advertisement
COBAS® TaqMan® Analyzer
Metode
3 Instrument
Metode
COBAS
®
TaqMan
®
Analyzer bruger Roches patenterede teknologi, som benytter brugen af 5' nuclease-analysen ved PCR.
Metoden anvender en dobbeltfluorescerende, farvemærket probe, der indeholder et rapportfarvestof og et quencher-farvestof. Proben undertrykker fluorescens, når den er i naturlig tilstand. Under reaktionen spalter exonuclease-aktiviteten i DNApolymerasen proben og adskiller de to farvestoffer. Dette eliminerer rapportfarvestoffets quenching-effekt og resulterer i en tilsvarende forøgelse af det fluorescerende signal.
A C E
Polymerisation
5’
3’
5’
B
R
D
Q
3’
5’
3’
5’
Strand displacement
5’
3’
5’
R Q
3’
5’
3’
5’
Spaltning
5’
3’
5’
R
Q
3’
5’
3’
5’
Polymerisationen er fuldført
5’
3’
5’
R
Q
3’
5’
3’
5’
A Forward primer
B Rapportfarvestof
C Probe
Figur 3-1
D
E
Quencher-farvestof
Reverse primer
Fluorescerende energioverførselsprobe
COBAS
®
TaqMan
®
Analyzer benytter desuden en intern kontrol/kvantificeringsstandard (IC/QS), der består af en ikke-smitsom nukleinsyre, der er indsat i hver prøve med et kendt antal kopier. IC/QS foretages via prøveforberedelse, amplifikation og 5' nuclease-detektion langs targetnukleinsyren.
IC/QS korrigerer for variationer i instrument, kemi eller prøver ved at relatere fluorescensen fra targetproben til fluorescensen fra IC/QS-proben. IC/QS benyttes også i kvantitative test til at bestemme antallet af kopier af den ukendte targetnukleinsyre.
Via anvendelsen af et tilpasset design af specifik primer og dobbeltmærkede probesæt kan metoden på COBAS
®
TaqMan
®
Analyzer anvendes til alle virale, bakterielle og parasitiske patogener. Den generelle metode vises i figuren nedenfor. Den specifikke metode afhænger af det patogen, der analyseres.
Roche Diagnostics
Instrumentmanual · Version 2.0
37
3 Instrument
Metode
COBAS® TaqMan® Analyzer
COBAS ®
TaqMan ®
Analyzer
Metode
Annealing
Forberedt prøve
AmpErase-enzym
(uracil-N-glycosylase)
Revers transkription
(hvis det er nødvendigt for RNA-target)
Denaturering
Forlængelse og spaltning
Monitorering af kinetik
Figur 3-2 Metode
Dataanalyse
Titerresultater
Roche Diagnostics
38 Instrumentmanual · Version 2.0
advertisement