
Smart-Prep
B-TMB12
B-STS12
Reconstitution
Table 1
1)
2/36
2014-08-14
3/36
TM
The
2014-08-14
4/36
2014-08-14
5/36
EK-CAL
EK-CAL2
Rekonstitution
8 x 12
Kavitäten
2 x 8 x 12
Kavitäten
3 Stück
B-TMB12
B-STS12
2014-08-14
6/36
1)
2)
3)
Stopp-Lösung
Table 5
B-CALEX-C50
B-CALEX-C200
Smart-Prep
2014-08-14
TMB-Substrat
7/36
2014-08-14
8/36
3.
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Die Leistungsmerkmale
evaluiert.
2014-08-14
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FRANCAIS
DOMAINE D’UTILISATION
TM
La trousse BÜHLMANN fCAL ELISA d a été conçue pour
l’extraction et la détermination quantitative de calprotectine
(MRP8/14 ; S100A8/S100A9) humaine dans les échantillons
de selles (réf. 1-3).
PRINCIPE DU DOSAGE
Après une extraction rapide avec un volume de selles et 49
volumes de tampon d’extraction, ce dosage permet la
mesure sélective de l’antigène calprotectine au moyen d’un
ELISA de type „sandwich“. Les puits de la microplaque sont
recouverts d’un anticorps monoclonal de capture (Acm),
anticorps
hautement
spécifique
aux
complexes
hétérodimériques et polymériques de calprotectine (réf. 4-5).
Les calibrateurs, les contrôles et les extraits de selles sont
incubés pendant 30 minutes à température ambiante. Après
une étape de lavage, le second anticorps (Ac) conjugué à la
péroxydase de raifort (HRP) se fixe à la molécule de
calprotectine liée à l’Acm. Après une incubation et un
lavage, le substrat TMB (tétraméthylbenzidine) est ajouté
aux puits. La réaction enzymatique permet d’obtenir une
coloration bleue. Elle est stoppée par l’ajout d’une solution
acide (H2SO4). La couleur bleue vire au jaune. La mesure de
l’absorbance à 450 nm est directement proportionnelle à la
concentration de calprotectine.
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION
Réactifs
EK-CAL
Code
Reconstitution
Quantité
Tampon
d’extraction
Microplaque
Coatée avec un
Acm antiCalprotectine
Films adhésifs
Tampon de
lavage
concentré 10x
Avec
conservateurs
Tampon
d’incubation
Avec
conservateurs
Calibrateurs AE1) 2)
Calprotectine
dans un tampon
protéique avec
conservateurs
Contrôles bas
et élevé 3)
Sérum humain
avec
conservateurs
Marqueur
enzymatique
Ac antiCalprotectine
conjugué à la
HRP
Substrat TMB
Solution de TMB
dans un tampon
citrate
Solution stop
0.25 M H2SO4
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B-CAL-EX Prêt à l’emploi
8 x 12 puits
2 x 8 x 12
puits
Prête à l’emploi
3 pièces
6 pièces
A reconstituer
avec 900 mL
d’eau déionisée
(chacun)
3 flacons de
B-CAL -IB Prêt à l’emploi
125 mL
5 flacons de B-CAL1 mL
CASET
Prêts à l’emploi
2 flacons de 1
mL
2 flacons de B-CAL1 mL
CONSET
Prêts à l’emploi
2 flacons de
B-CAL-EL Prêt à l’emploi
12 mL
Prêt à l’emploi
Prête à l’emploi
corrosif
Table 7
1)
2)
3)
Les concentrations actuelles de calprotectine des calibrateurs A à E
sont respectivement : 4, 12, 40, 120 et 240 ng/mL. Après extraction et
dilution de l’échantillon, une dilution à 1:2500 est prise en compte pour
la détermination des calibrateurs A à E. Les concentrations suivantes
doivent être utilisées pour la gamme basse de dosage ELISA : 10, 30,
100, 300 and 600 µg/g de calprotectine fécale.
Pour la procédure ELISA étendue utilisez les concentrations de
calibrateurs A à E suivantes dans le mode opératoire du lecteur de
microplaques correspondant : 30, 90, 300, 900 et 1800 µg/g de
Calprotectine.
Les concentrations en Calprotectine humaine native des contrôles
varient en fonction des lots. Veuillez-vous référer à la fiche de contrôle
qualité pour les concentrations effectives.
STOCKAGE ET PEREMPTION DES REACTIFS
Réactifs non ouverts/ non entamés
Stables à 2-8°C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption figurant sur
les étiquettes.
Réactifs ouverts/ reconstitués
Tampon d’extraction Stables à 2-8°C jusqu’à la date de péremption
Replacer immédiatement les barrettes non utilisées
dans la pochette contenant le dessiccateur puis la
Microplaque
refermer soigneusement.
Stable à 2-8°C jusqu’à la date de péremption.
Tampon de lavage
Stable à 2-8°C pendant 6 mois aprè s dilution
Tampon d’incubation
Calibrateurs
Contrôles
Stables à 2-8°C jusqu’à la date de péremption
Marqueur
enzymatique
Substrat TMB
Solution stop
Table 8
REACTIFS FOURNIS SELON LA DEMANDE
Tubes d’extraction de selles
CALEX® Cap
Unités à 50 ou 200 dispositifs réremplis avec 5 mL de tampon
d’extraction / prêts à l’emploi
B-CALEX-C50
Smart-Prep
50 tubes, spatules et fonds de
tube
B-CALEX-C200
50 tubes comprenant chacun
cône & embout du doseur,
pré-remplis avec 1.3 mL de
tampon d’extraction / prêts à
l’emploi
Table 9
MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
Procédure d’extraction
• Anses d’inoculation jetables de 10 µl
• Tubes de 15 mL en polypropylène avec bouchons à visser
pour la procédure d’extraction standard ou tubes
d’extraction (voir ci-dessus).
• Hotte à flux laminaire
• Agitateur Multi- tubes ou vortex
• Balance de précision (10-150 mg)
• Micro centrifugeuse (≥3000 x g)
• Centrifugeuse (≥500 x g)
Procédure de l’ ELISA
• Pipettes de précision réglables avec pointes jetables pour
10, 100 et 1000 µL.
• Tubes jetables en polypropylène ou polystyrène pour la
préparation des dilutions d’échantillons.
• Eprouvette graduée de 1000 mL pour la préparation du
tampon de lavage.
• Laveur automatique de microplaques ou une pissette pour
le tampon de lavage (voir PRÉCAUTIONS TECHNIQUES).
Revision date:
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• Papier absorbant.
• Agitateur de microplaques (voir PRÉCAUTIONS
TECHNIQUES).
• Lecteur de microplaques pour la mesure de l’absorbance à
450 nm.
PRECAUTIONS
PRÉCAUTIONS DE SÉCURITÉ
• Matériel d’origine humaine : Les barrettes de la microplaque,
les calibrateurs et les contrôles de cette trousse contiennent
des composants d’origine humaine. Bien que les tests de
détection de l’antigène de surface du VHB et des anticorps
des virus VHC et VIH1/2 se soient révélés négatifs, il
convient de considérer les réactifs comme capables de
transmettre des maladies infectieuses, et de les manipuler
conformément aux bonnes pratiques de laboratoire
(GLP/BPL), en prenant les précautions appropriées.
• Substrat et Solution Stop : Le Substrat (B-TMB12)
contient du tétraméthylbenzidine, et du peroxyde
d’hydrogène (H2O2). La Solution stop (B-STS12) contient
de l’acide sulfurique. Ces substances irritent les yeux, la
peau ainsi que les muqueuses. Eviter par conséquent
tout contact avec les yeux, la peau et les vêtements. En
cas de contact accidentel avec les yeux ou la peau, rincer
impérativement à grande eau.
• Pour en savoir plus sur les précautions pour la manipulation
et l’élimination des déchets, nous vous recommandons
fortement de consulter l’organisme réglementaire compétent
pour votre pays.
PRÉCAUTIONS TECHNIQUES
Réactifs
• Les puits de la microplaque peuvent être recouverts de
résidus formés lors du processus de production. Ils sont
éliminés par le lavage (voir l'étape 3 de la procédure) et
n'ont aucune influence sur les résultats.
• Lire attentivement les instructions avant de réaliser le test.
Le test ne donnera pas les résultats escomptés en cas de
dilution incorrecte ou de modification des réactifs, ou de
stockage dans des conditions autres que celles détaillées
dans le présent mode d’emploi.
• Les composants ne doivent pas être utilisés au-delà de la
date d'expiration imprimée sur les étiquettes.
• Ne pas mélanger des réactifs de lots différents.
• Il convient de prendre toutes les précautions requises
pour empêcher toute contamination croisée entre réactifs,
entre échantillons ou entre puits.
• Laisser les réactifs s’équilibrer à température ambiante.
Reconstituer les réactifs lyophilisés comme indiqué. Bien
mélanger (au vortex) les réactifs avant utilisation.
• Les puits de la microplaque sont à usage unique.
Extraction
• Dans le but d’obtenir des résultats quantitatifs, il est
important d’homogénéiser l’intégralité des selles pesées
dans le tampon d’extraction. Il convient également d’éviter
de contaminer le bouchon du tube. Les substances non
dissoutes (non digérées) peuvent persister dans les tubes
après l’extraction.
Procedure de l’ ELISA
• Le lavage est un point important de l’ELISA. Pour garantir la
reproductibilité des résultats il est nécessaire que le tampon
de lavage incube à chaque fois au minimum 20 secondes
dans les puits de la plaque.
• Les laboratoires BÜHLMANN recommandent, lors de
l’utilisation d’un laveur de plaque automatique, le choix du
mode
“Plaque”
avec
lequel
chaque
étape
BÜHLMANN fCALTM ELISA
(remplissage/aspiration) est effectuée sur toute la plaque
avant de passer à l’étape suivante. De cette façon le temps
d’incubation minimum est garanti.
• Il est obligatoire de respecter le nombre de cycles de lavage
pour l’obtention de résultats fiables.
• L’agitateur de plaque doit être réglé à 450 rpm (<10 Hz).
Une fréquence de rotation supérieure peut avoir pour
conséquence une faible linéarité de dilution pour les
valeurs comprises entre 300/900 et 600/1800 µg/g. Le
mode orbital est préférable au mode réciproque.
• Le temps d’incubation de l’étape 5 ne doit pas être inférieur
à 30 minutes pour assurer l’interaction complète entre
l’antigène et l’anticorps. Des temps d’incubation un peu plus
longs (jusqu’à 5 minutes) n’ont pas d’influence sur le résultat
final.
• L‘enzyme (HRP) utilisée comme marqueur est inactivée par
l’oxygène et est hautement sensible à l’azoture de sodium,
au thimérosal, à l’acide hypochloreux, ainsi qu’aux
hydrocarbures chlorés couramment rencontrés dans l’eau.
N’utiliser par conséquent que de l’eau déionisée ou distillée
de bonne qualité.
• Comme les conditions varient d’essai à essai, une courbe
d’étalonnage doit être établie pour chaque nouveau dosage.
L’alignement vertical est recommandé.
• Si la concentration initiale d’un échantillon présente un
signal plus élevé que celui du calibrateur le plus haut,
l’échantillon doit être dilué à l’aide du tampon d’incubation et
dosé à nouveau selon la procédure standard. Le facteur de
dilution doit être pris en compte pour le calcul de la
concentration effective. Les cycles de congélation/
décongélation répétés des échantillons et des réactifs
doivent être évités.
PRELEVEMENT ET CONSERVATION DES
ECHANTILLONS
La mise en œuvre de la procédure nécessite 50 à 100 mg
d’échantillon natif de selles pour chaque extraction.
Le prélèvement de selles se fait dans des tubes ordinaires.
Elles se conservent au réfrigérateur à 2-8°C au moi ns 6 jours.
Les extraits sont stables pendant au moins 7 jours à 2-8°C et
au moins 24 mois à -20ºC.
Important : Les échantillons doivent être prélevés sans
additifs.
STANDARDISATION
TM
La trousse BÜHLMANN fCAL ELISA est calibrée avec la
MRP8/14 purifiée de granulocytes humains.
EXTRACTION
Procédure d’extraction standard
1. Marquer et peser les tubes en polypropylène avec l’anse
d’inoculation jetable.
2. Prélever 50 à 100 mg d’échantillon de selles décongelées
au moyen de l’anse d’inoculation et transférer l’anse dans
le tube pré-pesé.
3. Déterminer la quantité nette d’échantillon, casser l’anse et
laisser sa partie inférieure dans le tube.
4. Ajouter le tampon d’extraction selon la formule
x mg de selles x 49 = y µl de tampon d’extraction
(par ex.. 50 mg de selles + 2450 µl tampón d’extraction)
dans le tube et le fermer.
5. Homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un agitateur multitubes pendant 30 minutes à vitesse maximale. Si on
utilise le tube d’extraction de selles Roche, l’extraction
peut être réduite à 1 minute à l’aide d’un vortex.
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6. Transférer l’extrait obtenu dans un tube Eppendorf de 2
mL puis centrifuger dans une micro centrifugeuse durant
5 minutes à 3000 x g.
7. Récupérer le surnageant dans un nouveau tube
préalablement identifié et poursuivre avec la procédure
ELISA.
Procédure d’extraction à l’aide des tubes d’extraction de
selles.
L’extraction est décrite et illustrée dans le manuel
d’utilisation fourni avec les tubes d’extraction respectifs.
®
1. Tube d’extraction CALEX Cap (réf. : B-CALEX-C50/ BCALEX-C200) : les tubes d’extraction sont pré-remplis
avec le tampon d’extraction.
®
Important : Après extraction, centrifuger les tubes CALEX
Cap 5 minutes à 500 x g et poursuivre avec la procédure
ELISA.
2. Tubes d’extraction de selles BÜHLMANN Smart-Prep
(réf. : B-CAL-RD) .
®
TM
3. ScheBo Quick-Prep (réf. : B-CAL-SO50) : les tubes
d’extraction sont pré-remplis avec le tampon d’extraction.
®
Important : Après extraction avec Smart-Prep ou ScheBo
TM
Quick-Prep centrifuger les tubes 5 minutes à 3000 x g.
L’extrait peut aussi être transféré dans un tube Eppendorf
de 2 mL et centrifugé à l’aide d’une micro-centrifugeuse
pendant 5 minutes à 3000 x g. Récupérer le surnageant
dans un nouveau tube préalablement identifié et poursuivre
avec la procédure ELISA.
GAMME DE DOSAGE ELISA
Le dosage peut être mis en œuvre selon la procédure ELISA
standard ou étendue. Le choix dépend de la concentration en
Calprotectine des échantillons. Pour les échantillons dont la
concentration ne dépasse pas 600 µg/g, suivez la procédure
ELISA standard (10 - 600 µg/g).
Si la concentration des échantillons tend à dépasser 600
µg/g, suivez la procédure ELISA étendue (30 -1800 µg/g).
PROCÉDURE ELISA
Important : Les réactifs doivent être équilibrés à
température ambiante (18-28°C) avant utilisation. S euls les
échantillons de selles doivent être diluées. Calibrateurs et
contrôles sont prêts à l’emploi.
1.
GAMME DE DOSAGE 10 – 600 µg/g
1.1. Procédure de pesée manuelle, Smart Prep ou
®
ScheBo Quick Prep™: diluer les surnageants au
1/50ème avec du tampon d’incubation (par exemple :
20 µL d’extrait et 980 µL de tampon d’incubation) et
bien homogénéiser. Laisser les
échantillons
sédimenter pendant au moins 5 min à température
ambiante (18-28°C) avant de réaliser l’étape 4c.
®
1.2. Dispositif CALEX Cap : diluer les surnageants au
1/5ème avec du tampon d’incubation (par exemple :
100 µL d’extrait et 400 µL de tampon d’incubation) et
bien homogénéiser. Laisser les
échantillons
sédimenter pendant au moins 5 minutes à
température ambiante (18-28°C) avant de réaliser
l’étape 4c.
GAMME DE DOSAGE 30-1800 / µg/g
La gamme de dosage peut être étendue d’un facteur
3, si les échantillons sont dilués au 1/7500ème au lieu
de 1/2500ème. Cette procédure est recommandée
lorsque des valeurs élevées de calprotectine fécale
sont attendues. La précision et la linéarité du test
permettent l’extension de la gamme de dosage.
1.1. Procédure de pesée manuelle, Smart-Prep ou
®
ScheBo Quick Prep™ : diluer les surnageants au
1/150ème avec du tampon d’incubation (par exemple :
20 µL d’extrait et 2980 µL de tampon d’incubation) et
bien homogénéiser. Laisser les
échantillons
sédimenter pendant au moins 5 min à température
ambiante (18-28°C) avant de réaliser l’étape 4c
®
1.2. Dispositif CALEX Cap : diluer les surnageants au
1/15ème avec du tampon d’incubation (par exemple :
50 µL d’extrait et 700 µL de tampon d’incubation) et
bien homogénéiser. Laisser les
échantillons
sédimenter pendant au moins 5 min à température
ambiante (18-28°C) avant de réaliser avant de réali ser
l’étape 4c
2.
3.
Préparer une microplaque avec suffisamment de puits
pour recevoir tous les calibrateurs, contrôles et
échantillons dilués. Retirer les barrettes en surplus du
support et les placer immédiatement au froid dans la
pochette prévue à cet effet et contenant le
dessiccateur.
Laver deux fois chaque puits avec au moins 300 µL de
tampon de lavage. Vider les puits et taper
énergiquement la microplaque sur du papier
absorbant.
Important : le tampon de lavage doit incuber un minimum
de 20 secondes dans les puits et ceci pour chacune des
trois étapes de lavage (se référer aux PRÉCAUTIONS
TECHNIQUES, procédure de l’ELISA)
4a. Distribuer 100 µL de tampon d’incubation (blanc) dans
le puits respectif.
Distribuer 100 µL de calibrateur A-E dans les puits
respectifs.
4b. Distribuer 100 µL de contrôles bas et élevé dans les
puits respectifs.
4c. Distribuer 100 µL de chaque échantillon dilué dans les
puits suivants.
5.
Couvrir la microplaque à l’aide d’un des films adhésifs
fournis et incuber à 18-28°C pendant 30 ± 5 min sur
un agitateur de microplaque réglé à 450 rpm (se
référer aux PRÉCAUTIONS TECHNIQUES, procédure
de l’ELISA).
6.
Retirer et jeter le film adhésif. Vider puis laver chaque
puits trois fois, avec au moins 300 µL de tampon de
lavage (se référer aux PRÉCAUTIONS TECHNIQUES,
procédure de l’ELISA). Vider les puits et les sécher en
tapant énergiquement la microplaque sur du papier
absorbant.
7.
Ajouter 100 µL de marqueur enzymatique dans tous
les puits.
8.
Recouvrir la microplaque d’un nouveau film adhésif et
incuber à 18-28°C durant 30 ± 5 min sur un agitateu r
de microplaques réglé à 450 rpm.
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9. Retirer et jeter le film adhésif. Vider puis laver les puits
cinq fois avec au moins 300 µL de tampon de lavage.
Vider les puits et les sécher en tapant énergiquement
la microplaque sur du papier absorbant.
Important : laisser le substrat TMB s’équilibrer à une
température de 18-28°C.
10. Ajouter 100 µL de substrat TMB dans chaque puits.
11. Recouvrir la microplaque d’un nouveau film adhésif et
incuber sur l’agitateur à 450 rpm pendant 15 ± 2 min à
18-28°C. Protéger la microplaque de la lumière
directe.
12.Ajouter 100 µL de solution stop acide dans chaque
puits. Eliminer les bulles d’air à l’aide d’une pointe de
pipette puis passer à l’étape 13 au cours des 30 min
suivantes.
13.Lire l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de
microplaques.
CALCUL DES RESULTATS
Lire l’absorbance à 450nm à l’aide d’un lecteur de plaque,
pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon. Utiliser un
modèle de régression logistique à 4 paramètres en
soustrayant le blanc et calculer les concentrations en
calprotectine fécale des échantillons.
GAMME DE DOSAGE 10 - 600 µg/g
Si vous optez pour la procédure domaine de valeurs basses,
utilisez les concentrations de calibrateurs suivantes dans le
mode du lecteur de microplaques correspondant : 10, 30,
100, 300, 600 µg/g. Les résultats doivent être multipliés
par le ou les éventuels facteurs de dilution
supplémentaires pour obtenir les résultats finaux.
Des exemples caractéristiques de données sont reportés
dans la Table 19 (résultats) et la Figure 1 (courbe
d’étalonnage). Ces résultats et cette courbe d’étalonnage
ne sont fournis qu'à titre d'exemple. Tracez une courbe
d’étalonnage pour chaque nouveau set d'échantillons à
doser.
GAMME DE DOSAGE 30 - 1800 µg/g
Si vous optez pour la procédure plage de mesure étendue
utilisez les concentrations de calibrateurs suivantes dans le
mode du lecteur de microplaques correspondant : 30, 90,
300, 900 et 1800 µg/g. Les résultats doivent être
multipliés par le ou les éventuels facteurs de dilution
supplémentaires pour obtenir les résultats finaux.
Des exemples caractéristiques de données sont reportés
dans la Table 24 (résultats) et la Figure 3 (courbe
d’étalonnage). Ces résultats et cette courbe d’étalonnage
ne sont fournis qu'à titre d'exemple. Tracez une courbe
d’étalonnage pour chaque nouveau set d'échantillons à
doser.
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE
Les caractéristiques de performances de l’essai ont été
validées sur des échantillons testés en double.
GAMME DE DOSAGE 10 - 600 µg/g
Précision intra-essai : 4.7%. Elle est obtenue à partir des
résultats de 20 duplicatas de valeurs de 3 extraits de
selles, au cours d’un même essai. Les données sont
répertoriées dans la Table 20.
Inter-essai : <15 %. La précision moyenne entre dosages
’ELISA est calculée sur 5 extraits de selles. Les prélèvements
sont testés selon la procédure de dosage en 10 analyses
distinctes, par trois techniciens, en utilisant deux lots de kit
dans deux laboratoires différents. Les valeurs sont
répertoriées dans la Table 21.
Limite de blanc (LoB) : <10 µg/g. 20 duplicatas de tampon
d’incubation furent analysés au cours d’un même essai. La
valeur moyenne et la déviation standard furent calculées
pour chaque absorbance obtenue. La plus petite
concentration détectable de Calprotectine, clairement
inférieure au Calibrateur A (10 µg/g) fut définie en ajoutant 2
déviations standard à l’absorbance moyenne et en reportant
la valeur obtenue sur la courbe d’étalonnage générée lors
d’un nouvel essai.
Limite de quantification (LoQ) : <10 µg/g. 10 échantillons
différents de selles présentant des concentrations de
Calprotectine comprises entre 5.2 et 1254 µg/g furent
analysés 20 fois en double en intra-essai. Le % de CV et
les valeurs moyennes furent calculées pour chaque
échantillon. La LoQ observée est de l’ordre de 15 % de CV.
Le profil de précision résultant (Figure 1) permet une
mesure précise dans la gamme standard entière de 10 à
600 µg/g).
Linéarité de la dilution : 103 %. 7 échantillons de selles
présentant des valeurs de Calprotectine élevés furent
extraits selon la procédure usuelle. Les extraits furent
dilués avec du tampon d’incubation puis analysés selon le
protocole standard. Les valeurs attendues furent calculées
à partir des résultats obtenus lors de la première dilution.
Elles sont présentées dans la Table 22.
Test de récupération : 100 %. 2 extraits de selles furent
additionnés de différentes concentrations de Calprotectine
native diluée contenant du sérum humain. Les échantillons
furent analysés selon la procédure standard avant, puis
après l’addition de Calprotectine. Les données obtenues
sont présentées dans la
Table 23.
Réactions croisées : <0.1 %. Le tampon d’incubation fut
additionné respectivement de différentes concentrations
des 2 monomères recombinant MRP8 et MRP14 puis
analysé selon la procédure standard. Les données
obtenues sont présentées dans la Table 28.
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE
Les caractéristiques de performances de l’essai ont été
validées sur des échantillons testés en double.
GAMME DE DOSAGE 30 - 1800 µg/g
Précision intra-essai : 4,0 %. La précision intra-dosage
moyenne est calculée à partir des résultats de 20 duplicatas
de valeur provenant de trois extraits de selles dosés au cours
d'une analyse unique, selon la procédure de dosage. Les
valeurs sont répertoriées dans la Table 25.
Précision inter-essai : < 15 %. La précision moyenne entre
dosages ELISA est calculée sur 5 extraits de selles. Les
prélèvements sont testés selon la procédure de dosage en 10
analyses distinctes, par trois techniciens, en utilisant deux lots
de kit dans deux laboratoires différents. Les valeurs sont
répertoriées dans la Table 26.
Limite de quantification (LoQ) : < 30 µg/g. 18 échantillons
de selles de concentrations en Calprotectine comprises entre
10.8 et 2080 µg/g sont analysés 20 fois en double au cours
d'un dosage unique. Le CV en % et la moyenne sont calculés
pour chaque échantillon. La LoQ est calculée comme étant la
concentration de Calprotectine à un CV de 15 %. Le profil de
précision obtenu démontre que les mesures sont précises
dans toute la plage d'étalonnage entre 30 et 1800 µg/g.
Les résultats sont représentés sur la Figure 4.
Revision date:
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Linéarité de la dilution : 102 %. Cinq échantillons de selles
de concentration en Calprotectine supérieure à la normale
sont prélevés selon la procédure de dosage. Les extraits sont
dilués dans le tampon d'incubation avant d'être dosés selon la
procédure de dosage. Les valeurs attendues sont calculées à
partir de la valeur observée déterminée à la première dilution.
Les résultats sont répertoriés dans la Table 27.
INTERPRETATION DES RESULTATS
La méthode d’estimation de Calprotectine dans les selles
est fiable et facile à utiliser pour différencier les maladies
gastro-intestinales organiques des maladies gastrointestinales fonctionnelles.
Dans une étude clinique, 401 patients symptomatiques,
programmés pour une coloscopie, ont été examinés.
L’examen endoscopique a montré que 273 patients
présentent des maladies fonctionnelles alors que 128
patients présentent des maladies organiques diverses
(colites, maladie de Crohn, ulcères, diverticules, polypes,
adénomes, cancer, ou maladies infectieuses) (réf. 12).
L’analyse de la courbe ROC (AUC : 0.935) montre une
valeur seuil clinique optimale à 50 µg/g. En appliquant
cette valeur seuil, une sensibilité clinique et une spécificité,
respectivement, de 84.4% et 94.5%, ont été atteintes dans
la différenciation des maladies organiques et fonctionnelles
(voir Table 29).
La concentration de Calprotectine dans les selles est
comparable chez les adultes et les enfants, tandis qu’elle
peut augmenter de façon significative chez les nouveaunés (réf. 8).
Ces données confortent les recommandations suivantes
pour l’interprétation des résultats :
Valeurs normales inférieures à 50 µg/g :
Des valeurs de Calprotectine <50 µg/g excluent une
inflammation au niveau du tractus gastro-intestinal. Les
patients ayant une faible concentration de Calprotectine
fécale ne nécessitent donc pas d’intervention invasive pour
déterminer la cause de l’inflammation (réf. 12).
Valeurs élevées entre 50 et 200 µg/g :
Des valeurs de Calprotectine entre 50 et 200 µg/g peuvent
avoir pour origine une maladie organique telle qu’une
inflammation causée par les AINS, une diverticulite non
sévère ou un syndrôme de l’intestin irritable en phase de
rémission. En présence d’une inflammation de faible
intensité il est recommandé de répéter la mesure et de
réaliser des tests complémentaires.
Valeurs élevées supérieures à 200 µg/g :
Des valeurs de Calprotectine >200 µg/g indiquent une
maladie de type organique active avec inflammation du
tractus gastro-intestinal. Il est suggéré de réaliser des
examens complémentaires et de mettre en place un
traitement curatif sous le suivi de médecins spécialistes.
La valeur seuil proposée pour les adultes (50 µg/g) peut
également être utilisée comme référence chez les enfants
âgés de 4 à 17 ans, quel que soit le sexe (réf. 9).
CONTROLE QUALITE
Une lecture exhaustive de ce manuel est recommandée
pour l’utilisation correcte du produit. Des résultats fiables
ne seront obtenus que par un travail en laboratoire précis
(bonnes pratiques de laboratoire usuelles) et en suivant
fidèlement les recommandations de cette brochure.
Comme il n’existe pas de contrôle pour la calprotectine
commercialement
disponible,
nous
recommandons
BÜHLMANN fCALTM ELISA
l’utilisation d’un pool d’extraits positifs et négatifs comme
référence interne et contrôle qualité.
La reproductibilité des paramètres de la courbe
d’étalonnage et des valeurs des contrôles devrait être
comprise dans le domaine des valeurs attendues établies
par chaque laboratoire.
Si la précision des mesures ne correspond pas aux limites
établies et que les répétitions excluent toute erreur
technique, il est recommandé de contrôler les paramètres
suivants: i) pipetage, appareils de mesure de température
et de temps, ii) calibration des instruments, iii) date de
péremption des réactifs, iv) conditions de stockage et
d’incubation, v) le substrat TMB devrait être incolore, vi)
pureté de l’eau.
LIMITES
• Les réactifs fournis dans ce coffret sont optimisés pour le
dosage de Calprotectine dans les échantillons de selles.
• Les résultats du test doivent être interprétés en tenant
compte des informations résultant de l’examen clinique du
patient et d’autres procédures diagnostiques.
EK-CAL
2014-08-14
16/36
3 fogli
6 fogli
5 provetteda B-CAL1 mL
CASET
1 provetta
da 12 mL
B-TMB12
B-STS12
2)
3)
PRECAUZIONI
PRECAUZIONI DI SICUREZZA
PRECAUZIONI TECNICHE
B-CALEX-C50
B-CALEX-C200
2014-08-14
17/36
TM
TM
2014-08-14
18/36
6.
7.
8.
9.
2014-08-14
19/36
RANGE DI MISURAZIONE: 30 – 1800 µg/g
2014-08-14
20/36
ALMACENAMIENTO Y DURACIÓN DE LOS REACTIVOS
TM
EK-CAL
Reconstituci
ón
B-CALEX-C50
B-CALEX-C200
Listo para
usar
Smart-Prep
Listo para
usar
2 viales
de 1 mL
Listo para
usar
2 viales
de 12 mL
Listo para
usar
2 viales
de 12 mL
B-TMB12
2014-08-14
Table 15
PRECAUCIONES
21/36
2014-08-14
22/36
TM
®
®
6.
7.
8.
9.
2014-08-14
23/36
2014-08-14
24/36
2014-08-14
25/36
1)
2)
3)
EK-CAL
EK-CAL2
3 peças
6 peças
B-TMB12
Pronto para
uso
B-STS12
Device
Smart-Prep
B-CALEX-C200
Table 17
2014-08-14
26/36
TM
®
2014-08-14
27/36
3.
6.
7.
8.
9.
2014-08-14
5.
28/36
do
teste
foram
2014-08-14
29/36
APPENDIX I
REFERENCES/ LITERATURREFERENZEN/ RÉFÉRENCES/ RIFERIMENTI/ REFERENCIAS
2014-08-14
30/36
0.073
0.066
0.069
0.143
0.153
0.148
0.465
0.456
0.460
1.121
1.135
1.128
1.658
1.671
1.664
0.201
0.189
0.195
0.598
0.583
0.590
2
7.2
1.5
4.8
1
1.4
0.5
0.9
0
10
0.6
41
39
40
134
130
132
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Sample 5
Mean
1.4
5.6
33.0
2.7
3.2
8.1
Table 22:
Sample
C
D
R^2
400
2.67
1
1:200
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:6400
1:12800
Mean
1:50
1:100
1:200
1:400
1:800
Mean
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:6400
Mean
Mean
Mean
Mean
Mean
S1
S2
60
40
Dilution
S3
Intra Assay CV [%CV] n=20
B
1.19
1.8
SD
[µg/g]
A
0.0354
4.4
4.7
Mean
[µg/g]
18.1
44.5
74.3
227
520
1000
Mean
Table 21:
Sample
0.096
10
10
10
30
30
30
100
100
100
300
300
300
600
600
600
Table 20:
Sample
Calc. Conc.
[µg/g]
232
124
61
28
12
116
58
29
15
290
145
73
39
19
145
72
36
18
15 % CV
Table 23:
20
Sample
Spiking Recovery
µg/g
0
1
10
100
1000
10000
S1
5.3
Observed
[µg/g]
13.6
33.6
101
147
287
468
Mean
10
600
S2
24.6
2014-08-14
31/36
10
30
100
150
300
400
32.9
49.2
139
176
358
467
34.6
54.6
125
175
325
425
30
30
30
90
90
90
300
300
300
900
900
900
1800
1800
1800
0.057
0.047
0.046
0.047
0.138
0.140
0.139
0.464
0.452
0.458
1.207
1.192
1.200
1.627
1.630
1.629
0.147
0.162
0.155
0.618
0.618
0.618
Table 25:
Sample
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Calc. Conc.
[µg/g]
0.9
1.5
1.0
1
1.9
37.7
713
1246
0.8
0
10
0.1
105
115
110
396
396
396
6.2
SD
[µg/g]
2.5
20.1
32.4
6.7
2.8
2.6
SD
[µg/g]
9.7
20
62
111
221
B
1.47
C
736
D
2.06
R^2
1
80
70
60
50
40
<15 % CV
30
20
10
0
1.0
10.0
100.0
1000.0
10000.0
30
Sample
S1
S2
S3
S4
S5
Mean
2014-06-30
10000
0.6
Table 27:
1000
100
µg/g
4.0
Table 26:
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Sample 5
Mean
0.5
2
Mean
Sample
Intra Assay CV [%] n=20
32/36
1800
Dilution Linearity/Parallelism
Dilution
Observed
[µg/g]
2466
1296
420
237
111
758
702
552
406
210
108
Table 28*
Spiked with
100 µg/mL
10 µg/mL
1 µg/mL
100 ng/mL
10 ng/mL
26.0
8.0
<4.0
<4.0
<4.0
MRP14
[ng/mL]
38.7
3.4
<4.0
<4.0
<4.0
2014-08-14
33/36
* Data have been established with the lower range ELISA
procedure
Table
description:
cf.
“Results”,
“Performance
Characteristics” and “Interpretation of Results”.
Tabellenbeschreibung: siehe Resultate
“Leistungsmerkmale” und “Interpretation der Resultate”.
Explications aux tableaux: voir “Résultats”,
“Caracteristiques de Performance” et “Interprétation des
Résultats”.
Descrizione tavola: cf. “Risultati”, “Caratteristiche di
Prestazione” e “interpretazione dei resultati”.
Explicaciones a las Tablas: ver “Resultados”,
“Características de Efficiencia”) y “Interpetaciones de los
resultados.”
Explicação a Tablas: ver “Resultados”, “Características
de desempenho” y “Interpretação do resultados
APPENDIX IV
SHORT PROTOCOL
0.0 mg
75.0 mg
Centrifuge 5 min
at 3’000 x g
2014-08-14
34/36
NOTES
2014-08-14
35/36
REF
LOT
IVD
MP
Symbol
Use By
Verwendbar bis
Utiliser jusqu’au
Utilizzare entro
Fecha de caducidad
Data de expiração
Order Code
Bestellnummer
Code
Codice
Código
Código
Batch code
Chargenbezeichnung
Code du lot
Codice del lotto
Código de lote
Código lote
In Vitro Diagnostic Medical Device
In Vitro Diagnostikum
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Producto sánitario para diagnóstico in vitro
Contains sufficient for <n> tests
Ausreichend für ”n” Ansätze
Contenu suffisant pour „n“ tests
Contenuto sufficiente per „n“ saggi
Contenudo sufficiente para <n> ensayos
Contenudo sufficiente para <n> tests
Consult Instructions for UseGebrauchsanweisung beachten
Consulter le mode d’emploi
Consultare le istruzioni per l‘uso
Consulte las instrucciones de uso
Leia cuidadosamente as instruções
Temperature limitation
Zulässiger Temperaturbereich
Limites de température
Limiti di temperatura
Limite de temperatura
Lίmite de temperatura
Extraction Buffer
Extraktions-Puffer
Tampon d’extraction
Tampone per estrazione
Tampón de extracción
Tampão extração
Microtiter plate
Mikrotiterplatte
Microplaque
Micropiastra
Microplaca
Microplaca
BUF WASH 10X
BUF INC
CAL A
-
CAL E
CONTROL L
CONTROL H
EL
Explanation
Wash Buffer Concentrate (10x)
Wasch-Puffer Konzentrat (10x)
Concentré de tampon de lavage (10x)
Tampone di lavaggio concentrato (10x)
Tampón de lavado concentrado (x10)
Concentrado de tampão de lavagem
Incubation Buffer
Inkubations-Puffer
Tampon d’incubation
Tampone di incubazione
Tampón de incubación
Tampão de incubação
Calibrator A -E
Kalibrator A -E
Calibrateur A -E
Calibratore A - E
Calibrador A – E
Calibrador A – E
Control Low
Kontrolle tief
Contrôle bas
Controllo basso
Control bajo
Controle baixo
Control High
Kontrolle hoch
Contrôle élevé
Controllo alto
Control alto
Controle alto
Enzyme Label
Enzym-Marker
Marqueur enzymatique
Marcato enzimatico
Marcador enzimático
Marcador enzimático
TMB Substrate
TMB-Substrat
Substrat TMB
Substrato di TMB
Substrato de TMB
Substrato TMB
Stop Solution
Stopp-Lösung
Solution stop
Soluzione stoppante
Solución de parada
Solução stop
Printing Date
2014-08-15
2014-08-14
36/36