Calprotectin - Bühlmann Laboratories

TM
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192 tests
Revision date: 2014-08-14
English
Deutsch
Français
Italiano
Español
Português
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2
6
11
16
21
25
EK-CAL
Code
2)
3)
2014-08-14
Store at 2-8°C until expiration d ate.
Diluted Wash Buffer
Store at 2-8°C until expiration date.
B-CALEX-C50
B-CALEX-C200
Smart-Prep
B-TMB12
B-STS12
Revision date:
Table 1
1)
2/36
2014-08-14
3/36
TM
The
2014-08-14
4/36
2014-08-14
5/36
EK-CAL
EK-CAL2
Rekonstitution
8 x 12
Kavitäten
2 x 8 x 12
Kavitäten
3 Stück
B-TMB12
B-STS12
Revision date:
2014-08-14
6/36
1)
2)
3)
Stopp-Lösung
Table 5
B-CALEX-C50
B-CALEX-C200
Smart-Prep
2014-08-14
TMB-Substrat
7/36
2014-08-14
8/36
3.
Revision date:
2014-08-14
9/36
Die Leistungsmerkmale
evaluiert.
2014-08-14
10/36
EK-CAL
Code
Revision date:
2014-08-14
11/36
2 flacons de 1
mL
1)
2)
3)
Table 8
B-CALEX-C50
Smart-Prep
B-CALEX-C200
Table 9
2014-08-14
12/36
Revision date:
2014-08-14
13/36
TM
3.
6.
7.
8.
Revision date:
2014-08-14
14/36
2014-08-14
15/36
ITALIANO
USO
TM
Il Kit BÜHLMANN fCAL ELISA è inteso per l’estrazione e
la determinazione quantitativa della Calprotectina umana
(MRP8/14; S100A8/S100A9) nei campioni di feci (ref. 1-3).
PRINCIPIO DEL DOSAGGIO
Il test consente la misurazione selettiva dell’antigene
Calprotectina attraverso un saggio ELISA. Un anticorpo
monoclonale a cattura (mAb) altamente specifico
rispettivamente per i complessi eterodimerici e dimerici di
Calprotectina (ref. 4-5), è coattato alla micropiastra.
Calibratori, controlli ed estratti del paziente sono incubati per
30 min. a temperatura ambiente. Dopo una fase di lavaggio
un secondo anticorpo (Ab) coniugato con perossidasici di
rafano (HRP) rileva le molecole di Calprotectina legate
all’anticorpo monoclonale coattato alla piastra. Dopo
incubazione ed ulteriore lavaggio, viene aggiunto il
substrato tetrametilbenzidina (TMB) con formazione di
colore blu, seguito dall’aggiunta di soluzione di stop (virata
del colore al giallo). L’assorbanza viene misurata a 450 nm.
REAGENTI FORNITI E LORO PREPARAZIONE
Reagenti
EK-CAL
Codice
Ricostituzione
Quantità
Tampone per
estrazione
Micropiastra
Precoattata con
anti-calprotecina
mAb
Foglio
Sigillante per la
piastra
Tampone di
Lavaggio
Concentrato
(10x)
Con conservanti
Tampone di
Incubazione
Con
conservanti
Calibratori
dalla A-E1) 2
Calprotecina in
una matrice
tampone con
conservanti
Controllo
Basso / Alto 3)
Matrice di siero
umano con
conservanti
Marcatore
Enzimatico
AntiCalprotectina Ab
coniugato con
HRP
Substrato TMB
TMB in un
tampone citrato
Soluzione di
Stop
Acido Solforico
0.25 M
1)
Revision date:
2014-08-14
16/36
3 flaconi
da125 mL
6 flaconi
da125 ml
B-CAL-EX Pronto all’uso
Pozzetti da
12 x 8
Pozzetti da
2 x 12 x 8
B-CAL-MP Pronto all’uso
3 fogli
6 fogli
1 flacone
da 100 mL
2 flaconi
da 100 mL
Diluire
ciascuno con
B-CAL-WB 900 ml di
acqua
deionizzata
2 flaconi
da 125 mL
3 flaconi
da 125 mL
5 provette
da 1 mL
5 provetteda B-CAL1 mL
CASET
Pronto all’uso
2 provette da
1 mL
2 provette da B-CAL1 mL
CONSET
Pronto all’uso
1 provetta
da 12 mL
2 provette
da 12 mL
B-CAL-EL Pronto all’uso
1 provetta
da 12 mL
2 provette
da 12 mL
B-TMB12
Pronto all’uso
1 provetta
da 12 mL
2 provette
da 12 mL
B-STS12
Pronto all’uso
Agente
corrosivo
Pronto all’uso
Table 10
La concentrazione effettiva degli standards da A ad E è rispettivamente
di 4, 12, 40, 120 e 240 ng/ml di Calprotectina. Per l’estrazione e la
successiva diluizione del campione è stata presa in considerazione una
diluizione di 1:2500 per l'assegnazione dei calibratori da A ad E.
Le seguenti concentrazioni di Calprotectina devono essere utilizzate per
la procedura ELISA a basso range: 10, 30, 100, 300 e 600 µg/g di
Calprotectina.
2)
3)
Se invece si utilizza la procedura ELISA a range esteso si dovranno
utilizzare le seguenti concentrazioni: 30, 90, 300, 900 e 1800 µg/g di
Calprotectina.
I controlli contengono quantità lotto specifiche di Calprotectina umana.
Per le concentrazioni effettive far riferimento al foglio aggiuntivo QC.
PRECAUZIONI
PRECAUZIONI DI SICUREZZA
Tampone di Incubazione
• Le strip, i Calibratori e i Controlli di questo kit contengono
componenti di origine umana. Benché testati e risultati
negativi all’antigene di superficie HBV e agli anticorpi HCV e
HIV1/2, i reagenti devono essere maneggiati come
potenzialmente infettivi e secondo le buone pratiche di
laboratorio (GLP) utilizzando le dovute precauzioni.
• Substrato e soluzione di stop: Il substrato di TMB (BTMB12) contiene tetrametilbenzidina, e perossido di
idrogeno (H2O2). La soluzione di stop (B-STS12) contiene
acido solforico (0.25 M). Ciascuno di questi reagenti è
irritante per gli occhi, la pelle e le mucose. Evitare il
contatto con occhi, pelle e vestiario. Se viene a contatto con
gli occhi, la pelle e gli indumenti lavarsi immediatamente con
molta acqua. Se viene a contatto con gli occhi, la pelle e
gli indumenti lavarsi immediatamente con molta acqua.
Calibratori
PRECAUZIONI TECNICHE
CONSERVAZIONE E DURATA
Reagenti sigillati
Conservare a 2-8°C. Non utilizzare oltre la data di scadenza stampata sulle
etichette.
Reagenti aperti / ricostituiti
Tampone per estrazione
Micropiastra
Tampone di Lavaggio
Diluito
Controlli
Marcatore Enzimatico
Conservare a 2-8°C fino alla data di scadenza
Riporre immediatamente le strip non utilizzate
nella busta di alluminio che contiene l’essiccante
e risigillarle. Conservarle fino a 2 mesi a 2-8°C.
Conservare fino a 6 mesi a 2-8°C.
Conservare a 2-8°C fino alla data di scadenza.
Substrato-TMB
Soluzione di Stop
Table 11
REAGENTI FORNITI SU RICHIESTA
Dispositivi di estrazione delle feci
Dispositivi
®
Unità da 50 o 200 dispositivi,
ciascuno riempito con tampone di
estrazione ; 5 mL / pronto all’ uso
B-CALEX-C50
B-CALEX-C200
50 dispositivi, spatole e camere di
raccolta feci
50 dispositivi costituiti da provetta,
cono & tappo dosatore,
1.3 mL, Pronto all’ uso
MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
Procedura di estrazione
• Anse per inoculazione da 10 µL
• Provette di polipropilene con tappi a vite da 15 mL
necessarie per procedura di estrazione standard;
dispositivi di estrazione (vedi sopra).
• Cappa a flusso laminare
• Vortex per provette
• Bilancia di Precisione (10-150 mg)
• Microcentrifuga (≥3000 x g)
• Centrifuga (≥500 x g)
Procedura del dosaggio ELISA
• Pipette di precisione da 10 µL, 100 µL e 1000 µL con puntali
monouso.
• Provette monouso di polistirene o polipropilene, per la
preparazione delle diluizioni dei campioni.
• Cilindro da 1000 mL per la diluizione del Tampone di
Lavaggio Concentrato.
• Lavatore per micropiastra o erogatore a spruzzo per il
Tampone di Lavaggio (vedi Avvertenze Procedurali).
• Rotatore per micropiastra (vedi Avvertenze Procedurali)
• Carta da blotting
• Lettore per micropiastra per la misurazione
dell’assorbanza a 450 nm.
Revision date:
2014-08-14
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Reagenti del kit
• Residui rimasti nei pozzetti causati dal processo di
produzione, vengono completamente eliminati dai lavaggi
durante la procedura descritta e non compromettono in alcun
modo i risultati. (fare riferimento al punto 3 della Procedura del
Dosaggio Test).
• Leggere attentamente le istruzioni prima di eseguire il test.
Le prestazioni del test subiranno un effetto negativo se si
utilizzano reagenti diluiti in modo errato, modificati o
conservati diversamente da come specificato nelle presenti
istruzioni per l’uso.
• I componenti non devono essere utilizzati dopo la data di
scadenza riportata sulle etichette.
• Non miscelare reagenti appartenenti a lotti diversi.
• Assicurarsi che non si verifichino cross contaminazioni tra
reagenti, campioni o tra pozzetti.
• Lasciare che i reagenti raggiungano la temperatura
ambiente. Miscelare bene (agitare con il vortex) i reagenti
prima dell’uso.
• Le strip non possono essere riutilizzate.
Estrazione
• Per ottenere risultati quantitativi è importante omogeneizzare
l’intero campione di feci nel tampone di estrazione. Evitare la
contaminazione nella parte alta del dispositivo – componenti
non solubili (non digerite) possono ancora trovarsi nel
dispositivo dopo l’estrazione.
Procedura del dosaggio ELISA
• Nella procedura del dosaggio ELISA, i passaggi del
lavaggio sono essenziali per garantire la riproducibilità dei
risultati. Un tempo minimo di incubazione di almeno 20
secondi del tampone di lavaggio nei pozzetti, deve essere
eseguito in ogni passaggio.
• Usando un lavatore automatico, Bühlmann suggerisce
vivamente di usare il “PLATE MODE” ossia
erogazione/aspirazione sequenziale su tutte le strip, così
che il tempo minimo di incubazione sia garantito.
• E’ importante che il numero di lavaggi consigliato sia
rispettato per assicurare la riproducibilità dei risultati.
• L’agitatore per le micropiastre deve essere impostato
ad una velocità di 450 rpm (<10 Hz). Una frequenza di
rotazione superiore potrebbe causare una scarsa linearità
nelle diluizioni per valori tra 300/900 e 600/1800 µg/g. Il
movimento circolare dell’agitatore è preferibile a quello
latero-laterale.
BÜHLMANN fCALTM ELISA
• Per assicurare la reazione completa antigene/anticorpo, il
periodo d`incubazione al punto 5 della procedura, deve
essere di almeno 30 min. Un’incubazione moderatamente
più lunga (fino a 5 minuti) non influenza la procedura.
• Il marcatore enzimatico è inattivato con ossigeno ed è
altamente sensibile alla sodio azide, al thimerosal, all’acido
ipocloroso ed ai cloroidrocarboni aromatici che spesso si
trovano nei rifornimenti d’acqua di laboratorio .Di
conseguenza usare solo acqua deionizzata di elevata
qualità.
• Dal momento che le condizioni variano da saggio a saggio,
si deve creare una nuova curva standard ogni volta che
viene eseguito una nuova analisi. Si consiglia un
allineamento verticale.
• Se la concentrazione iniziale di un campione non noto è
maggiore del Calibratore E, il campione deve essere
ulteriormente diluito con il Tampone d’Incubazione e dosato
ancora secondo procedura. Il fattore di diluizione applicato
dovrà essere preso in considerazione per i calcoli finali.
RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Se si utilizzano i dispositivi di estrazione, è necessario meno
di 1g di feci originali per la procedura di estrazione.
Raccogliere il campione di feci in provette o contenitori e
conservarlo refrigerato a 2-8°C per almeno 6 giorni .
Gli estratti sono stabili a 2-8°C per almeno 7 gior ni e a
≤-20°C per almeno 24 mesi.
Attenzione: Il campione deve esser raccolto senza alcun
additivo chimico o biologico presente nel dispositivo.
STANDARDIZZAZIONE
Il kit BÜHLMANN fCAL ELISA è calibrato con la MRP8/14
purificata da granulociti umani.
Importante: Dopo l’estrazione, centrifugare il dispositivo
®
CALEX Cap per 5 min a 500 x g e proseguire con la
procedura del test.
2. Sistema di estrazione delle feci Roche (Codice:
10745804322) o BÜHLMANN Smart-Prep (Codice: BCAL-RD): È possibile ridurre il tempo di estrazione (con
vortex) a 1 min.
®
TM
3. ScheBo Quick-Prep (Codice: B-CAL-SOFI): Le
provette di estrazione sono già riempite con tampone di
estrazione.
®
Importante: Dopo l’estrazione con Smart-Prep e ScheBo
TM
Quick-Prep centrifugare le provette per 5 minuti a 3000 g.
Alternativamente, trasferire l'omogenato in una provetta di
Eppendorf da 2 mL e centrifugare in microcentrifuga per 5
minuti a 3000 x g. Decantare il surnatante in una nuova
provetta con etichetta e proseguire con la procedura del test.
RANGE DI MISURAZIONE ELISA
Il dosaggio può essere effettuato con le seguenti
procedure: procedura ELISA a basso range o a range
esteso. La scelta dell'una o dell'altra procedura dipende
dalla concentrazione di Calprotectina attesa dei campioni.
Per campioni fino a 600 µg/g scegliere la procedura a
basso range (range di misurazione 10 – 600 µg/g).
Se le concentrazioni dei campioni tendono a superare i 600
µg/g, scegliere la procedura a range esteso (range di
misurazione 30 – 1800 µg/g).
PROCEDURA DEL TEST
TM
PROCEDURA DI ESTRAZIONE DI CAMPIONI DI FECI
Procedura d’estrazione standard
1. Etichettare e pesare (tarare) la provetta di polipropilene
vuota insieme all’ansa per inoculazione.
2. Prelevare da 50 a 100 mg del campione di feci mediante
l’ansa per inoculazione e metterlo nella provetta
prepesata.
3. Calcolare il peso netto del campione, spezzare l’ansa per
inoculazione e lasciare la parte finale dell’ansa nella
provetta.
4. Aggiungere il Tampone d’estrazione corrispondente alla
formula
x mg di feci x 49 = y µl tampone d’estrazione
(per es. 50 mg di feces + 2450 µl tampone d’estrazione)
alla provetta e chiuderla.
5. Omogenizzare il campione in un vortex per provette
scuotendo vigorosamente (velocità massima) per 30 min.
6. Trasferire il composto omogeneizzato in una provetta
eppendorf da 2 mL e centrifugare in una microcentrifuga
per 5 min a 3’000 x g
7. Trasferire il surnatante in una nuova provetta con
etichetta e proseguire la procedura ELISA.
Procedure di estrazione con utilizzo di sistemi di
estrazione delle feci
La procedura di estrazione è descritta e illustrata nelle
istruzioni per l'uso fornite assieme ai rispettivi sistemi di
estrazione.
®
Cap (codice B-CALEX-C50/
1. Dispositivo CALEX
B-CALEX-C200): I tubi di estrazione sono già riempiti con
tampone di estrazione.
Revision date:
2014-08-14
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Importante: Lasciare equilibrare i reagenti a 18-28°C
prima dell'uso. Diluire solamente gli estratti di feci.
Calibratori e controlli sono pronti all’uso.
1. DILUIZIONE DEL CAMPIONE DI FECI
RANGE DI MISURAZIONE 10 – 600 µg/g
1.1. Procedura con pesatura manuale, con Smart Prep
®
TM
o ScheBo Quick Prep : Diluire gli estratti 1:50 con
il tampone di incubazione (es. 20 µL di estratto e 980
µL di tampone di incubazione) e mescolare bene.
Lasciare equilibrare i campioni per almeno 5 min a 1828°C prima di procedere al punto 4c.
®
1.2. Dispositivo CALEX Cap: Diluire gli estratti 1:5 con il
tampone di incubazione (es. 100 µL di estratto e 400
µL di tampone di incubazione) e mescolare bene.
Lasciare equilibrare i campioni per almeno 5 min a 1828°C prima di procedere al punto 4c.
RANGE DI MISURAZIONE 30 – 1800 µg/g
Il range di misurazione può essere esteso di un fattore
3, se si diluiscono i campioni 1:7500 invece di 1:2500.
Questa procedura è raccomandata qualora si
prevedano valori elevati di calprotectina. La precisione
e la linearità del saggio consentono questa estensione
del range di misurazione.
1.1. Procedura con pesatura manuale, con Smart Prep
®
TM
o ScheBo Quick Prep : Diluire gli estratti 1:150
con il tampone di incubazione (es. 20 µL di estratto e
2980 µL di tampone di incubazione) e mescolare
bene. Lasciare equilibrare i campioni per almeno 5
minuti a 18-28°C prima di procedere al punto 4c.
®
1.2. Dispositivo CALEX Cap: Diluire gli estratti 1:15 con
il tampone di incubazione (es. 50 µL di estratto e il 700
µL di tampone di incubazione) e mescolare bene.
Lasciare equilibrare i campioni per almeno 5 minuti a
18-28°C prima di procedere al punto 4c.
BÜHLMANN fCALTM ELISA
2. Preparare una piastra con le strip sufficienti per il
numero richiesto di calibratori, controlli e campioni
diluiti. Rimuovere le strip in eccesso dal contenitore e
risigillarle immediatamente nella busta di alluminio con
l’essiccante. Conservarle refrigerate.
3.
Lavare i pozzetti coattati due volte usando almeno 300 µL
di Tampone di Lavaggio per pozzetto. Svuotare i pozzetti
scuotendo la piastra energicamente su carta per blotting.
Importante: per i tre passaggi di lavaggio con il tampone di
lavaggio, deve essere assicurato un tempo di
incubazione minimo di 20 secondi (vedi Precauzioni
Tecniche – Procedura del dosaggio ELISA)
4a. Dispensare 100 µL di Tampone d’Incubazione nel
pozzetto rispettivo (Bianco).
Dispensare 100 µL del Calibratore A-E nei rispettivi
pozzetti.
4b. Dispensare 100 µL di Controllo Basso e Alto nei rispettivi
pozzetti.
4c. Dispensare 100 µL di ogni campione diluito nei
successivi pozzetti.
5.
Coprire la piastra con un foglio sigillante e incubarla per
30+5 minuti massimo su un mixer impostato a 450 rpm a
18-28°C (vedi Precauzioni Tecniche - Procedura del
dosaggio ELISA).
6.
Rimuovere ed eliminare il foglio sigillante. Svuotare i
pozzetti e lavare 3 volte usando almeno 300 µL di
Tampone di Lavaggio per pozzetto (vedi Precauzioni
Tecniche - Procedura del dosaggio ELISA). Svuotare i
pozzetti scuotendo la piastra energicamente su carta per
blotting.
7.
Dispensare 100 µL di Marcatore enzimatico in ogni
pozzetto.
8.
Coprire la piastra con un foglio sigillante e incubarla per
30±5 minuti massimo su un mixer impostato a 450 rpm a
18-28°C.
9.
Rimuovere ed eliminare il foglio sigillante. Svuotare i
pozzetti e lavare cinque volte usando almeno 300 µL di
Tampone di Lavaggio per pozzetto. Svuotare i pozzetti
scuotendo la piastra energicamente su carta per blotting.
Importante: lasciare che la soluzione di substrato TMB
raggiunga 18-28°C.
10. Dispensare 100 µL di Soluzione di Substrato TMB in tutti
i pozzetti.
11. Coprire la piastra con un foglio sigillante, proteggere la
piastra dalla luce diretta ed incubarla per 15 ± 2 minuti su
un mixer impostato a 450 rpm a 18-28°C.
12. Dispensare 100 µL di Soluzione di Stop in tutti i pozzetti.
Eliminare le bolle d’aria con un puntale. Procedere al
punto 13 entro 30 minuti.
13. Leggere l’assorbanza a 450 nm in un lettore per
micropiastre.
RISULTATI E CALCOLO
Leggere l’assorbanza a 450 nm in un lettore per micropiastre
per ognuno dei calibratori, controlli e campioni e con un
modello di regressione logistica 4 parametri, calcolare la
concentrazione di Calprotectina dei campioni.
Revision date:
2014-08-14
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RANGE DI MISURAZIONE 10 – 600 µg/g
Se si sceglie la procedura ELISA a basso range, si dovrà far
riferimento alle seguenti concentrazioni di calibratori: 10, 30,
100, 300 e 600 µg/g di Calprotectina.
Ulteriori fattori di diluizione devono essere moltiplicati
con i risultati per ottenere i risultati finali.
Per dati di riferimento vedere Table 19 e Figure 1 (risultati e
curva standard). Questi risultati e la curva standard sono
forniti a solo scopo dimostrativo. Una curva standard deve
essere generata per ogni set di campioni.
RANGE DI MISURAZIONE 30 – 1800 µg/g
Se si sceglie la procedura ELISA a range esteso, si dovrà far
riferimento alle seguenti concentrazioni di calibratori: 30, 90,
300, 900 e 1800 µg/g di Calprotectina.
Ulteriori fattori di diluizione devono essere moltiplicati
con i risultati per ottenere i risultati finali.
Per dati di riferimento vedere (risultati e curva standard).
Questi risultati e la curva standard sono forniti a solo scopo
dimostrativo. Una curva standard deve essere generata per
ogni set di campioni.
CARATTERISTICHE DEL TEST
RANGE DI MISURAZIONE 10 – 600 µg/g
Le caratteristiche di prestazione del dosaggio sono state
convalidate in duplicato.
Precisione Intra-Saggio: 4.7 %. La precisione intra-saggio
è stata calcolata sui risultati di 20 duplicati di valori da 3
campioni di estratto fecale, dosati in un’unica seduta
secondo la procedura del saggio. I valori sono presentati in
Table 20.
Precisione Inter-Saggio: <15 %. La precisione intersaggio (media) della procedura ELISA è stata calcolata su
5 campioni di estratti fecali. Le aliquote sono state dosate,
con la procedura prevista per il dosaggio, in 10 diverse
sedute da tre tecnici, utilizzando 2 lotti del kit in due diversi
laboratori. I valori sono presentati in Table 21.
Limite del Bianco (LoB): <10 µg/g. Venti duplicati di
Tampone d’Incubazione sono stati dosati in un’unica seduta.
La media e la deviazione standard sono state calcolate per i
valori di assorbanza. La dose minima rilevabile di
Calprotectina è stata calcolata nettamente al di sotto del
Calibratore A (10 µg/g) aggiungendo due deviazioni standard
all’assorbanza media e intersecando questo valore con la
curva standard ottenuta in una nuova seduta.
Limite di Quantificatione (LoQ): <10 µg/g. Dieci diversi
campioni di feci con valori tra 5.2 e 1254 µg/g di
Calprotectina sono stati misurati 20 volte in duplicato. La %
del CV ed i valori medi sono stati calcolati per ciascun
campione. Il LoQ è stato osservato al 15 % del CV. Il profilo
di precisione osservato (Figure 2) permette dosaggi accurati
entro la gamma standard da 10 a 600 µg/g.
Linearità di Diluizione: 103 %. Sette campioni di feci con
valori elevati di Calprotectina sono stati prelevati secondo
la procedura del saggio. L’estratto è stato diluito con
Tampone d’Incubazione e successivamente dosato
secondo il protocollo. I valori attesi sono stati calcolati dai
valori osservati con la prima diluizione. I valori sono
presentati in Table 22.
Rilevazione da inoculo: 100 %. Due campioni di estratti
fecali sono inoculati con diverse quantità di siero umano
contenente Calprotectina. I campioni sono stati misurati
prima e dopo l’inoculo secondo la procedura. I valori sono
presentati in
Table 23.
BÜHLMANN fCALTM ELISA
Cross-reattività: <0.1%. I Tamponi d’Incubazione inoculati
con diverse quantità di MRP8 e MRP14 ricombinante sono
stati misurati secondo la procedura. I valori sono presentati
in Table 28.
diverticolite e una IBD in fase di remissione. La bassa
risposta infiammatoria mostrata in questo range può
suggerire di ripetere la misurazione e di effettuare ulteriori
investigazioni.
RANGE DI MISURAZIONE: 30 – 1800 µg/g
Valori elevati sopra i 200 µg/g:
I valori di Calprotectina >200 µg/g sono indicativi di una
malattia attiva organica con infiammazione nel tratto
gastrointestinale. Sono suggerite appropriate ulteriori
procedure investigative e curative eseguite da specialisti.
Precisione Intra-Saggio: 4.0 %. La precisione intra-saggio
(media) è stata calcolata a partire dai risultati di 20 duplicati
da 3 campioni di estratti fecali dosati in una singola seduta
secondo la procedura del saggio. I valori sono presentati in
Table 25.
Precisione Inter-Saggio: <15 %. La precisione intersaggio (media) della procedura ELISA è stata calcolata da
5 campioni di estratti fecali. Le aliquote sono state dosate
con la procedura prevista per il dosaggio in 10 diverse
sedute da tre tecnici, utilizzando 2 lotti del kit in due diversi
laboratori. I valori sono presentati in Table 26.
Limite di Quantificatione (LoQ): <30 µg/g. 18 campioni di
feci con valori di Calprotectina compresi tra 10.8 e 2080
µg/g sono stati analizzati 20 volte in duplicato in un’unica
seduta. Per ciascun campione sono stati calcolati il CV in
% e i valori medi. Il LoQ è stato calcolato al 15 % di CV. Il
profilo di precisione osservato consente determinazioni
precise entro l'intero range standard da 30 a 1800 µg/g. I
risultati sono riportati in Figure 4.
Linearità di diluizione: 102 %. Cinque campioni di feci
con concentrazioni elevate di Calprotectina sono stati
estratti con la procedura prevista per il saggio. Gli estratti
sono stati diluiti con tampone di incubazione e
successivamente dosati con la procedura prevista per il
saggio. I valori attesi sono stati calcolati a partire dal valore
osservato rilevato con la prima diluizione. I valori sono
presentati in Table 27.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
La valutazione della Calprotectina nelle feci è un metodo
facile e attendibile, per distinguere tra malattie
gastrointestinali funzionali e organiche.
In uno studio clinico condotto su 401 pazienti sintomatici, la
Calprotectina è stata determinata prima di eseguire una
colonscopia. L`esame endoscopico ha mostrato 273
pazienti con malattie gastrointestinali funzionali, mentre
128 pazienti con varie malattie organiche (colite, Crohn`s,
ulcera, diverticolite, polipi, adenomi, cancro o malattie
infettive) (réf. 12).
Analisi di curve ROC (AUC 0.935) mostrano un cut-off
clinico ottimale ad un valore di 50 µg/g. Applicando questo
valore (cut-off), viene raggiunta una sensibilità di 84.4% e
specificità clinica di 94.5%. Ciò rende possibile la
differenziazione tra malattie gastrointestinali funzionali e
organiche (vedi . Table 29).
La concentrazione di Calprotectina nelle feci è comparabile
in adulti e bambini, mentre nei neonati può essere
significativamente più elevata (ref. 8).
Questi dati supportano le seguenti raccomandazioni per
l’interpretazioni dei risultati:
Il cut-off suggerito per gli adulti (50 µg/g) può essere anche
usato per i bambini con età compresa tra i 4 e i 17 anni
senza differenziazione di sesso (ref.9).
CONTROLLO DI QUALITA’
Per un uso efficace del prodotto è necessaria un’approfondita
comprensione di queste istruzioni. Si otterranno risultati
attendibili soltanto attraverso l’utilizzo di precise tecniche di
laboratorio (attuali linee guida GLP) e seguendo
accuratamente queste istruzioni per l’uso.
Dal momento che non esiste in commercio un controllo di
qualità esterno per Calprotectina, si consiglia l’uso di un pool
di estratti positivi per il controllo di qualità interno.
La riproducibilità dei parametri della curva standard e dei
valori di controllo deve rientrare entro determinati limiti di
accettabilità del laboratorio. I limiti di confidenza per i Controlli
sono lotto-specifici e riportati sul Foglio Dati di QC aggiunto al
kit.
Se la precisione del dosaggio non correla con i limiti stabiliti e
la ripetizione esclude errori nella tecnica, verificare quanto
segue: i) dispensazione, controllo della temperatura e timer ii)
settaggio del lettore ELISA, iii) date di scadenza dei reagenti
iv) condizioni di conservazione e di incubazione v) Soluzione
di Substrato TMB deve essere incolore, vi) purezza
dell’acqua.
LIMITI
• I reagenti forniti con questo kit sono ottimizzati per dosare
Calprotectina umana in campioni fecali estratti.
• I risultati del test vanno interpretati insieme alle informazioni
derivanti dagli studi epidemiologici, dalla valutazione clinica
del paziente e da altre procedure diagnostiche.
Valori normali sotto i 50 µg/g:
I valori di Calprotectina <50 µg/g non sono indicativi di una
infiammazione del tratto gastrointestinale. Per pazienti con
bassi livelli di Calprotectina probabilmente non sono
necessarie ulteriori procedure invasive per determinare le
cause dell’infiammazione (ref.12).
Valori elevati compresi tra i 50 e i 200 µg/g:
I valori di Calprotectina compresi tra i 50 e i 200 µg/g
possono rappresentare una debole malattia organica come
una infiammazione causata da NSAID, una debole
Revision date:
2014-08-14
20/36
ALMACENAMIENTO Y DURACIÓN DE LOS REACTIVOS
TM
EK-CAL
Reconstituci
ón
B-CALEX-C50
B-CALEX-C200
Listo para
usar
Smart-Prep
Listo para
usar
Listo para
B- CAL -IB
usar
Listo para
usar
2 viales
de 1 mL
Listo para
usar
2 viales
de 12 mL
Listo para
usar
2 viales
de 12 mL
B-TMB12
2014-08-14
Table 15
PRECAUCIONES
21/36
2014-08-14
22/36
TM
®
®
6.
7.
8.
9.
Revision date:
2014-08-14
23/36
2014-08-14
24/36
Revision date:
2014-08-14
25/36
1)
2)
3)
EK-CAL
EK-CAL2
3 peças
6 peças
B-TMB12
Pronto para
uso
B-STS12
Device
Smart-Prep
B-CALEX-C200
Table 17
2014-08-14
26/36
TM
®
Revision date:
2014-08-14
27/36
3.
6.
7.
8.
9.
2014-08-14
5.
28/36
do
teste
foram
2014-08-14
29/36
APPENDIX I
REFERENCES/ LITERATURREFERENZEN/ RÉFÉRENCES/ RIFERIMENTI/ REFERENCIAS
Revision date:
2014-08-14
30/36
0.073
0.066
0.069
0.143
0.153
0.148
0.465
0.456
0.460
1.121
1.135
1.128
1.658
1.671
1.664
0.201
0.189
0.195
0.598
0.583
0.590
2
7.2
1.5
4.8
1
1.4
0.5
0.9
0
10
0.6
41
39
40
134
130
132
1.4
5.6
33.0
2.7
3.2
8.1
C
D
R^2
400
2.67
1
1:200
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:6400
1:12800
Mean
1:50
1:100
1:200
1:400
1:800
Mean
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:6400
Mean
Mean
Mean
Mean
Mean
S1
S2
60
40
Dilution
S3
Intra Assay CV [%CV] n=20
B
1.19
1.8
SD
[µg/g]
A
0.0354
4.4
4.7
Mean
[µg/g]
18.1
44.5
74.3
227
520
1000
Mean
Table 21:
0.096
10
10
10
30
30
30
100
100
100
300
300
300
600
600
600
Calc. Conc.
[µg/g]
232
124
61
28
12
116
58
29
15
290
145
73
39
19
145
72
36
18
15 % CV
Table 23:
20
Spiking Recovery
µg/g
0
1
10
100
1000
10000
S1
5.3
Observed
[µg/g]
13.6
33.6
101
147
287
468
Mean
10
600
S2
24.6
Revision date:
2014-08-14
31/36
10
30
100
150
300
400
32.9
49.2
139
176
358
467
34.6
54.6
125
175
325
425
30
30
30
90
90
90
300
300
300
900
900
900
1800
1800
1800
0.057
0.047
0.046
0.047
0.138
0.140
0.139
0.464
0.452
0.458
1.207
1.192
1.200
1.627
1.630
1.629
0.147
0.162
0.155
0.618
0.618
0.618
Calc. Conc.
[µg/g]
0.9
1.5
1.0
1
1.9
37.7
713
1246
0.8
0
10
0.1
105
115
110
396
396
396
6.2
SD
[µg/g]
2.5
20.1
32.4
6.7
2.8
2.6
SD
[µg/g]
9.7
20
62
111
221
B
1.47
C
736
D
2.06
R^2
1
80
70
60
50
40
<15 % CV
30
20
10
0
1.0
10.0
100.0
1000.0
10000.0
30
S1
S2
S3
S4
S5
Mean
2014-06-30
10000
0.6
Table 27:
Revision date:
1000
100
µg/g
4.0
Table 26:
0.5
2
Mean
Intra Assay CV [%] n=20
32/36
1800
Dilution Linearity/Parallelism
Dilution
Observed
[µg/g]
2466
1296
420
237
111
758
702
552
406
210
108
Table 28*
Spiked with
100 µg/mL
10 µg/mL
1 µg/mL
100 ng/mL
10 ng/mL
26.0
8.0
<4.0
<4.0
<4.0
Revision date:
MRP14
[ng/mL]
38.7
3.4
<4.0
<4.0
<4.0
2014-08-14
33/36
* Data have been established with the lower range ELISA
procedure
Table
description:
cf.
“Results”,
“Performance
Characteristics” and “Interpretation of Results”.
Tabellenbeschreibung: siehe Resultate
“Leistungsmerkmale” und “Interpretation der Resultate”.
Explications aux tableaux: voir “Résultats”,
“Caracteristiques de Performance” et “Interprétation des
Résultats”.
Descrizione tavola: cf. “Risultati”, “Caratteristiche di
Prestazione” e “interpretazione dei resultati”.
Explicaciones a las Tablas: ver “Resultados”,
“Características de Efficiencia”) y “Interpetaciones de los
resultados.”
Explicação a Tablas: ver “Resultados”, “Características
de desempenho” y “Interpretação do resultados
APPENDIX IV
SHORT PROTOCOL
0.0 mg
75.0 mg
Centrifuge 5 min
at 3’000 x g
Revision date:
2014-08-14
34/36
NOTES
Revision date:
2014-08-14
35/36
REF
LOT
IVD
MP
Symbol
Use By
Verwendbar bis
Utiliser jusqu’au
Utilizzare entro
Fecha de caducidad
Data de expiração
Order Code
Bestellnummer
Code
Codice
Código
Código
Batch code
Chargenbezeichnung
Code du lot
Codice del lotto
Código de lote
Código lote
In Vitro Diagnostic Medical Device
In Vitro Diagnostikum
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Producto sánitario para diagnóstico in vitro
Contains sufficient for <n> tests
Ausreichend für ”n” Ansätze
Contenu suffisant pour „n“ tests
Contenuto sufficiente per „n“ saggi
Contenudo sufficiente para <n> ensayos
Contenudo sufficiente para <n> tests
Consult Instructions for UseGebrauchsanweisung beachten
Consulter le mode d’emploi
Consultare le istruzioni per l‘uso
Consulte las instrucciones de uso
Leia cuidadosamente as instruções
Temperature limitation
Zulässiger Temperaturbereich
Limites de température
Limiti di temperatura
Limite de temperatura
Lίmite de temperatura
Extraction Buffer
Extraktions-Puffer
Tampon d’extraction
Tampone per estrazione
Tampón de extracción
Tampão extração
Microtiter plate
Mikrotiterplatte
Microplaque
Micropiastra
Microplaca
Microplaca
BUF WASH 10X
BUF INC
CAL A
-
CAL E
CONTROL H
EL
Explanation
Wash Buffer Concentrate (10x)
Wasch-Puffer Konzentrat (10x)
Concentré de tampon de lavage (10x)
Tampone di lavaggio concentrato (10x)
Tampón de lavado concentrado (x10)
Concentrado de tampão de lavagem
Incubation Buffer
Inkubations-Puffer
Tampon d’incubation
Tampone di incubazione
Tampón de incubación
Tampão de incubação
Calibrator A -E
Kalibrator A -E
Calibrateur A -E
Calibratore A - E
Calibrador A – E
Calibrador A – E
Control Low
Kontrolle tief
Contrôle bas
Controllo basso
Control bajo
Controle baixo
Control High
Kontrolle hoch
Contrôle élevé
Controllo alto
Control alto
Controle alto
Enzyme Label
Enzym-Marker
Marqueur enzymatique
Marcato enzimatico
Marcador enzimático
Marcador enzimático
TMB Substrate
TMB-Substrat
Substrat TMB
Substrato di TMB
Substrato de TMB
Substrato TMB
Stop Solution
Stopp-Lösung
Solution stop
Soluzione stoppante
Solución de parada
Solução stop
Printing Date
2014-08-15
Revision date:
2014-08-14
36/36